本發(fā)明涉及一種用于制備疫苗的豬偽狂犬病毒變異毒株，特別涉及一種豬偽狂犬病毒變異毒株TK、gE和gI基因缺失的毒株。

背景技術(shù)：
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豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種豬的重要傳染病，主要臨床癥狀包括：新生仔豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、斷奶仔豬和育肥豬表現(xiàn)出呼吸道癥狀、妊娠母豬繁殖障礙，已經(jīng)給世界生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失 ^[1-3]。目前，該病防控主要依靠疫苗免疫，美國與部分歐洲國家已宣布通過基因缺失疫苗免疫和凈化技術(shù)，根除了該病在家豬中的流行^[4]。近30年來，我國廣泛使用PRV基因缺失弱毒疫苗，該病得到有效控制并逐步凈化^[5-6]。但是，2011年以來，我國許多免疫PRV活疫苗的豬場再次暴發(fā)該病，主要表現(xiàn)為仔豬神經(jīng)癥狀及死亡，生長豬呼吸道癥狀，妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱仔等，對該病防控提出新挑戰(zhàn)。

gE基因在PRV入侵宿主神經(jīng)系統(tǒng)(包括三叉神經(jīng)節(jié)和嗅神經(jīng))的擴散發(fā)揮重要作用，是PRV主要毒力基因，同時也是病毒復(fù)制的非必須基因。gE與gI是以非共價鍵形式結(jié)合成gE/gI復(fù)合物。最新研究表明gE/gI復(fù)合物與病毒順軸突傳播相關(guān)。gE/gI基因的缺失并不影響病毒的增殖滴度。敲除PRV TK和gE會導致一些PRV毒株毒力的顯著下降，并可用于研制PRV弱毒活疫苗。

本發(fā)明選擇一種PRV變異強毒株ZJ01，成功構(gòu)建ZJ01株的感染性細菌人工染色體克隆，并獲得TK、gE和gI基因缺失毒株ZJ01ΔTK/gE/gI(簡稱ZJ01R)和ZJ01ΔgE/gI。體外連續(xù)傳代培養(yǎng)試驗證明，該兩個重組病毒的滴度和遺傳特性穩(wěn)定。仔豬接種該病毒后體溫平穩(wěn)，無組織損傷，接種7日后即產(chǎn)生較高的gB抗體，21日時能夠產(chǎn)生較高的中和抗體。以大劑量變異強毒株進行攻毒，對照組全部死亡，重組病毒ZJ01R免疫組豬不發(fā)生死亡，無體溫升高和組織病變，肺臟及腦組織中未檢測到病毒，證明該重組病毒對豬體具有良好的免疫保護效 果，且對豬體不產(chǎn)生病理損傷，是理想的基因缺失疫苗候選對象，為研制PRV新型疫苗奠定了重要基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明提供一種豬偽狂犬病毒變異株TK/gE/gI基因缺失毒株，其保藏編號為：CGMCC No.10397，分類命名：豬偽狂犬病毒，PRV-ZJ01R。本發(fā)明所述的毒株，結(jié)構(gòu)為ZJ01TK^-/gE^-/gI^-。

本發(fā)明所述的毒株，其中，ZJ01TK^-/gE^-/gI^-的DNA序列為將ZJ01序列去除序列表1-2的序列所述序列后所得序列。

本發(fā)明所述的毒株，其中，ZJ01的GeneBank DNA序列號為KM061380.1。

本發(fā)明所述的毒株，其中，TK的DNA序列為序列表1的序列。

本發(fā)明所述的毒株，其中，gE的DNA序列為序列表2的序列。

本發(fā)明所述的毒株，其中，gI的DNA序列為序列表2的序列。

序列表2的序列為gE/gI基因序列融合在一起的序列。

本發(fā)明所述的毒株，以PRV ZJ01株為原始毒株經(jīng)過基因結(jié)構(gòu)改造得到，其中PRV ZJ01株由本實驗室于2012年2月分離自浙江某規(guī)模豬場發(fā)病仔豬，屬高致病性毒株，為BHK-21細胞F8代適應(yīng)毒。本發(fā)明以PRV ZJ01毒株為親本構(gòu)建的毒株為TK、gE和gI基因缺失病毒，為BHK-21細胞F10代適應(yīng)毒。

本發(fā)明的毒株已經(jīng)保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為CGMCC No.10397，保藏日期2015年02月3日，分類命名：豬偽狂犬病毒，PRV-ZJ01R，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

本發(fā)明的病毒毒株，其制備方法的設(shè)計方案為：

使用含有PRV變異強毒株ZJ01的US7和US8(gE/I)及UL23(TK)基因序列的PCR引物，從pHA2質(zhì)粒DNA擴增獲得含攜帶細菌人工染色體(BAC)載體和gfp表達盒的基因片段，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pHA2-pUC19-BAC-H1-H2和pHA2-pUC19-UL23-H1-H2。先將pHA2-pUC19-BAC-H1-H2與ZJ01毒株全基因組共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，通過同源重組，獲得重組病毒ZJ01-GFPΔgE/gI。提取該重組病毒基因組DNA，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌DH 10B，篩選獲得含有mini-F序列的PRV感染性BAC克隆(pZJ01)。將pZJ01轉(zhuǎn)染BHK-21細胞可以重新啟動病毒的生產(chǎn)性感染。該質(zhì)粒與pUC19-BAC-H1-H2或gE/gI基因片段全長共轉(zhuǎn) 染BHK-21細胞，通過同源重組刪除mini-F序列，構(gòu)建獲得gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔgE/gI。

