專利名稱：以脲酶為基礎(chǔ)的抗螺桿菌感染的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物(包括人)的胃感染，更具體說來，本發(fā)明涉及適用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物(包括人)的螺桿菌(Helicobacter)感染的疫苗、以及涉及罹患胃感染(例如慢性胃炎或消化道潰瘍)的人的治療方法和預(yù)防胃癌。
人胃上皮的螺桿菌(Helicobacter)感染引起胃炎是發(fā)展成消化道潰瘍和胃淋巴痛的主要因素，并可能是發(fā)展成胃癌的危險(xiǎn)因素[1-3]。最常見的感染因子是幽門螺桿菌(HelicobacterPylori)，而由Helicobacterheilmanii引起的機(jī)率要小得多。幽門螺桿菌(H.Pylori)是一種細(xì)長S形革蘭氏陰性微生物，它一般可從組織學(xué)上顯示胃炎或消化道潰瘍的成人和兒童的胃活組織檢查中收集到。從對人類自愿受試者，患潰瘍和胃癌的病人，限菌豬，以及無病菌嚙齒動(dòng)物的研究，可找到幽門螺桿菌(H.Pylori)和胃十二指腸病之間相關(guān)的證據(jù)。關(guān)于病原學(xué)，通過先前未感染的個(gè)體，隨后消耗存活的微生物來從組織學(xué)確信罹患胃炎[4-11]，并通過治療根除幽門螺桿菌(H.Pylori)隨之胃炎消除，并且患消化道潰瘍的病人復(fù)發(fā)率降低[12]這些事實(shí)，證明Koch的假設(shè)是令人滿意的。
盡管對許多抗生素在體外是敏感的，而以抗生素于體內(nèi)根除出現(xiàn)的幽門螺桿菌(H.Pylori)感染卻是通常難以成功的[13]。該微生物發(fā)現(xiàn)在覆蓋于胃表皮的粘膜層中及胃窩中。即使以高劑量口服抗生素，這些位置也沒有顯示出達(dá)到所估計(jì)的足夠的抗生素水平。最近，很多權(quán)威推薦所謂“三倍治療法”，即將鉍鹽與諸如四環(huán)素和甲硝達(dá)唑等藥物結(jié)合使用2-4星期。然而該方法或其它化療制均不容樂觀，而且該治療法可能產(chǎn)生嚴(yán)重不良藥物反應(yīng)。
目前為止很少了解有關(guān)胃中粘膜免疫體系的作用。在正常胃竇中免疫球蛋白(Ig)產(chǎn)生細(xì)胞的分布表明，IgA漿細(xì)胞占總漿細(xì)胞群體的80%。此外，存在于胃竇中的漿IgA細(xì)胞數(shù)與其它粘膜差不多[14、15]。許多以人[16]和動(dòng)物模式[8.10]進(jìn)行的研究證明了，在血清和在對螺桿菌(Helicobacter)感染應(yīng)答胃分泌物中，特異性IgG和IgA應(yīng)答。然而所觀察結(jié)果是幽門螺桿菌(H.Pylori)盡管誘導(dǎo)出局部和全身免疫反應(yīng)，但由于它是多年慢性感染，因此并不能促進(jìn)免疫策略的進(jìn)展。
Lee等人曾報(bào)導(dǎo)過，能以Helicobacterfelis(一種與幽門螺桿菌密切相關(guān)的細(xì)胞)感染無菌嚙齒動(dòng)物，并反復(fù)地記載患組織學(xué)胃炎[9.10]。自此，該細(xì)菌-宿主配對，對于研究螺桿菌介導(dǎo)的胃炎及其引發(fā)因子[17]，作為一種良好的模式而被采用。Czinn等人證明，用幽門螺桿菌的粗溶菌液加上霍亂毒素佐劑反復(fù)口服接種，可在鼠和白鼬體內(nèi)誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的胃腸道IgA抗H.Pylori反應(yīng)[13]。此外，Chen等人及Czinn等人最近報(bào)道，用H.felis粗溶菌液口服接種，在鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出抗H.felis感染的保護(hù)作用[21.22]。然而能誘導(dǎo)該保護(hù)作用的抗原(一種或多種)的確切性質(zhì)尚未被測定出，也沒有信息表明，誘導(dǎo)抗該病原體保護(hù)作用的H.felis保護(hù)抗原，將誘導(dǎo)出擴(kuò)大到其它螺桿菌種的交叉反應(yīng)保護(hù)作用。
我們首先證明了，用幽門螺桿菌或H.felis聲處理物給鼠口服接種后，通過獲得單克隆抗體幽門螺桿菌和H.felis共享抗原決定基，并且表明，抗幽門螺桿菌的這些抗體的某些，能與H.felis交叉反應(yīng)，反之亦然[24;25]。這些交叉反應(yīng)的基礎(chǔ)是未知的。
根據(jù)不同已知脲酶氨基酸序列之間存在的同源性，有人已建議可用脲酶作為抗幽門螺桿菌的疫苗[26]。然而盡管不同脲酶序列中有同源性，但交叉反應(yīng)卻并不是普遍規(guī)律。Guo和Liu幾年前證明Proteusmirabilis.Proteusvulgaris及Providenciarettgeri脲酶表現(xiàn)出相互有交叉反應(yīng)性，而刀豆(jackbean)和Morganellamorganii脲酶則在免疫學(xué)上有別于前三種脲酶[23]。即使幽門螺桿菌脲酶與其它螺桿菌脲酶的抗原交叉反應(yīng)是一種合理的假設(shè)，但是，直到我們證明某些H.felis單克隆抗體與幽門螺桿菌脲酶交叉反應(yīng)[25]為止，并沒有資料證明這確實(shí)是事實(shí)。J.Pappo進(jìn)一步證明，受H.felis感染的鼠產(chǎn)生與幽門螺桿菌脲酶交叉反應(yīng)，但不與刀豆脲酶交叉反應(yīng)的抗體。(J.Pappo，未發(fā)表的資料，1993)。
以前A.Labigne在EPO367，644[28]中已建議過用幽門螺桿菌脲酶或相關(guān)脲酶作為抗幽門螺桿菌感染的疫苗。然而，該申請并不包括以脲酶接種任何哺乳動(dòng)物抗任何螺桿菌感染的內(nèi)容。
而且，雖然與其它細(xì)菌脲酶的序列同源性可以支持使用脲酶作為抗幽門螺桿菌感染的疫苗候選物，但人類對幽門螺桿菌感染的現(xiàn)代知識卻肯定不支持這種觀點(diǎn)。第一，盡管事實(shí)是受感染的個(gè)體通常保持對脲酶很強(qiáng)的抗體反應(yīng)，但抗脲酶免疫反應(yīng)并不能導(dǎo)致消除或控制感染。第二、幽門螺桿菌能將脲酶轉(zhuǎn)移出細(xì)胞并從其表面脫落[19、20]，這樣脲酶可能不再代表為促進(jìn)保護(hù)粘膜免疫反應(yīng)的適當(dāng)?shù)陌?。事?shí)上，應(yīng)考慮粘膜免疫保護(hù)作用是主要由分泌的IgA介導(dǎo)的，當(dāng)識別抗原可由靶病原體排泄出并由此作為保護(hù)抗體的誘導(dǎo)物時(shí)，其粘結(jié)活性將受到損害。第三，在培養(yǎng)物中，脲酶看來對表皮細(xì)胞是有毒的，并被懷疑對粘膜破壞及體內(nèi)消化潰瘍起作用。因此將它作為抗原使用是有毒的。
然而，我們推論，假如滿足下列條件，那么該抗原可能是一種有潛力的有效疫苗第一，我們以口服足夠高劑量給藥，以造成比天然出現(xiàn)的免疫反應(yīng)較強(qiáng)的免疫反應(yīng);
第二，產(chǎn)生的抗體量高到足以粘連所有脲酶、脫落或不脫落;
第三，我們可使用脲酶亞單元或無毒的分子品種。
