一種潛在的高效重組HIV-1 CRF07-BC gp140免疫原的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種潛在的高效重組HIV-1?CRF07-BC?gp140免疫原的制備方法。該免疫原基于國際上已經發(fā)表和本實驗室獲得的HIV-1包膜蛋白晶體結構而設計，具體方法為運用重疊延伸PCR技術，獲得gp140的基因片段，將目的基因克隆入真核表達載體pMT，經質粒大提去除內毒素后，與抗性篩選質粒pCoBlast一起共轉染黑腹果蠅Schneider2(S2)細胞，用殺稻瘟菌素(Blasticidin?S)進行陽性克隆篩選，篩選出穩(wěn)定高效分泌表達gp140的S2細胞系。擴大培養(yǎng)后，經鎳柱親和層析和凝膠過濾層析兩步純化，即可獲得純度很高的gp140。經一系列生物化學和生物物理技術證明該gp140聚合狀態(tài)均一，抗原反應性高，非常適合作為免疫原用于艾滋病亞單位疫苗或多價聯(lián)合疫苗的研發(fā)。
【專利說明】—種潛在的高效重組HIV-1 CRF07-BC gp140免疫原的制備
方法
所屬【技術領域】:
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及到基于蛋白質結構的免疫原設計，分子克隆，脂質體轉染，蛋白質表達純化，分析型超速離心(SV-AUC)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等技術。
【背景技術】:
[0002]艾滋病(accquiredimmunodeficiency syndrome, AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染所導致的一種病死率極高的正在全球肆虐的慢性傳染病。HIV分為兩種:HIV-1和HIV-2，HIV-1的毒性與傳染性均高于HIV-2，在全球范圍內引發(fā)AIDS的流行，HIV-2則基本只存在于西部非洲部分地區(qū)。世界衛(wèi)生組織網站的數據顯示，截止2013年10月，全球艾滋病病毒感染者人數為3600萬，累計死亡超3600萬，2012年新增艾滋病病毒感染者230萬，160萬人因艾滋病而死亡。到2012年我國實際HIV感染人數已超過100萬，中國成人流行率為0.1%~0.5%,防控形勢比較嚴峻。
[0003]艾滋病的流行已成為嚴重影響人類健康和全球社會經濟發(fā)展的公共衛(wèi)生問題。目前仍沒有針對HIV的特效治療方法，雖然高效抗逆轉錄病毒的治療方法(highly activeantiretroviral therapy, HAART)已經在減輕患者痛苦、延長患者壽命等方面取得了一定的效果，但用于治療HIV感染的藥物只能控制病毒復制，不能徹底清除病毒，而且抗HIV藥物價格昂貴，具有較嚴重的副作用，藥物使用不當，也會誘發(fā)耐藥株的產生。因此，研制安全、有效的疫苗是控制HIV傳播的重要手段之一，被認為是預防艾滋病的最有效工具。
[0004]流行病學調查顯示，HIV-1不同亞型或流行重組型在不同地域的感染者中所占比例有很大差異。而不同型別間免疫原性和抗原性的差異也導致針對某一亞型病毒的疫苗對另一亞型的病毒并無很好的交叉保護效果。這一情況給HIV疫苗的研發(fā)帶來很大挑戰(zhàn)。在我國，HIV-1最主要的流行亞型或流行重組型是CRF07-BC，CRF08-BC, B’(泰國B)和CRF01-AE，其中B’ /C重組毒株(CRF07_BC、CRF08_BC)感染比例在全部感染者中逐年上升，所占比已超過50 %，表明該重組病毒可能獲得了某種傳播優(yōu)勢而有加速流行的趨勢，并在傳播過程中逐漸取代了親代B’和C亞型HIV-1毒株。無論從B’/C重組株在我國感染者中所占的比例還是該毒株表現出的傳播優(yōu)勢來看，選擇B’ /C重組毒株主要抗原作為疫苗的免疫原都有利于迅速遏制我國艾滋病的蔓延。
