專利名稱：：抗幽門螺旋桿菌的新免疫球蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療和診斷由幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)引起的感染的材料和方法。更具體地說，本發(fā)明涉及新的特異性抗體可變區(qū)，其衍生物和完全人免疫球蛋白Abba3，其顯示對幽門螺旋桿菌表達(dá)的BabA抗原具有特異性活性，生產(chǎn)所述免疫球蛋白的方法，它們的分離和用途，例如檢測由幽門螺旋桿菌引起的疾病。本發(fā)明還涉及治療和預(yù)防幽門螺旋桿菌菌株引起的病理性感染的免疫療法，即被動疫苗接種。
背景技術(shù)：
：幽門螺旋桿菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，定居在人胃粘膜，引起慢性胃炎，慢性胃炎可以發(fā)展為消化性潰瘍和胃癌(6)。幽門螺旋桿菌在其表面表達(dá)粘附素，粘附素使得其與胃粘膜緊密粘附，以容許這些營養(yǎng)缺陷型生物從宿主組織獲得營養(yǎng)。BabA粘附素是外膜蛋白平行同源家族的成員(2)，其與在上皮細(xì)胞上表達(dá)的巖藻糖基化AB0/Lewisb血型抗原結(jié)合(7，22)。BabA是一種可能的疫苗候選物，因?yàn)榕R床分離物中高比例顯示出表達(dá)BabA(22，26,33)。由于胃腸道中免疫活性低，抗幽門螺旋桿菌的主動疫苗接種很困難。一個其他問題是幽門螺旋桿菌的高重組率。被動免疫反而更有利，因?yàn)锳bba3抗體與抗原結(jié)合，使得幽門螺旋桿菌難于附著于粘膜。最近的研究也已經(jīng)證明BabA表達(dá)與消化性潰瘍和胃癌的發(fā)展之間有顯著的關(guān)聯(lián)(16,36)?，F(xiàn)在，正在研究遞送高度ABO/Lewisb巖藻糖基化糖綴合物進(jìn)行被動免疫療法的可能性(18，43)。做為選擇，干擾粘膜粘附的抗體衍生物可以口服給予或由GRAS(GenerallyRecognisedAsSafe,公認(rèn)安全的)微生物在原位產(chǎn)生，正如口服給予抗幽門螺旋桿菌的IgG(ll，25)，或給予表達(dá)抗鏈球菌突變株的單鏈可變片段(scFv)的乳酸桿菌(30)所顯示。scFv是一種由免疫球蛋白的可變重鏈(VH)和輕鏈(VL)通過靈活的肽接頭連接組成的基因工程抗體。胃中細(xì)菌不僅僅面臨著宿主特定環(huán)境條件，而且要面對病變進(jìn)展過程中粘膜糖基化模式的改變。盡管如此，幽門螺旋桿菌仍具有產(chǎn)生慢性和持續(xù)感染的卓越能力，這可能是由于它出奇高的重組率(15)。幽門螺旋桿菌緊密粘附和不粘附之間轉(zhuǎn)換的能力使得該細(xì)菌得到從炎癥組織滲漏的營養(yǎng)物，但同時也使細(xì)菌暴露于宿主炎癥反應(yīng)(37)。BabA通過以下方法有助于結(jié)合靈活性富含CT的引導(dǎo)序列中基于移碼的變異，與BabA密切相關(guān)的外膜蛋白(OMPs)在它的N-和C_末端區(qū)域但位于不同位點(diǎn)的babB和babC(4，5，40)的水平基因轉(zhuǎn)移和基因轉(zhuǎn)換。盡管BabA主要發(fā)現(xiàn)在babA位點(diǎn)中，但是與位于babB位點(diǎn)中的BabB的基因轉(zhuǎn)換導(dǎo)致較弱BabB啟動子控制下的全長BabA形成或產(chǎn)生BabA區(qū)別于BabB的獨(dú)特區(qū)域上游重組位點(diǎn)的嵌合BabA/BabB基因(12)。在受感染獼猴和患者中，重組還可以引起babA位點(diǎn)內(nèi)BabB的存在，及隨后Lewisb結(jié)合的喪失(12，20，40)。第三個位點(diǎn)BabC，以前僅在26695菌株中描述過，最近在另外的菌株中也表明其涉及與BabA的重組交換。Backstr6m等(5)已經(jīng)表明已失去結(jié)合Lewisb能力的臨床幽門螺旋桿菌分離株當(dāng)中，一小部分細(xì)菌群隱匿BabB/BabA嵌合體，并且體外通過與磁珠包被的Lewisb淘選可以重建Lewisb結(jié)合。這將使細(xì)菌對宿主炎癥反應(yīng)時糖基化模式的改變產(chǎn)生應(yīng)答?；蜣D(zhuǎn)換引起嵌合型BabA形成，但是CBD(碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域)突變將引起功能喪失并由此引起幽門螺旋桿菌急性傳染期的存活率降低，其中血型抗原仍然在上皮細(xì)胞上高度表達(dá)。恒河猴試驗(yàn)性感染末期，所分析菌株中babA位點(diǎn)中唯獨(dú)babB的存在產(chǎn)生了抗原變異用來避免宿主免疫應(yīng)答的假說(40)。在兩份報(bào)道中測試了患者血清中幽門螺旋桿菌抗原的抗原性，但是因?yàn)樵诙S分離前，蛋白被尿素變性，檢測構(gòu)象依賴性膜蛋白的可能性頗受限制(19，27)。用分離自包涵體的重組BabA(44)免疫兔子已經(jīng)產(chǎn)生了多克隆抗BabA血清，并且在大多數(shù)菌株中顯示出識別BabA。迄今為止，已經(jīng)描述了兩個單克隆BabA特異性scFv，其用BabA-GST融合蛋白免疫嚙齒動物而產(chǎn)生，范圍覆蓋BabA-J99結(jié)構(gòu)域的氨基酸128至310(21)。Western印跡分析所分析的菌株僅僅大約一半是陽性的，可能由于與多克隆血清相比單克隆抗體有更多限制表位。此外，對僅含一部分BabA，沒有明確功能性構(gòu)象的蛋白進(jìn)行所描述scFv的噬菌體選擇。預(yù)防通過粘膜部位傳播傳染性疾病的新方法包括通過乳酸桿菌或其他GRAS微生物原位遞送抗體片段(30)。以前已經(jīng)鑒定了BabA粘附素并表明位于幽門螺旋桿菌細(xì)菌的表面(SE9602287-6)。血型結(jié)合活性顯示pH依賴性，本發(fā)明人現(xiàn)在證明了與Lewis-b受體結(jié)合的親和力揭示高平衡常數(shù)。深入研究涉及由幽門螺旋桿菌引起的感染的免疫治療和預(yù)防。EP0484148(Ando&Nakamura)描述了治療和/或預(yù)防哺乳動物中上胃腸道疾病的方法，所述方法包括將含抗幽門螺旋桿菌多克隆免疫球蛋白和藥物可接受載體的有效量的藥物組合物口服給予需要其的患者。該說明書進(jìn)一步詳述了所述療法與給予抗生素結(jié)合的聯(lián)合方法。作為生產(chǎn)所述多克隆抗體的方法，EP0484148描述了從哺乳動物血清和乳汁中分離和純化抗幽門螺旋桿菌免疫球蛋白。根據(jù)EP0484148，在牛、山羊、綿羊、豬或馬的胃中沒有發(fā)現(xiàn)幽門螺旋桿菌本身，但是人們認(rèn)為這些動物物種中已經(jīng)定居了具有與幽門螺旋桿菌抗原決定簇類似的決定簇的微生物，因?yàn)樗鼈兙哂信c在人類中發(fā)現(xiàn)的幽門螺旋桿菌菌株有交叉反應(yīng)的免疫球蛋白。根據(jù)EP0484148，優(yōu)選大型哺乳動物例如妊娠牛，用幽門螺旋桿菌全細(xì)胞免疫，和隨后從乳汁或初乳中提取免疫球蛋白。在免疫實(shí)驗(yàn)中，使用NCTC菌株11362和臨床分離株幽門螺旋桿菌No.153觸發(fā)免疫球蛋白的產(chǎn)生。另一方面，使用NCTC菌株11637進(jìn)行分析目的。聲稱免疫在乳汁中產(chǎn)生了如此幅度的抗幽門螺旋桿菌滴度，日劑量O.Ol-O.lg/天免疫球蛋白成分，足以進(jìn)行成功的治療。