本發(fā)明屬于免疫學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，涉及一種檢測(cè)Cry1Ie蛋白的Cry1Ie單克隆抗體細(xì)胞株、單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)是世界公認(rèn)的生產(chǎn)規(guī)模最大、應(yīng)用最廣泛、最具有前途的微生物殺蟲(chóng)劑，其產(chǎn)生的殺蟲(chóng)晶體蛋白是蘇云金芽孢桿菌發(fā)揮殺蟲(chóng)活性的主要物質(zhì)，編碼殺蟲(chóng)晶體蛋白的基因稱為Bt基因。1981年，Schnepf等人首次成功克隆了第一個(gè)編碼Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白基因，揭開(kāi)了利用基因工程培育抗蟲(chóng)植物的序幕。轉(zhuǎn)基因玉米是第一個(gè)規(guī)模化種植的轉(zhuǎn)基因作物，自1996年商業(yè)化種植以來(lái)，種植面積和種植國(guó)家不斷增加。Btcry1Ie基因是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所從Bt菌株Btc007中分離克隆的一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的殺蟲(chóng)蛋白基因(專利號(hào)：ZL03149867.1)，它與目前在轉(zhuǎn)基因植物中廣泛應(yīng)用的cry1A類基因相似性很低，只有30％，并且它們之間沒(méi)有交互抗性。其編碼的蛋白對(duì)亞洲玉米螟有一定的殺蟲(chóng)活力，而且對(duì)Cry1A類抗性亞洲玉米螟具有一定毒力。因此cry1Ie基因可與其他Bt基因形成二價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米，在克服Bt基因種類單一、同源性高、產(chǎn)生交互抗性的問(wèn)題上發(fā)揮重要作用。然而轉(zhuǎn)基因玉米種植帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，其潛在的環(huán)境安全問(wèn)題也引起了大家廣泛的關(guān)注。目前，轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測(cè)大部分是基于核酸和蛋白質(zhì)水平。核酸水平檢測(cè)遺傳物質(zhì)中是否含有插入的外源毒素基因，如PCR、定量PCR等；蛋白質(zhì)水平利用插入外源毒素基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其功能進(jìn)行檢測(cè)，如酶聯(lián)免疫檢測(cè)法、Westernblot法、試紙條法等。在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)(ELISA)檢測(cè)Cry毒素是目前公認(rèn)的一種具有明顯優(yōu)勢(shì)的技術(shù)，它具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、能大量檢測(cè)樣本等優(yōu)點(diǎn)。然而，獲取具有強(qiáng)親和力、高特異性的Cry毒素抗體(單克隆、多克隆、單鏈抗體)是這一技術(shù)的關(guān)鍵。單克隆抗體技術(shù)是將骨髓瘤細(xì)胞和經(jīng)某種抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性B細(xì)胞經(jīng)PEG等融合劑作用或電激光融合，形成雜交瘤細(xì)胞然后篩選分離出單個(gè)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。再將其擴(kuò)增最終分離，純化抗體的過(guò)程。雜交瘤細(xì)胞具有雙重特性既能如骨髓瘤細(xì)胞般持續(xù)繁殖，又能如B細(xì)胞一樣分泌針對(duì)單一抗原表位的特異性抗體。單克隆抗體與抗血清又稱多克隆抗體(polyclonalantibodyPcAb)，主要區(qū)別是單克隆抗體是一種均一的免疫球蛋白分子，具有針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的特異性；與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性：如高特異性、高純度、均質(zhì)性好、重復(fù)性好、效價(jià)高、等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)治療及診斷等有廣泛應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)Cry1Ie蛋白的Cry1Ie單克隆抗體細(xì)胞株、單克隆抗體及其應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種Cry1Ie單克隆抗體細(xì)胞株，于2016年5月19日，保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNO.12297。