本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種桔霉素類化合物dicitrinoned制備方法及其在淋巴癌方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
桔霉素是一類由生物次級代謝產(chǎn)生的含氮有機(jī)化合物，自然界中的桔霉素種類較多，大多來源于植物，因此又有植物堿之稱。桔霉素對人和動物有重要的生理作用，包括平喘鎮(zhèn)咳、降血糖、降血脂、抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等，其中以抗菌、抗腫瘤活性最為突出。天然結(jié)構(gòu)桔霉素是創(chuàng)新藥物研究中發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的重要來源，目前應(yīng)用于臨床的桔霉素藥物已經(jīng)近百種。研究發(fā)現(xiàn)，一些海洋真菌能夠在次級代謝過程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性好的桔霉素,具有很好的藥用和產(chǎn)業(yè)化前景。
本發(fā)明人研究得知，桔青霉(penicilliumcitrinum)ibpt-5，(已于2013年12月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:武漢武漢大學(xué)，保藏編號是：cctccno：m2013713)的發(fā)酵產(chǎn)物的粗提取物有很好的細(xì)胞增殖抑制活性，遂對其活性成分進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)所示桔霉素類化合物具有抗淋巴癌活性，目前尚未見該化合物對人淋巴癌細(xì)胞u937的增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關(guān)的藥物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種桔霉素類化合物dicitrinoned制備方法及其在淋巴癌方面的應(yīng)用，該化合物具有抑制淋巴癌細(xì)胞增殖作用，具有抗淋巴癌活性，其結(jié)構(gòu)式為：
該化合物的制備方法，是通過發(fā)酵培養(yǎng)桔青霉(penicilliumcitrinum)ibpt-5，獲取發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出該化合物，具體步驟如下：
（1）發(fā)酵生產(chǎn)
培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取桔青霉(penicilliumcitrinum)ibpt-5接種到pda固體斜面培養(yǎng)基上在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，然后接種到培養(yǎng)液中，28℃靜止培養(yǎng)30天后，獲得菌絲體和發(fā)酵液；所述培養(yǎng)液組成：每升水含甘露醇20.0g、酵母膏3.0g、麥芽糖20.0g、味精10.0g、葡萄糖10.0g、kh2po40.5g、mgso40.3g和nacl30.0g；
（2）浸膏的獲得
用紗布將菌絲體和發(fā)酵液分離，將發(fā)酵液用兩倍體積的乙酸乙酯萃取兩次，萃取液減壓蒸餾至干，得到發(fā)酵液的乙酸乙酯浸膏；
（3）化合物的分離精制
該步驟（2）得到的乙酸乙酯浸膏通過100-200目硅膠拌樣后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為洗脫液用減壓硅膠色譜柱梯度洗脫，以二氯甲烷：甲醇為洗脫液，進(jìn)一步通過加壓硅膠柱層析梯度洗脫，得到二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脫物，再通過半制備液相色譜(1010型ods-a，10×250mm，5μm)：分離流速為5ml/min，流動相為85%乙腈含0.1%tfa，得到所示化合物，tr6.8min。
所述桔青霉(penicilliumcitrinum)ibpt-5，已于2013年12月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:武漢武漢大學(xué)，保藏編號是：cctccno：m2013713。
本發(fā)明還保護(hù)了所述的化合物在制備抑制淋巴癌細(xì)胞增殖藥物中的用途，及該化合物在制備抗淋巴癌藥物中的用途。所述淋巴癌細(xì)胞為人淋巴癌細(xì)胞u937。
本發(fā)明的有益效果在于：研究所示該桔霉素化合物較為罕見，所述桔霉素類化合物具有顯著的抑制淋巴癌細(xì)胞增殖活性，目前尚未見該化合物對人淋巴癌細(xì)胞u937增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關(guān)的藥物。
附圖說明：
圖1為化合物dicitrinoned主要的cosy，hmbc和noe信號。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不僅僅限于這些實施例。
在如下的實施例中所指的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
實施例1該化合物的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制