然而Ando&Nakamura提供的實(shí)驗(yàn)不支持O.Ol-O.lg/天的聲稱區(qū)間，因此至今在臨床試驗(yàn)中未能證明如此低的劑量有效。實(shí)施例5和7中實(shí)際使用的劑量是lg/天的數(shù)量級，即已給出的區(qū)間上限的10倍。此外，Ando&Nakamura制備的非特異性免疫球蛋白混合物在所聲稱劑量下是有效的幾乎不大可能，因?yàn)轭愃频膭┝靠蛊渌改c病原體無效。在該說明書中廣泛論述的同時給予抗生素，強(qiáng)調(diào)了所公開免疫球蛋白的不足。EP0469359(Cordle&Schaller)同樣描述了用福爾馬林殺死的幽門螺旋桿菌細(xì)菌(ATCC菌株26695)免疫哺乳動物，優(yōu)選妊娠牛。從乳汁中分離和純化抗幽門螺旋桿菌多克隆抗體，并最后飼喂給小豬，總量大約O.5g免疫球蛋白，每天三次。通過測定活檢標(biāo)本中試驗(yàn)后革蘭氏陰性細(xì)菌呈陽性的數(shù)量來評價結(jié)果。在飼喂非免疫性營養(yǎng)物質(zhì)的小豬中78%發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性細(xì)菌，但是飼喂含有所謂特異性抗幽門螺旋桿菌抗體的營養(yǎng)物質(zhì)的小豬僅僅(Sic!)發(fā)現(xiàn)35%。US20040234529，與本發(fā)明相同的發(fā)明人的一件專利申請，公開了BabA蛋白。所述粘附素和/或DNA對診斷和治療和/或預(yù)防幽門螺旋桿菌誘導(dǎo)的感染有效，例如胃炎和酸性消化性疾病(acidp印ticdisease)，即主動接種疫苗。他們還公開了用于被動免疫接種的免疫球蛋白組合物，其對結(jié)合幽門螺旋桿菌粘附素的Lewisb抗原顯示出特異活性，用于治療和/或預(yù)防由幽門螺旋桿菌引起的胃腸疾病。與本發(fā)明不同，該抗體是動物抗體，不是特異性選擇的人抗體。此外，US20040234529的申請人沒有提及糞便樣品的檢測。盡管BabA的中心部分是最不同的并且其決定了受體結(jié)合的特異性(4，22)，但是未定位的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)不能經(jīng)受不喪失功能的高效率突變；不過分離自南美本土人群的幽門螺旋桿菌菌株經(jīng)由BabA的適應(yīng)性變化顯示出了在進(jìn)化過程中的微調(diào)，其優(yōu)先結(jié)合這個洲中主要血型抗原O-Lewisb(命名為"專用(Specialists)"菌株)。相反，分離自洲的菌株，其中A/BLewisb血型抗原更能普遍代表老居民，這證明抗A/BLewisb(包括O-Lewisb)的更普遍結(jié)合能力并因此被命名為"通用(Generalist)"結(jié)合株(4)。比對BabA序列，但是沒有定位出對應(yīng)于通用對專用的特異性babA結(jié)構(gòu)域。因此我們旨在開發(fā)對受體結(jié)合位點(diǎn)特異性的抗體并使用噬菌體展示技術(shù)富集來自于患者的抗體，患者的血清特征在于對Lewisb具有競爭性BabA結(jié)合特性。本領(lǐng)域已經(jīng)認(rèn)識到如何生產(chǎn)由外周血單核細(xì)胞得到的抗各種肽的人scFv文庫。也獲知了如何選擇幽門螺旋桿菌的變性、線性、非天然肽。但是以前沒有文獻(xiàn)描述選擇方法，選擇天然、非變性、三維BabA多肽。這里，我們提供了一種由感染幽門螺旋桿菌的患者外周血單核細(xì)胞得到的人scFv文庫，和所鑒定和選擇的BabA特異性人單鏈之一轉(zhuǎn)變?yōu)槿薎gGl抗體，名為Abba3。Abba3scFv是指可變結(jié)合區(qū)，且包括其衍生物。令人驚奇的是，該抗體結(jié)合大多數(shù)幽門螺旋桿菌臨床分離株，并顯示出與A-Lewisb或B-Lewisb血型糖抗原類似的結(jié)合特性，即優(yōu)先識別世界范圍內(nèi)分布最廣泛的"通用"型BabA。Abba3抗體通過與BabA結(jié)合而中和幽門螺旋桿菌，使得該細(xì)菌難于附著于粘膜。因此該細(xì)菌/抗體復(fù)合物從消化系統(tǒng)自然消失。由于胃腸道免疫活性低，抗體檢測不如抗原檢測有效。因此，優(yōu)選使用Abba3抗體檢測糞便樣品中幽門螺旋桿菌的檢測試劑盒。因?yàn)锳bba3是一個完全人IgGl抗體，所以它具有在激活補(bǔ)體指導(dǎo)的細(xì)菌溶解中有效的優(yōu)勢，由此也激活免疫系統(tǒng)。因此本發(fā)明的一個目的是提供根據(jù)特異性結(jié)合幽門螺旋桿菌BabA的能力選擇的抗體Abba3，用于被動疫苗接種。使用Abba3進(jìn)行糞便樣品中幽門螺旋桿菌的抗原檢測也是本發(fā)明的一個目的。因此本發(fā)明的一個目的是提供使用本發(fā)明這里描述的方法根據(jù)其特異性結(jié)合幽門螺旋桿菌BabA的能力選擇的任何抗體。由下列公開內(nèi)容和所附權(quán)利要求，其他目的和優(yōu)點(diǎn)將更加明顯。
發(fā)明內(nèi)容病原體幽門螺旋桿菌粘附人胃粘膜需要屬于幽門螺旋桿菌外膜(HOP)蛋白家族的粘附素。較好表征的相互作用是BabA粘附素和巖藻糖基化血型ABO/Leb抗原之間的作用，所述抗原沿著胃腸道(GI)內(nèi)壁以糖綴合物表達(dá)。這里，我們描述了對BabA蛋白具有特異性的人scFv抗體片段的鑒定和選擇，尤其是競爭結(jié)合Lewisb抗原(Leb)的scFv克隆。選擇其血清被證明與BabA介導(dǎo)的細(xì)菌結(jié)合Leb具有競爭性結(jié)合活性的感染幽門螺旋桿菌患者，和從外周血單核細(xì)胞(PBLs)分離的RNA用于構(gòu)建噬菌體展示scFv文庫。從幽門螺旋桿菌純化的天然BabA粘附素用于探測文庫并鑒定到克隆(Abba3)，其完成了完全人IgGl抗體并在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。與Leb競爭性結(jié)合并結(jié)合于構(gòu)象依賴性BabA免疫表位揭示自然受體的類似結(jié)合位點(diǎn)，即ABH/Leb抗原。如Aspholm-Hurtig等在2004年描述的具有通用(ABO/Leb抗原)結(jié)合特征的幽門螺旋桿菌菌株優(yōu)先被Abba3抗體結(jié)合，提示通用對專用類型BabA在結(jié)構(gòu)和構(gòu)象上的差異。我們鑒定了通過結(jié)合BabA而中和幽門螺旋桿菌的Abba3抗體，使得該細(xì)菌難于定居在粘膜上，因此Abba3/BabA復(fù)合物從胃腸道自然消失。Abba3是一個完全人IgGl抗體，優(yōu)勢在于是非免疫原性的和同型IgGl在激活免疫效應(yīng)器功能中有效。Abba3scFv是指可變結(jié)合區(qū)，且包括其衍生物。此外，公開了使用Abba3抗體和衍生物檢測糞便樣品中幽門螺旋桿菌的檢測試劑盒。附圖簡要說明圖1顯示了各個噬粒承載克隆表達(dá)的scFv-pIII融合蛋白，在ELISA分析了其結(jié)合BabA。檢測與抗pIIImAb—起進(jìn)行。括號中的名稱給出了測序后的克隆。作為陰性對照，等同檢測相同噬粒載體中克隆的不相關(guān)抗Ph0xscFv。圖2顯示了分離的BabA-結(jié)合物推導(dǎo)的VH-(a)和VL-(b)氨基酸序列與它們的最接近人種系的V基因的序列比較。(a)與它們的種系基因相比VH鏈高數(shù)量的突變表明親和力成熟?？寺?和6的VH序列僅在FR2區(qū)域有一個氨基酸序列置換而不同于Abba3序列。