本發(fā)明還公開(kāi)了一種單克隆抗體，所述單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCCNO.12297的Cry1Ie單克隆抗體細(xì)胞株產(chǎn)生，所述單克隆抗體是對(duì)Cry1Ie蛋白有特異性的單克隆抗體。本發(fā)明再公開(kāi)了上述Cry1Ie單克隆抗體細(xì)胞株在檢測(cè)Cry1Ie蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明再公開(kāi)了上述單克隆抗體在檢測(cè)Cry1Ie蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明再公開(kāi)了一種Cry1Ie蛋白檢測(cè)試紙，包括保藏號(hào)為CGMCCNO.12297的Cry1Ie單克隆抗體細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。本發(fā)明再公開(kāi)了一種Cry1Ie蛋白檢測(cè)試劑盒，包括保藏號(hào)為CGMCCNO.12297的Cry1Ie單克隆抗體細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：1)本發(fā)明通過(guò)對(duì)Cry1Ie蛋白的氨基酸序列的抗原性、親水性和表位性分析，選定抗原表位，人工合成特異性肽段，進(jìn)而得到抗Cry1Ie蛋白的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，為研制靈敏、快速的BtCry1Ie晶體蛋白檢測(cè)試劑盒(試紙條)奠定了基礎(chǔ)，在Cry1Ie蛋白定性、定量檢測(cè)方面具有廣闊的前景。2)本發(fā)明的單克隆抗體，對(duì)在植物中表達(dá)的BtCry1Ie蛋白具有高親和力，用于定性或定量檢測(cè)棉花、玉米等轉(zhuǎn)基因植物中的BtCry1Ie蛋白，具有特異性強(qiáng)、快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品必不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。附圖說(shuō)明此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中Cry1le小量表達(dá)膠圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中Cry1le大量表達(dá)膠圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中Cry1le純化膠圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例5中陽(yáng)性Cry1Ie植物材料SDS-PAGE圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例5中陰性Cry1Ie植物材料SDS-PAGE圖；圖6為本發(fā)明實(shí)施例5中Cry1Ie蛋白抗體對(duì)陽(yáng)性、陰性Cry1Ie植物材料的Westernblot圖。具體實(shí)施方式以下將配合附圖及實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。實(shí)施例1Cry1Ie(全長(zhǎng))抗原的制備過(guò)程如下：1、Cry1Ie(全長(zhǎng))DNA序列Cry1Ie(全長(zhǎng))DNA序列如SEQIDNO.1所示。2、轉(zhuǎn)化(1)取出－80℃保存的感受態(tài)細(xì)胞(BL21)，放在冰上緩慢解凍。(2)將感受態(tài)細(xì)胞加入連接產(chǎn)物中混勻，冰上放置30min。(3)42℃熱激90s。(4)冰浴2min后，加入800μl無(wú)抗性的LB培養(yǎng)基。(5)37℃培養(yǎng)45min。(6)5000rpm離心3min，棄大部分上清，留約100-150μl，重懸菌體，選擇有相應(yīng)抗性的LB平板，涂板。(7)晾干，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜。3、小量表達(dá)(1)從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到1.5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)。(2)培養(yǎng)至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mmol/L)誘導(dǎo)，37℃，200rpm培養(yǎng)2h。