本發(fā)明屬于真菌育種領(lǐng)域，具體涉及一種金針菇單細(xì)胞選育優(yōu)良菌株的方法。
背景技術(shù)：
：金針菇學(xué)名為毛柄金錢菌(Flammulinavelutiper(Fr.)Sing)，它既是一種美味食品，又是較好的保健食品。金針菇性寒，味甘、咸，具有補肝、益腸胃、抗癌的功效，主治肝病、胃腸道炎癥、潰瘍、腫瘤等病癥。金針菇中鋅含量較高，對預(yù)防男性前列腺疾病較有幫助。而且金針菇還是高鉀低鈉食品，可預(yù)防高血壓，對老年人也有益。金針菇氨基酸的含量也非常豐富，高于一般菇類，尤其是賴氨酸的含量特別高，賴氨酸具有促進(jìn)兒童智力發(fā)育的功能。最近有研究表明，金針菇還具有很好的抗癌作用。金針菇是我國工廠化生產(chǎn)發(fā)展最快的食用菌種類。幾十年來，為了跟上產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求，國內(nèi)同行一直致力于金針菇新品種的選育。品種選育必然需要進(jìn)行栽培出菇試驗，以確定其子實體形狀的優(yōu)劣，進(jìn)而選擇優(yōu)質(zhì)的菌種。金針菇品種選育方法主要有雜交育種、誘變育種和基因工程育種等，然而，這些方法的缺點在于：育種周期長、選育1個新品種需要3-5年，需要大量的原材料和設(shè)施設(shè)備。對于能源的消耗非常大，而且人力方面的需求也很大，另外也比較容易造成不同菌株孢子間的相互附著，造成菌種遺傳表現(xiàn)的不穩(wěn)地。這些缺點會導(dǎo)致資源方面的浪費，及研究經(jīng)費的約束，大大降低了育種效率。且金針菇菌種在長期保存過程中，用于菌絲細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核分離不一致，造成菌種活力下降。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種金針菇單細(xì)胞選育優(yōu)良菌株的方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種金針菇單細(xì)胞選育優(yōu)良菌株的方法，它包括以下步驟：S1.接種培養(yǎng)：在無菌環(huán)境下，取出發(fā)菌種塊，接種于菌絲體培養(yǎng)基中，在20～25℃靜置培養(yǎng)5～7d；S2.分離單細(xì)胞：取接種培養(yǎng)后的菌絲體3～5g放入容器中，加入細(xì)胞壁溶解酶制劑，在28～34℃下震蕩3～4h，過濾收集濾液用硫酸鎂溶液稀釋至單細(xì)胞濃度為1×103個/ml，得原生質(zhì)體懸浮液；S3.接種培養(yǎng)單細(xì)胞：取原生質(zhì)體懸浮液0.1ml涂抹接種于單細(xì)胞培養(yǎng)基表面，置于20～25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10d，待單細(xì)胞培養(yǎng)基表面生長出白色菌落后，選取單個菌落接種于新的單細(xì)胞培養(yǎng)基中，在20～25℃下繼續(xù)培養(yǎng)，選取具有雙核單細(xì)胞菌株進(jìn)行篩選試驗；S4.培養(yǎng)發(fā)菌：于無菌環(huán)境下在出菇培養(yǎng)基中接種雙核單細(xì)胞菌株，在20～25℃培養(yǎng)25～30d，長滿菌絲體；S5.出菇：將培養(yǎng)發(fā)菌后的菌袋移至出菇房內(nèi)，去除表面菌種，控制出菇房溫度為7～15℃、空氣相對濕度為90～95％，光照強度為5～10Lx，待子實體生長至3～4cm時，子實體上套塑料筒，塑料筒下端扎口固定，上端扎口并保留直徑為2～3cm的透氣孔，子實體生長長度至20～22cm時采收；S6.