模擬桔青霉素抗原的納米抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，設(shè)計(jì)一種模擬桔青霉素抗原的納米抗體，具有（a）SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列或?qū)⒃撔蛄薪?jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有針對(duì)抗桔青霉素單克隆抗體或多克隆抗體結(jié)合活性的由（a）衍生的與（a）具有90%以上同源性的氨基酸序列。本發(fā)明納米抗體能模擬模擬桔青霉素抗原，具有廣闊的市場(chǎng)空間。
【專利說(shuō)明】模擬桔青霉素抗原的納米抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本專利涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及模擬桔青霉素抗原的納米抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]桔青霉素(Citrinin, CIT),又稱為桔霉素,是青霉屬和曲霉屬等真菌菌株產(chǎn)生的真菌毒素，廣泛存在于多種食品及動(dòng)物飼料中。CIT污染也存在于傳統(tǒng)紅曲發(fā)酵產(chǎn)品，廣泛用于食品著色及風(fēng)味增強(qiáng)。同時(shí)因其發(fā)酵代謝產(chǎn)物有多種功能活性成分也用于保健食品中。毒理學(xué)研究表明CIT具有腎毒性、肝毒性和潛在的致畸性，且能引發(fā)腫瘤和誘發(fā)突變。嚴(yán)重危害人體和動(dòng)物的健康。因此，對(duì)食品中CIT含量的檢測(cè)監(jiān)控十分必要。
[0003]目前，常見(jiàn)的真菌毒素檢測(cè)方法有高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用分析法、免疫分析法。高效液相色譜法等儀器分析法具有檢測(cè)準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特點(diǎn)，但同時(shí)也有儀器價(jià)格昂貴、樣品前處理過(guò)程繁瑣、樣本檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品等缺點(diǎn)，因而其使用受到極大的限制，不適于基層監(jiān)控使用。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法以其高靈敏度、檢測(cè)方便、成本低廉等優(yōu)勢(shì)廣泛用于真菌毒素的初步檢測(cè)。然而，在方法建立過(guò)程中，必須使用真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品作為競(jìng)爭(zhēng)抗原和制備包被抗原，對(duì)檢測(cè)人員的健康和環(huán)境造成極大的威脅。因此，采用抗獨(dú)特型抗體及抗原模擬表位等技術(shù)可替代有害的毒素標(biāo)準(zhǔn)品，并已取得了一定的進(jìn)展。噬菌體展示技術(shù)已廣泛用于從天然抗體庫(kù)或免疫抗體庫(kù)中淘選得到特異抗體。該技術(shù)在研究未知蛋白空間結(jié)構(gòu)表位，受體與配體結(jié)合位點(diǎn)、尋找高親和力生物活性的配體分子及新型疫苗的開發(fā)等方面也得到 廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明通過(guò)對(duì)天然納米抗體噬菌體展示庫(kù)中，篩選得到能與抗桔青霉素單克隆抗體特異結(jié)合的納米抗體，該抗體具有與天然CIT分子相似的反應(yīng)特性，能替代毒性較強(qiáng)的CIT標(biāo)準(zhǔn)品，并可作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于CIT的免疫學(xué)檢測(cè)。
[0005]本發(fā)明以抗CIT單克隆抗體為靶分子，將其固相包被于酶標(biāo)板上，加入噬菌體展示的天然駝源單域重鏈納米抗體庫(kù)，進(jìn)行親和淘選，獲得了可以模擬桔青霉素抗原的納米抗體。
[0006]本發(fā)明模擬桔青霉素抗原的納米抗體:
Ca)該抗體的氨基酸序列如下:
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAGSGRTFNRYPMSWFRQVPGKEREFVAEINWSGSSTYYADSVKGRFTISRD
NAKNTVFLQMSSLKPEDTAVYYCAAGSPGRYDYWGQGTQVTVSS
上述納米抗體的序列中，大寫英文字母分別代表二十一種已知的天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體的一種，即A代表丙氨酸殘基，C代表半胱氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，E代表谷氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，G代表甘氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，M代表蛋氨酸殘基，N代表天冬酰胺酸殘基，P代表脯氨酸殘基，Q代表谷胺酰氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，T代表蘇氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，W代表色氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基。