(3)取1ml誘導(dǎo)的菌液，12000rpm，離心1min，棄上清，沉淀用50-100μl10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入緩沖液的量視菌體量而定)，加入與緩沖液等體積的2×loadingbuffer，100℃煮5min，電泳檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖1，圖中各條帶分別為：M為Marker標(biāo)記；1為未經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞；2-5為經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞。說(shuō)明Cry1Ie在細(xì)胞中成功表達(dá)。4、大量表達(dá)(1)接1-2μl活化的菌液到10ml的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，200rpm。(2)將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到500ml的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mmol/L)37℃誘導(dǎo)4h。(3)收菌：6000rpm，離心5min，棄上清。(4)超聲破菌：菌體用20-30ml10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散，超聲波破碎(500W，60次，每次10s，間隔15s)。(5)電泳確定表達(dá)形式：取100μl超聲后的菌懸液，12000rpm，離心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干凈后沉淀用50μl10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散。電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2，圖中各條帶分別為：M為Marker標(biāo)記；1為未經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞；2為經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞；3為超聲破碎后細(xì)胞上清；4為超聲破碎后細(xì)胞沉淀。說(shuō)明Cry1Ie蛋白在細(xì)胞中大量表達(dá)。5、蛋白質(zhì)純化(包涵體)(1)20～30ml10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸超聲離心得到的沉淀，靜置10min。(2)12000rpm，離心10min，上清轉(zhuǎn)入另一管中保存。(3)20～30ml10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，靜置10min。(4)12000rpm，離心10min，棄上清。(5)重復(fù)(3)、(4)一次。(6)先加入少量的10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)溶液重懸沉淀，再加5～10ml含8mol尿素的10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白。(7)12000rpm，離心10min，收集上清，取50μl電泳。結(jié)果見(jiàn)圖3，各條帶分別為：M為Marker；1-5為純化后的Cry1Ie蛋白條帶。實(shí)施例2雜交瘤細(xì)胞株制備1、動(dòng)物免疫用“Cry1Ie(全長(zhǎng))”作為免疫原，對(duì)4只SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠進(jìn)行腹部皮下初次免疫，免疫量為：60μg蛋白/只，小鼠編號(hào)為：1、2、3、4。兩周后進(jìn)行皮下第一次加強(qiáng)免疫，免疫量為30μg蛋白/只。間隔兩周后進(jìn)行皮下第二次加強(qiáng)免疫，免疫量為30μg蛋白/只。再間隔兩周后進(jìn)行皮下第三次加強(qiáng)免疫，免疫量為30μg蛋白/只。7天后眼眶取血，測(cè)血清效價(jià)，血清效價(jià)如表1所示。3天后選取效價(jià)較高的2號(hào)小鼠，用免疫原50μg，進(jìn)行腹腔沖擊，再間隔3天后進(jìn)行細(xì)胞融合。表1血清效價(jià)稀釋倍數(shù)1號(hào)小鼠2號(hào)小鼠3號(hào)小鼠4號(hào)小鼠2000.8651.3671.1800.9424000.5301.2911.0070.6698000.3201.1550.7120.39616000.2100.9090.6300.20432000.0730.6870.4270.11964000.0450.4940.2810.050128000.0410.3950.1910.041256000.0380.2470.1120.024512000.0310.1470.0710.0141024000.0280.1000.0530.013空白0.0290.0210.0210.017陰性0.0770.0780.0850.0792、細(xì)胞融合(1)將狀態(tài)良好的sp2/0細(xì)胞輕柔的從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來(lái)，吸入到50ml離心管中。