按上述相同方法，將pHA2-pUC19-UL23-H1-H2與ZJ01ΔgE/gI重組病毒全基因組DNA共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，通過同源重組，獲得重組病毒ZJ01-GFPΔTK/gE/gI，然后刪除mini-F序列，構(gòu)建獲得TK/gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔTK/gE/gI(簡稱ZJ01R)。

體外傳代試驗結(jié)果顯示，本發(fā)明的病毒毒株ZJ01R和ZJ01ΔgE/gI產(chǎn)生的細胞病變與親本病毒ZJ01一致，病毒滴度與ZJ01毒株相仿；重組病毒目的基因缺失區(qū)持續(xù)穩(wěn)定存在，沒有出現(xiàn)回復(fù)性突變。豬體免疫及攻毒保護試驗表明，重組病毒ZJ01R免疫后，豬體無臨床癥狀及病理變化產(chǎn)生，免疫21天后即可產(chǎn)生較高水平的PRV中和抗體，能夠抵御致死性PRV變異毒株P(guān)VR-ZJ01的感染。

附圖說明：

圖1pHA2質(zhì)粒經(jīng)同源重組插入PRV ZJ01病毒基因組示意圖

(A)PRV ZJ01基因組示意圖(大小約為140Kbp)及US7與US8所在區(qū)域(B)轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建示意圖(C)重組病毒ZJ01-GFPΔgE/gI基因組構(gòu)成的示意圖

圖2pUC19-BAC-H1-H2的構(gòu)建與鑒定

(A)同源重組臂BAC-H1與BAC-H2基因片段擴增產(chǎn)物((泳道1和2分別為BAC-H1與BAC-H2基因)；(B)pUC19-BAC-H1重組質(zhì)粒酶切鑒定(泳道1，泳道2為PCR產(chǎn)物對照)；(C)pUC19-BAC-H1-H2重組質(zhì)粒PacI線性化DNA。泳道M：DS^TM 5000標準分子量。

圖3重組病毒ZJ01-GFPΔgE/gI的噬斑純化與鑒定

圖3(A)熒光顯微鏡下的噬斑(上圖ZJ01-GFPΔgE/gI拯救病毒、下圖細胞對照)。(B)病毒PCR鑒定產(chǎn)物電泳圖.泳道1-3：PRV-gE-632-for/rev引物PCR擴增產(chǎn)物；泳道4-6：PRV-HOMO1-for/rev引物PCR擴增產(chǎn)物；泳道1、4：ZJ01；泳道2、5：ZJ01ΔgE/gI；泳道3、6：ZJ01gE/gI-R毒株；泳道M：DS^TM 5000bp標準分子量。

圖4PRV ZJ01BΔC克隆的遺傳穩(wěn)定性鑒定

(A)BAC質(zhì)粒拯救病毒DNA的BamHI酶切圖譜(1：F1代病毒、2：F20代質(zhì)粒拯救出的病毒，M：DS^TM 2000bp marker.)。(B)BAC克隆質(zhì)粒PCR鑒定(1、2、3泳道分別為F5、F10和F20代質(zhì)粒，M：1Kb DNA Ladder Marker。(C)拯救病毒熒光空斑(左：F1病毒，右：F20病毒)。

圖5轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后熒光的鑒定

圖6重組病毒PRV ZJ01ΔTK/gE/gI的純化與鑒定

（A） 重組病毒鑒定：病毒接種細胞后進行免疫熒光試驗顯示PRV特異性熒光， （B）重組病毒PCR檢測結(jié)果（泳道1：ZJ01，泳道2：ZJ01ΔTK/gE/gI毒株，M：1Kb DNA Ladder Marker）。

圖7重組病毒在BHK-21細胞上的生長曲線

圖8重組病毒遺傳穩(wěn)定性鑒定

圖9重組病毒ZJ01R免疫后豬體體溫

圖10重組病毒ZJ01R免疫后豬體gB抗體水平

圖11重組病毒ZJ01R免疫后豬體中和抗體水平

圖12重組病毒ZJ01R免疫21天后豬組織切片

圖13PRV-ZJ01攻毒后豬體存活率

圖14PRV-ZJ01攻毒后豬體體溫變化

圖15PRV-ZJ01攻毒后豬體病毒分布

圖16PRV-ZJ01攻毒后豬體組織病理切片

具體實施方式：

以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。

1材料與方法

1.1主要材料

1.1.1病毒與細胞

PRV ZJ01株病毒，由本實驗室于2012年2月分離自浙江某規(guī)模豬場發(fā)病仔豬，屬高致病性毒株，為BHK-21細胞F8代適應(yīng)毒；PRV ZJ01ΔgE/gI毒株為本實驗室以PRV ZJ01毒株為親本構(gòu)建的獲得的gI、gE雙基因缺失病毒，為BHK-21細胞F10代適應(yīng)毒。BHK-21細胞由本實驗室保存，細胞生長液為含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)，維持液為含2％胎牛血清的DMEM。