總之，目前仍存在著需要有效治療及預(yù)防在人類中幽門螺桿菌誘導(dǎo)胃感染的方法。現(xiàn)有的資料表明生產(chǎn)抗該感染的疫苗的可能性，但并沒有提供可加入到安全和有效的疫苗中的限定的抗原(對所有幽門螺桿菌菌株共同的)的清楚鑒定結(jié)果。
本發(fā)明中，我們鑒定了作為候選疫苗的幽門螺桿菌脲酶抗原，并在動(dòng)物模式中證明了它的效力。這些結(jié)果以過去記載的天然的螺桿菌感染的觀點(diǎn)來看是出乎予料的。
我們發(fā)現(xiàn)，利用顯示于螺桿菌組織表面上或周圍的脲酶抗原決定簇，并以之作為疫苗靶子，可以在易受胃腸道螺桿菌感染的哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫性。該免疫性可由天然脲酶免疫作用誘導(dǎo)，但也可由作為酶促失活(因此是無毒的)形式產(chǎn)生的重組脲酶亞單位誘導(dǎo)出。本發(fā)明通過對哺乳動(dòng)物粘膜表面施用一種多氨基酸制劑來提供誘導(dǎo)對螺桿菌感染的免疫作用的方法，該制劑即肽和/或蛋白與適當(dāng)佐劑的混合物。該多氨基酸制劑存在多種抗原決定簇，它們以正感染的螺桿菌機(jī)體的內(nèi)源脲酶為特征及表現(xiàn)形式。該多氨基酸制劑施藥方式可以口服途徑進(jìn)行。
該制劑的活性成份可包含天然或生物合成的抗原決定簇，可以制成各種形狀。可能的制劑的非包羅完全的名單包括提純的天然或重組產(chǎn)生的細(xì)菌或其它來源的脲酶制劑，脲酶消化物，含脲酶抗原決定簇的融合蛋白，脲酶的截短形式或與脲酶氨基酸序列同源的肽。因?yàn)槊庖咝缘陌l(fā)展取決于與感染螺桿菌機(jī)體相結(jié)合的體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)作用，優(yōu)選的制劑是那些十分準(zhǔn)確復(fù)制感染機(jī)體內(nèi)源的脲酶抗原決定簇的制劑。例如，顯示幽門螺桿菌脲酶抗原決定簇的制劑，對于施用于易受幽門螺桿菌感染的人是優(yōu)選的，而顯示H.heilmanii脲酶抗原決定簇的制劑，施用于易受H.heilmanii感染的人是優(yōu)選的。然而，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)重要方面，已公開來自其它品種的脲酶也可使用。例如，我們已證明，施用來自幽門螺桿菌的脲酶可以預(yù)防鼠的H.felis感染。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種在哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)建立對螺桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法，其中將能建立這樣一種保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫學(xué)上有效量的脲酶(優(yōu)選幽門螺桿菌脲酶或幽門螺桿菌脲酶B亞單位)施用于宿主的粘膜表面。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種適用于預(yù)防螺桿菌感染的疫苗組合物，包含能在宿主體內(nèi)建立對螺桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的有效量脲酶抗原，優(yōu)選幽門螺桿菌脲酶或幽門螺桿菌脲酶B亞單位，與藥物學(xué)上可接受的載體或稀釋劑相結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供給與哺乳動(dòng)物宿主對螺桿菌(Helicobacter)感染被動(dòng)保護(hù)作用的方法，包括于宿主粘膜表面，施用能產(chǎn)生對螺桿菌(Helicobacter)感染起保護(hù)性免疫反應(yīng)的，以脲酶(優(yōu)選幽門螺桿菌脲酶或幽門螺桿菌脲酶B亞單位)接種的宿主體內(nèi)產(chǎn)生的，免疫學(xué)上有效量的脲酶特異性抗體。
現(xiàn)本發(fā)明參考附圖作進(jìn)一步描述，其中

圖1至圖6是表1至表6所述結(jié)果的圖形說明。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)給鼠口服顯示幽門螺桿菌脲酶抗原決定簇的多氨基酸制劑，能在鼠(一種為研究對螺桿菌感染的免疫反應(yīng)的有普遍采納價(jià)值的動(dòng)物模式[9])體內(nèi)產(chǎn)生對H.felis的保護(hù)性免疫學(xué)反應(yīng)。該保護(hù)性免疫反應(yīng)的效果是，經(jīng)免疫接種的動(dòng)物，當(dāng)受病原體攻擊時(shí)，其與未接種的動(dòng)物相比大大減少了受感染的機(jī)率。而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了，對鼠以幽門螺桿菌脲酶B亞單位(作為酶促失活重組蛋白產(chǎn)生的)口服接種能產(chǎn)生鼠體內(nèi)對H.felis的保護(hù)性免疫學(xué)反應(yīng)。該保護(hù)性免疫反應(yīng)的結(jié)果是，與未接種的動(dòng)物(它們確定受到感染)相比，經(jīng)接種的動(dòng)物，在受病原體攻擊時(shí)，大大減少了受感染的機(jī)率。
因此，首先本發(fā)明提供在哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)引發(fā)對螺桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法，該方法包括對哺乳動(dòng)物(包括人)粘膜表面施以能產(chǎn)生這種保護(hù)性免疫反應(yīng)的、免疫學(xué)上有效量的脲酶抗原(優(yōu)選幽門螺桿菌脲酶)。
第二方面，本發(fā)明提供在哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)，產(chǎn)生對螺桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法。該方法包括給哺乳動(dòng)物(包括人)的粘膜表面，施以能產(chǎn)生此種保護(hù)性免疫反應(yīng)的、免疫學(xué)上重組有效量的、酶促失活的、作為抗原的脲酶B亞單位，優(yōu)選重組幽門螺桿菌脲酶B亞單位。
本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物動(dòng)物(包括人)的螺桿菌感染，其中，將能產(chǎn)生對螺桿菌感染保護(hù)性免疫反應(yīng)的，免疫學(xué)上有效量的脲酶或其亞單位施以患者的粘膜表面。優(yōu)選的脲酶是幽門螺桿菌脲酶或幽門螺桿菌脲酶B亞單位。并且該脲酶可以單獨(dú)用藥，或與羥基化磷酸鈣(例如作為載體顆粒的羥磷灰石)結(jié)合給藥。此外優(yōu)選幽門螺桿菌粘膜佐劑、霍亂毒素B亞單位，胞壁酰二肽或其它此類佐劑一起給藥。