篩選：對單細(xì)胞菌種和出發(fā)菌種進(jìn)行菌絲體的生長速度、生育期、產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行比較，篩選出產(chǎn)量高于出發(fā)菌種10％以上的單細(xì)胞菌種為優(yōu)良菌種。進(jìn)一步地，步驟S1所述菌絲體培養(yǎng)基每1000ml含有下述重量的原料：酵母粉：5～6g、葡萄糖：20～22g、加水定容至1000ml。進(jìn)一步地，步驟S2中所述分離酶制劑為溶壁酶溶于0.6mol的MgSO4溶液。進(jìn)一步地，步驟S3中所述單細(xì)胞培養(yǎng)基每1000ml含有下述重量的原料：馬鈴薯：180～200g、蔗糖：100～110g、瓊脂：20g、加水定容至1000ml。進(jìn)一步地，步驟S4中所述出菇培養(yǎng)基由下述重量份的原料組成：棉籽殼70～90、麩皮15～22、石膏0.5～2、石灰0.5～2。所述培養(yǎng)基的含水量為60～70％。本發(fā)明具有以下優(yōu)點：金針菇品種選育是金針菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展關(guān)鍵之一，而傳統(tǒng)金針菇菌種在長期保存過程中，用于菌絲細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核分離不一致，造成菌種活力下降，本發(fā)明通過單細(xì)胞分離可獲得細(xì)胞核分裂同步的菌種，淘汰細(xì)胞核分裂不同步、退化的菌種，從而獲得更優(yōu)良菌種；利用本發(fā)明方法篩選出菌株的產(chǎn)量較雜交種高32.9％～39.3％，生育期和產(chǎn)品質(zhì)量與原菌種一致；本發(fā)明方法操作簡單、成本低、周期短、適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。實施例1：一種金針菇單細(xì)胞選育優(yōu)良菌株的方法，它包括以下步驟：S1.接種培養(yǎng)：在無菌環(huán)境下，取出發(fā)菌種塊，接種于菌絲體培養(yǎng)基中，在20℃靜置培養(yǎng)5d；所述菌絲體培養(yǎng)基每1000ml含有下述重量的原料：酵母粉：5g、葡萄糖：20g、加水定容至1000ml；制備方法為：在鍋內(nèi)裝入1000ml水，加入酵母粉和葡萄糖，使其完全融化，然后加水定容至1000ml，將培養(yǎng)基裝入體積為300ml三角瓶內(nèi)，裝量為50ml，瓶口用透氣膜封口，在高壓滅菌鍋內(nèi)121℃下滅菌處理30分鐘；S2.分離單細(xì)胞：取接種培養(yǎng)后的菌絲體3g放入容器中，加入細(xì)胞壁溶解酶制劑，分離酶制劑為溶壁酶溶于0.6mol的MgSO4溶液，在28℃下震蕩3h，過濾收集濾液用硫酸鎂溶液稀釋至單細(xì)胞濃度為1×103個/ml，得原生質(zhì)體懸浮液；S3.接種培養(yǎng)單細(xì)胞：取原生質(zhì)體懸浮液0.1ml涂抹接種于單細(xì)胞培養(yǎng)基表面，置于20℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8d，待單細(xì)胞培養(yǎng)基表面生長出白色菌落后，選取單個菌落接種于新的單細(xì)胞培養(yǎng)基中，在20℃下繼續(xù)培養(yǎng)，選取具有雙核單細(xì)胞菌株進(jìn)行篩選試驗；所述單細(xì)胞培養(yǎng)基每1000ml含有下述重量的原料：馬鈴薯：180g、蔗糖：100g、瓊脂：20g、加水定容至1000ml；制備方法為：將馬鈴薯去皮切成片，放入鍋內(nèi)，加入水1000ml，加熱煮沸30分鐘，用4層紗布過濾，在濾液中加入瓊脂，繼續(xù)加熱煮沸至瓊脂完全融化為止，加入蔗糖加熱攪拌至蔗糖完全融化，加入水定容至1000ml，取培養(yǎng)基200ml裝入300ml的三角瓶內(nèi)，用封口膜封口，在121℃滅菌處理30min，將無菌培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基為20ml，冷卻后即可；S4.