本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種膜蹼畢赤酵母菌株其生物菌劑的制備方法及其應用。

背景技術(shù)：

目前好氧發(fā)酵堆肥生產(chǎn)商品有機肥仍是我國農(nóng)業(yè)廢棄物(主指畜禽糞便)最主要的處置利用方式，其設施簡便、處理量大、周期短、生產(chǎn)成本相對較低，畜禽糞等農(nóng)業(yè)廢棄物經(jīng)無害化高溫發(fā)酵堆腐后，含水率大幅度降低、有害病原微生物基本殺滅，運輸和施用都較為方便，但有機肥產(chǎn)品質(zhì)量需要符合《NY 525-2012有機肥料》標準，而采用的畜禽糞等原料在堆肥過程中會揮發(fā)產(chǎn)生大量氨氣及其他惡臭氣體，使得廢棄物處置場地及工人實際工作環(huán)境很差，對周邊環(huán)境造成不良影響，處理后的物料氮素損失較大，影響有機肥產(chǎn)品品質(zhì)進一步提升；目前，國內(nèi)對農(nóng)業(yè)廢棄物(主指畜禽糞便)的處置中產(chǎn)生的氨揮發(fā)及惡臭問題仍以調(diào)酸及通風、抽濾吸附等措施為主，但其氮素損失及臭氣污染環(huán)境問題依然存在，因此開發(fā)微生物菌劑用于的農(nóng)業(yè)廢棄物處置保氮除臭技術(shù)受到業(yè)內(nèi)廣泛關(guān)注。

含氮量較高的物質(zhì)在堆肥過程中常伴有氮損失，這不僅會造成營養(yǎng)元素的流失，還會導致周邊環(huán)境的污染。目前針對堆肥氮素損失控制的微生物菌劑的開發(fā)與研制還較少見。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種用于農(nóng)業(yè)廢棄物處置與利用中保氮除臭的膜蹼畢赤酵母，本發(fā)明還公開了利用該菌株生產(chǎn)的微生物菌劑及其制備方法。本發(fā)明提供的膜蹼畢赤酵母及其微生物菌劑，繁殖適應性強，能減少農(nóng)業(yè)廢棄物處置中氮的揮發(fā)或損失，農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥物料中總氮有所增加，且能促進物料保氮除臭；改善農(nóng)業(yè)廢棄物處理及利用效果。

本發(fā)明第一目的在于提供一種用于農(nóng)業(yè)廢棄物處置與利用中保氮除臭的膜蹼畢赤酵母菌株和含有該膜蹼畢赤酵母的微生物菌劑，及其在農(nóng)業(yè)廢棄物處置上的應用及其微生物菌劑。

本發(fā)明第二目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。

本發(fā)明第三目的在于提供上述膜蹼畢赤酵母菌株及其微生物菌劑在農(nóng)業(yè)廢棄物處置堆肥過程中的應用。

培養(yǎng)和纖維形態(tài)特征：麥芽汁液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)三天，細胞卵形、橢圓形、臘腸形，大小為(5.7-11.3)×(3.6-4.4)μm，有沉淀形成，芽殖。麥芽汁瓊脂斜而25℃培養(yǎng)一個月，菌落表面細皺，粗糙暗淡，灰白色，無光澤，邊緣樹根狀。玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng)，產(chǎn)生假菌絲。

理化特征如表1所示：

表1

菌株生理特征：見鑒定證書。

rRNA基因D1D2區(qū)序列測定結(jié)果如下：

AAATCGTGCCAATTTTTTTGGCACGAGTTGTAGAGTGTAGGCGGGAGTCTTTGTGGAGCACGGTGTCCAAGTCCC

TTGGAACAGGGCGCCTGAGAGGGTGAGAGCCCCGTGGGGTGTCGTGCGAAGCTTTGAGGCCCTGCTGACGAGTCGAGTT

GTTTGGGAATGCAGCTCCAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATACTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTA

CTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGC

CCGACATGGGGAGTGCGCACCGCTGTCTCTTGTAGGCGGCGCTCTGGGCGCTCTCTGGGCCAGCATCGGTTCTTGCTGC

GGGAGAATGGGTGCCGGAAAGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCGGCGCCAGATACCGCGTGCGGGGACCGAGGACTGC

GGCTTCTGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTCTT

其具體技術(shù)方案為：

一種膜醭畢赤酵母菌，菌株已于2016年1月27日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號(郵編100101)，保藏編號：CGMCC No.12112；分類命名為Pichia membranifaciens。

進一步，所述膜蹼畢赤酵母菌的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明所述膜蹼畢赤酵母菌在農(nóng)業(yè)廢棄物處置堆肥過程中的應用。

一種利用本發(fā)明所述膜蹼畢赤酵母菌制備的微生物菌劑，所述微生物菌劑為或固體菌劑，由膜蹼畢赤酵母菌和及其培養(yǎng)物組成；其活性成分為膜蹼畢赤酵母酵菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物。

優(yōu)選地，所述微生物菌劑其內(nèi)含有的膜蹼畢赤酵母菌的活菌數(shù)大于5.0×10⁷cfu/g或5.0×10⁷cfu/ml。

本發(fā)明所述微生物菌劑在農(nóng)業(yè)廢棄物處置堆肥過程中的應用。

一種本發(fā)明所述微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)保藏物膜蹼畢赤酵母菌接種到糖蜜和葡萄糖固體斜面，實施斜面活化培養(yǎng)；

(2)液體培養(yǎng)基擴培，獲取種子液；

(3)將擴培后的對數(shù)期種子液，按照2％的接種量接種至發(fā)酵擴大固體培養(yǎng)基質(zhì)或培養(yǎng)液中，充分攪拌混勻后，在28℃培養(yǎng)2-3d，培養(yǎng)結(jié)束后用于堆肥試驗及生產(chǎn)應用。

優(yōu)選地，采用所述對數(shù)期種子液固體培養(yǎng)基質(zhì)，選擇半發(fā)酵腐熟的酒糟、菇渣及麥麩，并加入10％的麩皮和1％的酵母膏，調(diào)節(jié)含水率至40％-50％，在28℃培養(yǎng)5-7d，培養(yǎng)結(jié)束后用于堆肥試驗及生產(chǎn)應用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供的膜蹼畢赤酵母及其微生物菌劑，繁殖適應性強，能減少農(nóng)業(yè)廢棄物處置中氮的揮發(fā)或損失，處置場地周邊的環(huán)境有所改善，農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥物料產(chǎn)品中總氮有所增加，且能促進物料保氮除臭；改善農(nóng)業(yè)廢棄物處理及利用效果。

附圖說明

圖1是不同比例保氮除臭菌劑對豬糞蠅蛆養(yǎng)殖處理氨揮發(fā)的影響；

圖2是蠅蛆養(yǎng)殖過程保氮菌劑對氨揮發(fā)的影響。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。

實施例1

保氮除臭試驗：噴灑保氮菌劑(膜蹼畢赤酵母菌株制備的微生物菌劑)試驗設4個處理，即對照CK(自來水)、處理T1(稀釋100倍菌劑)、處理T2(稀釋10倍的菌劑)和處理T3(菌劑原液)，試驗在養(yǎng)殖處理大棚中進行。每個處理池寬2.25m，長4米，處理間間隔2m；直接將等量豬糞400kg倒入池內(nèi)攤平，豬糞物料用擠壓糞及麥麩調(diào)整至含水率65％左右，上層鋪撒2cm厚擠壓糞，物料總厚度6-8cm，保氮菌劑施用量為1％(V/W)，均勻噴灑在物料表面，然后將蠅蛆幼蟲按7.5‰(w/w)接種量均勻撒在各處理豬糞物料中。定時定點測定各處理的氨揮發(fā)量，每個處理測定3個點，測定時間為每天早上10：30至11點之間；在豬糞蠅蛆養(yǎng)殖后第四天和第五天各按保單菌劑試驗設計再噴灑一次，并測定噴灑菌劑后各處理的氨揮發(fā)量，試驗周期為6天。