破折號表示序列同一性，和點(diǎn)表示序列中的缺口。(克隆C4的VH:IgHV3-48*3IgHD-19*01，IgHJ4*02;克隆C5的VH:IgHVl-18柳l，IgHD3-10柳2，IgHJ4氺02)。Abba3-VL來自種系基因IgKVl-39*01和J-片段IgKJl*01。克隆6和克隆C5很可能源自與它們所來源的相同種系和J-片段(IgKJ4*01)相同的前體?？寺?的VL通過與IgKJl*01重組，來源于種系基因IgKV2-30-l。圖3顯示了結(jié)合幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb而不結(jié)合其中BabA基因已被敲除的相應(yīng)菌株babAlA2突變株的scFv-Abba3。用PBS系列地稀釋IMAC純化的scFv-Abba3并在包被相應(yīng)菌株的ELISA孔上孵育。使用抗myc標(biāo)記的mAb(9E10)和HRP偶聯(lián)抗鼠Ab檢側(cè)￡口口。圖4顯示了識別來自幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb溶菌液的BabA的ScFv-Abba3(泳道1)，但是BabA雙敲除菌株babAlA2溶菌液沒有見到條帶(泳道2)。甚至在粗略變性條件下，仍識別來自菌株17875/Leb溶菌液的BabA(泳道3至6)。相比之下，僅當(dāng)?shù)鞍妆贿m度處理(泳道7)和在添加硫基乙醇和熱處理(泳道8)后破壞了表位時，識別來自菌株17875/Leb的純化BabA，提示細(xì)菌溶菌液中蛋白穩(wěn)定。泳道1:非還原幽門螺旋桿菌溶菌液(5ii1菌株17875/Leb，0D1.0);泳道2:非還原菌株babAlA2，5ii10D1.0);泳道3至泳道6:粗略還原的幽門螺旋桿菌17875/Leb溶菌液(分別12yl，5yl，1yl，0.2yl，0D1.0;2.5%巰基乙醇，3%SDS和96。C加熱15分鐘)；泳道7:來自菌株17875/Leb的非還原的純化的BabA(500ng);泳道8:來自菌株17875/Leb的還原純化的BabA(500ng)。圖5顯示了與BabA-受體Leb競爭結(jié)合幽門螺旋桿菌的IgG-Abba3和scFv衍生物。幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb與恒定量的放射性標(biāo)記的HSA-Lewisb偶聯(lián)物在各種量的競爭物存在下共同孵育。相對親和力用使放射性標(biāo)記的Lewisb與幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb的結(jié)合降低至50%所需的競爭物的量來表示(參見本文)?？贵wAbba3的相對親和力顯示比scFvAbba3(247pM)高五倍(47pM)。對E1-HCV包膜蛋白具有特異性的對照抗體和對半抗原2-苯基惡唑酮具有特異性的scFv不競爭Leb結(jié)合。圖6顯示了電子顯微照片，證明幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb的BabA被Abba3-Ab染色細(xì)菌與人抗體孵育并用金標(biāo)記的A蛋白檢測結(jié)合率。抗體Abba3-Ab與幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb孵育(A，B);抗體Abba3與幽門螺旋桿菌菌株匿孵育(C)，不相關(guān)抗體(抗E1HCV包膜)與幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb孵育(D)。圖7顯示了ELISA測定的Abba3_抗體結(jié)合不同幽門螺旋桿菌臨床分離株的能力(A)。(A)ELISA中測試臨床幽門螺旋桿菌分離株的功能性BabA表達(dá)。用生物素-Leb偶聯(lián)物探測和用AP-鏈霉抗生物素蛋白檢測包被菌株。(B)使用相同的包被情況，通過用AP偶聯(lián)的抗人檢測來測試Abba3-IgGl結(jié)合?？傆?jì)79%(52株中的41株)所分析的菌株被Abba3-IgG結(jié)合。專用菌株用t標(biāo)出。圖8免疫印跡中顯示了Abba3_抗體識別來自不同的幽門螺旋桿菌臨床分離株的BabA的能力。從板上刮下幽門螺旋桿菌菌落，PBS中洗滌兩次并標(biāo)準(zhǔn)化至0D0.6。SDS溶解的培養(yǎng)提取物在37t:孵育，用SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。Abba3_IgG(6yg/ml)檢測后隨之用HRP偶聯(lián)的抗人IgG進(jìn)行檢測。顯示了兩個代表性的印跡。圖9是圖1的ELISA和Western印跡結(jié)合數(shù)據(jù)的圖解說明具有通用Lewisb結(jié)合特性的幾乎所有菌株都被Abba3抗體識別(31株中的30株)，而僅結(jié)合大約僅一半(21株中的ll株)的具有專用Lewisb結(jié)合特性的菌株。Fisher's精確檢驗(yàn)揭示具有可信值p<0.0002的統(tǒng)計(jì)顯著性。圖10是總結(jié)ELISA和免疫印跡測定Abba3抗體的結(jié)合分析的表。注意到針對不同菌株，ELISA和免疫印跡結(jié)合之間清楚的一致性。第5欄顯示了根據(jù)Aspholm-Hurtig等(4)，Leb對A-Leb結(jié)合之間的比值；值高于2.5的分為專用結(jié)合物并以粗體描述。來自(4)和本公開物所測定菌株的BabA基因序列的登錄號列在第6欄。具體實(shí)施例方式BabA血清陽性的供體的選擇測試36名感染幽門螺旋桿菌的瑞典患者的血清抑制多價連接于1251標(biāo)記的白蛋白的Leb(Leb偶聯(lián)物)與幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb細(xì)菌結(jié)合的能力。幾乎所有的患者顯示低抑制滴度(平均1:50)。然而，六個血清顯示出高滴度Leb抑制(1:355至1:8361)，使用兩個瑞典人(Sw7，Sw44)，一個秘魯人(P436)，一個阿拉斯加人(A714)，一個西班牙人(S863)，一個中國人(Chi)和一個參照菌株J99(3)進(jìn)一步測試這些對Leb結(jié)合的抑制。三個血清顯示對大多數(shù)菌株高抑制滴度(未顯示數(shù)據(jù))。V基因譜系和scFv文庫的產(chǎn)生分離抑制陽性血清的三個患者的PBLs的RNA，產(chǎn)生相應(yīng)cDNA并用于擴(kuò)增編碼抗體V區(qū)的基因。為了避免主要克隆的優(yōu)先擴(kuò)增造成的偏差，每個患者的VH和VL區(qū)與家族特異性引物分別擴(kuò)增?；旌厦總€患者的V1k即pa區(qū)并克隆入噬粒載體pSEX81(8)，產(chǎn)生三個k即paVL子庫，每個庫含有大約7X10S個單獨(dú)克隆。20個單獨(dú)克隆的測序證明完全不同。擴(kuò)增的每個患者的VH區(qū)被克隆入相應(yīng)VL-k即pa子庫，產(chǎn)生三個分離的scFv文庫，每個大約7Xl(f個單獨(dú)克隆。為了控制文庫的質(zhì)量，Western印跡使用抗pIII結(jié)構(gòu)域的mAb，分析scFv-pIII融合蛋白的全長表達(dá)(41)。由于15個單獨(dú)克隆中有6個表達(dá)scFv-pIII融合蛋白，因此估計(jì)每個庫的實(shí)際大小包含3X106個功能性克隆。