1.1.2質(zhì)粒與菌株

pHA2質(zhì)粒(包含BAC載體序列、真核細胞中表達gfp表達盒、大腸桿菌中表達氯霉素抗性基因與大腸桿菌mini-F質(zhì)粒)由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心王繼春博士惠贈：pUC19載體購自Invitrogen公司。

1.1.3工具酶與試劑

限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶與堿性磷酸酶均購自NEB公司；AccuPrime^TM pfx DNA Polymerase購自Invitrogen公司；AxyPrep DNA片段回收試劑盒購自AxyGEN公司；平末端克隆載體pEASY^TM-Blunt Simple購自TransGen公司；質(zhì)粒提取試劑盒Miniprep購自Qiagen公司；酚氯仿、蛋白酶K、RNase購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine^TM 2000購自Invitrogen公司；其余試劑均為分析純。

1.2ZJ01gE/gI基因缺失毒株的構(gòu)建與鑒定

1.2.1病毒純化與基因組提取

取1L PRV ZJ01 F5代病毒液，反復(fù)凍融3次，8000g離心30min除去細胞碎片，150000g超速離心2h，所得沉淀經(jīng)適量滅菌PBS重懸，用酚氯仿法在重懸液中提取PRV ZJ01基因組DNA(gDNA)。

1.2.2引物設(shè)計與同源重組臂的PCR擴增

根據(jù)GenBank公布的PRV Becker株基因組序列(GenBank收錄號為JF797219)，在US6與US9位置設(shè)計2對引物PRV BAC H1 F/R與PRV BAC H2F/R，引物序列為：PRV BAC H1 F：ATTGAATTC_{EcoR I}GTACCCGTACACCGAGTCGT，PRV BAC H1 R：ACTGAGCTC_{Sac I}GGTTAATTAA_{Pac I}TCATCATCGACGCCGGTACT；BAC H1基因片段長度為1135bp；PRV BACH2 F：CAACTGCAG_{Pst I}CGTTAATTAA_{Pac I}GCCGACATGGACACGTTCGA，PRVBAC H2 R：TCGAAGCTT_HindIIITTGTGGACCCGCGAACAT，BAC-H2基因片段長度為1163bp；PRV-gE-632-for：TCCACTCGCAGCTCTTCT，PRV-gE-632-rev：GCACGTCATCACGAAGGA，擴增的基因片段長度為632bp。斜體劃線部分為酶切位點，引物由Invitrogen公司合成。

采用上述PRV ZJ01基因組DNA作為模板，擴增同源重組臂BAC-H1與BAC-H2，反應(yīng)體系為：10×AccuPrime^TM pfx Buffer 2.5μL、引物各1.0μL、模板DNA 2μL、AccuPrime^TMpfx DNA Polymerase 0.5μL、DMSO 1μL、dd H₂O 18μL。反應(yīng)程序如下：95℃5min；95℃30s，62℃30s，68℃70s進行32個循環(huán)，最后68℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠回收純化，連接克隆入平末端克隆載體pEASY^TM-Blunt Zero，轉(zhuǎn)化TOPO10大腸桿菌感受態(tài)細胞， 涂布含50μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行PCR和PstI酶切鑒定，陽性克隆送Invitrogen公司測序。

1.2.3轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

提取測序正確的重組H1與H2質(zhì)粒分別用EcoRI/SacI與PstI/HindIII酶切，回收酶切H1片段與pUC19線性化(EcoRI/SacI)片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-H1，回收酶切H2片段與pUC19-H1線性化(PstI/HindIII)片段連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-H1-H2。pHA2與pUC19-H1-H2均以PacI線性化，線性化片段經(jīng)堿性磷酸酶處理后用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPO10感受態(tài)細胞，最后在含氨芐與氯霉素抗性的平板上篩選。挑取的單克隆經(jīng)引物PRV BAC H1 F/R與PRV BAC H2 F/R鑒定，選取陽性克隆用Qiagen Miniprep方法提取質(zhì)粒，獲得轉(zhuǎn)移載體pHA2-pUC19-H1-H2。取2ug轉(zhuǎn)移載體，采用Lipofectamine^TM 2000轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，5％CO2溫箱繼續(xù)培養(yǎng)16h，熒光顯微鏡下觀察所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體中g(shù)fp表達盒是否表達。圖1顯示了攜有大腸桿菌F(Mini-F)質(zhì)粒的BAC載體pHA2通過同源重組插入PRV ZJ01 US7與US8(gI與gE)基因內(nèi)的示意圖。

圖1pHA2質(zhì)粒經(jīng)同源重組插入PRV ZJ01病毒基因組示意圖

(A)PRV ZJ01基因組示意圖(大小約為140Kbp)及US7與US8所在區(qū)域(B)轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建示意圖(C)重組病毒ZJ01-GFPΔgE/gI基因組構(gòu)成的示意圖