雖不與任何理論相關(guān)，但本發(fā)明人相信，以脲酶抗原或其B亞單位對粘膜表面給藥，能刺激普通粘膜免疫體系，和或許誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的消化道粘膜中的局部位點(diǎn)，包括在消化分泌物中出現(xiàn)幽門螺桿菌特異性IgA抗體(它能預(yù)防螺桿菌感染)。因?yàn)樵趧?dòng)物模式中，它是一種對人使用的候選疫苗進(jìn)行臨床前試驗(yàn)的常規(guī)方式，因此人們相信本發(fā)明的方法對人類是有效的，特別是預(yù)防和治療消化道潰瘍、胃炎、胃癌以及由于幽門螺桿菌和/或H.heilmanii存在所引起的其它癥狀。
A-細(xì)菌培養(yǎng)及脲酶純化用于研究的幽門螺桿菌菌株來源于患十二指腸潰瘍的患者，并在BHI瓊脂糖平板中再培養(yǎng)至均一。幽門螺桿菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，典型的是BHI(腦-心浸劑)培養(yǎng)基，包含0.25%酵母提取物和10%胎牛血清及補(bǔ)充了0.4%彎曲桿菌(Campylobacter)選擇補(bǔ)體(SkirrowSupplement;Oxoid69)。將該細(xì)菌于瓶中，在37℃微需氧條件下保溫過夜，然后將瓶密封，于37℃振蕩2-3天產(chǎn)生液體培養(yǎng)物。也可以在含BHI加有0.25%酵母提取物及5%山羊血的瓊脂糖平板中，于37℃微需氧條件下培養(yǎng)3天來制備培養(yǎng)物。通過測660nm處BHI溶液的光密度來測定細(xì)菌的數(shù)量，一個(gè)光密度單位相當(dāng)于108個(gè)細(xì)菌。瓊脂糖平板上的培養(yǎng)物首先再懸浮于154mM NaCl中。
一種目前優(yōu)選的顯示脲酶抗原決定簇的多氨基酸源是經(jīng)純化的脲酶。例如，由采用經(jīng)如下修改的Dunn等人(J.Biol.Chem.265，9464-9469)的一般方法，獲得的幽門螺桿菌脲酶。培養(yǎng)之后，將幽門螺桿菌在水中收集，渦流狀旋轉(zhuǎn)并再次旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生上清液。將含脲酶活性物幽門螺桿菌(由快速脲酶試驗(yàn)測出，見下文)的溶液于CL-6B分級柱上進(jìn)行色譜分離，將有很濃脲酶活性物的餾份匯集，并透吸過夜，于陰離子交換凝膠上再次進(jìn)行色譜分離。在增加NaCl的緩沖液中洗脫出各餾份，將收集的含有濃脲酶活性物的餾份單獨(dú)送至SDS凝膠，并隨后以考馬斯(Coomassie)染色。相應(yīng)于分子量約63和28KDa的兩個(gè)明顯區(qū)別的譜帶被鑒定為脲酶。將含脲酶的餾份匯集起來，得到純度為95%-99%的經(jīng)提純的幽門螺桿菌脲酶。
B-以從幽門螺桿菌提純的脲酶口服接種雖然優(yōu)選采用按上文所述獲得的純化幽門螺桿菌脲酶作為抗原材料，但應(yīng)當(dāng)明白能產(chǎn)生對螺桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的任何脲酶或其亞單位，無論天然產(chǎn)生的或以以重組DNA技術(shù)獲得的，以及其消化片段，含該片段或完整脲酶的融合蛋白，截短脲酶構(gòu)件，或存在脲酶抗原決定簇的其它肽或蛋白制劑均能使用(見下文)。因此，采用與幽門螺桿菌脲酶本質(zhì)上同源的，并能有效產(chǎn)生對螺桿菌Helicobacter交叉保護(hù)性免疫反應(yīng)的脲酶是可能的。此類脲酶的例子是刀豆(jackbean)脲酶，它與幽門螺桿菌脲酶有70%同源性。因此本發(fā)明不限于使用完整的脲酶。本發(fā)明包括顯示脲酶抗原決定簇，并能有效地在宿主中產(chǎn)生對螺桿菌感染保護(hù)性免疫學(xué)反應(yīng)的任何多氨基酸制劑的使用。一般說來，具有70-95%與幽門螺桿菌脲酶同源的(例如80-90%同源)脲酶，都可在本發(fā)明中作為脲酶抗原使用。
有使用潛力的脲酶制劑來源，僅不完全的列舉出來，即包括不同螺桿菌品種的內(nèi)源脲酶、來自其它細(xì)菌、例如KlebsiellaPneumoniae或Proteusmirabilis的脲酶，以及由此類推，包括在該條件下幽門螺桿菌脲酶分享交叉反應(yīng)抗原決定簇的那些脲酶的任何其它脲酶。上面所述所有生物體的脲酶基因，均代表表達(dá)重組脲酶產(chǎn)物為完整蛋白或其部分的有效工具。
有使用潛力的脲酶制劑，僅不完全列舉，即包括由純化脲酶(上面介紹過其來源)，使用物理和/或化學(xué)裂解法(即CnBr)和/或蛋白水解裂法(使用蛋白酶、例如V8蛋白酶、胰蛋白酶或其它蛋白酶)產(chǎn)生的肽，或化學(xué)合成并與脲酶分享交叉反應(yīng)抗原決定簇的肽。
其它有使用潛力的抗原決定簇的來源包括以脲酶交叉反應(yīng)所鑒定的，以抗脲酶抗體篩選結(jié)果的抗原決定簇。這些肽可以是天然出現(xiàn)的肽或化學(xué)合成產(chǎn)生的肽。而且這類肽可以是從重組隨機(jī)寡核苷酸表達(dá)的結(jié)果。
有使用潛力的抗原決定簇的另一個(gè)來源包括與脲酶相似，作為脲酶抗基因型抗體生殖結(jié)果的抗原決定簇。這類在任何免疫適格宿主體內(nèi)產(chǎn)生的抗基因型抗體，由以抗脲酶抗體接種宿主，以產(chǎn)生針對抗脲酶抗體的抗體為目的而獲得，它與脲酶分享結(jié)構(gòu)同源性。
本文討論的內(nèi)容主要針對幽門螺桿菌天然產(chǎn)生的脲酶的應(yīng)用(B部分)。然而，能產(chǎn)生所需保護(hù)性免疫反應(yīng)的，上面介紹的脲酶或其亞單位或構(gòu)件也是有價(jià)值的，它們可以通過本領(lǐng)域已知重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生。具體制劑的效力，可以由動(dòng)物模式常規(guī)給藥、候選疫苗口服給藥，并使用基本上與下述方法相似或相同的方法，以病原體進(jìn)行攻擊，來加以測定。
下表1和2及圖1-5描述當(dāng)用純化幽門螺桿菌脲酶口服接種鼠時(shí)所獲結(jié)果。在該第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，幽門螺桿菌抗原經(jīng)口服給鼠給藥，按A部分所述將幽門螺桿菌脲酶提純并與羥磷灰石晶體結(jié)合，該羥磷灰石晶體用以作為載體，以提高M(jìn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和吸收。加以霍亂毒素(Sigma)作為粘膜佐劑。該實(shí)驗(yàn)中、給各組雌性SPF BALB/C六星期齡鼠，于第0、7、14和21天，口服接種30μg提純的幽門螺桿菌脲酶，結(jié)合1mg羥磷灰石，加10μg霍亂毒素佐劑。然后于第28及30天，以108H.felis攻擊鼠兩次。為了進(jìn)行比較，給相似的雌性SPF BALB/C六周齡鼠，于第0、7、14及21天，口服接種完整幽門螺桿菌溶胞產(chǎn)物(聲處理的)及10μg霍亂毒素。該鼠于第28天和30天，以H.felis攻擊。該幽門螺桿菌聲處理物系從細(xì)胞培養(yǎng)收集的幽門螺桿菌離心沉淀、并于0.9%氯化鈉中于懸浮該沉淀，接著進(jìn)行聲處理制備而成。