特異性結(jié)合物的淘選三個文庫混合庫的噬菌體顆粒通過過度感染輔助噬菌體并經(jīng)受在BabA包被免疫管上的三次淘選循環(huán)而產(chǎn)生。為了監(jiān)測BabA特異性結(jié)合物的增加，噬菌體還要經(jīng)受在BSA包被免疫管上的選擇。如從BabA包被免疫管和僅被BSA封閉的免疫管洗脫的噬菌體比值所測定的富集因子所示，在第二輪淘選中是55，和在第三輪淘選中是2381。第三輪淘選后得到的單獨(dú)克隆表達(dá)scFv-gIII融合蛋白并用ELISA篩選BabA結(jié)合。在所分析的24個克隆中，14個顯示特異性結(jié)合BabA。圖1顯示了噬粒表達(dá)單獨(dú)克隆的篩選ELISA試驗(yàn)。序列分析顯示一個克隆流行(6x倍)相似V區(qū)的存在和組合，由此命名為Abba3(抗babA)(圖2)。MGT數(shù)據(jù)庫中Abba3-VH區(qū)的篩選揭示它是由種系基因IgHV3_48*3與D-片段IgHD2-15*01和J-片段IgHJ4*03重組產(chǎn)生的。其他代表性結(jié)合物的VH區(qū)來源于不同的B細(xì)胞前體，因?yàn)樗鼈兪怯刹煌姆N系基因或與不同D-和J-片段發(fā)生重組得到的(參見圖2)。Abba3VL鏈來源于VL種系基因IgGKVlD_39*01，與J-片段IgKJl*01重組得到。類似地，其他結(jié)合物的VL區(qū)來源于不同的B細(xì)胞前體，因?yàn)榕c不同VL和J-片段發(fā)生重組。來自第二輪淘選的噬菌體也經(jīng)固定化菌株17875/Leb淘選，用BabA配體親和洗脫，即Leb代替常規(guī)三乙胺緩沖液，產(chǎn)生Abba3克隆的唯一選擇(未顯示數(shù)據(jù))。Abba3的結(jié)合特異性主要的scFvAbba3亞克隆在原核生物表達(dá)載體上，允許用抗ciyc的單克隆抗體檢測和IMAC純化(13，14)。為了測試scFv-Abba3是否能夠識別細(xì)菌上BabA，用固定化幽門螺旋桿菌進(jìn)行ELISA結(jié)合試驗(yàn)。Abba3-scFv的系列稀釋證明結(jié)合幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb，但是不結(jié)合相應(yīng)的陰性對照菌株DM，其中功能性BabA基因(BabA2)以及非轉(zhuǎn)錄BabA基因(BabAl)已被敲除(22)(圖3)。免疫印跡分析進(jìn)一步證明Abba3-scFv的特異性，因?yàn)樗R別細(xì)菌溶菌液中預(yù)期分子量的條帶和菌株17875/Leb的純化蛋白條帶(圖4)。有趣的是，只有當(dāng)純化的BabA蛋白已在適度條件下處理時才發(fā)生特異性識別；用還原劑和加熱96t:處理破壞Abba3表位(圖4，泳道8)，類似Lewisb結(jié)合特性中所描述(22)。這與幽門螺旋桿菌17875/Leb溶菌液的BabA識別相比，在Western印跡中其甚至在粗略還原和變性條件下亦不會消除scFv的結(jié)合。這可能是由于BabA和其他穩(wěn)定蛋白質(zhì)之間形成復(fù)合物，該穩(wěn)定物質(zhì)在純化后的蛋白制劑中缺乏。細(xì)菌溶菌液中雙條帶的出現(xiàn)可能是由于不同的糖基化模式，因?yàn)槎鄠€N-糖基化位點(diǎn)(N-X-S/T)位于BabA的C-末端區(qū)。為了達(dá)到穩(wěn)定性、親合力和極易操作，使用其它地方描述的表達(dá)載體將scFv轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆薎gG(24)。Abba3抗體在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生并顯示出對ELISA板上包被的細(xì)菌不受限制的結(jié)合，且多個解凍循環(huán)時也不受損害(未顯示數(shù)據(jù))。為檢測與Lewisb的競爭性結(jié)合，系列稀釋Abba3-scFv和Abba3抗體并在恒定量放射性標(biāo)記的Lewisb存在下與幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb孵育。足以使Lewisb結(jié)合還原降至其最大值的一半的scFv和IgG抗體的濃度分別測定是0.25iiM和47pM。使用不相關(guān)scFv(抗半抗原2-苯惡唑酮)(31)或不相關(guān)同型匹配人單克隆抗體觀察到不抑制Lewisb結(jié)合，后者已經(jīng)通過重組而生產(chǎn)出來(抗HCV包膜蛋白El(23))(圖5)。電子顯微術(shù)中細(xì)菌外膜上BabA的染色可以通過Abba3-抗體與幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb孵育證明，而不是與相應(yīng)BabA敲除的菌株DM孵育。作為另外的陰性對照，與同型匹配人抗體在表達(dá)BabA的幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb上不顯示出任何染色(圖6)。抗幽門螺旋桿菌分離株的反應(yīng)性為測試Abba3免疫表位在全世界臨床幽門螺旋桿菌菌株BabA中的流行程度，我們用代表性菌株進(jìn)行全系列ELISA和免疫印跡測試。對于Abba3分析，僅僅考慮表達(dá)功能性BabA蛋白的這些幽門螺旋桿菌菌株。因此我們在ELISA結(jié)合試驗(yàn)中測試了菌株結(jié)合血型抗原的能力(圖7a)。使用相同的ELISA條件，測定相同菌株的Abba3結(jié)合(圖7b)。使用已經(jīng)根據(jù)"適度方案"處理的幽門螺旋桿菌全部細(xì)胞抽提物進(jìn)行免疫印跡分析，即無還原條件和低溫，SDS-PAGE分離之前(22)(圖8)。表1總結(jié)了所使用臨床分離株的結(jié)合特性，即Leb配體和Abba3-抗體的結(jié)合能力。此夕卜，列出了相應(yīng)babA基因的登錄號。發(fā)現(xiàn)Abba3抗體識別最好的來自幽門螺旋桿菌菌株的BabA，其結(jié)合一系列ABO/Leb抗原(被(4)定義為通用型)，而Abba3抗體識別來自專用菌株(專用型)的BabA效率較低(圖9)。大多數(shù)通用菌株(31株中的30株)被Abba3-Ab結(jié)合(日本菌株J507是例外)，而21株專用菌株中僅ll株(Sw60，Sw103，P302，P304，P308，P326，P330，P445，P449，P454，P455)被Abba3-Ab識另U。與專用型相比，Abba3抗體優(yōu)先結(jié)合通用型可能是由于抗體的partope，分別反映A-Lewis和B-Lewis血型糖抗原較龐大的Gal和GaINAc末端基團(tuán)。Abba3抗體與(Henning等，2004)描述的抗體相比，較高的結(jié)合率可能是由于受體競爭性結(jié)合特性和因此識別更保守表位。我們相信高親合力抗體的成功選擇建立在充分篩選合適的具有限定抗體結(jié)合特性的患者血清上。此外，在固定化抗原保持與其受體結(jié)合的條件下進(jìn)行噬菌體的選擇，如通過在免疫管中測定固定化BabA與生物素化Lewisb的結(jié)合進(jìn)行驗(yàn)證(未顯示數(shù)據(jù))。噬菌體展示應(yīng)用于從感染幽門螺旋桿菌患者開發(fā)和援救全部免疫系統(tǒng)(immuner印ertoire)被證明可成功選擇具有限定特性的單克隆抗體。