1.2.4重組病毒拯救與噬斑純化

取轉(zhuǎn)移載體pHA2-pUC19-H1-H2與PRV ZJ01gDNA各1.5μg采用Lipofectamine^TM2000共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，共轉(zhuǎn)染48h后，棄去維持液，覆蓋含有1％低熔點瓊脂糖、10％胎牛血清的DMEM，37℃，5％CO₂繼續(xù)培養(yǎng)24h，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光的空斑(為重組病毒形成空斑)，挑取顯示綠色熒光的單個空斑，在BHK-21細胞上進行空斑純化。經(jīng)6次亞克隆純化后，獲得重組病毒命名為ZJ01-GFPΔgE/gI。

1.2.5重組病毒ZJ01-GFPΔgE/gI株BAC的克隆與鑒定

將ZJ01-GFPΔgE/gI病毒接種BHK-21細胞，37℃培養(yǎng)16h后，在熒光顯微鏡下觀察病變達到70％左右，用預(yù)冷的PBS洗滌1次，2000g，4℃離心5min，沉淀以100μL TE分散重懸后，經(jīng)酚氯仿法提取重組病毒基因組，取出2μL DNA電轉(zhuǎn)化(1500V 200Ω25uF)至E.coli DH 10B感受態(tài)細胞，涂布于含34μg/mL氯霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)72h，挑取單菌落至液體培養(yǎng)基后培養(yǎng)48h，用引物PRV BAC H1 F/R與PRV BAC H2 F/R進行PCR鑒定。選取10個PCR陽性的克隆，Miniprep方法提取質(zhì)粒命名為pZJ01/G1-10，提取的質(zhì)粒DNA用BamHI酶切以進行RFLP分析，脈沖場電泳程序為：電壓6V/cm；電泳時間10h；脈沖 角度120°；起始脈沖時間1s，終止脈沖時間35s。鑒定正確的陽性克隆命名為pZJ01質(zhì)粒。

取Qiagen Midi Kit試劑盒提取pZJ01質(zhì)粒DNA 2μg，采用Lipofectamine^TM2000轉(zhuǎn)染BHK-21細胞。置37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)4d，每隔12h在熒光顯微鏡下觀察，待細胞病變達到80％時，將細胞培養(yǎng)物凍融3次以收獲重組病毒，即為拯救的重組病毒。

篩選出的陽性克隆在含有CAM的LB平板上連續(xù)傳20代，32℃條件下培養(yǎng)，選擇F5、F15與F20接種LB液體培養(yǎng)基，采用Qiagen Miniprep方法提取BACDNA，用PRV BAC H1 F/R引物進行PCR檢測；或提取BAC DNA以BamHI進行RFLP分析；并采用Lipofectamine^TM 2000轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，鑒定是否可以拯救出重組病毒。

1.2.6gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔgE/gI的構(gòu)建與鑒定

取轉(zhuǎn)移載體pHA2-pUC 19-H1-H2與pZJ01各2μg采用Lipofectamine^TM 2000共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，共轉(zhuǎn)染48h后，棄去維持液，覆蓋含有1％低熔點瓊脂糖、10％胎牛血清的DMEM，37℃，5％CO₂繼續(xù)培養(yǎng)24h，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光的空斑與無熒光空斑，挑取顯示無綠色熒光的單個空斑，在BHK-21細胞上進行空斑純化。經(jīng)6輪純化后，獲得重組病毒命名為ZJ01ΔgE/gI。提取重組病毒DNA，分別以引物PRV-gE-632-for/rev與PRV BAC H1 F/PRV BAC H2 R驗證gE/gI基因與載體片段的刪除。

1.3ZJ01TK/gE/gI基因缺失毒株(ZJ01R)的構(gòu)建與鑒定

1.3.1ZJ01gE/gI基因缺失病毒基因組提取

取500mL PRV ZJ01ΔgE/gI F10代病毒液，按1.1.4.1方法提取病毒基因組DNA。

1.3.2引物設(shè)計與同源重組臂的PCR擴增

根據(jù)PRV ZJ01毒株UL23位置設(shè)計2對引物PRV UL23-H1F/R與PRVUL23-H2F/R，引物序列為：PRV UL23-H1F：GCAGAATTC_{EcoR I}CGTCGTTCTTGGCGATCTGC；PRV UL23-H1 R：GATGGTACC_{Kpn I}CTTTAATTAA_{Pac I}AAATACCGGCCACCGTGTCC；PRV UL23-H2 F：GGCGCTGCAG_{Pst I}AGTTAATTAA_{Pac I}TGTGCGCCTTCACGTCGGAGAT；PRVUL23-H2 R：GACAAGCTT_{Hind III}AGAAGACGAAGGCGGCCACG，斜體劃線部分為酶切位點，引物由Invitrogen公司合成。按1.1.4.2方法，提取PRV ZJ01gE/gI^-基因組DNA，作為模板，擴增同源重組臂UL23-H1與UL23-H2，克隆至pEASY^TM-Blunt Simple載體，獲得含UL23-H1與UL23-H2重組質(zhì)粒。