[0005]有效的疫苗通常需要高效的抗體反應來阻斷感染和清除抗原，因此廣譜高效中和抗體的產生對艾滋病疫苗的成功至關重要。HIV-1包膜糖蛋白(Env)的前體蛋白gpl60在靶細胞的粗面內質網中起始合成、折疊并伴隨著寡聚化和部分糖基化，隨后被輸送到高爾基體中，經furin蛋白酶家族剪切形成成熟的表面糖蛋白gpl20(SU)和跨膜蛋白gp41 (TM)，酶切后gpl20和gp41仍然非共價地聯(lián)系在一起形成異二聚體并進一步糖基化，最終定位于病毒表面，形成由三個gpl20分子和三個gp41分子構成的三聚體(trimer)刺突(spike)。因為包膜糖蛋白(Env)是病毒唯一暴露于外部環(huán)境中的結構，所以是人體中和抗體識別并中和的最主要的病毒成分，這樣就使得Env —直以來都是HIV疫苗研發(fā)的焦點。如何進一步提高Env的免疫原性就成了擺在廣大研究者面前的一個至關重要的難題。起初，大家的興趣主要集中在單體Env組分一gpl20和gp41上面，結果卻很不理想。隨后，大家的目光就逐漸轉到了類似于天然構象的可溶的三聚體Env胞外結構域gpl40上面。研究發(fā)現三聚體的gpl40確實可以比單體的gpl20觸發(fā)更強的中和抗體反應，并且具有幾乎和完整病毒刺突一樣的全部抗原性質，所以三聚體gpl40就成了以誘導中和抗體為主要目標的艾滋病疫苗的一個重要發(fā)展方向。目前效果最好的是BG505S0SIP.664gpl40三聚體，它在野生型序列的基礎上做了許多改變，包括1)A501C和T605C(參照HIV-1HXB2標準株gpl60編號，下同)替換以在gpl20和gp41胞外域形成二硫鍵，2) I559P替換以增強三聚體的穩(wěn)定性，3)膜近外側區(qū)(MPER)的刪除以增強三聚體的可溶性和減少高聚體的形成，4)T332N的替換以產生依賴于該糖苷的多個廣譜中和抗體的表位利于純化，furin的自然位點(REKE)替換為最適位點(RRRRRR，R6)以利于切割完全。但是該三聚體有一個缺點，二硫鍵的引入雖然在穩(wěn)定gpl20和gp41胞外域相互作用的過程中起了十分重要的作用，但也有可能將此gpl40鎖定在融合前的構象(該gpl40的晶體和電鏡的結構支持此觀點)，作為免疫原并不一定利于廣譜中和抗體的產生。
[0006]我們在最常規(guī)的突變掉furin的酶切位點(K/R-X-K/R-R，REKR)以獲得未切割的gpl40 (uncleaved gpl40, gpl40unc)的基礎上,通過基于結構的優(yōu)化設計,用柔性linker將向FPPR延長多個氨基酸的gp41胞外核心結構域與兩端做了截短的gpl20共價連接,獲得了高表達的抗原反應性(antigenicity)有較大提高的，生物化學和生物物理性質可以媲美BG505S0SIP.664gpl40的中國流行株HIV-1CRF07-BC gpl40，為艾滋病病毒疫苗特別是中國優(yōu)勢流行病毒疫苗的研制奠定了良好的基礎。

【發(fā)明內容】
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[0007]本發(fā)明公開了一種潛在的高效重組HIV-1CRF07-BC gpl40免疫原的制備方法，其特征在于我們參照本實驗室發(fā)表的HIV-lCRF07gp41胞外核心結構域的晶體結構(PDB號:3WFV)和馬傳染性貧血病毒(EIAV)跨膜糖蛋白gp45胞外核心結構域的晶體結構(PDB號:3WP2和3WMI)以及國際同行解析的HIV-lgpl20的核心結構域的晶體結構和HIV-1Env胞外結構域gpl40的晶體結構(PDB號:3TGS、3TIH和4NC0)，通過向近融合肽區(qū)(fusionpeptide proximal region, FPPR)延長gp41胞外核心結構域氨基末端七肽重復NHR(HRl)的多個氨基酸，再通過柔性linker與gpl20共價連接,獲得了 gp41的六股螺旋束(six-helixbundle)閉合程度增加，穩(wěn)定性提高的三聚體gpl40。具體為用GGSGG將gp41的氨基末端七肽重復NHR(HRl)和羧基末端七肽重復CHR(HR2)連接起來，運用重疊延伸聚合酶鏈式反應(overlap extension PCR)技術獲得了 gp41胞外核心區(qū)的DNA片段，然后用GSGAG將gp41和gpl20共價連接起來,運用overlap extension PCR技術獲得了包膜糖蛋白Env胞外結構域的基因片段gpl40，將目的基因克隆入真核表達載體pMT，經質粒大提去除內毒素后，與抗性篩選質粒PCoBlast —起共轉染黑腹果蠅Schneiderf (S2)細胞，用殺稻瘟菌素(Blasticidin S)進行陽性篩選，篩選出穩(wěn)定高效分泌表達gpl40的S2細胞系擴大培養(yǎng)后，用鎳柱結合緩沖液(50mM/LTris-HCl，500mM/LNaCl，pH8.0)替換SFX-1nsect昆蟲培養(yǎng)基，經鎳柱親和層析和凝膠過濾層析(Gelfiltration chromatography,GF)純化，即可獲得目的蛋白gpl40。經聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測并結合凝膠過濾色譜的峰圖初步判定純化得到的三體gpl40的純度和均一性都非常好，且表達量較大。進一步利用分析型超速離心沉降速率法(SV-AUC)測定該gpl40的絕對分子量以獲得蛋白在溶液中的聚集狀態(tài)信息，結果發(fā)現溶液中的gpl40絕大部分都以三聚體形式存在，其它聚合形式包括單體的含量較少，大大優(yōu)于gpl40unc。最后利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測gpl40的抗原反應性(antigenicity),發(fā)現該gpl40三體的抗原反應性至少比gpl40unc三體高四倍。
[0008]本發(fā)明與gpl40unc三體相比,均一'丨生好,抗原反應性(antigenicity)高,生化和物理性質可以媲美BG505S0SIP.664gpl40,且針對目前中國流行株，非常適合作為免疫原用于艾滋病亞單位疫苗或多價聯(lián)合疫苗的研發(fā)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是gpl40構建的原理圖。
[0010]圖2 是 BG505S0SIP.664gpl40 的凝膠過濾圖譜(引用自 Rogier ff.Sanders 等人，2013PLoS Pathog:e1003618)。圖 2A 是 BG505S0SIP.664gpl40 經 Hiload26/60Superdex200分了篩層析柱純化的圖譜，圖 2B 是經 BG505S0SIP.664gpl40 經 Hiload26/60Superdex200分子篩層析柱純化后再重過SUpeix)Se610/30COlUmn分子篩層析柱的分析圖譜。
[0011]圖3是目的蛋白的凝膠過濾圖譜與鑒定。圖3A是重組蛋gpl40經Hiloadl6/60Superdex200 分子篩層析柱純化的圖譜，圖 3B 是經 Hiloadl6/60Superdex200分子篩層析柱純化純化后重組蛋白gpl40的SDS-PAGE檢測，圖3C是gpl40蛋白經Hiloadl6/60Superdex200分子篩層析柱純化后再重過Superdex20010/300分子篩層析柱的分析圖譜。
[0012]圖4是純化后的gpl40蛋白的Western blot檢測結果。
[0013]圖5是純化的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)表達的gpl40unc的藍綠非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳(BN-PAGE)檢測(引用自 Norbert Schulke 等人，2002J Virol76:7760-7776)。
[0014]圖6是純化的gpl40的分析型超速離心沉降速率法分析。
[0015]圖7是純化的重組蛋白gpl40與多位艾滋病長期不進展者雪清的酶聯(lián)免疫吸附試驗。
[0016]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細敘述。
【具體實施方式】:
[0017]實施例1.重組gpl40真核表達載體的構建
[0018]以CRF07-BC gpl60cDNA 為模板，經兩次 overlap extension PCR,獲得了用兩個不同linker連接的包膜糖蛋白Env胞外結構域(見圖1)的DNA片段gpl40,通過雙酶切連接的方法將目的基因片段克隆入經本實驗室改造過的pMT/Bip/TEV-HisA載體。通過將V5表位替換為煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEV酶)的酶切位點，使我們能夠用TEV酶除去目的蛋白羧基末端的組氨酸標簽^XHis-tag)，使目的蛋白羧基末端盡可能少地帶有不必要的寡肽。經過雙酶切和測序鑒定正確后(氨基酸和核苷酸序列見序列表)，通過無內毒素質粒大提試劑盒進行目的質粒的大提以提聞質粒濃度和去除內毒素。