給雌性SPFBALB/C六周齡鼠于第0、7、14及21天時(shí)口服假接種10μg霍亂毒素及1mg羥磷灰石作為空白對照。該鼠于第28及30天以H.felis攻擊之。所有的鼠圈養(yǎng)，接種及攻擊均平行進(jìn)行。第35天將所有受試鼠殺死。
C-以幽門螺桿菌重組脲酶亞單位口服接種根據(jù)以前公開的序列[29]，按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆，獲得編碼幽門螺桿菌脲酶結(jié)構(gòu)A和B亞單位的基因。將這些基因插入設(shè)計(jì)用于大腸桿菌中高水平表達(dá)，并容易純化外來基因的載體[即pEV40]中。簡單說來，將外來基因插入熱抑制啟動(dòng)子的下游。于編碼六組氨酸重復(fù)單元序列的框架內(nèi)。該載體上有-ampR基團(tuán)用于轉(zhuǎn)化子選擇。在適當(dāng)溫度條件下、將獲得的重組蛋白在N末端補(bǔ)充以六組氨酸，使之能在鎳柱上一步親和提純。將幽門螺桿菌重組脲酶A和B亞單位二者分別在大腸桿菌中表達(dá)并在鎳柱上提純至純度＞95%。
雖然優(yōu)選采用按上述方法獲得的重組幽門螺桿菌脲酶作為抗原材料，但應(yīng)當(dāng)了解，也可使用通過重組技術(shù)(例如融合蛋白)表達(dá)脲酶抗原位點(diǎn)獲得的，能產(chǎn)生對螺桿菌感染保護(hù)性免疫反應(yīng)的任何脲酶或脲酶亞單位，來作為抗原材料。因此，采用一個(gè)與幽門螺桿菌脲酶基本上同源，能產(chǎn)生對螺桿菌交叉保護(hù)性免疫反應(yīng)的構(gòu)建的脲酶基因是可能的。此類脲酶的例子是刀豆(jackbean)脲酶，它與幽門螺桿菌脲酶或H.felis脲酶具約70%同源性。因此，本發(fā)明不限于使用幽門螺桿菌脲酶基因及其基因產(chǎn)物，也覆蓋使用能在宿主體內(nèi)有效產(chǎn)生對螺桿菌(Helicobacter)感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的任何重組脲酶或其亞單位。一般來說，與幽門螺桿菌脲酶具有70-95%同源性(例如80-90%同源性)的重組脲酶可用作本發(fā)明的重組脲酶抗原。
本文主要集中討論有關(guān)由大腸桿菌(C部分)產(chǎn)生的重組幽門螺桿菌脲酶A和B亞單位的應(yīng)用。但是，上面提到的能產(chǎn)生所需保護(hù)性免疫反應(yīng)的重組脲酶或其亞單位或構(gòu)建均是有價(jià)值的，它們可使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的其它重組DNA技術(shù)及其它真核或原核表達(dá)載體來產(chǎn)生。
下面表3、4和5及圖6描述當(dāng)鼠以在大腸桿菌內(nèi)產(chǎn)生的重組幽門螺桿菌脲酶亞單位口服接種而獲得的結(jié)果。在該實(shí)驗(yàn)中，給鼠口服按上面所述在大腸桿菌中產(chǎn)生并提純的重組幽門螺桿菌脲酶A或B亞單位，來進(jìn)行幽門螺桿菌抗原給藥，并結(jié)合羥磷灰石晶體，該羥磷灰石晶體用作載體并增加M細(xì)胞結(jié)合和吸取?；魜y毒素(Sigma)用作粘膜佐劑。在該實(shí)驗(yàn)中，于第0、8、14及21天，各組雌性SPF BALB/C六周齡鼠，均以30μg重組幽門螺桿菌脲酶A亞單位，結(jié)合1mg羥磷灰石加10μg霍亂毒素佐劑口服接種。然后于第32、34及36天以10，8H.felis三次攻擊鼠。為比較的目的，于第0、8、14及21天，給相似的雌性SPF BALB/C六周齡鼠口服接種30μg重組幽門螺桿菌脲酶B亞單位結(jié)合羥磷灰石加10μg霍亂毒素。于第32、34和36天以H.felis攻擊該鼠三次。給雌性SPF BALB/C六周齡鼠，以10μg霍亂毒素及1mg羥磷灰石于第0、8、14及21天口服假接種作為空白對照。然后于第32、34及36天以H.felis攻擊該鼠。所有受試鼠接種及攻擊均平行進(jìn)行。在第48天(攻擊后12天)或攻擊后10周將動(dòng)物殺死。
D-胃活檢、血及腸分泌物的分析從胃取活組織檢查并從心臟得到血，移出腸，在PBS緩沖液中以1mMPMSF(Boeringher)洗滌，得到腸分泌物用于ELISA分析。
為評價(jià)抗H.felis移出保護(hù)作用，根據(jù)廠商的說明書，采用JatroxHP試驗(yàn)(RohmPharma)快速評估脲酶活性，將每只動(dòng)物的胃活檢進(jìn)行篩選，確定H.felis的存在。簡單地說，將胃活檢浸入0.5ml廠商提供的脲和酚紅(pH指示劑)混合物中。從脲中脲酶活性物產(chǎn)生氨和碳酸氫鹽，接著通過結(jié)腸測定器(colometril)于550nm處測定溶液向較高吸收率處的改變。由分光光度計(jì)分析對脲酶活性物進(jìn)行定量分析。
包括在B部分所述實(shí)驗(yàn)中各動(dòng)物胃活檢也可于BHI瓊脂糖平板(按上面所述加以補(bǔ)充的)上培養(yǎng)，用于檢測H.felis。在微需氧條件下培養(yǎng)3-10天后，通過革蘭氏(Gram)染色及脲酶活性測定，可以肯定H.felis的存在。因?yàn)樵诘谝唤M實(shí)驗(yàn)中，在胃活檢中檢測H.felis，脲酶試驗(yàn)和H.felis培養(yǎng)這兩種方法之間獲得十分明顯的相關(guān)性(見表3)，在C部分所述實(shí)驗(yàn)中僅進(jìn)行胃活檢脲酶試驗(yàn)來檢測H.felis。由顯微鏡，使用兩種不同的染色法(吖啶橙及甲酚紫)，通過兩個(gè)獨(dú)立的觀察者來證實(shí)H.felis檢測。
將血樣于RT凝聚3小時(shí)，收取血清并于-20℃冷凍至分析。將腸分泌物旋轉(zhuǎn)5分鐘，于4℃除去細(xì)胞碎片并于-20℃冷凍之。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，以ELISA分析各動(dòng)物的血清及腸樣品，以評估抗螺桿菌活性。簡單說來，以聲處理的幽門螺桿菌覆蓋96孔平板，接著用5%無脂奶使之飽和。將樣品進(jìn)行1∶1至1∶1000的系列稀釋，并于ELISA平板上4℃保溫過夜。使用生物素化抗鼠IgG(血清)及抗鼠IgA，然后用抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶來測定抗體水平。
在純化幽門螺桿菌脲酶接種之后，以H.felis攻擊后的結(jié)果列于表1-3中及圖1-4中，而以重組幽門螺桿菌脲酶A和B亞單位接種后再以H.felis攻擊的結(jié)果列于表4-6及圖5和6中。
表1
表1中的數(shù)據(jù)是B部分所述實(shí)驗(yàn)得出的，“h”指小時(shí)，“Ig”指免疫球蛋白，“ND”指“未測定”，“脲酶+HF”表示給鼠接種脲酶(結(jié)合羥磷灰石，并帶有霍亂毒素)然后以H.felis攻擊，“脲酶”表示給鼠接種脲酶(結(jié)合羥磷灰石，并加有霍亂毒素)和不受攻擊，“CT+HF”表示給鼠以霍亂毒素假接種，并以H.felis攻擊，“HP聲處理物+HF”表示以加有霍亂毒素的幽門螺桿菌聲處理物給鼠接種并以H.felis攻擊，“HP聲處理物”表示給鼠以幽門螺桿菌聲處理物接種(加有霍亂毒素)而不受攻擊。表1中，抗體產(chǎn)生數(shù)以595nm處測定的吸收率并乘以1000表示，減去無抗體時(shí)所測的本底。