[0007](b)將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有針對(duì)抗桔青霉素單克隆抗體結(jié)合活性的由(a)衍生的與(a)具有90%以上同源性的氨基酸序列。
[0008]本發(fā)明還涉及所述模擬桔青霉素抗原的納米抗體的核苷酸。
[0009]以及，包含所述核苷酸序列的載體，包含所述的載體的宿主細(xì)胞。
[0010]本發(fā)明提及的模擬桔青霉素抗原的納米抗體可通過(guò)噬菌體擴(kuò)增或基因工程重組表達(dá)的方式進(jìn)行大量制備。噬菌體擴(kuò)增是指將展示有模擬桔青霉素抗原的納米抗體的噬菌體，通過(guò)生物擴(kuò)增的方式，大量繁殖展示有該納米抗體的噬菌體粒子。基因工程重組表達(dá)的方式是指將編碼該抗體的基因，通過(guò)克隆至表達(dá)載體上，以蛋白的形式大量制備。
[0011]本發(fā)明還涉及所述的該納米抗體在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)、膠體金免疫層析、免疫斑點(diǎn)雜交等基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)分析檢測(cè)方法。
[0012]本發(fā)明模擬桔青霉素抗原的納米抗體在應(yīng)用時(shí)，可通過(guò)噬菌體擴(kuò)增獲得的展示有該納米抗體的噬菌體粒子直接用于分析檢測(cè)，也可以通過(guò)基因工程表達(dá)成蛋白作為包被抗原用于分析檢測(cè)。當(dāng)然，也可作為CIT標(biāo)準(zhǔn)品的代替物來(lái)進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)分析。
[0013]還涉及該納米抗體以固相抗原或競(jìng)爭(zhēng)抗原在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。 [0014]前述該納米抗體可替代具有較強(qiáng)毒性CIT標(biāo)準(zhǔn)品，并作為固相包被抗原或競(jìng)爭(zhēng)抗原應(yīng)用于CIT的免疫學(xué)檢測(cè)。該納米抗體具有與天然CIT分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。
[0015]本發(fā)明的意義在于可替代毒性較強(qiáng)的CIT標(biāo)準(zhǔn)品，并可作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相抗原應(yīng)用于CIT的免疫學(xué)檢測(cè)，具有和天然CIT分子相似的免疫反應(yīng)特異性。該方法成本低，可多樣品同時(shí)檢測(cè)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為該納米抗體以噬菌體展示形式作為競(jìng)爭(zhēng)抗原時(shí)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)范圍 1.50 - 45.94 ng/mL, IC50 % 11.55 ng/mL。
[0017]圖2為該納米抗體以抗體蛋白形式作為固相包被抗原時(shí)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)范圍 12.14-196.35 ng/mL, IC50 為 48.94 ng/mL。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0019]實(shí)施例1.抗桔青霉素單克隆抗體的制備 (一)免疫抗原的制備
桔青霉素為小分子半抗原不具備免疫源性，但可以通過(guò)偶聯(lián)大分子載體蛋白使其具有免疫源性。通過(guò)對(duì)桔青霉毒素結(jié)構(gòu)分析，其具有羥基、羧基和羰基三個(gè)基團(tuán)，都可通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。但羧基和羥基是其抗原決定簇中的重要基團(tuán)，若利用其作為連接基團(tuán)與蛋白質(zhì)連接將導(dǎo)致桔青霉素抗原性的改變，不能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)桔青霉素分子的抗體。故采用甲醛加成法，通過(guò)桔青霉素分子上的C1位置的活潑氫制備桔青霉素人工抗原。具體步驟如下:0.5 mg桔青霉素溶解于150 μ I甲醇中，加入100 μ I 37%的甲醛，滴入5 mg匙眼貝血藍(lán)蛋白(KLH，pH 4.2)溶液中，37 °C反應(yīng)24 h，即得到桔青霉素人工抗原。同樣與卵清蛋白(OVA)反應(yīng)得到的桔青霉素人工抗原作為檢測(cè)抗原。反應(yīng)結(jié)束后，置