培養(yǎng)發(fā)菌：于無菌環(huán)境下在出菇培養(yǎng)基中接種雙核單細(xì)胞菌株，在20℃培養(yǎng)25d，長滿菌絲體；所述出菇培養(yǎng)基由下述重量份的原料組成：棉籽殼70、麩皮15、石膏0.5、石灰0.5；S5.出菇：將培養(yǎng)發(fā)菌后的菌袋移至出菇房內(nèi)，去除表面菌種，控制出菇房溫度為7℃、空氣相對濕度為90％，光照強度為5Lx，待子實體生長至3cm時，子實體上套塑料筒，塑料筒下端扎口固定，上端扎口并保留直徑為2cm的透氣孔，子實體生長長度至20cm時采收；S6.篩選：對單細(xì)胞菌種和出發(fā)菌種進(jìn)行菌絲體的生長速度、生育期、產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行比較，篩選出產(chǎn)量高于出發(fā)菌種10％以上的單細(xì)胞菌種為優(yōu)良菌種。實施例2：一種金針菇單細(xì)胞選育優(yōu)良菌株的方法，它包括以下步驟：S1.接種培養(yǎng)：在無菌環(huán)境下，取出發(fā)菌種塊，接種于菌絲體培養(yǎng)基中，在25℃靜置培養(yǎng)7d；所述菌絲體培養(yǎng)基每1000ml含有下述重量的原料：酵母粉：6g、葡萄糖：22g、加水定容至1000ml；制備方法為：在鍋內(nèi)裝入1000ml水，加入酵母粉和葡萄糖，使其完全融化，然后加水定容至1000ml，將培養(yǎng)基裝入體積為300ml三角瓶內(nèi)，裝量為50ml，瓶口用透氣膜封口，在高壓滅菌鍋內(nèi)121℃下滅菌處理30分鐘；S2.分離單細(xì)胞：取接種培養(yǎng)后的菌絲體5g放入容器中，加入細(xì)胞壁溶解酶制劑，分離酶制劑為溶壁酶溶于0.6mol的MgSO4溶液，在34℃下震蕩4h，過濾收集濾液用硫酸鎂溶液稀釋至單細(xì)胞濃度為1×103個/ml，得原生質(zhì)體懸浮液；S3.接種培養(yǎng)單細(xì)胞：取原生質(zhì)體懸浮液0.1ml涂抹接種于單細(xì)胞培養(yǎng)基表面，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，待單細(xì)胞培養(yǎng)基表面生長出白色菌落后，選取單個菌落接種于新的單細(xì)胞培養(yǎng)基中，在25℃下繼續(xù)培養(yǎng)，選取具有雙核單細(xì)胞菌株進(jìn)行篩選試驗；所述單細(xì)胞培養(yǎng)基每1000ml含有下述重量的原料：馬鈴薯：200g、蔗糖：110g、瓊脂：20g、加水定容至1000ml；制備方法為：將馬鈴薯去皮切成片，放入鍋內(nèi)，加入水1000ml，加熱煮沸30分鐘，用4層紗布過濾，在濾液中加入瓊脂，繼續(xù)加熱煮沸至瓊脂完全融化為止，加入蔗糖加熱攪拌至蔗糖完全融化，加入水定容至1000ml，取培養(yǎng)基200ml裝入300ml的三角瓶內(nèi)，用封口膜封口，在121℃滅菌處理30min，將無菌培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基為25ml，冷卻后即可；S4.培養(yǎng)發(fā)菌：于無菌環(huán)境下在出菇培養(yǎng)基中接種雙核單細(xì)胞菌株，在25℃培養(yǎng)30d，長滿菌絲體；所述出菇培養(yǎng)基由下述重量份的原料組成：棉籽殼90、麩皮22、石膏2、石灰2；S5.