本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及N-(噻吩-2)酰胺類衍生物在耐吡嗪酰胺結(jié)核病及結(jié)核病治療中的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的全球流行最廣的疾病之一。吡嗪酰胺(PZA)是抗結(jié)核病一線藥物，對處于吞噬細(xì)胞內(nèi)酸性環(huán)境中緩慢生長的結(jié)核分支桿菌抑菌效果明顯，能有效的縮短治療周期，是目前一線抗結(jié)核病藥物。由于耐PZA結(jié)核桿菌出現(xiàn)，對現(xiàn)有治療方案提出嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。2011年Science研究成果提出了PZA在體內(nèi)經(jīng)吡嗪酰胺酶(PZase)水解為吡嗪酸(POA)后，抑制核糖體30S小亞基的核糖體蛋白S1(RpsA)反式翻譯的作用機(jī)制。目前，臨床上產(chǎn)生的耐PZA結(jié)核分枝桿菌，一部分是由于吡嗪酰胺酶(PZase)缺失，使PZA無法水解為活性形式POA，而不能與RpsA結(jié)合，導(dǎo)致不能抑制反式翻譯過程；另一部分主要是由于RpsA結(jié)構(gòu)發(fā)生突變，使POA無法與RpsA結(jié)合，不能發(fā)生相互作用，從而導(dǎo)致失活。由此可見，RpsA可作為抗耐藥藥物開發(fā)的理想靶標(biāo)，而且RpsA只廣泛分布在細(xì)菌中，而在人類等哺乳動物中不存在，具有良好的特異性。基于反式翻譯機(jī)制和RpsA突變導(dǎo)致的結(jié)核耐藥桿菌的研究，有助于發(fā)現(xiàn)直接阻斷反式翻譯機(jī)制的小分子化合物，將有效解決PZA耐藥性問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本專利基于野生型結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S1、耐藥菌的438位丙氨酸缺失核糖體蛋白S1和固有耐藥的恥垢種屬核糖體蛋白S1(分別簡寫為MtRpsA、MtRpsAd438A和MsRpsA)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，建立基于受體結(jié)構(gòu)和配體相似性藥物篩選模型，通過分子水平的蛋白-配體相互作用研究和細(xì)胞水平的體外抑菌活性研究確認(rèn)，從含有數(shù)百萬化合物庫中篩選獲得了具有拮抗RpsA蛋白，并能有效抑制耐PZA結(jié)核分支桿菌化合物。本發(fā)明的化合物可用于耐吡嗪酰胺結(jié)核病及結(jié)核病的治療中。本專利涉及具有以下結(jié)構(gòu)通式(1)N-(噻吩-2)酰胺類化合物，以及相應(yīng)化合物在藥物上可接受的鹽類。X結(jié)構(gòu)表示C、N、O、S等元素，當(dāng)X＝C時，可連接R6。Y結(jié)構(gòu)表示C、N、O、S等元素，當(dāng)X＝C時，可連接R7。且X和Y至少有一個為N元素。R1結(jié)構(gòu)表示羥基、氨基、巰基、鹵素、硝基、R3、OR3、CR3R4R5、NHR3、NR3R4、SR3。R2、R6和R7結(jié)構(gòu)表示羥基、氨基、巰基、羧基、磺酸基、鹵素、硝基、氫原子、R3、OR3、CR3R4R5、NHR3、NR3R4、SR3、COR3、COOR3、OCOR3、NHCOR3、CONHR3、CONR3R4、SO2R3、PO3R3，其中R3、R4和R5結(jié)構(gòu)表示C1-C10的鏈狀或環(huán)狀烴基、烯烴基、炔烴基；“藥學(xué)上可接受的鹽”指含有無毒陰離子的鹽，例如(但不限于)氯化物、溴化物、碘化物、硫酸鹽、鹽酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、葡萄糖酸鹽、甲磺酸鹽和4-甲苯磺酸鹽。還可以指含有無毒陽離子的鹽，例如(但不限于)鈉、鉀、鈣、鎂、膽堿、乙醇胺、二乙醇胺、芐乙胺、哌嗪、N-甲基糖胺或氨丁三醇。本發(fā)明的方法能夠靶向核糖體蛋白S1，拮抗其反式翻譯過程中的功能，發(fā)揮抑制結(jié)核分枝桿菌和耐PZA結(jié)核分枝桿菌活性，可用于制備抗結(jié)核病藥物，特別是耐PZA結(jié)核病藥物。為了證明本發(fā)明拮抗RpsA和抑制結(jié)核分枝桿菌和PZA耐藥結(jié)核分枝桿菌活性，將化合物ZRL07和ZRL08進(jìn)行以下活性測定實驗。具體實施方式本發(fā)明主要涉及含N-(噻吩-2)酰胺類化合物的發(fā)現(xiàn)過程，以及分子水平的化合物與蛋白相互作用研究(熒光猝滅滴定方法)，以及細(xì)胞水平的體外抗結(jié)核分枝桿菌和耐PZA結(jié)核分枝桿菌的抑菌實驗。藥品與試劑樣品試劑：對照POA和PZA以及待測定化合物ZRL07和08；表達(dá)并純化的蛋白樣品：MtRpsA(285-476)、MtRpsAd438A(285-476)和MsRpsA(285-474)；結(jié)核分枝桿菌菌株：野生型的全敏菌株(H37Ra)和3個臨床發(fā)現(xiàn)的PZA耐藥菌株(PZA069、PZA080和PZA073)；其它常規(guī)化學(xué)試劑：DMSO、D2O、磷酸鹽緩沖液(PBS)等。