由于供體全部來自瑞典，可能他們已經(jīng)感染了通用菌株，即使為構(gòu)建噬菌體展示文庫對抗體可變區(qū)進(jìn)行了改組，看來也足以可能進(jìn)行功能重組。既然胃腸道中免疫活性受限，那么就優(yōu)選被動的免疫形式。Abba3抗體結(jié)合BabA，防止幽門螺旋桿菌粘附于胃粘膜。偶爾當(dāng)抗體來源于動物時，由于過敏反應(yīng)，被動免疫伴發(fā)并發(fā)癥。由于Abba3抗體是人的，因此副作用風(fēng)險(xiǎn)降低了。由于胃腸道中免疫活性受限，通過檢測抗體診斷幽門螺旋桿菌感染的可能性受限。因此優(yōu)選檢測糞便樣品。預(yù)防通過粘膜部位傳播傳染性疾病的新方法包括通過乳酸桿菌或其他GRAS微生物原位遞送抗體片段(30)。因此，具有抗BabA特異性的Abba3及其片段可以用來防止幽門螺旋桿菌定居在粘膜上。此外，增長的證據(jù)提示幽門螺旋桿菌參與冠狀動脈病的發(fā)病(29)。與非人抗體相比，Abba3抗體完全是人源的，不激發(fā)免疫遺傳應(yīng)答，和IgGl型的優(yōu)點(diǎn)是有效活化補(bǔ)體指導(dǎo)的細(xì)菌溶解，由此活化免疫系統(tǒng)的效應(yīng)子功能。實(shí)施例1BabA-抗體陽性的供體的選擇測試36名感染幽門螺旋桿菌的瑞典患者血清抑制放射性標(biāo)記的Lewisb-HSA偶聯(lián)物與幽門螺旋桿菌菌株CCUG17875結(jié)合(17875/Leb)的能力。為更容易回收沉淀，用已經(jīng)失去結(jié)合Leb能力的菌株17874以1:60稀釋0D0.1的菌株17875/Leb。血清系列稀釋以封閉緩沖液(PBS0.05%Tween20，1%BSA)稀釋，并添加50y1放射性標(biāo)記的Lewisb-HSA偶聯(lián)物(0.Olng/y1)至終體積500。添加500y1細(xì)菌后，管在RT(室溫)輕柔混合17小時。樣品離心(13000g，13分鐘)，隨后測定沉淀和上清的放射性并彼此建立關(guān)聯(lián)，表示結(jié)合的和游離的偶聯(lián)物。測試血清的相對滴度是通過缺乏任何血清時由偶聯(lián)物結(jié)合測定的足以使結(jié)合降至最大值一半的濃度。進(jìn)一步測試滴度最高的六個血清對放射性標(biāo)記Lewisb-抗原與七個幽門螺旋桿菌臨床分離株(Sw7，Sw44，P436，A714，S863，Chi(本文描述)和J99(3))結(jié)合的抑制。實(shí)施例2.人可變區(qū)的cDNA合成和PCR擴(kuò)增Ficoll梯度從10ml患者血液分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，并使用標(biāo)準(zhǔn)方案提取總RNA(Qiagen，Hilden，德國)。用寡d(T)弓|物(AmershamBiosciences,Buckingham,英國)合成第一條cDNA鏈，和在50iU反應(yīng)中PCR擴(kuò)增人可變免疫球蛋白基因，反應(yīng)中包含lylcDNA、200iiMdNTPs、5ii110X反應(yīng)緩沖液、1U聚合酶(BD-Advantage2，BDBiosciencesClontech，PaloAlto，CA)和適當(dāng)?shù)幕诩易宓恼x和反義引物(500nM)，36個循環(huán)(94t:變性15秒，65t:退火30秒，72t:30秒)。正義和反義引物在其它地方已經(jīng)描述過(31,42)。對于可變k即pa輕鏈擴(kuò)增，為了引入MIuI克隆位點(diǎn)，正義引物在5'末端延長序列TACAGGATCCACGCGTA(SEQIDNO:1)和為了引入NotI位點(diǎn)，反義引物延長序列TGACAAGCTTGCGGCCGCG(SEQIDNO:2);對于可變重鏈擴(kuò)增，正義引物延長序列GAATAGGCCATGGCG(NcoI)(SEQIDNO:3)和反義引物延長序列CAGTCAAGCTT(HindIII位點(diǎn))(SEQIDNO.4)。反義引物分別在CHI和恒定K即pa區(qū)5'末端退火。全部擴(kuò)增用每個家族特異性正義引物單獨(dú)進(jìn)行?；旌螾CR產(chǎn)物，凝膠提取(Qiagen)，對于可變輕鏈，用MIuI/NotI(NewEnglandBiolabs)消化，和對于可變重鏈的克隆，用NcoI/HindIII消化。消化后，再次凝膠純化片段并保存在-20°C。實(shí)施例3.scFv文庫的構(gòu)建在CIP存在時，用MIuI/NotI消化噬粒載體pSEX81-ph0x(8)并在0.7%瓊脂糖凝膠中分離和提取(Qiagen，德國)。lOOng消化的載體與lOng純化的可變輕鏈16。C連接過夜，連接終體積為40ii1，其中含1U連接酶(Roche)。乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，在大腸桿菌菌株XLl-blue(Stratagene)中電穿孔，細(xì)菌在lmlS0Cmedia(含0.1M葡萄糖的LB)中生長lh以容許其恢復(fù)。隨后將細(xì)菌鋪在SOBGAT板(0.1M葡萄糖、100yg/ml氨芐青霉素、12.5yg/ml四環(huán)素)上，并37t:孵育過夜。刮下克隆并用陰離子交換層析柱(Macherey&Nagel，德國)分離載體DNA。對于可變重鏈的克隆，用HindIII/NcoI(NewEnglandBiolabs)消化載體DNA，與適當(dāng)消化的VH鏈連接，轉(zhuǎn)入XL-Iblue并如上所述生長。刮下單獨(dú)的克隆并8(TC保存在25%甘油中，提供了最后的scFv文庫。實(shí)施例4.噬菌體展示選擇從基本上如Schier等1996年(39)描述的文庫搜篩噬菌體聯(lián)合抗體。在用5yg純化BabA(D印artmentofOralBiology,UmeaUniversity,瑞典)4。C包被過夜并用2%MPBS(含2X(w/v)的PBS)低脂脫脂奶粉封閉的Maxisorb免疫管(Nunc,Wiebaden，德國)中進(jìn)行淘選。包被BSA的管用作陰性對照。對于選擇，添加等體積含4%乳劑(w/v)的PBS封閉噬菌體(1012菌落形成單位)，添加到管中并在恒定滾動下室溫(RT)孵育2小時。隨后丟棄溶液，和在第一輪淘選中，用PBS洗滌管10次。隨著淘選循環(huán)的進(jìn)展，增加洗滌嚴(yán)格性，用PBS/0.1%Tween20旋轉(zhuǎn)10次。結(jié)合的噬菌體通過添加1ml三乙胺(0.1M)輕柔攪拌，洗脫5分鐘，并用0.5mlTris-HCl，pH7.4(1M)中和。使用中和混合物37。C感染20ml2YT(12.5yg/ml四環(huán)素)中生長的指數(shù)期大腸桿菌XLl-blue。37°C不搖動孵育15分鐘后，將細(xì)菌搖動45分鐘，鋪在SOBGAT板(參見上面)上，并37。C孵育過夜。如所述收獲細(xì)菌，接種在10mlLB-培養(yǎng)基(氨芐青霉素100g/ml，0.IM葡萄糖)，0D0.4，生產(chǎn)用于隨后淘選循環(huán)的噬菌體。洗脫的含輔助噬菌體或噬?；蚪M的噬菌體滴度分別通過在LB-卡那霉素(70iig/ml)或LB氨節(jié)青霉素(100yg/ml)板上的cfu滴定來測定，基本上如Koch等2000年(28)的描述。選擇步驟過程中，特異性結(jié)合物的富集用從包被BabA的免疫管洗脫的噬菌體數(shù)量除以從BSA包被的免疫管洗脫的噬菌體數(shù)量來確定。實(shí)施例5.