0.01 M PBS 4°C透析 72h。
[0020](二)抗桔青霉素單克隆抗體的制備
BALB/c小鼠經(jīng)桔青霉素人工抗原免疫4次后，間隔四周，尾靜脈注射人工抗原0.05mg/只，3天后，脾細(xì)胞在50% PEG融合劑作用下與對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SP2/0雜交瘤細(xì)胞融合。經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)7d后，換HT培養(yǎng)基培養(yǎng)，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行間接ELISA篩選陽(yáng)性克隆，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選分泌抗桔青霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法亞克隆3次均為100%的陽(yáng)性后，建立細(xì)胞系并凍存。并將雜交瘤細(xì)胞接種于提前注射降植烷的BALB/c小鼠腹腔，制備腹水，經(jīng)辛酸.硫酸銨沉淀法純化單抗。
[0021](三)抗桔青霉素單克隆抗體的鑒定
經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)，篩選到一株分泌抗桔青霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(4G6)，3次亞克隆后，全部克隆為陽(yáng)克隆。采用小鼠單抗分型試紙條測(cè)定該單抗為IgG2a型。與其他0ΤΑ、ZEN、AFB1和DON等常見(jiàn)的真菌毒素基本無(wú)交叉反應(yīng)。成功篩選得到抗桔青霉素單克隆抗體。
[0022]實(shí)施例2.天然單域重 鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定 (一)天然單域重鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建
從兩只健康未免疫的羊駝白細(xì)胞中提取總RNA。以O(shè)ligo dT反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，經(jīng)半巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因。將噬菌粒載體pHENl和PCR擴(kuò)增得到的可變區(qū)編碼基因分別用Sfi !,Not I雙酶切后，用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TGl中，取10 μ L轉(zhuǎn)化后菌液倍數(shù)稀釋測(cè)定庫(kù)容量。其余菌液涂布于含100 μ g/mL2XYT培養(yǎng)板上。用含30%甘油的2XYT培養(yǎng)基刮下所有菌落。接種10倍庫(kù)容量的活細(xì)胞于5mL的2XYT (含2%葡萄糖、100 μ g/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，37°C，220r/min培養(yǎng)至OD 600nm達(dá)0.5，按感染復(fù)數(shù)20:1加入輔助噬菌體，371:、2201./!^!!培養(yǎng)60min。將培養(yǎng)物在1000 g離心10min，用50mL的2XYT(含100 μ g/mL氨芐青霉素和50 μ g/mL卡那霉素)培養(yǎng)液重懸沉淀，30°C>220r/min過(guò)夜培養(yǎng)，8000g離心取上清，PEG法純化噬菌體，即得到噬菌體展示抗體文庫(kù)，取10 μ L測(cè)定滴度，其余分裝于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0023](二)抗體噬菌體展示文庫(kù)的鑒定
隨機(jī)挑取40個(gè)克隆進(jìn)行分析，利用載體上的通用引物(M13-R和pHEN-R)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。其中有35個(gè)能擴(kuò)增出400-750bp條帶，提示文庫(kù)的克隆效率約為87%，因此該初級(jí)文庫(kù)的實(shí)際庫(kù)容為1.9 X IO7個(gè)。
[0024]實(shí)施例3.模擬桔青霉素抗原納米抗體的親和淘選及其鑒定 (一)納米抗體的親和淘選