B部分所述實(shí)驗(yàn)根據(jù)胃活檢脲酶實(shí)驗(yàn)及根據(jù)H.felis培養(yǎng)物革蘭(Gram)染色所得結(jié)果列于表2中。感染通過鼠帶有一個(gè)或多個(gè)由H.felis產(chǎn)生的移出標(biāo)記來定義(包括脲酶試驗(yàn)或培養(yǎng)物革蘭Gram染色)。
表2接種攻擊感染%保護(hù)%脲酶 H.felis 3/10(30%) 7/10(70%)*聲處理物 H.felis 6/9(66%) 3/9(33%)**CTH.felis9/10(90%)1/10(10%)*P=0.0198(兩個(gè)經(jīng)跟蹤Fisher 精確實(shí)驗(yàn))與CT空白對照相比**P=0.303(兩個(gè)經(jīng)跟蹤Fisher 精確實(shí)驗(yàn))與CT空白對照相比從表1和2的結(jié)果看出，與使用幽門螺桿菌聲處理物或霍亂毒素相比，使用幽門螺桿菌脲酶口服接種所獲得的對H.felis攻擊，具統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯的保護(hù)作用。就表2來說，可以看出，總共10只接種動(dòng)物，只有3只受到感染，而相比之下，以幽門螺桿菌聲處理物接種的動(dòng)物有6只感染，而以霍亂毒素接種的有9只受到感染。表2表現(xiàn)出有70%的動(dòng)物對H.felis攻擊受到保護(hù)，相比之下對于隨后經(jīng)受H.felis攻擊以幽門螺桿菌聲處理物接種的動(dòng)物僅33%被保護(hù)，而對于隨后經(jīng)受H.felis攻擊以霍亂毒素接種的動(dòng)物僅10%受到保護(hù)。換言之，空白對照鼠暴露于H.felis有90%受到病原體感染，而相反的，暴露于H.felis以前28天以幽門螺桿菌(H.Pylori)脲酶給鼠接種，感染率僅為30%。這表明了感染的明顯降低(P＝0.0198，在Fisher精確試驗(yàn)中與空白對照鼠相比)。當(dāng)給鼠以幽門螺桿菌(H.Pylori)聲處理物口服免疫時(shí)，感染率是67%(與空白對照相比差別不明顯。使用幽門螺桿菌脲酶所獲得的保護(hù)作用是未曾予料到的，并且不可能根據(jù)使用幽門螺桿菌聲處理物所觀察到的結(jié)果予測到。
有關(guān)圖1-4，圖1是以圖形表示用脲酶接種之后，未受到保護(hù)的鼠體內(nèi)的血清(IgG)及腸分泌物(IgA)中抗體試驗(yàn)結(jié)果。這些是表1中的第1、4和6號鼠，構(gòu)成A組。圖2表示用脲酶接種之后，受到保護(hù)的鼠的抗體反應(yīng)(B組)，即第2、3、5及7-10號鼠。圖3和4是有關(guān)31-39號鼠所獲得的結(jié)果，圖3(C組)表示以幽門螺桿菌(H.Pylori)聲處理物接種之后未受到保護(hù)的鼠的抗體反應(yīng)(第31、32、33、35、36及38號鼠)，而圖4(D組)表示以幽門螺桿菌(H.Pylori)聲處理物接種之后受到保護(hù)的鼠(第34、37及39號鼠)的抗體反應(yīng)。非常有趣的注意到，就圖3和4來說，表現(xiàn)出保護(hù)作用的鼠體內(nèi)的IgA抗體反應(yīng)(而非IgG)比起未受到保護(hù)的鼠體內(nèi)來說要高，這表明保護(hù)作用與IgA反應(yīng)之間的相關(guān)性。血清IgG反應(yīng)沒有表現(xiàn)出相關(guān)。已知粘膜IgA而非血清IgG抗體，在對抗內(nèi)臟的細(xì)菌感染的保護(hù)作用中起作用[30]。
在胃活檢中，用脲酶試驗(yàn)與通過培養(yǎng)來檢測H.felis之間的相關(guān)結(jié)果列于表3中。
表3脲酶試驗(yàn)+脲酶試驗(yàn)-總計(jì)H.felis培養(yǎng)+16016H.felis培養(yǎng)-23032總計(jì)183048雙跟蹤Fisher的精確試驗(yàn):P<0.00001表3表明在胃活檢中進(jìn)行的脲酶試驗(yàn)的結(jié)果和由培養(yǎng)鑒定H.felis二者之間存在非常明顯的相關(guān)性。因?yàn)橥ㄟ^培養(yǎng)較之脲酶試驗(yàn)較少能檢測幽門螺桿菌感染，在下面的實(shí)驗(yàn)中，脲酶實(shí)驗(yàn)由于其靈敏度較好，而優(yōu)選被用來診斷鼠的H.felis感染。該方法允許以各鼠胃的較大片斷重脲酶試驗(yàn)，并進(jìn)一步提高了脲酶試驗(yàn)的靈敏度。而且，使用最高靈敏度的方法可避免過高評估被試疫苗制劑所獲得的保護(hù)作用。當(dāng)陽性培養(yǎng)物用作感染標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，在B部分所述實(shí)驗(yàn)中經(jīng)脲酶接種之后所誘導(dǎo)的保護(hù)作用相當(dāng)于以脲酶試驗(yàn)及培養(yǎng)結(jié)合使用時(shí)那么大(p＝0.021對p＝0.019)。
C部分所述實(shí)驗(yàn)根據(jù)胃活檢脲酶試驗(yàn)所得結(jié)果列于表4、5和6中并描述于圖6中。
表4接種鼠號脲酶試驗(yàn)感染CT200.49+210.31+220.62+230.67+240.55+500.50+510.37+520.29+530.79+540.32+ureA+HAP+CT400.67+410.48+420.42+430.65+440.56+450.52+460.33+470.63+480.22+490.37+
ureB+HAP+CT250.15-260.07-270.03-280.64+290.13-300.02-310.66+320.00-ureA+HAP+CT680.00-690.07-700.42+710.00-720.00-ureB+HAP+CT730.37+740.00-750.37+760.00-770.00-780.00-790.39+800.00-810.37+820.00-
表4中“Cl”表示霍亂毒素;“UreA”表示重組幽門螺桿菌脲酶A亞單位;“UreB”表示重組幽門螺桿菌脲酶B亞單位;“HAP”表示羥磷灰石結(jié)晶。第20-54號鼠于攻擊后第12天殺死，而第68-82號鼠于攻擊后10周(106天)殺死。從各鼠胃活檢進(jìn)行的脲酶試驗(yàn)結(jié)果表示為550nm處的OD值?！?”號和“-”號表示各感染動(dòng)物的最終狀態(tài)，根據(jù)檢測H.felis的脲酶試驗(yàn)的陽性或陰性確定。陽性O(shè)D550值＞0.2。
表5攻擊后12天所測到的保護(hù)作用接種攻擊感染%保護(hù)%脲酶A亞單位H.felis10/10(100%)0/10(0%)脲酶B亞單位 H.felis 3/10(30%) 7/10(70%)*CTH.felis10/10(100%)0/10(0%)*P=0.0031(雙跟蹤Fisher精確試驗(yàn))與CT空白對照相比表6攻擊后10周所測保護(hù)作用接種攻擊感染%保護(hù)%脲酶A亞單位 H.felis 1/5(20%) 4/5(80%)*脲酶B亞單位 H.felis 4/10(40%) 6/10(60%)**