用scFv-gIII融合蛋白進(jìn)行EL1SA篩選利用在噬粒載體中編碼的表達(dá)pIII的蛋白，改進(jìn)但基本上如Mersma皿等1998年(32)的描述，篩選BabA特異性scFvs。簡言之，IPTG(100yM)30。C誘導(dǎo)16小時，誘導(dǎo)對數(shù)生長細(xì)菌產(chǎn)生scFv-glII融合蛋白。將細(xì)菌離心，和將沉淀在球芽溶液(50mMTris-HClpH8.0，20%蔗糖，1慮EDTA)中冰上孵育20分鐘，隨后20000g，4。C離心45分鐘。用相同體積的4%MPBS稀釋代表周質(zhì)提取物的上清，并用于ELISA試驗(yàn)。用200ngBabA在包被緩沖液(Na2C03-NaHC03pH9.6)中4。C過夜包被ELISA孔(NuncMicrotitreplates，德國)。2%MPBS封閉后，添加周質(zhì)提取物并室溫孵育4小時。結(jié)合抗原的scFv-pIII的融合蛋白的檢測通過如下方法，與pIII特異性的鼠單克隆抗體(41);MobiTec，德國)室溫孵育l小時，隨后與辣根過氧化酶偶聯(lián)兔抗鼠抗體(Dako，丹麥)室溫孵育1小時。在底物緩沖液(lOOmM醋酸鈉/檸檬酸pH4.9/H2020.004%)中使用TMB-(3，3'，5，5'-三甲苯，Merck，德國)來完成著色。作為陰性結(jié)合對照，在相同噬粒載體中表達(dá)2-苯惡唑酮(抗ph0x)(31)scFv，和使用包被ph0x偶聯(lián)的BSA的ELISA分析這個scFv的表達(dá)。實(shí)施例6.亞克隆入原核生物表達(dá)載體p0PE101將來自噬粒載體pSEX81的全部scFv表達(dá)盒在NcoI和NotI位點(diǎn)亞克隆入原核生物表達(dá)載體p0PE101(Genbank#Y14585)。(該克隆名為p0PE101-Abba3并根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)，德國Braunschweig。其收到保藏號DSM19101和2007年2月28日保藏)。myc-C-末端和(His)6-標(biāo)記分別允許檢測和IMAC純化。如Breitling等2001年(9)描述的從周質(zhì)間隙進(jìn)行純化。實(shí)施例7免疫印跡為了控制scFv文庫的質(zhì)量，將從IPTG誘導(dǎo)的單克隆細(xì)菌中提取的10iU周質(zhì)提取物在12%SDSNuPageBis-Tris凝膠(Invitrogen，CA)上進(jìn)行分離。分離的蛋白轉(zhuǎn)移到I,bilonPVDF膜(Millipore，Bredford，MA)，用2%MPBS(含2%低脂脫脂奶粉的PBS)封閉并用抗gIIImAb(MobiTec，GSttingen，德國)，隨后的AP偶聯(lián)兔抗鼠(Fab)2Ab(Sigma-Aldrich，德國)和底物進(jìn)行顯影。對于功能性結(jié)合分析，BabA或可變量幽門螺旋桿菌細(xì)菌，于PBS中重懸并校準(zhǔn)至OD0.6，溶解于一體積SDS-樣品緩沖液(62mMTris-HClpH6.8，25%甘油，2%SDS，溴酚藍(lán))并加熱至37。C10分鐘(根據(jù)liver等1998年)或重懸于含巰基乙醇(5%)(或另外3XSDS)的l體積SDS-樣品緩沖液并加熱至96t:。樣品進(jìn)行SDS-PAGE，分離蛋白轉(zhuǎn)移到Hybond-ECL硝酸纖維素膜(AmershamBiosciences)上。用2%M-PBS封閉膜并添加IMAC純化的scFv-Abba3(PBS稀釋)或Abba3_Ab(在T-PBS0.05X中含6iig/ml)4t:過夜。結(jié)合的scFv的檢測通過將膜與生物素化的鼠抗mycmAb9E10孵育，隨后與鏈霉抗生物素-HRP-偶聯(lián)物孵育來進(jìn)行。結(jié)合的Abba3抗體通過與T-PBS0.05%以1:3000稀釋的HRP偶聯(lián)抗人IgGAb(Dako，丹麥)孵育來檢測。每個抗體孵育步驟后，膜用T-PBSO.05%洗滌4次。用ECL加Western印跡檢測系統(tǒng)試劑盒(AmershamBiosciences)根據(jù)廠家規(guī)程進(jìn)行顯影。實(shí)施例8.完全人抗體的生產(chǎn)可變區(qū)克隆入分別攜帶人IgGl重鏈和人k即pa鏈的恒定區(qū)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pMThlgGl-V(24)。PCR擴(kuò)增使用VL鏈的引物:VL5'Sfil，TTACTCGCCTGGCCGTCGTGGCCTTTGTTGGCCTCTCGCTGGGCGACATCCAGATGACCCAGTC(SEQIDNO:5);VL3'BsiWI，AGCGTACGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC(SEQIDNO:6);和VH鏈的引物VH5'SnaBI，GATGTCTACGTAGGCCTCTCGCTGGGCCAGGTGCAGCTGGTCCAGTC(SEQIDNO:7);VH3'Apal，ACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCGGAGGAGACGGCGACCAGGG(SEQIDNO:8);PCR擴(kuò)增使用lOOng噬粒載體作為模板，各自的VL和VH引物對每種25pmol，2iiMMgCl2，0.2mMdNTP和lOUTaq聚合酶(Promega)。94°C2分鐘初次變性步驟后，進(jìn)行如下32個循環(huán)94。C15秒，62。C30秒，72。C30秒；最后一次延伸步驟72°C5分鐘。PCR產(chǎn)物用QiagenPCR純化試劑盒(Hilden，德國)純化，并在克隆前用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化。如以前所述構(gòu)建穩(wěn)定的分泌抗體的S2細(xì)胞系(Invitrogen，美國)，使用G蛋白柱(AmershamPharmacia,Uppsala，瑞典)純化培養(yǎng)基中的抗體并富集。分別用考馬斯染色和ELISA分析所純化抗體的純度和功能。實(shí)施例9.表達(dá)抗體片段的乳酸桿菌的生產(chǎn)使用引物通過PCR擴(kuò)增來源于Abba3抗體可變區(qū)(VH和VL)的scFv編碼基因5'Clal-ABBA3(TTTGCATCGATCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTG)(SEQIDN0:9)作為正義引物和Vk-mycXhoITTCCACCTTGGT)(SEQIDNO;10);或Vk-myc-STOP-XhoITGATTTCCACCTTGGT)(SEQIDNO:ll)作為反義引物，用于分別克隆入載體pLP502-l禾口pLP502-2。這個穿梭載體允許在大腸桿菌中的克隆和繁殖和在乳酸桿菌中表達(dá)，因?yàn)樗鼈儼竽c桿菌和乳酸桿菌兩者的復(fù)制起點(diǎn)和它們的克隆位點(diǎn)上游的乳酸桿菌特異性調(diào)節(jié)序列和啟動子。在載體pLP502-l中，scFv表達(dá)盒以和乳酸桿菌膜-蛋白基因prtp融合的形式克隆，該基因調(diào)節(jié)scFv盒在細(xì)胞表面的表達(dá)。載體pLP502-2允許scFv分泌到細(xì)菌細(xì)胞外部，因?yàn)閟cFv序列后存在終止信號。