(2)小鼠摘眼球取血，然后拉頸處死，放入75％的酒精中浸泡5min。(3)在平皿中倒入少量無(wú)血清的IMDM，將細(xì)胞篩及注射器內(nèi)芯放入平皿中。用剪刀和鑷子取下小鼠的脾臟，放到細(xì)胞篩上。用注射器的內(nèi)芯輕輕地將脾充分碾碎，將碾好的細(xì)胞吸入到裝sp2/0的離心管中，1500rad/min離心5min。(4)用剪刀和鑷子取下小鼠的胸腺，碾碎。將碾好的胸腺細(xì)胞到15ml離心管中，再加入1ml的HAT，放在孵箱中備用。(5)將離心好的細(xì)胞，倒掉上清，用無(wú)血清的IMDM將細(xì)胞小心輕柔地吹勻，1500rad/min離心5min。(6)將離心好的細(xì)胞上清盡量倒掉。拍打離心管底充分懸浮細(xì)胞，將離心管放入37℃溫水中，在1分鐘內(nèi)緩慢加入1ml的PEG1450，加完后在溫水中靜置1min。然后2min內(nèi)緩慢加入2ml的無(wú)血清的IMDM，接著2min內(nèi)緩慢加入8ml無(wú)血清的IMDM，1000rad/min離心5min。(7)倒掉上清，加入10ml的新生牛血清，小心的將細(xì)胞吹勻，倒入步驟(4)準(zhǔn)備好的胸腺細(xì)胞。再加入25ml滅菌的半固體培養(yǎng)基(2.2％羧甲基纖維素+2×IMDM+HT)，充分混勻。然后均勻倒入30個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入濕盒中，然后放入孵箱中培養(yǎng)。3、挑克隆融合后7-10天，在體視顯微鏡下，用移液器將克隆挑到96孔板孔內(nèi)，挑10板×93個(gè)細(xì)胞單克隆，培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(事先用100μl/添加有胸腺細(xì)胞的IMDM完全培養(yǎng)基鋪板)。4、雜交瘤細(xì)胞株篩選4.1一篩：挑克隆3天后，用“Cry1Ie(全長(zhǎng))”包板，對(duì)挑選的克隆采用ELISA方法，做第一次篩選，得到37株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。(1)用包被液(碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)稀釋“Cry1Ie(全長(zhǎng))”，終濃度為2μg/ml，100μl/孔，4℃，過(guò)夜；然后用PBS-T洗液(含0.05％吐溫的PBS)洗滌3次。(2)用含2％牛奶的PBS作為封閉液封閉，200μl/孔，37℃孵箱，2h；然后用PBS-T洗液洗滌3次。(3)加入一抗(細(xì)胞培養(yǎng)上清)、陰性對(duì)照(SP2/0培養(yǎng)上清)、空白對(duì)照(PBS)、陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性血清PBS200倍稀釋)，均為100μl/孔，37℃孵箱孵育1h；然后用PBS-T洗液洗滌3次。(4)加入PBS稀釋20000倍的二抗(山羊抗小鼠IgG/HRP)，100μl/孔，37℃孵箱孵育1h；取出后用PBS-T洗液洗滌3次。(5)加入顯色液100μl/孔，顯色時(shí)間為5min左右。顯色液為1％A液+10％B液(A液：含1％TMB的DMSO；B液：含0.1％H2O2的檸檬酸緩沖液)。(6)每孔加入50μl終止液(2mol/L硫酸)終止。(7)雙波長(zhǎng)(450nm，630nm)測(cè)吸光值。4.2二篩：一篩后3天，將一篩篩選出來(lái)的37株陽(yáng)性的細(xì)胞株，用“Cry1Ie(全長(zhǎng))”再次包板，采用ELISA方法，做第二次篩選，得到21株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。(1)用包被液(碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)稀釋“Cry1Ie(全長(zhǎng))”，終濃度為2μg/ml，100μl/孔，4℃，過(guò)夜；然后用PBS-T洗液(含0.05％吐溫的PBS)洗滌3次。(2)用含2％牛奶的PBS作為封閉液封閉，200μl/孔，37℃孵箱，2h；然后用PBS-T洗液洗滌3次。(3)加入一抗(細(xì)胞培養(yǎng)上清)、陰性對(duì)照(SP2/0培養(yǎng)上清)、空白對(duì)照(PBS)、陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性血清PBS200倍稀釋)，均為100μl/孔，37℃孵箱孵育1h；然后用PBS-T洗液洗滌3次。(4)加入PBS稀釋20000倍的二抗(山羊抗小鼠IgG/HRP)，100μl/孔，37℃孵箱孵育1h；取出后用PBS-T洗液洗滌3次。(5)加入顯色液100μl/孔，顯色時(shí)間為5min左右。