1.3.3轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

按1.1.4.4方法，將重組UL23-H1與UL23-H2質(zhì)粒中的UL-23-H1和UL-23-H2基因片段分別克隆至pUC19載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-UL23-H1-H2。pHA1與pUC19-UL23-H1-H2均以Pac I線性化，線性化片段經(jīng)堿性磷酸酶處理后用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPO10感受態(tài)細胞，最后在含氨芐與氯霉素抗性的平板上篩選。挑取的單克隆經(jīng)引物PRV UL23-H1 F/R與PRV UL23-H2 F/R鑒定，獲得轉(zhuǎn)移載體pHA1-pUC19-UL-23-H1-H2。取2μg轉(zhuǎn)移載體，采用Lipofectamine^TM2000轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)移載體中g(shù)fp表達盒是否表達。

1.3.4重組病毒ZJ01R拯救與噬斑純化

按1.1.5.4方法，取轉(zhuǎn)移載體pHA2-pUC19-UL23-H1-H2與PRV rZJ01gE/gI^-基因組DNA各1.5μg采用Lipofectamine^TM 2000共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光的空斑(為重組病毒形成空斑)，挑取顯示綠色熒光的單個空斑，在BHK-21細胞上進行空斑純化。經(jīng)6輪純化后，獲得重組病毒命名為ZJ01-GFPΔTK/gE/gI。

將所得重組病毒ZJ01-GFPΔTK/gE/gI增殖500ml，采用1.1.4.1方法，差速離心濃縮后提取基因組DNA，按1.1.4.6方法，將該重組病毒基因組DNA與中間載體pUC19-UL-23-H1-H2共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，獲得敲除GFP熒光標簽的病毒空斑。通過空斑純化，獲得PRV ZJ01ΔTK/gE/gI(ZJ01R)。

1.3.5PRV ZJ01ΔTK/gE/gI(ZJ01R)的鑒定

將PRV ZJ01ΔTK/gE/gI毒株(ZJ01R)在BHK-21細胞上進行增殖，提取DNA用PRV TK del F/R進行PCR檢測，確定目的基因的刪除，引物序列為：PRV TK del F：5‘-CACCACGGCCCGGGTGATGGCGCTC-3’；PRV TK del R：5‘-AACTTTATTGGGATGACATACACAT-3‘。

1.4重組病毒ZJ01R體外培養(yǎng)生長特性測定

1.4.1不同代次重組病毒ZJ01R TCID₅₀測定

將F3、F10、F20代重組病毒ZJ01R、PRV ZJ01ΔgE/gI及ZJ01毒株分別用維持液(含2％胎牛血清的DMEM)按10倍系列稀釋，即10^-1，10^-2～10^-8，10^-9等。將100μL不同稀釋度的病毒液接種剛長滿單層BHK-21細胞的96孔細胞板中，每個滴度設(shè)置8個重復(fù)，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4d后記錄 細胞病變孔，按Reed-Muench法計算TCID₅₀。

1.4.2重組病毒ZJ01R生長曲線測定

將F10代重組病毒ZJ01R、ZJ01ΔgE/gI及ZJ01毒株病毒液以1MOI接種于24孔細胞板中長滿單層的BHK21細胞，先置于4℃吸附1h，然后于37℃孵育1.5h，滅菌PBS(pH7.2)洗2遍后用檸檬酸鹽緩沖液(CBS)處理3min，以除去細胞表面的病毒。再用滅菌PBS(pH7.2)洗2遍后再加入含有2％胎牛血清的DMEM。在感染后4，8，12，16，20，24，28，32h分別收集培養(yǎng)物，-70℃反復(fù)凍融3次后測定各毒株的病毒滴度，重復(fù)3次，按統(tǒng)計學方法處理數(shù)據(jù)，繪制病毒在體外培養(yǎng)條件下的生長曲線。

1.5重組病毒ZJ01R遺傳穩(wěn)定性鑒定

將重組病毒ZJ01R在BHK21細胞上連續(xù)傳代20代，取F3、F10、F20代病毒提取DNA作為模板，以PRV TK del F/R進行PCR鑒定，確定其目的片段穩(wěn)定缺失。

1.6重組病毒ZJ01R缺失基因與親本毒株基因重組可能性測定

將重組病毒ZJ01R與其親本毒株ZJ01等量混合后接種于BHK21細胞，待出現(xiàn)病變后連續(xù)傳代10代，收獲F10代病毒提取DNA，以PRV TK del F/R進行PCR鑒定。

1.7重組病毒ZJ01R免疫后豬體指標監(jiān)測

選取20頭35～40日齡仔豬，平均分為2組，實驗組滴鼻免疫重組病毒ZJ01R，2×10⁷TCID₅₀/頭，對照組以MEM營養(yǎng)液滴鼻作為對照，免疫后，觀察記錄豬體每日體溫情況、臨床癥狀、向周圍排毒情況。免疫后每隔7天，檢測gB抗體水平；21天檢測PRV中和抗體水平。免疫后21天，每組剖殺3頭豬，檢測病毒在體內(nèi)的分布情況并觀察組織病理變化。

1.8重組病毒ZJ01R免疫保護力試驗

1.7中所述試驗豬免疫21天后，每頭以2×10⁷TCID₅₀PRV-ZJ01強毒進行滴鼻，觀察重組病毒ZJ01R對豬體的免疫保護力。攻毒后，觀察記錄豬體每日體溫情況、臨床癥狀、向周圍排毒情況。攻毒后14天，將存活豬全部剖殺，檢測病毒在體內(nèi)的分布情況并觀察組織病理變化。