通過干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，ATCC293)轉(zhuǎn)化菌株的免疫印跡或可溶ELISA試驗(yàn)分析ScFv表達(dá)，使用用于檢測的抗共表達(dá)myc-標(biāo)記和AP-偶聯(lián)抗鼠抗體的單克隆抗體。實(shí)施例10.使用改良乳酸桿菌生產(chǎn)口服疫苗和口服疫苗的用途改良的實(shí)施例9的乳酸桿菌菌株如工業(yè)中所知生長、收獲和冷凍干燥，然后以每克至少104至1(fCFU范圍的量裝入標(biāo)準(zhǔn)硬凝膠膠囊。已知感染幽門螺旋桿菌的一組患者給予這種膠囊一周。這段時間之后，使用標(biāo)準(zhǔn)方法或本文描述的方法再次分析患者的幽門螺旋桿菌感染，表明在幾名患者中，感染已經(jīng)被消除或減輕。實(shí)施例11.幽門螺旋桿菌菌株的ELISA結(jié)合測試抗體-Abba3結(jié)合幽門螺旋桿菌臨床分離株的能力。菌株在補(bǔ)充10%牛血和l%IsoVitox(SvenskaLABFAB，Ljusne，瑞典)的布魯氏桿菌瓊脂培養(yǎng)基上，37°C，10%C02和5%02生長4045小時。刮下細(xì)菌并通過懸于PBS洗滌兩次，4000g離心和將沉淀重懸于PBS。光密度調(diào)至0D600nm0.6，和使用100ii1包被96孔MaxisorbELISA板(Nunc,丹麥)的每個孔。4t:過夜孵育后，用2XM-PBS封閉板，添加T-PBS(PBS0.05%Tween20)稀釋的抗體4t:過夜?？贵w的檢測如下進(jìn)行AP偶聯(lián)抗人IgG(Dako，丹麥)室溫孵育l小時，隨后添加lmg/ml的4-磷酸硝基苯(Sigma-Aldrich，德國)。顯色40分鐘后，讀取405nm處的吸光度。對于Lewis-b結(jié)合試驗(yàn)，向幽門螺旋桿菌包被的ELISA板的孔中添加生物素化HSALewis-b糖綴合物(Isos印.Tullinge，瑞典)(0.115iig/ml，4。C過夜)。通過與1:2000稀釋的AP偶聯(lián)鏈霉抗生物素室溫孵育45分鐘來檢測結(jié)合的糖綴合物。T-PBS0.05%洗滌孔4次，添加lmg/ml4-磷酸硝基苯(Sigma-Aldrich，德國)10分鐘后，隨之測定405nm處的吸光度。實(shí)施例12.BabA的核苷酸序列分析菌株如上所述生長，從板上刮下菌落并洗滌，重懸于PBS至光密度OD1。使用一毫升這種懸液根據(jù)廠家指導(dǎo)(Qiagen，德國)分離基因組DNA。PCR擴(kuò)增覆蓋第一個核苷酸大約核苷酸1200的BabA片段，使用4iU基因組細(xì)菌DNA作為模板和正向弓|物babA2-271(4)(5'-ATCCAAAAAGGAGAAAAAACATGAAA-3')(SEQIDN0:12)/babA2-Leader(5'-GCTTTTAGTTTCCACTTTGAG-3')(SEQIDN0:13)兩者之一與反向引物Jl1R(5'-TGTGTGCCACTAGTGCCAGC-3，)(SEQIDNO:14)或A26R(5'-TTGCTCCACATAGGCGCA-3')(SEQIDNO:15)之一的組合。PCR片段連入T-載體并用T7和SP6啟動子特異性引物測序。實(shí)施例13.測序和DNA分析用Sanger的雙脫氧鏈終止法測定核苷酸序列，使用BigDye終止循環(huán)測序試劑盒(BigDyeTerminatorCycleSequencingkit,AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)或使用麗G-BiotechAG，Ebersberg，德國的服務(wù)。使用網(wǎng)址http:〃imgt.cines.fr確定人V-D-J片段的IgG-種系序列。用載體NTI10程序(Invitrogen，CA)進(jìn)行裝配和序列分析。實(shí)施例14.預(yù)先免疫電子顯微術(shù)(Pre-immunoelectronmicroscopy,p—iEM)幽門螺旋桿菌菌株17875/Leb和DM(BabA2和BabA雙敲除)如上所述生長，從板上刮下并重懸和在PBS中校準(zhǔn)至0D600nm1。將等分每個菌株重懸于含2%牛血清白蛋白(BSAV片段)的O.1M二甲次胂酸鈉緩沖液(caco)中15分鐘。然后將細(xì)菌離心并重懸于初級人抗體Abba3或不相關(guān)的相同同工型的人抗丙型肝炎病毒抗體(HCV)，稀釋(1+1)于0.1Mcaco+0.1%BSA并孵育60分鐘。孵育后，細(xì)菌在O.1Mcaco+0.1XBSA中洗滌兩次并重懸于含有與10nm金顆粒偶聯(lián)的A蛋白(Amersham，英國)的相同緩沖液中并孵育45分鐘。添加戊二醛至終濃度1%終止孵育。4t:固定樣品過夜。隨后細(xì)菌離心成球丸并包埋進(jìn)行其它地方(17)描述的常規(guī)電子顯微鏡檢查并在TecnaiIO透射電子顯微鏡(Fei，荷蘭)中80kV檢查，和用MegaviewIII照相機(jī)(AnalySiS，Miinster，德國)收集數(shù)字圖像。實(shí)施例15.直接免疫電子顯微術(shù)(d-iEM)包埋前，取小份的球丸并將其重懸于蒸餾水中。小滴(3iU)置于聚醋酸甲基乙烯脂涂布的柵格并允許貼附5分鐘。用濾紙除去過量水，柵格空氣干燥5分鐘，并用Tecnai10電子顯微鏡，100kV檢查，和攝影膠片記錄圖像。實(shí)施例16.檢測幽門螺旋桿菌或BabA的用于體外診斷用途的免疫測定對于體外診斷用途，Abba3可以用于酶免疫測定定量測定大便樣品中毒力因子之一的幽門螺旋桿菌或BabA。對于該測試，用夾心法用特異性抗體捕獲幽門螺旋桿菌將多克隆抗螺旋桿菌血清固定于微孔板的孔中，在本領(lǐng)域已知的封閉和PBS洗滌步驟后，移液管移取待檢測的大便樣品懸液和對照在環(huán)境溫度下進(jìn)行孵育。向微孔板中添加酶(例如過氧化物酶)偶聯(lián)Abba3抗體在室溫下檢測結(jié)合的細(xì)菌，隨后是進(jìn)一步的洗滌步驟和添加底物時顏色形成。消光與樣品中存在的幽門螺旋桿菌濃度成正比。實(shí)施例17檢測試劑盒的制備使用免疫測定技術(shù)的試劑盒，其依賴于抗原和相應(yīng)抗體例如Abba3之間的特異性結(jié)合，已經(jīng)被證明是測定樣品中存在(或缺乏)病原體的可靠方法。在本例中，是糞便樣品中的幽門螺旋桿菌?！愌b置，被認(rèn)為是免疫層析檢測(ICT)裝置，使用免疫測定技術(shù)和與抗體偶聯(lián)的標(biāo)記相結(jié)合，現(xiàn)在常常用于快速、可靠現(xiàn)場檢測確定特定分析物的存在或缺乏。該標(biāo)記與抗體/抗原分子連接時，然后一起積聚在特定限制區(qū)域內(nèi)，根據(jù)所用標(biāo)記的類型，變得人裸眼或用掃描裝置容易檢測到。通常，標(biāo)記可以是乳液、金或碳的顆粒，放射性顆粒，磁粉，或具有允許其被固定或吸引至某限定區(qū)域的其他物理或化學(xué)特性。使用夾心技術(shù)的ICT裝置尤其易于使用。利用這個技術(shù)，結(jié)合待檢測的特異性抗原的標(biāo)記抗體混雜在懷疑包含特異性抗原的樣品中。如果樣品中存在抗原，標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合而形成標(biāo)記_抗體_抗原復(fù)合物。穩(wěn)定固定在檢測區(qū)并且也與特異性抗原結(jié)合的二抗在檢測區(qū)與標(biāo)記_抗體_抗原復(fù)合物結(jié)合。