*P=0.003(雙跟蹤Fisher試驗(yàn))與CT空白對照相比**P=0.01(雙跟蹤Fisher試驗(yàn))與CT空白對照相比從表4、5和6的結(jié)果可以看出，與使用重組幽門螺桿菌脲酶A亞單位或霍亂毒素相比，使用重組幽門螺桿菌脲酶B亞單位口服接種獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯的對抗H.felis攻擊的保護(hù)作用。從表4中可看出，在脲酶B亞單位組，攻擊后12天總共10只接種鼠中僅有3只發(fā)現(xiàn)感染，相比之下，以幽門螺桿菌脲酶A亞單位接種的10只和以霍亂毒素接種的10只均受感染。表4表明，70%動(dòng)物受到保護(hù)免于H.felis攻擊，相比之下，經(jīng)受H.felis攻擊后以幽門螺桿菌脲酶A亞單位及以霍亂毒素接種的動(dòng)物受保護(hù)均為0%。換言之以H.felis攻擊后空白對照鼠100%受到感染，反之，以重組幽門螺桿菌脲酶B亞單位接種的鼠感染率僅為30%。這表明與空白對照鼠相比感染明顯下降(P＝0.0031Fisher精確試驗(yàn))。
用幽門螺桿菌脲酶所觀察到的保護(hù)作用完全由脲酶B亞單位免疫作用提供，而A亞單位沒有此種效果這一事實(shí)，是根據(jù)我們以純化脲酶所作實(shí)驗(yàn)未曾予料到的。因此對脲酶的該兩結(jié)構(gòu)亞單位在產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)中的作用進(jìn)行上述定義是新的。使用重組脲酶B亞單位(它被酶促失活)所獲得的保護(hù)作用也告訴我們，脲酶的非毒性形式可以用作抗螺桿菌感染的口服疫苗。而且這些結(jié)果也有力地證明，活性位點(diǎn)的識別對保護(hù)作用并不需要，因?yàn)槭Щ铍迕窧亞單位非常不可能誘導(dǎo)出將識別和抑制天然脲酶催化位點(diǎn)的抗體。
從表6可以看出，當(dāng)鼠在攻擊后10周殺死時(shí)，以脲酶B亞單位接種的動(dòng)物60%(10只中的6只)，而以幽門螺桿菌脲酶A亞單位接種的動(dòng)物80%(5只中的4只)對H.felis感染具抵抗作用。以脲酶B亞單位接種獲得的保護(hù)作用持續(xù)時(shí)間延長，而以脲酶A接種所誘導(dǎo)的保護(hù)作用與由脲酶B亞單位誘導(dǎo)的保護(hù)作用相比滯后這一事實(shí)，從我們以純化脲酶所作實(shí)驗(yàn)，或早期所作其它實(shí)驗(yàn)中不可能予料到的。脲酶A亞單位接種所給與的保護(hù)作用這一事實(shí)，肯定證明了活性位點(diǎn)的識別對保護(hù)作用是不需要的。圖6總結(jié)了以重組脲酶A和B亞單位口服接種后所獲得的結(jié)果(表5和6所述)。
本發(fā)明也提供適于予防螺桿菌感染的疫苗組合物，該組合物包含有效量的脲酶抗原，優(yōu)選幽門螺桿菌脲酶或重組幽門螺桿菌脲酶亞單位(它能在宿主體內(nèi)產(chǎn)生對螺桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng))與藥物學(xué)上可接受的載體和稀釋劑相結(jié)合。
本發(fā)明的疫苗給藥量很容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。因此，對成年人來說，適合劑量在10μg到100mg之間，例如50μg至50mg。相近的劑量范圍對兒童也可用。用于人的載體體系可包括能保護(hù)抗原經(jīng)受胃的酸性環(huán)境的腸釋放膠囊，并包括作為融合蛋白不溶形式的脲酶抗原。該疫苗可作為一級予防劑對成人和兒童施用，在成功地根除感染宿主體內(nèi)的幽門螺桿菌之后用作二級予防，或者可作為治療劑，為在能根除幽門螺桿菌的宿主體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
正如上面指出的，適當(dāng)?shù)恼衬ぷ魟┦腔魜y毒素，可以使用的其它佐劑是胞壁酰二肽或其衍生物，霍亂毒素?zé)o毒衍生物(包括其B亞單位)，和/或脲酶抗原加霍亂毒素或其B亞單位的連接或基因工程融合物。其它適宜的輸送方法包括可生物降解的微膠囊或免疫刺激復(fù)合物(ISCOM′S)或脂質(zhì)體，基因工程減毒活載體，例如病毒或細(xì)菌，以及重組(嵌合)類病毒顆粒，例如蘭舌病毒(bluetongue)。粘膜佐劑的用量取決于所用粘膜佐劑的類型。例如當(dāng)粘膜佐劑是霍亂毒素，適宜用量為5μg到50μg，例如10μg至35μg。當(dāng)以微膠囊形式使用時(shí)，用量取決于為達(dá)到所需劑量而在微膠囊基質(zhì)中使用的量。該量的決定是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技能所及。
本發(fā)明疫苗的適當(dāng)載體是腸衣膠囊和聚交酯-乙交酯微球。適宜的稀釋劑是0.2N碳酸氫鈉和/或鹽水。
微粒羥基化磷酸鈣(HCP)作為幽門螺桿菌脲酶施用于粘膜表面的載體是特別有用的。確信幽門螺桿菌脲酶-羥化磷酸鈣結(jié)合物穿過產(chǎn)生多Ig免疫反應(yīng)的上皮。優(yōu)選羥化磷酸鈣為適于穿過上皮(特別是為此目的特化的細(xì)胞[M細(xì)胞])的微粒形式。羥化磷酸鈣的優(yōu)選形式是羥基磷灰石，一種市售的結(jié)晶羥磷酸鈣Ca10(PO4)6(OH)2。
市售羥磷灰石一般由類似厚片的晶體組成，該晶體是正常骨組織中的無機(jī)羥磷灰石的化學(xué)和物理類似物。因此咽下羥磷灰石是安全的，正如來自用于咽下的磨細(xì)的骨粉所具有的營養(yǎng)鈣/磷補(bǔ)充劑一樣的作用。市售高分解羥磷灰石(購自CalBioChecm)由大小變化很大的晶體組成。長度超過1μm的晶體不大可能由M細(xì)胞吸收。因此為用于本發(fā)明，可用如聲處理等技術(shù)將市售羥磷灰石晶體粉碎成小的十分均勻的結(jié)晶片。優(yōu)選羥磷灰石基本上為約0.01-1.0μm的碎片，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)、可通過電子顯微鏡或光散射來測量其碎裂程度。
優(yōu)選的幽門螺桿菌脲酶抗原的給藥方式是口服、鼻注、直腸、眼滴?？诜o藥可以傳輸?shù)桨c粘膜在內(nèi)的其它G、L、粘膜。
本發(fā)明的疫苗可以以氣霧劑、懸浮液、膠囊和/或栓劑的形式施用于粘膜表面。給藥方法對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明進(jìn)一步包括哺乳動(dòng)物(包括人)對螺桿菌感染的被動(dòng)免疫作用。該目的通過給患者粘膜表面施用有效量的脲酶特異性抗體來達(dá)到。優(yōu)選給以有效量的幽門螺桿菌脲酶特異性IgA單克隆抗體。