出菇：將培養(yǎng)發(fā)菌后的菌袋移至出菇房內(nèi)，去除表面菌種，控制出菇房溫度為15℃、空氣相對濕度為95％，光照強度為10Lx，待子實體生長至4cm時，子實體上套塑料筒，塑料筒下端扎口固定，上端扎口并保留直徑為3cm的透氣孔，子實體生長長度至22cm時采收；S6.篩選：對單細(xì)胞菌種和出發(fā)菌種進(jìn)行菌絲體的生長速度、生育期、產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行比較，篩選出產(chǎn)量高于出發(fā)菌種10％以上的單細(xì)胞菌種為優(yōu)良菌種。實施例3：一種金針菇單細(xì)胞選育優(yōu)良菌株的方法，它包括以下步驟：S1.接種培養(yǎng)：在無菌環(huán)境下，取出發(fā)菌種塊，接種于菌絲體培養(yǎng)基中，在22℃靜置培養(yǎng)6d；所述菌絲體培養(yǎng)基每1000ml含有下述重量的原料：酵母粉：5.3g、葡萄糖：21g、加水定容至1000ml；制備方法為：在鍋內(nèi)裝入1000ml水，加入酵母粉和葡萄糖，使其完全融化，然后加水定容至1000ml，將培養(yǎng)基裝入體積為300ml三角瓶內(nèi)，裝量為50ml，瓶口用透氣膜封口，在高壓滅菌鍋內(nèi)121℃下滅菌處理30分鐘；S2.分離單細(xì)胞：取接種培養(yǎng)后的菌絲體3.5g放入容器中，加入細(xì)胞壁溶解酶制劑，分離酶制劑為溶壁酶溶于0.6mol的MgSO4溶液，在30℃下震蕩3.5h，過濾收集濾液用硫酸鎂溶液稀釋至單細(xì)胞濃度為1×103個/ml，得原生質(zhì)體懸浮液；S3.接種培養(yǎng)單細(xì)胞：取原生質(zhì)體懸浮液0.1ml涂抹接種于單細(xì)胞培養(yǎng)基表面，置于22℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9d，待單細(xì)胞培養(yǎng)基表面生長出白色菌落后，選取單個菌落接種于新的單細(xì)胞培養(yǎng)基中，在22℃下繼續(xù)培養(yǎng)，選取具有雙核單細(xì)胞菌株進(jìn)行篩選試驗；所述單細(xì)胞培養(yǎng)基每1000ml含有下述重量的原料：馬鈴薯：190g、蔗糖：105g、瓊脂：20g、加水定容至1000ml；制備方法為：將馬鈴薯去皮切成片，放入鍋內(nèi)，加入水1000ml，加熱煮沸30分鐘，用4層紗布過濾，在濾液中加入瓊脂，繼續(xù)加熱煮沸至瓊脂完全融化為止，加入蔗糖加熱攪拌至蔗糖完全融化，加入水定容至1000ml，取培養(yǎng)基200ml裝入300ml的三角瓶內(nèi)，用封口膜封口，在121℃滅菌處理30min，將無菌培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基為22ml，冷卻后即可；S4.培養(yǎng)發(fā)菌：于無菌環(huán)境下在出菇培養(yǎng)基中接種雙核單細(xì)胞菌株，在22℃培養(yǎng)26d，長滿菌絲體；所述出菇培養(yǎng)基由下述重量份的原料組成：棉籽殼75、麩皮18、石膏1、石灰1；S5.出菇：將培養(yǎng)發(fā)菌后的菌袋移至出菇房內(nèi)，去除表面菌種，控制出菇房溫度為10℃、空氣相對濕度為92％，光照強度為7Lx，待子實體生長至3.5cm時，子實體上套塑料筒，塑料筒下端扎口固定，上端扎口并保留直徑為2.5cm的透氣孔，子實體生長長度至21cm時采收；S6.篩選：對單細(xì)胞菌種和出發(fā)菌種進(jìn)行菌絲體的生長速度、生育期、產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行比較，篩選出產(chǎn)量高于出發(fā)菌種10％以上的單細(xì)胞菌種為優(yōu)良菌種。