[0019]載體構建過程中用到的引物為，[0020]引物 1: 5，CATGCCATGG GTGTGGAAGGGCGCCACC3，
[0021 ]引物 2:5，TCCTGCCCCTGAGCCGGGCTTGATCTCCACCAC3，
[0022]引物3:5，GGCTCAGGGGCAGGAAGCATCACCCTGACCGTGCAG3，
[0023]引物4:5，ACCGCCTGACCCTCCCTGCTGGTCCTTCAGG3，
[0024]引物5:5，GGAGGGTCAGGCGGTTGGGACAACATGACCTGG3 ’
[0025]引物6:5，CTAGTCTAGAGGCCAGCAGGTCCTTCTC3 ’
[0026]實施例2.S2細胞的共轉染及穩(wěn)定表達目的蛋白的S2細胞系的篩選
[0027]提前一天將細胞鋪于T25培養(yǎng)瓶中，當細胞的匯合度(conf Iuency)達到60-70%時用脂質體法進行共轉染。轉染步驟按照轉染試劑Cellfectin II的說明書進行，注意重組質粒和抗性篩選質粒PCoBlast的質量比為19: I。細胞于27°C孵育5小時后吸出轉染液，加入4mL新鮮的SFX-1nsect培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48h，棄去原培養(yǎng)基，加入含有殺稻瘟菌素(終濃度為25ug/mL)的SFX-1nsect培養(yǎng)基進行抗性篩選，未成功轉染的細胞在加入殺稻瘟菌素篩選后的一周內會大量死亡，少量的貼壁細胞會在培養(yǎng)瓶中繼續(xù)生長，大約3周左右，當細胞的匯合度達到100%時，即可獲得穩(wěn)定高效分泌表達重組gpl40的S2細胞系。
[0028]實施例3.重組gpl40的表達純化
[0029]將篩選出的T25S2細胞系擴大培養(yǎng)至T75 培養(yǎng)瓶中(體積比1:5)，進一步轉到500mL轉瓶中進行擴大培養(yǎng)(體積比1: 10)，27°C，120rpm，培養(yǎng)2-3天，當細胞的生長達到對數期時，加入硫酸銅誘導蛋白表達(終濃度為0.5mmol/L)，3天后收集。將S2細胞收集到300mL的離心桶中，4000rpm，4°C離心15min。收集細胞上清，經0.22 μ m的濾膜過濾后，放至Amicon Stirred Cell8003型超濾杯中濃縮蛋白，壓縮50mL時,用鎳柱結合緩沖液(50mM/L Tris-HCl, 500mM/L NaCl, pH8.0)稀釋10倍后，將蛋白液收集至50mL離心管中，20000rpm，4°C離心20min，收集上清，經0.22 μ m的濾膜過濾后，將上清液進行鎳柱親和層析純化，用鎳柱洗滌緩沖液(50mM/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl，20mM咪唑，pH8.0)沖洗三個柱長，洗去非特異性吸附的雜蛋白，最后用鎳柱洗脫緩沖液(50mM Tris-HCL, 500mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0)進行洗脫，收集洗脫組分，用10%的SDS-PAGE結合考馬斯亮藍染色法檢測分析。用Amicon Ultra超濾管將洗脫組分用鎳柱結合緩沖液稀釋至咪唑(imidazole)濃度小于50mM，并濃縮至3mL，加入200uL預先純化好的TEV蛋白酶，20°C酶切過夜，用Westernblot檢驗酶切效率至100%。因該蛋白無法用離子交換層析純化，所以將酶切完全后的樣品濃縮至1.5mL,上樣至Hiloadl6/60Superdex200分子篩層析柱純化,緩沖液同鎳柱結合緩沖液，需預先平衡一個柱體積，流速lmL/min，柱壓設為0.3MPa，收集洗脫組分，用10%的SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的純度。將收集的洗脫組分濃縮至0.5mL，再上樣至分析型SuperdeX20010/300分子篩層析柱，緩沖液同鎳柱結合緩沖液，需預先平衡一個柱體積，流速0.5mL/min,柱壓設為1.5MPa。結果見圖3。