顯色液為1％A液+10％B液(A液：含1％TMB的DMSO；B液：含0.1％H2O2的檸檬酸緩沖液)。(6)每孔加入50μl終止液(2mol/L硫酸)終止。(7)雙波長(zhǎng)(450nm，630nm)測(cè)吸光值。5、雜交瘤細(xì)胞株亞類鑒定將篩選出來(lái)的21株陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，得到15株IgG類型的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。(1)用100mmol/LPBS(pH7.4)稀釋包被抗體至0.5μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜。(2)PBS-T洗2次(含0.05％吐溫的PBS)，每孔加入200μl封閉液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育2h。(3)PBS-T洗3次；每孔加入100μl雜交瘤上清液，37℃孵育1h。(4)PBS-T洗3次；用封閉液1：10000(κ，λ)或1：20000(各類亞型IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgA)稀釋的HRP標(biāo)記的抗體0.1ml每孔，分別加入適當(dāng)?shù)目字校?7℃孵育1h。(5)PBS-T洗3次；每孔加100μl顯色液(1％A液+10％B液，A液：含1％TMB的DMSO；B液：含0.1％H2O2的檸檬酸緩沖液)，50μl終止液(2mol/L硫酸)，10-20min內(nèi)于雙波長(zhǎng)(450nm，630nm)測(cè)吸光值。6、大量培養(yǎng)及凍存將鑒定完成的細(xì)胞株轉(zhuǎn)入6孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)至2×106，使用2.5ml凍存液將細(xì)胞保存至液氮中。實(shí)施例3單克隆抗體制備1、雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇與擴(kuò)大培養(yǎng)(1)取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加入細(xì)胞培養(yǎng)液約2ml。(2)從液氮中取出細(xì)胞，放入37℃水浴鍋中迅速解凍。(3)吸取細(xì)胞放入5-10ml完全培養(yǎng)基，1000rpm離心5min，棄掉上清。(4)將離心好的細(xì)胞上清液吸除，吸取1ml細(xì)胞培養(yǎng)液混勻沉淀細(xì)胞，將該細(xì)胞液吸出，混勻到相應(yīng)的培養(yǎng)板孔中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。2、準(zhǔn)備小鼠在打雜交瘤細(xì)胞之前一周對(duì)小鼠采用腹腔注射方式打石蠟油制造腹水，每只Balb/c小鼠打石蠟油為500μl，根據(jù)需要制備的腹水量，準(zhǔn)備好相應(yīng)小鼠。3、雜交瘤細(xì)胞收集與注射待培養(yǎng)的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即可收集。吸取上清1ml后，吹打細(xì)胞，使其脫落，然后收集到15ml離心管中，1000rmp離心5min。用適量的生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105-9×105個(gè)/ml。采用腹腔注射方式注射雜交細(xì)胞瘤，每只鼠注射1ml。4、腹水收集打雜交瘤細(xì)胞后7天左右，小鼠腹腔開(kāi)始鼓起。如果肚子夠大(一般為7-10天)，就可以取腹水。取腹水之前先要把細(xì)胞株名稱記在裝腹水的管子上(15ml離心管)。左手把小鼠抓牢，右手拿針頭(取腹水用針頭)，針頭與小鼠平行。針從腹股溝和最靠下的兩個(gè)乳頭這三點(diǎn)形成的三角形中扎進(jìn)去。針頭的一端放在備用離心管中。針扎進(jìn)小鼠腹部不要太深，以免扎傷內(nèi)臟。腹水就會(huì)順著針管流進(jìn)離心管里。取的過(guò)程中適當(dāng)調(diào)換手的姿勢(shì)，盡可能多取、快取。(最好兩天取一次)取出的腹水5000rpm離心10min，離心后將腹水上清吸到相應(yīng)離心管中，做好標(biāo)記和記錄。放到-20℃指定位置保存。5、抗體純化(1)樣本預(yù)處理：用偶聯(lián)緩沖液(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0)以1:3稀釋，配平，10000rpm，4℃離心20min，上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾，除去脂肪、細(xì)胞殘?jiān)靶☆w粒物質(zhì)。(2)平衡：用5-10倍柱體積的偶聯(lián)緩沖液平衡預(yù)裝親和柱(HiTrapProteinAFF，GE)，保持流速為4s/滴。(3)上樣：用注射器把樣品注入柱子上端接口，保持流速為5s/滴。(4)洗雜：用5倍柱體積的偶聯(lián)緩沖液過(guò)柱，保持流速為4s/滴。