儀器：熒光分光光度計(F-7000，日本日立公司)、羅氏培養(yǎng)基、恒溫培養(yǎng)箱、滅菌移液器和顯微鏡。1.化合物與蛋白的親和力大小和結(jié)合位點數(shù)測定準(zhǔn)備蛋白：表達(dá)純化三個蛋白(PBS6.0)，儲液濃度500uM?；衔餃?zhǔn)備：POA儲液(100mMPBS6.0和100mM100％DMSO)和ZRL07和08化合物(100mM100％DMSO)。實驗過程：配制實驗蛋白濃度梯度，POA作為陽性對照。對POA而言屬于水溶性的，配置配體濃度分別為0uM、10uM、20uM、30uM、40uM、50uM、60uM、70uM、80uM、90uM、100um、110uM、120uM、130uM、140uM、150uM、160uM和170uM，使POA的熒光猝滅效應(yīng)達(dá)到飽和。目的蛋白測定濃度為20uM。DMSO的終濃度為40％(v/v)，保證蛋白和藥品不沉淀。分別測定各個濃度的熒光強(qiáng)度，根據(jù)化合物的猝滅效應(yīng)不同，采用不同的濃度梯度，保證每個化合物的數(shù)據(jù)不少于8個。使用F-7000熒光光譜儀的參數(shù)設(shè)置：method為Wavelengthscan，Scanmode為Emission，Datamode為Fluorescence，EXWL：279.0nm，EMStartWL：290.0nm，EMEndWL：450.0nm，Scanspeed：1200nm/min，Delay：0.0s，EXSlit：2.5nm，EMSlit：2.5nm，PMTVoltage：700V，Response：0.002s。參數(shù)設(shè)置后，開始scanning獲得熒光譜圖。隨著猝滅劑的加入，熒光強(qiáng)度逐漸減小，直至不再減小，達(dá)到飽和。結(jié)果判斷：首先根據(jù)Stern-Volmerequation(如下)來判斷反應(yīng)為靜態(tài)猝滅，F(xiàn)0/F＝1+Ksv[Q]＝1+Kqτ0[Q]式中F0和F表示未加猝滅劑和加猝滅劑的熒光強(qiáng)度，[Q]為猝滅劑或配體的摩爾濃度，Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)，Kq為靜態(tài)猝滅常數(shù)，τ0為熒光壽命，一般為10-8s。Kq的最大值約為2.0*10-10，所求的kq遠(yuǎn)大該值表明為靜態(tài)猝滅。然后根據(jù)Hill方程(如下)計算結(jié)合常數(shù)和位點數(shù)，lg[(F0-F)/F]＝1gKa+nlg[Q]根據(jù)計算的Ka(或Kd)值確定結(jié)合強(qiáng)弱，根據(jù)N值確定結(jié)合位點數(shù)。測定的解離常數(shù)數(shù)據(jù)如表-1。表-12.化合物的體外抑菌活性研究實驗菌株：野生型的全敏菌株(H37Ra)和3個臨床發(fā)現(xiàn)的PZA耐藥菌株(PZA069、PZA080和PZA073)。(1)菌種轉(zhuǎn)種：接種于中性羅氏培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)，經(jīng)2-4周的培養(yǎng)獲得。(2)菌懸液的制備：在生物安全柜內(nèi)，取臨床標(biāo)本分離菌株，在0.5％Tween-80生理鹽水中研磨成勻漿，與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，配成濕重?mg/ml菌懸液，用生理鹽水將上述菌懸液1∶3稀釋至0.3mg/ml備用。(3)含藥培養(yǎng)基置備：無菌條件下，用液體培養(yǎng)基配制成藥物起始濃度，進(jìn)行倍比稀釋，蓋上蓋。以吡嗪酰胺(PZA)為對照組。其中PZA采用酸性培養(yǎng)基(pH5.5)條件測定，其它化合物采用中性培養(yǎng)基(pH7.4)測定。(4)將專用微量培養(yǎng)板上蓋打開，板內(nèi)各孔已經(jīng)預(yù)先加好培養(yǎng)基和相應(yīng)藥物，用滅菌移液器準(zhǔn)確吸取稀釋后的菌液20ul分別接種于每個反應(yīng)孔內(nèi)，使每孔中的接種量為6×10-3mg。接種完畢后，放入含濕布的密封盒內(nèi)，置37℃恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，每種藥物檢測如表-2所示(單位ug/ml)。(5)結(jié)果觀察：每間隔24h或48h，將專用培養(yǎng)板從37℃恒溫培養(yǎng)箱取出，觀察一次，采集細(xì)菌生長圖像，并與陰、陽對照孔圖像比較，與陽性對照孔生長數(shù)量和微小菌簇形態(tài)相似判為耐藥，反之為敏感。H37Ra25612864321684210.50.250.125PZA06925612864321684210.50.250.125PZA08025612864321684210.50.250.125PZA07325612864321684210.50.250.125表-2抑菌活性測試結(jié)果如表-3。從實驗結(jié)果可知，化合物ZRL07和ZRL08對H37Ra和的最小抑菌濃度PZA069、PZA080和PZA073明顯強(qiáng)于PZA，可有效的抑制結(jié)核分枝桿菌以及PZA耐藥結(jié)核分枝桿菌的生長，具有較好的抑菌效果，可應(yīng)用于吡嗪酰胺耐藥結(jié)核病及結(jié)核病的治療。表-3當(dāng)前第1頁1 2 3