[0030]實施例4.HIV-lgpl40 蛋白的 Western blot 分析
[0031]將2ug純化的去除6XHis標簽的gpl40蛋白進行10%的SDS-PAGE電泳后，轉移至PVDF膜上，以羊抗gpl20多克隆抗體作為第一抗體(NIH惠贈，I: 10000稀釋)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗羊IgG為第二抗體(I: 10000稀釋)，進行Western blot鑒定。結果見圖4。
[0032]實施例5.分析型超速離心實驗[0033]沉降速率(Sedimentationvelocity, SV)實驗在 Beckman/Coulter XL-1 分析型超速離心機上進行。將待測的純化后的gpl40樣品用Superdex20010/300分子篩換至超速離心緩沖液(50mMTris，pH8.0，IOOmM NaCl,ImMEDTA)中，超濾濃縮。SV實驗選用雙通道樣品池和藍寶石窗口進行。約14.9 4 11純化的8?140蛋白在41:42000印111進行離心沉降。實驗數據用280 nm紫外檢測器收集。蛋白質比重和緩沖液黏度、密度用SEDNTERP (http://www.rasmb.bbr1.0rg/)軟件計算，SV數據用Sedfit軟件處理。結果見圖6。
[0034]實施例6.酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELASA)檢測gpl40的抗原反應性(antigenicity)
[0035]將4ug gpl40unc和gpl40分別進行一系列4倍倍比稀釋(3200倍起)，包被96孔酶標板，用中國疾病預防控制中心(CDC)提供的艾滋病長期不進展者的血清(I: 100稀釋)作為第一抗體，HRP標記的山羊抗人IgG為第二抗體(I: 1000稀釋)，3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(3, 3’，5, 5’ -Tetramethylbenzidine, TMB)顯色完成后，加入2M硫酸終止反應，在450nm波長下讀板，制作標 準曲線。結果見圖7。
【權利要求】
1.一種針對HIV-ι中國流行株CRF07的高效重組gpl40免疫原的制備方法。其特征在于針對中國最廣泛的流行株CRF07，并且是在結構基礎上重新設計的。獲得的gpl40均一性好，抗原反應性高，非常適合作為免疫原用于艾滋病亞單位疫苗或者是多價聯(lián)合疫苗的研發(fā)。
2.根據權利要求1所述的潛在的gpl40免疫原的制備方法，其特征在于載取的gpl20的片段為44-493位氨基酸(參照HIV-1HXB2標準株gpl60編號，下同)，截取的gp41的NHR片段為534-591位氨基酸，截取的CHR片段為623-662位氨基酸。
3.根據權利要求1所述的潛在的gpl40免疫原的制備方法，其特征在于連接gp41NHR和 CHR 的 linker 為 GGSGG 連接，連接 gpl20 與 gp41 的 linker 為 GSGAG0
4.根據權利要求1所述的潛在的gpl40免疫原的制備方法，其特征在于通過將pMT載體的V5表位替換為煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEV酶)的酶切位點，使我們能夠用TEV酶除去目的蛋白羧基末端的組氨酸標簽^XHis-tag)，使目的蛋白羧基末端盡可能少地帶有非必要的氨基酸殘基，更適合用作免疫原。
5.根據權利要求1所述的潛在的gpl40免疫原的制備方法，其特征在于用重疊延伸PCR技術獲得該gpl40的基因片段，將目的基因克隆入真核表達載體pMT，經質粒大提去除內毒素后，與抗性篩選質粒PCoBlast —起共轉染黑腹果蜆Schneider2 (S2)細胞,用殺稻痕菌素(Blasticidin S)進行陽性篩選，篩選出穩(wěn)定高效分泌表達gpl40的S2細胞系。擴大培養(yǎng)后，經鎳柱親和 層析和凝膠過濾層析兩步純化，即可獲得高純度的gpl40。
【文檔編號】C07K1/16GK103992396SQ201410160156
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權日:2014年4月17日
【發(fā)明者】劉新奇, 段良偉 申請人:南開大學