避免過(guò)度洗滌，如果目的蛋白和配體的相互作用很弱，過(guò)度洗滌會(huì)降低得率。(5)洗脫：用5倍柱體積洗脫緩沖液(0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液)洗脫抗體，收集于EP管中。(6)純化抗體用K5500微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，記錄之后于-20℃分裝保存。實(shí)施例4抗體相對(duì)親和力測(cè)定1、包被：2.0μg/ml“Cry1Ie(全長(zhǎng))”(碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)包被96孔板，包被過(guò)夜；洗板1次。2、封閉：封閉液(2％脫脂奶粉溶解于PBS，pH7.4)，200μl/孔，37℃封閉2h。洗板1次。3、一抗：加入純化抗體，1:200開(kāi)始2倍梯度稀釋，設(shè)一個(gè)空白，37℃孵育1h。洗板3次。4、二抗:加入羊抗鼠二抗，1:20000稀釋，37℃孵育1h。洗板3次。5、顯色：加入顯色液100μl/孔。6、終止：加入終止液50μl/孔。7、測(cè)定：用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，找出≥1/2“平臺(tái)OD值”對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)A。親和常數(shù)測(cè)定數(shù)據(jù)如表2所示。表2親和常數(shù)測(cè)定數(shù)據(jù)親和常數(shù)大小反應(yīng)抗體親和力的強(qiáng)弱，也就是抗體的質(zhì)量高低?？贵w的親和常數(shù)一般達(dá)到1.0E+7即為ELISA可用的水平。目前抗體可以達(dá)到1.23E+10，說(shuō)明該抗體的親和力比較高，質(zhì)量非常好。實(shí)施例5單克隆純化抗體在Westernblot水平對(duì)陰陽(yáng)性天然材料的識(shí)別反應(yīng)1、實(shí)驗(yàn)材料：抗原：Cry1Ie玉米葉陽(yáng)性樣本；一個(gè)陰性玉米葉樣本：農(nóng)大108非Bt。一抗：Cry1Ie單克隆抗體。二抗：HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體。2、實(shí)驗(yàn)方法：Westernblot3、實(shí)驗(yàn)原理：Western印跡是在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳基礎(chǔ)上，將電泳分離的蛋白組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持物上，應(yīng)用抗體可與附著于固相支持物上的靶蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)的特點(diǎn)，針對(duì)特定蛋白進(jìn)行鑒別和定量。4、主要試劑(1)動(dòng)植物組織裂解液:50mmol/LTris(pH7.4)、150mmol/LNaCl、1％Triton-100、0.2％SDS、1mmol/LEDTA、1％脫氧膽酸鈉(Sodiumdeoxycholate)、1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、5％β-巰基乙醇(2)30％丙烯酰胺(4℃避光保存)(3)10％SDS溶液(4)分離膠緩沖液(1.5mol/LpH8.8Tris-HCl儲(chǔ)液，4℃保存)(5)濃縮膠緩沖液(1.0mmol/LpH6.8Tris-HCl儲(chǔ)液，4℃保存)(6)TEMED(要提前分裝1ml.注意避光)(7)SDS-PAGE加樣緩沖液(5×loading)：1mol/LpH6.8Tris-HCl、0.1％SDS、0.05％溴酚藍(lán)、0.5％甘油、0.01％巰基乙醇(8)10％AP(9)轉(zhuǎn)移緩沖液：0.5M甘氨酸、60mmol/LTris、10％SDS(10)封閉液(5％的脫脂奶粉)(11)TBST：50mmol/LTris(pH7.4)、150mmol/LNaCl、2ml吐溫-205、操作規(guī)程動(dòng)植物組織樣本制備規(guī)程本實(shí)驗(yàn)需全程保持在4℃左右環(huán)境，操作嚴(yán)格限制在冰浴中。稱取組織樣本1g，研磨后加入2-3ml的裂解液。把組織裂解液吸到1.5ml預(yù)冷EP管中，每隔5min渦旋混勻1min，重復(fù)3次。充分裂解后12000r，4℃離心10min，收上清，加入5×loadingBuffer，100℃水浴10min，低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?、配制SDS-PAGE凝膠(1)制備樣品：上樣量為0.1ug重組蛋白或100ug全蛋白(天然)/孔，樣品沸水浴10min。(2)上樣：20μl/孔。(3)跑膠：溴酚藍(lán)前沿到達(dá)玻璃板底部時(shí)停止電泳，取出凝膠。