2結(jié)果

2.1ZJ01gE/gI基因缺失毒株的構(gòu)建與鑒定

2.1.1中間載體構(gòu)建與鑒定

以PRV ZJ01gDNA為模板，分別以PRV BAC-H1 F/R與PRV BAC-H2F/R為引物PCR擴增兩個同源重組臂BAC-H1與BAC-H2，目的片段長度均為1135bp和1163bp。中間載體pUC19-BAC-H1-H2經(jīng)PacI線性化大小約為5Kb(圖2)。

圖2pUC19-BAC-H1-H2的構(gòu)建與鑒定

(A)同源重組臂BAC-H1與BAC-H2基因片段擴增產(chǎn)物((泳道1和2分別為BAC-H1與BAC-H2基因)；(B)pUC19-BAC-H1重組質(zhì)粒酶切鑒定(泳道1，泳道2為PCR產(chǎn)物對照)；(C)pUC19-BAC-H1-H2重組質(zhì)粒PacI線性化DNA。泳道M：DS^TM 5000標準分子量。

2.1.2轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建與vZJ01-GFPΔgE/gI重組病毒拯救

將中間載體pUC19-BAC-H1-H2與pHA2質(zhì)粒經(jīng)PacI線性化以T4連接酶連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pHA2-pUC19-BAC-H1-H2。轉(zhuǎn)移載體經(jīng)PCR與測序鑒定，兩個同源臂核苷酸組成正確。將轉(zhuǎn)移載體pHA2-pUC19-BAC-H1-H2轉(zhuǎn)染BHK21細胞，在熒光顯微鏡下可見發(fā)出綠色熒光的噬斑（圖3A），挑取噬斑繼續(xù)傳代純化，經(jīng)6輪噬斑純化，獲得的重組病毒命名為ZJ01-GFPΔgE/gI。提取純化ZJ01-GFPΔgE/gI病毒基因組DNA為模板，以PRV-gE-632-for/rev為引物未擴增出約700bp的gE基因片段，說明gE已經(jīng)被載體序列替換，經(jīng)6輪噬斑純化的重組病毒無野毒污染，可用于后續(xù)BAC構(gòu)建。

圖3重組病毒ZJ01-GFPΔgE/gI的噬斑純化與鑒定

圖3(A)熒光顯微鏡下的噬斑(上圖ZJ01-GFPΔgE/gI拯救病毒、下圖細胞對照).(B)病毒PCR鑒定產(chǎn)物電泳圖.泳道1-3：PRV-gE-632-for/rev引物PCR擴增產(chǎn)物；泳道4-6：PRV-HOMO1-for/rev引物PCR擴增產(chǎn)物；泳道1、4：ZJ01；泳道2、5：ZJ01ΔgE/gI；泳道3、6：ZJ01gE/gI-R毒株；泳道M：DS^TM 5000bp標準分子量。

2.1.3PRV ZJ01BAC克隆的篩選與鑒定

ZJ01-GFPΔgE/gI環(huán)狀DNA電轉(zhuǎn)化E.coli DH 10B感受態(tài)細胞后，得到氯霉素抗性克隆，Qiagen Miniprep方法提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI酶切分析，篩選出1個疑似包含病毒完整基因組的克隆。PRV ZJ01的感染性BAC克隆命名為pZJ01。提取病毒親本毒ZJ01的gDNA與pZJ01質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHI RFLP分析(圖4A)，結(jié)果表明重組毒的RFLP帶型與親本毒一致，并且長約8kbp的mini-F片段已經(jīng)插入US7與US8區(qū)域之間。

小量提取F5、F15與F20的LB液體培養(yǎng)物BAC DNA，以PRV BAC-H1F/R為引物進行PCR檢測，結(jié)果20代內(nèi)的BAC克隆均能檢測出目的條帶(圖4B)；將F20代的BAC DNA進行RFLP分析，結(jié)果顯示其特征性條帶未發(fā)生變化(圖4A)；將F5與F20代的BAC DNA轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后均能成功地拯救出病毒。 被拯救的重組病毒細胞病變、形成的空斑大小均一致(圖4C)。以上結(jié)果均表明，PRV ZJ01BAC克隆的遺傳穩(wěn)定性良好。

圖4PRV ZJ01BAC克隆的遺傳穩(wěn)定性鑒定

(A)BAC質(zhì)粒拯救病毒DNA的BamHI酶切圖譜(1：F1代病毒、2：F20代質(zhì)粒拯救出的病毒，M：DS^TM2000bp marker.)。(B)BAC克隆質(zhì)粒PCR鑒定(1、2、3泳道分別為F5、F10和F20代質(zhì)粒，M：1Kb DNA Ladder Marker。(C)拯救病毒熒光空斑(左：F1病毒，右：F20病毒)。

