本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)細(xì)胞中溶酶體內(nèi)次氯酸根離子的熒光探針的制備方法和應(yīng)用，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來，對(duì)環(huán)境、生物體系內(nèi)乃至醫(yī)藥方面無機(jī)陰離子的檢測(cè)備受矚目。無機(jī)陰離子中活性氧類化合物在生理過程和病理過程起重要作用。其中次氯酸在生命體中主要靠過氧化氫和氯離子在髓過氧化酶(mpo)催化下反應(yīng)生成。生理?xiàng)l件下，大約一半的次氯酸理解成次氯酸根，次氯酸根也是自然界中最強(qiáng)的氧化劑之一。在生活中次氯酸根也是被廣泛應(yīng)用的一種強(qiáng)氧化劑。次氯酸和機(jī)體的免疫性能有關(guān)，能夠殺滅很多種病原體。但是，機(jī)體中過量的氧化物的產(chǎn)生也會(huì)對(duì)其本身造成傷害。已經(jīng)有證據(jù)表明次氯酸跟一些組織的炎癥有關(guān)，而且人們認(rèn)為中性粒細(xì)胞釋放的次氯酸跟跟肺部受損、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝缺血再灌注損傷以及腎臟疾病有關(guān)。因?yàn)榇温人岬闹匾?，?duì)其檢測(cè)特別是生命體中的檢測(cè)就顯得十分重要。

熒光檢測(cè)方法因?yàn)樗母哽`敏度和很好的時(shí)空分辨率，成為一種被廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)檢測(cè)并能夠?qū)σ恍┥矬w系內(nèi)重要的物種進(jìn)行成像檢測(cè)的方法。它能夠提供這些物種在細(xì)胞、組織甚至活體中的動(dòng)態(tài)信息，比如一些生物分子的分布和分布的量。1,8-萘酰亞胺類化合物是一種重要的熒光團(tuán)，具有高的光穩(wěn)定性、大的stokes位移、較強(qiáng)的熒光發(fā)射等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于聚合物、儲(chǔ)光物質(zhì)、dna切割和燃料等方面。

已報(bào)道的次氯酸熒光探針存在著諸多缺陷，如靈敏度低，選擇性差，響應(yīng)速度慢以及合成復(fù)雜等，更主要的缺陷是靶向性差，已申請(qǐng)的專利[cn103173213a]、[cn104910070a]展示了特異性選擇次氯酸的熒光探針，但是不具有靶向性，不能用于溶酶體中次氯酸根的檢測(cè)，鑒于此，開發(fā)定位溶酶體中次氯酸根的檢測(cè)成為目前亟待解決的課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的問題是：克服現(xiàn)有技術(shù)存在問題，提供一種靶向檢測(cè)細(xì)胞溶酶體中次氯酸根離子的熒光探針。該探針結(jié)構(gòu)新穎，合成簡(jiǎn)單，生物兼容性好，對(duì)次氯酸根離子選擇性好，靈敏度高，能夠定向檢測(cè)細(xì)胞溶酶體中的次氯酸根離子。

本發(fā)明還提供該熒光探針的制備方法以及該探針檢測(cè)次氯酸根離子的應(yīng)用。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：基于1,8-萘酰亞胺，在酰亞胺n原子引入溶酶體定位基，4位br被甲硫醇鈉取代作為次氯酸根識(shí)別基團(tuán)。其特征在于，其結(jié)構(gòu)如式（?。┧荆?/p>

式（ⅰ）

合成路線如下：

上述熒光探針的制備方法，其特征在于，制備方法包含以下步驟：1)將4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺溶于乙醇，加入胺基嗎啡啉，回流。反應(yīng)完成后室溫下冷卻反應(yīng)液，濾除固體，柱層析純化，即得n16-1。2)將n16-1和碳酸鉀溶于dmf中，加入甲硫醇鈉，氮?dú)獗Ｗo(hù)下恒溫反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入水中，有固體產(chǎn)生，濾得固體，出層析純化即得n16。