將膠放入轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡20min。(4)處理膜：電泳結(jié)束前30min，將PVDF膜于100％甲醇溶液浸泡5min,再用三蒸水漂洗5min，最后將膜浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡20min，濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)移緩沖液中浸泡20min。(5)轉(zhuǎn)膜：時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)分子量大小做調(diào)整。(6)封閉：電轉(zhuǎn)后的膜用TBST漂洗5min，置于5％脫脂奶粉封閉液中，過(guò)夜封閉，次日拿出震蕩1h。(7)孵一抗：稀釋一抗(單抗細(xì)胞培養(yǎng)上清1：5-1：10，多抗上清1:500-1:1000，純化抗體1：1000-1：5000，封閉液稀釋)。室溫震蕩孵育2h。(8)孵二抗：TBST漂洗膜4×5min，二抗用封閉液1：5000稀釋配制，孵育1.5h。(9)ECL顯色：TBST漂洗膜4×5min，取出GEAmershamECLprime顯色試劑盒顯色，觀察顯色效果并記錄保存。具體結(jié)果見(jiàn)表3：表3WB數(shù)據(jù)WB結(jié)果如圖4-6所示，圖4中M為Marker標(biāo)記；2-10為陽(yáng)性樣本，圖中2-10在70-100KD范圍內(nèi)有目的條帶，說(shuō)明純化Cry1Ie單抗能夠檢測(cè)出陽(yáng)性樣本中的Cry1Ie蛋白。圖5中M為Marker標(biāo)記；圖中陰性樣本在70-100KD范圍內(nèi)無(wú)條帶，說(shuō)明陰性樣本中不含Cry1Ie蛋白。圖6中1、3、5、7為陽(yáng)性樣本，2、4、6、8為陰性樣本，從圖中可看出，陽(yáng)性樣本在70-100KD范圍內(nèi)有條帶產(chǎn)生，陰性樣本在70-100KD范圍內(nèi)無(wú)對(duì)應(yīng)條帶。本發(fā)明通過(guò)對(duì)Cry1Ie蛋白的氨基酸序列的抗原性、親水性和表位性分析，選定抗原表位，人工合成特異性肽段，進(jìn)而得到抗Cry1Ie蛋白的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，為研制靈敏、快速的BtCry1Ie晶體蛋白檢測(cè)試劑盒(試紙條)奠定了基礎(chǔ)，在Cry1Ie蛋白定性、定量檢測(cè)方面具有廣闊的前景。本發(fā)明的單克隆抗體，對(duì)在植物中表達(dá)的BtCry1Ie蛋白具有高親和力，用于定性或定量檢測(cè)棉花、玉米等轉(zhuǎn)基因植物中的BtCry1Ie蛋白，具有特異性強(qiáng)、快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)如在說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來(lái)指稱特定成分或方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可理解，不同地區(qū)可能會(huì)用不同名詞來(lái)稱呼同一個(gè)成分。本說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求并不以名稱的差異來(lái)作為區(qū)分成分的方式。如在通篇說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的“包含”為一開(kāi)放式用語(yǔ)，故應(yīng)解釋成“包含但不限定于”?！按笾隆笔侵冈诳山邮盏恼`差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問(wèn)題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。說(shuō)明書(shū)后續(xù)描述為實(shí)施本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃以說(shuō)明本發(fā)明的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。還需要說(shuō)明的是，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統(tǒng)不僅包括那些要素，而且還包括沒(méi)有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統(tǒng)所固有的要素。在沒(méi)有更多限制的情況下，由語(yǔ)句“包括一個(gè)……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統(tǒng)中還存在另外的相同要素。上述說(shuō)明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3