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗CIT單克隆抗體4G6，并以終濃度100 μ g/mL包被于酶標(biāo)板上，4°C孵育過(guò)夜。第二天用PBST (PBS包含0.1% Tween-20 (v/v))洗滌10次后，加入300 μ I封閉液(3% BSA-PBS)4°C孵育I小時(shí)。I小時(shí)后棄封閉液，用PBST洗滌5次，加入100 μ I制備的噬菌體展示抗體文庫(kù)(用PBS稀釋噬菌體至約1.0 X IO11 c.f.u)，37°C孵育反應(yīng)I小時(shí)。棄去未結(jié)合的噬菌體，用PBST洗滌10次，結(jié)合上的噬菌體用0.2 MGlycine-HCl (pH 2.2)洗脫，并立即用 15 μ I I M Tris-HCl (pH 9.1)中和。取 10 μ I洗脫噬菌體測(cè)定滴度，其余的用于感染20mL生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)前期的疋coli TGl菌株進(jìn)行擴(kuò)增。次日用PEG/NaCl沉淀純化噬菌體，并測(cè)定擴(kuò)增后噬菌體的滴度。噬菌體回收率按以下公式計(jì)算:回收率=(洗脫噬菌體/投入噬菌體)X 100%。
[0025]在隨后三輪淘選過(guò)程中，包被的抗CIT單克隆抗體濃度分別為75 μ g/mL, 50 μ g/mL，25y g/mL，并用CIT標(biāo)品溶液替代酸洗脫液，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗脫。洗脫噬菌體的擴(kuò)增同上。
[0026](二)陽(yáng)性噬菌體克隆的鑒定
從平板上隨機(jī)挑取30個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增。用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗CIT單克隆抗體，10 Pg/mL包被96孔酶標(biāo)板，4°C孵育過(guò)夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05%Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有4%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行封閉，37°C孵育I小時(shí)。投入100 μL擴(kuò)增后的噬菌體克隆，以原始噬菌庫(kù)體作為陰性對(duì)照，噬菌體濃度梯度稀釋，37°C孵育I小時(shí)。加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育I小時(shí)。然后用TMB底物顯色，酶標(biāo)儀(Thermo Scientific, USA)讀取450 nm處的吸收值。選取OD45c!大于陰性對(duì)照2倍的噬菌體克隆為陽(yáng)性克隆。
[0027](三)噬菌體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗CIT單克隆抗體，10 Pg/mL包被96孔酶標(biāo)板，4°C孵育過(guò)夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有4%脫脂奶粉的PBS封閉，37°C孵育I小時(shí)。投入50 μL噬菌體和50 μL CIT (100ng/mL)，37°C孵育I小時(shí)。加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育0.5小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取OD450。能結(jié)合抗CIT單克隆抗體，且能被CIT標(biāo)準(zhǔn)品阻斷的噬菌體pHEN-X27，鑒定為模擬桔青霉素抗原的陽(yáng)性克隆。
[0028]實(shí)施例4.編碼模擬桔青霉素抗原的納米抗體基因的測(cè)序及氨基酸序列的確定 將前述得到的陽(yáng)性克隆PHEN-X27進(jìn)行擴(kuò)增，菌液送自南京金斯瑞測(cè)序公司測(cè)序。依據(jù)
測(cè)序結(jié)果及密碼子表可獲得該納米抗體的氨基酸序列為:QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAGSGRTFNRYPMSWFRQVPGKEREFVAEINWSGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVFLQMSSLKPEDTAVYYCAAGSPGRYDYWGQGTQVTVSS。
[0029]實(shí)施例5.模擬桔青霉素抗原的納米抗體的大量制備 (一)以噬菌體擴(kuò)增的方式制備
將展示有含有模擬桔青霉素抗原的納米抗體陽(yáng)性克隆子的TGl菌液加入至20mL2XYT (含有氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入輔助噬菌體進(jìn)行救援。37°C孵育I小時(shí)后離心，用等體積培養(yǎng)基2 X YT (含有氨芐青霉素和卡那霉素)重懸菌體后，30°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。次日離心后，取上清加入1/5體積的PEG/NaCl，4°C靜置2小時(shí)。離心后，棄上清，加入ImL PBS重懸沉淀，即為噬菌體擴(kuò)增液。
[0030](二)以納米抗體蛋白的方式制備