因?yàn)橐炎C明幽門螺桿菌脲酶代表與誘導(dǎo)保護(hù)性免疫相關(guān)的抗原，因此本發(fā)明進(jìn)一步涉及的是使用幽門螺桿菌脲酶作為診斷劑，用來測定已接受基于脲酶的疫苗的個(gè)人的免疫反應(yīng)、或測定某個(gè)體是具免疫力的還是易受感染的(因而需要接種)。本發(fā)明也包括使用脲酶和脲酶特異性抗體以建立用于診斷螺桿菌免疫力、評估螺桿菌的易感性，定義對疫苗的免疫反應(yīng)的測試方法及藥盒。
實(shí)施例通過參考下述非限制性實(shí)施例現(xiàn)對本發(fā)作進(jìn)一步描述。
a)細(xì)菌菌株H.felis由J.Fox(divisionofCoperativeMedicine，Mass，InstituteofTechnology，Boston，USA)，幽門螺桿菌由患潰瘍的病人體內(nèi)分離出(CHUV，Lausanne，Switzerland)。
b)細(xì)菌培養(yǎng)液體培養(yǎng)-在含有0.25%酵母提取物(Difco)及10%胎牛血清(Inotech)補(bǔ)充有0.4%彎曲桿菌(Campylobacter)選擇補(bǔ)體(Oxoid)的BHI(腦-心浸劑，BioMerieux)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌。于37℃、微需氧條件下將該細(xì)菌保溫過夜并于37℃振蕩2-3天。
瓊脂糖平板培養(yǎng)-在由加有0.25%酵母提取液和5%羊血的BHI組成的瓊脂平板上，于37℃微需氧條件下將細(xì)菌培養(yǎng)3天。
定時(shí)-由BHI溶液于660nm波長處的光密度來定量測定細(xì)菌數(shù)(1光密度單位相當(dāng)于108個(gè)細(xì)菌)。
c)聲處理物的制備將幽門螺桿菌從31個(gè)血瓊脂平板上收集到0.15MNaCl中，并于40℃1400g下旋轉(zhuǎn)5分鐘。將沉淀再懸浮于3mlNaCl中并聲處理4分鐘。以Bradford檢測法估測蛋白質(zhì)的量(根據(jù)廠商的BioRadKit)。
d)免疫原與羥磷灰石結(jié)合將免疫原(脲酶或其亞單位)與羥磷灰石于4℃培養(yǎng)1小時(shí)，每鼠使用30μg免疫原時(shí)羥磷灰石為1.0mg。培養(yǎng)結(jié)束，加入10μg霍亂毒素，最終體積為200μlPBS。
實(shí)施例1a)提取將從30個(gè)血瓊脂平板上收集到的幽門螺桿菌置于冰上的0.15MNaCl中，并于4℃1400g下將該溶液旋轉(zhuǎn)5分鐘。將所得沉淀再懸浮于20ml水中并渦旋45秒(最大速度)。將提取液于4℃6700g下旋轉(zhuǎn)20分鐘?；厥丈锨逡翰⑦M(jìn)行蛋白定量測定(見上述定量一節(jié))，再以70%硫酸氨沉淀之。
b)脲酶的提純在SepharoseCL-6B柱(Pharmacia)上，以PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)作為流動(dòng)相將溶液進(jìn)行色譜分離。將22個(gè)表現(xiàn)出強(qiáng)脲酶活性的收集餾分匯集在一起，并于4℃，以3升PEB(20mM磷酸緩沖液，PH7)透析過夜，然后在QSepharose快速流動(dòng)柱(Pharmacia)上以PBS作為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離。由0-500mMNaCl的梯度液洗脫出各餾分。將10個(gè)顯示強(qiáng)脲酶活性的收集餾分獨(dú)立地進(jìn)行SDS凝膠分析，然后進(jìn)行考馬斯(Coomassie)染色。將代替2個(gè)不同譜帶，相當(dāng)于MW-63和-28KDa的6個(gè)餾分匯集在一起，這些被認(rèn)為是純化的脲酶。
實(shí)施例2(也見B部分)在胃內(nèi)接種之前，將用于接種研究的鼠以乙醚輕度麻醉。然后，將聲處理制劑或純化脲酶，羥磷灰石和霍亂毒素懸浮于PBS，使用連接于皮下注射器的聚乙烯管，將200μl該液輸送到各鼠的胃中。該方法作為口服接種法。
對三種口服接種方案進(jìn)行評估，敘述如下方法B1-以純化的脲酶接種在第0、7、14及21天，以30μg純化的幽門螺桿菌脲酶及1mg羥磷灰石和10μg霍亂毒素，給雌性BALB/c六周齡鼠(20只)口服接種。在第28和30天，以5×107和108來自液體培養(yǎng)的H.felis攻擊10只鼠。
方法B2-以螺桿菌的聲處理液接種在第0、7、14及21天，用2mg幽門螺桿菌聲處理物溶液給雌性BALB/c六周齡鼠(20只)口服接種。在第28和30天，以5×107及108H.felis攻擊10只鼠。
方法B3-空白對照在第0、7、14及21天，用1mg羥磷灰石及10μg霍亂毒素給雌性BALB/c六周齡鼠口服接種。在第28和30天，以5×107及108H.felis攻擊該鼠。
在第35天將所有鼠殺死，從胃取活檢并取腸分泌物及血。
保護(hù)作用及評估為評估保護(hù)作用，采用JetroxHP試驗(yàn)(RohmPharma)，根據(jù)廠商的說明，對活檢進(jìn)行脲酶活性檢查。于550nm波長處進(jìn)行分光光度測量對脲酶定量分析。該活檢也于H.felis存在下培養(yǎng)，并通過革蘭氏染色估測。將胃竇活檢進(jìn)行勻漿處理并在0.15MNaCl中稀釋(1∶10及1∶1000)，鋪于血瓊脂平板上并于37℃微需氧條件下培養(yǎng)4-10天。
ELISA以ELISA分析腸分泌物及血，以評估抗體效價(jià)。ELISA按下述進(jìn)行于37℃按1μg/孔在聚乙烯平板(96孔)上涂復(fù)純化的脲酶2小時(shí)。以5%奶粉的PBS0.1%Tween液于37℃將非特異性位點(diǎn)阻隔30分鐘。用PBS0.1%Tween洗平板一次。血樣品以1∶1000稀釋度試驗(yàn)，腸分泌物以1∶1試驗(yàn)。將各樣品100μl加入到涂復(fù)抗原的板上。保溫2小時(shí)后，用PBS0.1%Tween洗板3次。除了IgA(以1∶250加入)外，來自山羊的抗鼠生物素化完整抗體及抗鼠IgA、IgG和IgM生物素化物(Amersham)均按1∶500稀釋度加入(100μl)，并于37℃培養(yǎng)1小時(shí)。用PBS0.1%Tween洗該板3次，并加入100μl按1∶1000稀釋的抗生蛋白鏈菌素辣根過氧化酶以PBS0.1%Tween液，再于37℃培養(yǎng)30分鐘。將該板洗三次，并加入50μl以1∶50稀釋的O-苯基-二胺的檸檬酸緩沖液(PH5.0，含1μl/ml30%H2O)，于室溫下培養(yǎng)20分鐘，測量每孔于495nm處的吸收率。
實(shí)施例3(也見C部分)進(jìn)行胃內(nèi)接種之前用乙醚將用于免疫接種研究的鼠輕度麻醉。然后，將30μg大腸桿菌中產(chǎn)生的重組幽門螺桿菌脲酶A或B亞單位與羥磷灰石結(jié)合，并補(bǔ)充以霍亂毒素懸浮于PBS液中。使用連接于聚乙烯管的皮下注射器，將200μl該液輸送于各鼠胃中。該方法作為口服接種法。
評估三種口服接種法，敘述如下方法C1-以重組脲酶A亞單位接種在第0、8、14及21天，以30μg純化的重組幽門螺桿菌脲酶A亞單位和10mg羥磷灰石及10μg霍亂毒素給雌性BALB/c六周齡鼠(10只)口服接種，于第32、34及36天用來自液體培養(yǎng)的108H.felis攻擊10只鼠。