2.1.4mini-F載體序列刪除與gE/gI基因缺失病毒篩選

以脂質(zhì)體介導將轉(zhuǎn)移載體pHA2-pUC19-BAC-H1-H2與pZJ01共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后，成功篩選到刪除mini-F載體序列的在熒光顯微鏡下不顯綠色的gE/gI基因缺失病毒。將挑取的無熒光的病毒空斑純化6次。提取純化ZJ01ΔgE/gI病毒基因組DNA為模板，以PRV-gE-632-for/rev為引物擴增gE/gI基因為陰性，而引物PRV BAC-H1F/PRV BAC-H2R擴增片段大小約2000bp，符合預(yù)期，說明該病毒gE/gI基因的缺失而且載體序列已被成功刪除。

2.2ZJ01TK/gE/gI基因缺失毒株ZJ01R的構(gòu)建與鑒定

2.2.1中間載體和轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建與鑒定

按上述相同方法，以PRV ZJ01gE/gI基因缺失毒株gDNA為模板，采用PCR擴增兩個同源重組臂UL23-H1與UL23-H2，構(gòu)建中間載體pUC19-UL23-H1-H2。再將該中間載體與pHA1質(zhì)粒經(jīng)Pac I線性化以T4連接酶連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pHA1-UL23-H1-H2，基因序列測定結(jié)果正確。將該轉(zhuǎn)移載體DNA轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，在熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染細胞表達綠色熒光(圖5)，pHA1-H1-H2可作為轉(zhuǎn)移載體進行下一步重組病毒的構(gòu)建。

圖5轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后熒光的鑒定

2.2.3重組病毒ZJ01R拯救與純化

PRV rZJ01gE/gI^-gDNA與轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后，獲得敲除TK基因的重組病毒。在熒光顯微鏡下觀察到發(fā)出綠色熒光的噬斑，挑取空斑繼續(xù)傳代純化，獲得重組病毒vZJ01-GFPΔTK/gE/gI。

提取該病毒基因組DNA，與pUC19-UL23-H1-H2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，挑取無熒光病毒噬斑，獲得敲除TK基因且敲除熒光標簽的重組病毒PRV ZJ01ΔTK/gE/gI。采用間接免疫熒光試驗，證明該病毒為PRV。采用PRV TK del F/R引物進行PCR鑒定，僅檢測到250bp左右的條帶(圖6B)，對照野生毒株P(guān)RV ZJ01可檢測到1030bp左右的條帶，說明該病毒株中TK基因已被成功且穩(wěn)定敲 除。鑒此，我們成功構(gòu)建獲得TK、gE、gI基因缺失重組PRV ZJ01ΔTK/gE/gI毒株，命名為ZJ01R毒株。

圖6重組病毒PRV ZJ01ΔTK/gE/gI的純化與鑒定

A. 重組病毒鑒定：病毒接種細胞后進行免疫熒光試驗顯示PRV特異性熒光。B重組病毒PCR檢測結(jié)果（泳道1：ZJ01，泳道2：ZJ01ΔTK/gE/gI毒株, M：1Kb DNA Ladder Marker）。

2.3重組病毒體外增殖穩(wěn)定性

將重組病毒ZJ01ΔTK/gE/gI、ZJ01ΔgE/gI和ZJ01分別在BHK21細胞上連續(xù)傳代20代。分別取F3、F10、F20代病毒液測定其滴度，結(jié)果見表1，證明重組病毒ZJ01ΔTK/gE/gI、ZJ01ΔgE/gI滴度與同代次野生毒株P(guān)RV ZJ01相仿，但病變出現(xiàn)時間也略遲于野生型毒株P(guān)RV ZJ01。

表1重組病毒體外增殖滴度比較

病毒生長曲線結(jié)果見圖7，重組病毒ZJ01ΔTK/gE/gI與ZJ01ΔgE/gI生長規(guī)律基本一致，但與ZJ01毒株在BHK-21細胞中增殖速度存在一定差異。親本毒ZJ01在接種后24h病毒滴度即可達到最高10^7.8TCID₅₀/mL，而ZJ01ΔTK/gE/gI與ZJ01ΔgE/gI在接毒后28h才達到最高滴度，分別為10^7.3TCID₅₀/mL與10^7.5TCID₅₀/mL。說明ZJ01ΔTK/gE/gI與ZJ01ΔgE/gI在體外增殖速度比親本毒要略慢一些，但對病毒最高滴度幾乎無影響。

圖7重組病毒在BHK-21細胞上的生長曲線

2.4重組病毒遺傳穩(wěn)定性

TK基因檢測結(jié)果見表2。取F3、F10、F20代重組病毒ZJ01ΔTK/gE/gI，以PRV TK del F/R進行PCR鑒定，可得到大小為250bp的單一條帶，ZJ01毒株P(guān)CR產(chǎn)物大小為1030bp。采用PRV-gE-632-for/rev引物PCR檢測gE/gI基因，結(jié)果顯示，兩個重組病毒均為陰性，而ZJ01毒株擴增結(jié)果為陽性，大小為632bp(表2)。該結(jié)果表明，兩個重組病毒缺失的目的基因片段持續(xù)穩(wěn)定，未因傳代發(fā)生突變。

表2重組病毒體外傳代后遺傳穩(wěn)定性測定結(jié)果(PCR檢測目的基因)