從含有模擬桔青霉素抗原的納米抗體陽(yáng)性克隆子的TGl菌液提取質(zhì)粒后，經(jīng)Afco I和Not I雙酶切后回收編碼抗體的基因片段，然后亞克隆至表達(dá)載體pET-25b (+) (Novagen公司，加入6個(gè)組氨酸標(biāo)簽)，電轉(zhuǎn)化至Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。涂布于LB-A(含氨芐青霉素)固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，得到陽(yáng)性克隆。
[0031]將上述得到的陽(yáng)性克隆子，從平板上挑單菌落接種于5mL LB-AC (含氨芐青霉素和氯霉素)液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)物按1%接種量(v/v)接種于50mL的LB-AC培養(yǎng)基中，370C，200r/min振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)物細(xì)菌濃度0D600達(dá)到0.7-0.9時(shí)，加入終濃度為0.1 mM的IPTG誘導(dǎo)，30°C振蕩培養(yǎng)6_8小時(shí)。離心收集菌體沉淀，重懸于I mL PBS溶液中，超聲破碎后，離心取上清。經(jīng)過(guò)Ni柱純化后，得到較高純度的納米抗體蛋白。
[0032]實(shí)施例6.模擬桔青霉素抗原的納米抗體作為競(jìng)爭(zhēng)抗原在ELISA中的應(yīng)用 (一)樣品提取
取紅曲液態(tài)發(fā)酵樣品2 mL，加入甲醇萃取后用PBS調(diào)至甲醇終濃度為10%，樣品待測(cè)。
[0033](二)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗CIT單克隆抗體，0.75 Pg/mL包被于96孔酶標(biāo)板，4°C孵育過(guò)夜。次日用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有4%脫脂奶粉的PBS封閉，37°C孵育I小時(shí)后，再用PBST洗滌3次，4°C保存待用。
[0034](三)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
取出經(jīng)上述步驟處理的酶標(biāo)板，每孔分別投入50 μL表面展示有納米抗體的噬菌體和一系列不同濃度的50 μL CIT標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時(shí)。加入1:5000稀釋HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育0.5小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以CIT濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入CIT的孔的OD450/未加入CIT孔的OD45tlX 100%)為縱坐標(biāo)，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型，線性相關(guān)性較好，檢測(cè)范圍1.50 - 45.94 ng/mL, IC50為11.55 ng/mL (圖1)。
[0035](四)樣品的檢測(cè)
取出處理好的酶標(biāo)板，每孔分別投入50 μL表面展示有納米抗體的噬菌體和待測(cè)樣品提取液，其余步驟同上述步驟。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，倒推出樣品中CIT的含量。
[0036]實(shí)施例7.模擬桔青霉素抗原的納米抗體作為固相抗原在ELISA中的應(yīng)用 (一)樣品提取
取紅曲大米固體發(fā)酵樣品lg，加入5mL甲醇超聲萃取20 min后，靜置30min，將上清液轉(zhuǎn)入具塞試管中。殘?jiān)偌?mL甲醇超聲萃取，共萃取3次，合并上清液。取適量用PBS調(diào)至甲醇終濃度為10%后待測(cè)。
[0037](二)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗納米抗體至終濃度1.8 Pg/mL，取100μΙ包被于96孔酶標(biāo)板，4°C孵育過(guò)夜。次日用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有4%脫脂奶粉的PBS封閉，37°C孵育I小時(shí)后，再用PBST洗滌3次，4°C保存待用。
[0038](三)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
取出經(jīng)上述步驟處理的酶標(biāo)板，每孔分別投入50 41濃度為3.5 Pg/mL抗CIT單克隆抗體和一系列不同濃度的50 μL CIT標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時(shí)。加入1:2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37°C孵育0.5小時(shí)。然后用TMB底物顯色，讀取0D.。以CIT濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入CIT的孔的OD45tl/未加入CIT孔的OD45tlX 100%)為縱坐標(biāo)，結(jié)果也顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線呈S型，線性相關(guān)性較好，檢測(cè)范圍12.14-196.35 ng/mL, IC50為48.94 ng/mL(圖 2)。