所述步驟1)中硅膠柱洗脫劑為乙酸乙酯。

所述步驟2)中硅膠柱洗脫劑為二氯甲烷。

本發(fā)明還提供了上述熒光探針的應(yīng)用，其特征在于，該探針用于純緩沖溶劑體系和生物細(xì)胞體系中次氯酸根離子的含量檢測(cè)；所屬的含量檢測(cè)包括熒光檢測(cè)，目視定性檢測(cè)，細(xì)胞成像檢測(cè)。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是：(1)探針結(jié)構(gòu)新穎，合成容易且后處理簡(jiǎn)單；(2)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對(duì)次氯酸根離子的快速檢測(cè)，并且選擇性好，抗干擾能力強(qiáng)。肉眼即可觀測(cè)到檢測(cè)后的溶液顏色變化，紫外燈下也能看到檢測(cè)后溶液的熒光顏色變化。(3)本發(fā)明可應(yīng)用于生物體系細(xì)胞內(nèi)溶酶體中次氯酸根的檢測(cè)。

附圖說明

圖1:n16對(duì)clo^-的熒光選擇性實(shí)驗(yàn)。

圖2:n16對(duì)clo^-的紫外選擇性實(shí)驗(yàn)。

圖3:n16檢測(cè)clo^-的競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)。

具體實(shí)施方案

實(shí)施例1。目標(biāo)探針化合物n16的制備：1)化合物n16-1的合成：將1g(3.6mmol)4-溴-1,8-萘二甲酰亞胺溶于乙醇，加入1g(7.2mmol)嗎啡啉，回流。反應(yīng)完成后室溫下冷卻反應(yīng)液，濾除固體，柱層析純化，即為目標(biāo)產(chǎn)物n16-1，產(chǎn)率85%；2)化合物n16的合成：將388mg(1mmol)n16-1和276mg(2mmol)碳酸鉀溶于5mldmf中，加入140mg(2mmol)甲硫醇鈉，氮?dú)獗Ｗo(hù)下恒溫80℃反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入40ml水中，有固體產(chǎn)生，濾得固體，出層析純化即得n16，產(chǎn)率88%。

實(shí)施例2。n16對(duì)clo^-的熒光選擇性實(shí)驗(yàn)：取實(shí)施例1制備的n16次氯酸根熒光探針溶于dmf中，制成1mmol/l儲(chǔ)備液。取30μl儲(chǔ)備液加到3ml的pb緩沖溶液(ph=7.4)中，然后分別加入30μl濃度為100μm的不同陰離子和陽(yáng)離子，clo^-的加入使熒光完全淬滅。激發(fā)波長(zhǎng)405nm，發(fā)射波長(zhǎng)506nm?？v坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)表示波長(zhǎng)；n16對(duì)clo^-的紫外選擇性實(shí)驗(yàn)：取實(shí)施例2中熒光探針儲(chǔ)備液30μl加到3ml的pb緩沖溶液(ph=7.4)中，分別加入30μl濃度為100μm不同陰離子和陽(yáng)離子后的可見吸收光譜。clo^-的加入405nm處的吸光度顯著下降，350nm處的吸光度顯著增強(qiáng)?？v坐標(biāo)表示吸光度，橫坐標(biāo)表示波長(zhǎng)；n16檢測(cè)clo^-的競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)：取實(shí)施例2中熒光探針儲(chǔ)備液30μl加到3ml的pb緩沖溶液(ph=7.4)中，先加入濃度為100μm的不同陰離子和陽(yáng)離子，再加入100μmclo^-的熒光強(qiáng)度變化。表明n16檢測(cè)clo^-不受其他常見共存離子的影響?？v坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)表示離子種類。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種基于1,8?萘酰亞胺能夠定向檢測(cè)測(cè)溶酶體中次氯酸根的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。該探針分子結(jié)構(gòu)如(I)所示，該探針合成簡(jiǎn)單，在純PB緩沖溶液中能選擇性檢測(cè)次氯酸根離子，能夠抵抗其他活性氧類小分子干擾。此外，肉眼就能觀察到溶液顏色變化，紫外燈下也能觀察到溶液熒光顏色變化。該探針還能應(yīng)用于細(xì)胞溶酶體中次氯酸根離子的檢測(cè)。該探針響應(yīng)時(shí)間短，檢測(cè)限低，有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：葉勇;劉瑤;趙玉芬
受保護(hù)的技術(shù)使用者：鄭州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2016.05.16
技術(shù)公布日：2017.08.18