實施例4：一種金針菇單細(xì)胞選育優(yōu)良菌株的方法，它包括以下步驟：S1.接種培養(yǎng)：在無菌環(huán)境下，取出發(fā)菌種塊，接種于菌絲體培養(yǎng)基中，在24℃靜置培養(yǎng)6.5d；所述菌絲體培養(yǎng)基每1000ml含有下述重量的原料：酵母粉：5.8g、葡萄糖：21g、加水定容至1000ml；制備方法為：在鍋內(nèi)裝入1000ml水，加入酵母粉和葡萄糖，使其完全融化，然后加水定容至1000ml，將培養(yǎng)基裝入體積為300ml三角瓶內(nèi)，裝量為50ml，瓶口用透氣膜封口，在高壓滅菌鍋內(nèi)121℃下滅菌處理30分鐘；S2.分離單細(xì)胞：取接種培養(yǎng)后的菌絲體4.5g放入容器中，加入細(xì)胞壁溶解酶制劑，分離酶制劑為溶壁酶溶于0.6mol的MgSO4溶液，在32℃下震蕩3.5h，過濾收集濾液用硫酸鎂溶液稀釋至單細(xì)胞濃度為1×103個/ml，得原生質(zhì)體懸浮液；S3.接種培養(yǎng)單細(xì)胞：取原生質(zhì)體懸浮液0.1ml涂抹接種于單細(xì)胞培養(yǎng)基表面，置于24℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9.5d，待單細(xì)胞培養(yǎng)基表面生長出白色菌落后，選取單個菌落接種于新的單細(xì)胞培養(yǎng)基中，在24℃下繼續(xù)培養(yǎng)，選取具有雙核單細(xì)胞菌株進(jìn)行篩選試驗；所述單細(xì)胞培養(yǎng)基每1000ml含有下述重量的原料：馬鈴薯：195g、蔗糖：108g、瓊脂：20g、加水定容至1000ml；制備方法為：將馬鈴薯去皮切成片，放入鍋內(nèi)，加入水1000ml，加熱煮沸30分鐘，用4層紗布過濾，在濾液中加入瓊脂，繼續(xù)加熱煮沸至瓊脂完全融化為止，加入蔗糖加熱攪拌至蔗糖完全融化，加入水定容至1000ml，取培養(yǎng)基200ml裝入300ml的三角瓶內(nèi)，用封口膜封口，在121℃滅菌處理30min，將無菌培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基為24ml，冷卻后即可；S4.培養(yǎng)發(fā)菌：于無菌環(huán)境下在出菇培養(yǎng)基中接種雙核單細(xì)胞菌株，在24℃培養(yǎng)28d，長滿菌絲體；所述出菇培養(yǎng)基由下述重量份的原料組成：棉籽殼85、麩皮20、石膏1.5、石灰1.5；S5.出菇：將培養(yǎng)發(fā)菌后的菌袋移至出菇房內(nèi)，去除表面菌種，控制出菇房溫度為14℃、空氣相對濕度為94％，光照強度為9Lx，待子實體生長至4cm時，子實體上套塑料筒，塑料筒下端扎口固定，上端扎口并保留直徑為2cm的透氣孔，子實體生長長度至22cm時采收；S6.篩選：對單細(xì)胞菌種和出發(fā)菌種進(jìn)行菌絲體的生長速度、生育期、產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行比較，篩選出產(chǎn)量高于出發(fā)菌種10％以上的單細(xì)胞菌種為優(yōu)良菌種。對實施例1、2的出發(fā)菌株和篩選出的單細(xì)胞菌株的平均產(chǎn)量進(jìn)行對比，結(jié)果如表1所示。表1：實施例1、2金針菇單細(xì)胞菌株和出發(fā)菌株產(chǎn)量比較結(jié)果名稱出發(fā)菌株產(chǎn)量(g/袋)單細(xì)胞菌株(g/袋)實施例1467.1650.9實施例2187.4249.1當(dāng)前第1頁1 2 3