[0039](四)樣品的檢測(cè)取出處理好的酶標(biāo)板，每孔分別投入50 μL濃度為3.5Pg/mL抗CIT單克隆抗體和待測(cè)樣品提取液，其余步驟同上述步驟。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，倒推出樣品中CIT的含量。
[0040]實(shí)施例7:易錯(cuò)PCR法對(duì)模擬桔青霉素抗原的納米抗體進(jìn)行改造
以噬菌粒pHEN-X27作為模板，易錯(cuò)PCR向X27的DNA序列片段中隨機(jī)引入突變，上游引物 F:5’ -TCG CGG CCC AGC CGG CCA TGG CCC AGT TGC AGC TG -3’，下游引物 R:5’_CGA GTG CGG CCG CTT GTG GTT TTG GTG TCT TGG G- 3’。50 μ L 易錯(cuò) PCR 體系如下:5μ L IOX 易錯(cuò)PCR緩沖液(500 mmol/L KCl, 70 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L Tris-HCl pH8.3，0.1%(W/V，明膠));0.5 mmol/L dATP/dGTP, 2.5 mmol/L dCTP/dTTP;引物 F/R 各 40pmol ；MgCl2 7 mmol/L ；MnCl2 0.3 mmol/L ；Taq DNA 聚合酶 2.5 U, ddH20 補(bǔ)至 50 μ L。PCR擴(kuò)增條件:94° C，3 min ；94° C I min, 59° C I min, 72° C 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72。C 10min。易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后，用限制性內(nèi)切酶SfiI和? I對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和噬菌粒pHENl進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化試劑盒純化后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TGl感受態(tài)細(xì)胞，涂布LBA平板，37° C過(guò)夜培養(yǎng)。將獲得的轉(zhuǎn)化子用輔助噬菌體KM13進(jìn)行救援，得到展示突變的X27片段的噬菌體展示突變文庫(kù)。
[0041]采用應(yīng)用實(shí)例3中的親和淘選和鑒定的方法，獲取具有與原始單域重鏈抗體X27同樣性質(zhì)(即與天然桔青霉素分子相似的反應(yīng)特性，能與抗桔青霉素單克隆抗體或多克隆抗體結(jié)合)的突變體，這些突變體的氨基酸序列具有與抗桔青霉素單克隆抗體或多克隆抗體結(jié)合活性，由(a)衍生 的與(a)具有90%以上同源性。
【權(quán)利要求】
1.模擬桔青霉素抗原的納米抗體，其特征如(a)或(b)所述:(a)、具有SEQID N0.:1所示的氨基酸序列；或(b)、將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有針對(duì)抗桔青霉素單克隆抗體或多克隆抗體結(jié)合活性的由(a)衍生的與(a)具有90%以上同源性的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述模擬桔青霉素抗原的納米抗體的核苷酸。
3.包含權(quán)利要求2所述核苷酸序列的載體。
4.包含權(quán)利要求3所述的載體的宿主細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述納米抗體的制備方法，其特征在于通過(guò)噬菌體擴(kuò)增或基因工程重組表達(dá)的方式進(jìn)行大量制備；所述噬菌體擴(kuò)增是指將展示模擬桔青霉素抗原的納米抗體的噬菌體，通過(guò)生物擴(kuò)增的方式，大量繁殖展示有納米抗體的噬菌體粒子；所述基因工程重組表達(dá)的方式是指將編碼納米抗體的基因，通過(guò)克隆至表達(dá)載體，以抗體蛋白的形式大量制備。
6.權(quán)利要求1所述模擬桔青霉素抗原的納米抗體在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于該納米抗體以固相抗原或競(jìng)爭(zhēng)抗原在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C07K16/42GK103965358SQ201410160576
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】李燕萍, 許楊, 熊亮, 何慶華 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)