-表示PCR結(jié)果為陰性，-表示PCR結(jié)果為陽性，*表示PCR產(chǎn)物大小

2.5重組病毒缺失基因回復(fù)突變可能性測定

將重組病毒ZJ01ΔTK/gE/gI與其親本毒株ZJ01等量混合，接種于BHK21細胞，傳代10次，收獲F10代病毒，并采用空斑純化方法挑選單個克隆，培養(yǎng)后分別提取DNA，以PRV TK del F/R引物PCR，擴增TK基因片段，結(jié)果見圖4，F(xiàn)10代病毒液中能檢測到約250bp及1030bp的條帶，克隆1和克隆2病毒擴增結(jié)果只有一條條帶，大小為1030bp及250bp，表明混合傳代10代后，PRV ZJ01ΔTK/gE/gI與親本毒株P(guān)RV ZJ01獨立存在，重組病毒與親本毒株沒有發(fā)生重組性回復(fù)性突變，其基因缺失持續(xù)而穩(wěn)定。

圖8重組病毒遺傳穩(wěn)定性鑒定

M：1Kb DNA Ladder Marker，1，混合傳代F10代次病毒液，1、2：克隆1、克隆2病毒

2.6重組病毒ZJ01R免疫后豬體指標監(jiān)測

2.6.1重組病毒ZJ01R免疫后豬體體溫變化

如圖9所示，重組病毒ZJ01R免疫后，豬體未出現(xiàn)發(fā)熱情況，體溫與MEM對照組不存在顯著差異。

圖9重組病毒ZJ01R免疫后豬體體溫

2.6.2重組病毒ZJ01-gE/gI/TK^-免疫后豬體gB抗體水平

ELISA檢測結(jié)果(圖10)表明，重組病毒ZJ01R免疫后7天，免疫豬gB抗體即達到陽性水平并穩(wěn)定維持，對照MEM免疫組則一直為陰性。

圖10重組病毒ZJ01R免疫后豬體gB抗體水平

2.6.3重組病毒ZJ01R免疫21天后豬體中和抗體水平

由圖11可見，免疫后21天，重組病毒ZJ01R免疫組豬中和抗體滴度達到 約10⁶log₂/ml水平，且對變異毒株ZJ01和傳統(tǒng)毒株LA的抗體滴度基本相當，表明該重組病毒免疫21天后，對變異毒株和傳統(tǒng)毒株感染均能夠提供足夠的保護力。

圖11重組病毒ZJ01R免疫后豬體中和抗體水平

2.6.4重組病毒ZJ01R免疫21天后豬組織病變情況

免疫21天后，各組取3頭豬進行剖殺，取腦及肺臟組織制作切片(圖12)，可見重組病毒免疫組與MEM對照組并無顯著差異，均表現(xiàn)正常組織形態(tài)，證明該重組病毒對免疫動物不存在組織損傷。

圖12重組病毒ZJ01R免疫21天后豬組織切片

2.7重組病毒ZJ01R免疫保護力試驗

2.7.1PRV-ZJ01攻毒后重組病毒ZJ01R免疫組豬體存活率

由圖13可知，攻毒后2-3天，MEM免疫組豬只陸續(xù)表現(xiàn)典型的PRV感染癥狀，包括高熱、咳嗽、奇癢、震顫等，后逐步表現(xiàn)為共濟失調(diào)、角弓反張直至死亡。重組病毒ZJ01R免疫組則一直存活直至試驗結(jié)束，且不表現(xiàn)任何臨床癥狀。

圖13PRV-ZJ01攻毒后豬體存活率

2.7.2PRV-ZJ01攻毒后重組病毒ZJ01R免疫組豬體體溫情況

由圖14可知，攻毒后1天，MEM免疫組體溫即開始上升，最高可達41.5℃，并維持高熱直至死亡。重組病毒ZJ01R免疫組豬自攻毒后穩(wěn)定維持在39℃左右，未出現(xiàn)明顯升高。

圖14PRV-ZJ01攻毒后豬體體溫變化

2.7.3PRV-ZJ01攻毒后重組病毒ZJ01R免疫組豬體組織病毒含量

攻毒后，對MEM免疫組死亡豬只及時進行剖檢，采集腦、肺臟組織，并于14天觀察期結(jié)束后對所有豬進行剖殺，采集腦、肺臟組織，以Real-time PCR檢測組織中野毒含量，可見MEM免疫組豬只腦、肺臟中均檢測到較高含量的病毒，而ZJ01R免疫組豬腦、肺臟組織中未檢測到病毒(圖15)，表明該重組病毒能夠 對豬提供足夠的免疫保護，避免豬體出現(xiàn)野毒感染。

圖15PRV-ZJ01攻毒后豬體病毒分布

2.7.4PRV-ZJ01攻毒后重組病毒ZJ01R免疫組豬組織病變情況

取MEM免疫組死亡豬及重組病毒免疫組剖殺豬腦、肺臟組織制作病理切片，可見MEM免疫組肺臟中肺泡壁腫脹、有大面積出血，腦組織有明顯的炎性細胞浸潤和“血管套”現(xiàn)象(圖16)；而重組病毒ZJ01R免疫組肺臟及腦組織均與攻毒前形態(tài)一致，表明重組病毒免疫組豬只未受到野毒攻擊。

圖16PRV-ZJ01攻毒后豬體組織病理切片。