實施例2

養(yǎng)殖物料中氨揮發(fā)量的測定方法：根據(jù)銨態(tài)氮測定原理，氨揮發(fā)的量可被固定體積的硼酸吸收液(內(nèi)含特定甲基紅與溴甲酚綠指示劑，為酒紅色)吸收，氨被硼酸溶液吸收后，硼酸溶液由紅色逐漸轉(zhuǎn)為綠色，吸收氨的量越多吸收液的綠色越深，然后用標準酸滴定硼酸吸收液至酒紅色，根據(jù)滴定所消耗的標準酸的用量即可計算出硼酸中吸收氨的總量。試驗時定時定點在各蠅蛆養(yǎng)殖處理池中的養(yǎng)殖蠅蛆處理物料表面懸空放置3個特定的氨揮發(fā)收集容器(廣口，內(nèi)含250ml硼酸溶液，保證硼酸溶液足夠量以避免氨吸收達到飽和，可密閉運輸)，分別用固定體積的封閉容器(口大底小)倒扣在裝有硼酸溶液的氨揮發(fā)收集容器的物料上，該容器不與氨揮發(fā)收集容器接觸，而與養(yǎng)殖蠅蛆處理物料表面相密合。吸收氨氣測定時間為1小時/天，吸收完成后取出吸收裝置密閉保存，用作測定氨揮發(fā)量。在蠅蛆養(yǎng)殖的全過程中按蠅蛆生長的規(guī)律設定測定的頻度。

豬糞蠅蛆脫水處理過程中保氮菌劑應用效果顯示(圖1)：整個蠅蛆養(yǎng)殖過程中，氨揮發(fā)量是一個從低到高再下降的過程，養(yǎng)殖4天時，氨揮發(fā)量到達最大值；保氮菌劑對于降低豬糞蠅蛆處理過程中的氨揮發(fā)量效果是顯著的，噴施菌劑原液(T3)、稀釋10倍(T2)和稀釋100倍(T1)處理均比對照處理氨揮發(fā)量有所減少，呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律，原液保氮效果最好，稀釋10倍(T2)的次之，稀釋100倍(T1)的再次之；噴施菌劑原液的T3處理單位時間單位面積氨揮發(fā)量總體下降明顯，在峰值(4天)時比對照單位時間單位面積氨揮發(fā)量減少39.52％，在整個蠅蛆養(yǎng)殖處理6天周期內(nèi)，氨揮發(fā)量明顯減少，且變化平穩(wěn)；整個豬糞蠅蛆脫水處理過程隨著蠅蛆逐漸長大，幾個處理豬糞中氨揮發(fā)量逐漸變化減小而趨于一致。

在豬糞蠅蛆養(yǎng)殖過程中第4天和第五天，分別進行了保氮菌劑噴撒前后不同處理的氨揮發(fā)量測試(圖2)，在噴灑相同液體情況下，噴灑保氮菌劑均比不噴灑菌劑的氨揮發(fā)量有顯著減少，噴灑水也有一定的減少氨揮發(fā)的效果；蠅蛆養(yǎng)殖第4天的各試驗處理均比養(yǎng)殖第5天的氨揮發(fā)量大，而不同處理單位面積單位時間氨揮發(fā)量的排序為CK＞T1＞T2＞T3，說明保氮菌劑的保氮效果還是較為明顯的，且菌劑濃度越高，氨揮發(fā)量越小，保氮效果越好。

實施例3氮損失情況

豬糞經(jīng)蠅蛆養(yǎng)殖后堆肥過程中物料理化性質(zhì)變化及保氮菌劑(膜蹼畢赤酵母菌株制備的微生物菌劑)保氮除臭試驗氮損失情況如表2所示。

表2

由表1可得，在堆肥6天后，T3和T2處理氮損失比T0處理氮損失分別減少29.61％和4.79％，而T2T1處理氮損失較多，可能與初始氮含量較高相關(guān)。堆肥28天后，T3和T2處理氮損失比T0處理氮損失分別減少21.7％和4.79％，而49天后，T3和T2處理氮損失比T0處理氮損失分別減少14.18％和4.26％。說明保氮除臭菌劑對保氮具有一定的效果。而且堆肥時間越長，氮損失越多，由發(fā)芽指數(shù)試驗可知，本堆肥在28天，堆肥已腐熟，因此，本物料在堆置28天后即應停止堆肥，否則過度發(fā)酵，造成堆肥物料碳氮損失。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，本發(fā)明的保護范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。