1發(fā)酵生產(chǎn)
生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)：按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取桔青霉(penicilliumcitrinum)ibpt-5(已于2013年12月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:武漢武漢大學(xué)，保藏編號是：cctccno：m2013713)適量，接種到pda固體斜面培養(yǎng)基上在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。
取斜面培養(yǎng)4天的桔青霉(penicilliumcitrinum)ibpt-5適量，接種到裝有400ml培養(yǎng)液[培養(yǎng)液組成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麥芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，kh2po40.5，mgso40.3，nacl30.0定容]的1000ml錐形瓶中，28℃靜止培養(yǎng)30天后，獲得菌絲體和發(fā)酵液。
2浸膏的獲得
用紗布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將發(fā)酵液用乙酸乙酯1:2(v/v)萃取兩次，萃取液減壓蒸餾至干，得到發(fā)酵液的乙酸乙酯浸膏32.0g。
3化合物的分離精制
該浸膏通過100-200目硅膠拌樣后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為洗脫液用減壓硅膠色譜柱梯度洗脫，得到11個組分。組分3(1.8g)(二氯甲烷的洗脫物)以二氯甲烷：甲醇為洗脫液，進(jìn)一步通過加壓硅膠柱層析梯度洗脫，得到的亞組分3-2(210mg)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脫物)，再通過半制備液相色譜(1010型ods-a，10×250mm，5μm)：分離流速為5ml/min，流動相為85%乙腈含0.1%tfa，得到所示化合物(4.6mg，tr6.8min)。
化合物白色粉末，高分辨質(zhì)譜hresi-ms在m/z359.1457處給出分子離子峰[m+h]+，(calcd.forc20h23o6,359.1489)，提示分子量為358，結(jié)合波譜信息推測分子式為c20h22o6。1h和13c-nmr數(shù)據(jù)見表1，主要的cosy，hmbc和noe信號見圖1。
表1nmr化合物的1h和13c-nmr數(shù)據(jù)(500mhz1hand125mhz13c，incdcl3)
實施例2體外抗腫瘤活性的測試
1實驗樣品及實驗方法
被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施1中分離精制的化合物純品。精密稱取適量樣品，用dmso配制成所需濃度的溶液，供測活性。
細(xì)胞系及細(xì)胞的繼代培養(yǎng)采用腫瘤細(xì)胞系，腫瘤細(xì)胞用含10%fbs的rpmi1640培養(yǎng)基，在37℃于通入5%co2的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
細(xì)胞增殖抑制活性測試方法
wst-1法取對數(shù)生長期的淋巴癌細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至每毫升5×104個細(xì)胞，按每孔100μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃通入5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸去上清液，加入含樣品的培養(yǎng)基100μl，繼續(xù)培養(yǎng)48h。每孔加入10μlwst-1液，培養(yǎng)4h。利用bio-rad公司產(chǎn)680型酶標(biāo)儀測定每孔在450nm處的吸光值(od)值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設(shè)置五孔，另設(shè)五孔空白對照和無細(xì)胞調(diào)零孔(如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細(xì)胞調(diào)零)。各孔o(hù)d值先做相應(yīng)無細(xì)胞調(diào)零，再取五孔平均od值按ir(%)=(od空白對照-od樣品)/od空白對照×100%式計算每個濃度下細(xì)胞增殖抑制率(ir%)。
2.實驗結(jié)果
細(xì)胞增殖抑制活性測試結(jié)果
在wst-1法測試中，根據(jù)不同濃度的該化合物的淋巴癌細(xì)胞增殖抑制率，應(yīng)用spss16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并計算半數(shù)抑制濃度ic50值，結(jié)果見表2。
表2化合物對人淋巴癌細(xì)胞增殖的抑制活性
3.結(jié)論
該化合物對人淋巴癌細(xì)胞u937具有較好的抗腫瘤活性，可作為制備淋巴癌細(xì)胞增殖抑制藥物或抗腫瘤藥物用于淋巴癌的研究。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。