方法C2-用重組脲酶B亞單位接種在第0、8、14及21天，以30μg重組幽門螺桿菌脲酶B亞單位和1mg羥磷灰石及10μg霍亂毒素給雌性BALB/c六周齡鼠(10只)口服接種，于第32、34及36天用來自液體培養(yǎng)的108H.felis攻擊10只鼠。
方法C3-空白對照在第0、8、14及21天，用1mg羥磷灰石和10μg霍亂毒素給雌性BALB/c六周齡鼠口服接種，于第32、34及36天用108H.felis攻擊該鼠。
在第42天或第106天將鼠殺死，從胃中取多份活檢。
保護(hù)作用及評估為評估保護(hù)作用，采用JetroxHP試驗(yàn)(RohmPharma)，根據(jù)廠商的說明，對胃體及胃竇活檢進(jìn)行脲酶活性檢查。于550nm波長處進(jìn)行分光光度測量以對脲酶定量分析?？偽阁w和胃竇OD值相加得到每鼠最終OD值。
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權(quán)利要求
1.使哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)產(chǎn)生對螺桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括下述步驟給所說哺乳動(dòng)物粘膜表面施用免疫學(xué)上有效量的，存在足夠數(shù)量的由所說螺桿菌生物體內(nèi)源脲酶所表現(xiàn)出的抗原決定簇的多氨基酸制劑，以產(chǎn)生對所說生物體引起的感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑含來自生物體的經(jīng)純化的完整脲酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑含與脲酶氨基酸序列酶促失活部分同源的肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑含有與脲酶氨基酸序列不同源，并顯示與脲酶交叉反應(yīng)的抗原決定簇的肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑含幽門螺桿菌脲酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑含至少含有脲酶亞單位、帶或不帶酶活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑含有對脲酶的抗基因型抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑含有與脲酶免疫學(xué)交叉反應(yīng)的肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求3和9的方法，其中所說肽由化學(xué)合成獲得。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑含使用DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的脲酶抗原。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑含以重組技術(shù)生產(chǎn)的脲酶亞基因片斷。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑含作為遺傳學(xué)融合蛋白產(chǎn)生的脲酶亞基因片斷。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說融合蛋白包含霍亂毒素亞單位。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑與粘膜佐劑結(jié)合給藥。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說粘膜佐劑是霍亂毒素。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說哺乳動(dòng)物宿主是人。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說制劑與羥化磷酸鈣結(jié)合給藥。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所說羥化磷酸鈣是羥磷灰石。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所說羥磷灰石是為適于透過上皮的顆粒形式。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說脲酶，以口服、鼻注、直腸或眼滴給藥。
21.于哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)對螺桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的疫苗，該疫苗含存在由內(nèi)源于所說螺桿菌生物體的脲酶所表現(xiàn)的抗原決定簇的多氨基酸制劑，與藥物學(xué)上可接受的載體或稀釋劑一起使用。
22.權(quán)利要求21的疫苗，進(jìn)一步包含粘膜佐劑。
23.給與哺乳動(dòng)物對螺桿菌感染被動(dòng)免疫的方法，該方法包括給所說哺乳動(dòng)物粘膜表面施用免疫學(xué)上有效量的脲酶特異性IgA抗體，該抗體是通過以能產(chǎn)生對螺桿菌保護(hù)性免疫反應(yīng)的脲酶接種在宿主體內(nèi)產(chǎn)生的。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所說抗體是幽門螺桿菌脲酶特異性IgA抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所說哺乳動(dòng)物是人。
26.評估受螺桿菌生物體感染的哺乳動(dòng)物的內(nèi)源免疫反應(yīng)的方法，該方法包括測定來自所說哺乳動(dòng)物胃腸道的樣品中存在與內(nèi)源于所說螺桿菌生物體的脲酶表現(xiàn)出的抗原決定簇具反應(yīng)活性的抗體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，包括在所述測定之前，給所說哺乳動(dòng)物施用螺桿菌疫苗的附加步驟。
全文摘要
通過給宿主施用免疫學(xué)上有效量的螺桿菌脲酶或脲酶亞單位作為抗原，以使在哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)產(chǎn)生對螺桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法。也提供疫苗組合物。
文檔編號C07K19/00GK1094640SQ9311267
公開日1994年11月9日 申請日期1993年11月3日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月3日
發(fā)明者P·米切蒂, A·布盧姆, C·達(dá)文, R·哈斯, I·科特西·特拉茲, J·P·克拉亨布爾, E·沙拉加 申請人:瑞上腸胃疾病研究基金會