標(biāo)記在檢測區(qū)蓄積使得可見到陽性結(jié)果。這種裝置是標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品，容易獲得，經(jīng)濟(jì)，并且非專業(yè)人員可以使用。實(shí)施例18AbbaVH和AbbaVL的序列在此附上的是序列表，顯示了AbbaVH(SEQIDNO:16)和AbbaVL(SEQIDNO:17)的核苷酸序歹!J，和AbbaVH(SEQIDNO:18)和AbbaVL(SEQIDNO:19)的氨基酸序列。參考文獻(xiàn)1.Achtman，M.，T.Az麗，D.E.Berg，Y.Ito，G.Morelli，Z.J.Pan,S.Suerba咖，S.A.Thompson,A.vanderEnde，andLJ.vanDoom.1999.RecombinationandclonalgroupingswithinHelicobacterpylorifromdifferentgeogr即hicalregions.MolMicrobiol32:459_470.2.Alm，R.A.，J.Bina，B.M.Andrews,P.Doig，R.E.Hancock,andT.J.Trust.2000.ComparativegenomicsofHelicobacterpylori-analysisoftheoutermembraneproteinfamilies.InfectImm皿68:4155—4168.3.Alm，R.A.，L.S.Ling，D.T.Moir，B.L.King,E.D.Brown，P.C.Doig，D.R.Smith,B.Noonan，B.C.Guild,B.L.dejonge，G.Carmel，P.J.Tummino，A.Caruso，M.Uria-Nickelsen，D.M.Mills,C.Ives，R.Gibson,D.Merberg，S.D.Mills,Q.Jiang，D.E.Taylor,G.F.Vovis，andT.J.Trust.1999.Genomic—sequencecomparisonoftwounrelatedisolatesofthehumangastricpathogenHelicobacterpylori.Nature397:176-180.4.Aspholm-Hurtig，M.，G.Dailide，M.Lahma皿，A.Kalia，D.liver，N.Roche，S.Vikstrom，R.Sjostrom，S.Linden,A.Backstrom，C.Lundberg，A.Arnqvist，J.Mahdavi，U.J.Nilsson，B.Velapatino，R.H.Gilman，M.Gerhard,T.Alarcon，M.Lopez_Brea，T.Nakazawa，J.G.Fox，P.Correa，M.G.Dominguez_Bello，G.I.Perez-Perez，M.J.Blaser，S.Normark，I.Carlstedt，S.0scarson，S.Teneberg，D.E.Berg，andT.Boren.2004.FunctionaladaptationofBabA，theH.pyloriABObloodgroupantigenbindingadhesin.Science305:519_522.5.Backstrom，A.，C.Lundberg，D.Kersulyte，D.E.Berg，T.Boren，andA.Arnqvist.2004.MetastabilityofHelicobacterpyloribabadhesingenesanddynamicsinLewisbantigenbinding.ProcNatlAcadSciUSA101:16923—16928.6.Blaser，M.J.，andD.E.Berg.2001.Helicobacterpylorigeneticdiversityandriskofhumandisease.JClinInvest107:767_773.7.Boren，T.，P.Falk，K.A.Roth，G.Larson,andS.Normark.1993.AttachmentofHelicobacterpyloritohumangastricepitheliummediatedbybloodgroupantigens.Science262:1892-1895.8.Breitling，F(xiàn).，S.Dubel，T.Seehaus，I.Klewinghaus,andM.Little.1991.Asurfaceexpressionvectorforantibodyscreening.Gene104:147—153.9.Breitling,F.，Moosmayer，D.，Brocks，B.，Dubel，S.2001.ConstuctionofscFvfromhybridomabytwo—stepcloning.AntibodyEngineeringISDN3_540_41354—5:41-55.10.Cao，J.，Y.Sun，T.Berglindh，B.Mellgard，Z.Li，B.Mardh，andS.Mardh.2000.Helicobacterpylori—antigen—bindingfragmentsexpressedonthefilamentousMl3phagepreventbacterialgrowth.BiochimBiophysActa1474:107—113.11.Casswall，T.H.，H.0.Nilsson，L.Bjorck，S.Sjostedt，L.Xu，C.K.Nord，T.Boren，T.Wadstrom，andL.Hammarstrom.2002.Bovineanti_Helicobacterpyloriantibodiesfororalimmunotherapy.ScandJGastroenterol37:1380—1385.12.Colbeck，J.C，L.M.Hansen,J.M.Fong，andJ.V.Solnick.2006.GenotypicprofileoftheoutermembraneproteinsBabAandBabBinclinicalisolatesofHelicobacterpylori.InfectImm皿74:4375—4378.13.Dubel，S.，F(xiàn).Breitling,P.Fuchs，M.Braunagel，I.Klewinghaus,andM.Little.1993.Afamilyofvectorsforsurfacedisplayandproductionofantibodies.Genel28:97-101.14.Dubel，S.，F(xiàn).Breitling,I.Klewinghaus,andM.Little.1992.RegulatedsecretionandpurificationofrecombinantantibodiesinE.coli.CellBiophys21:69-79.15.Falush，D.，C.Kraft，N.S.Taylor,P.Correa，J.G.Fox，M.Achtman，andS.Suerbaum.2001.Recombinationandmutationduringlong—termgastriccolonizationbyHelicobacterpylori-estimatesofclockrates,recombinationsize,andminimalage.P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