本發(fā)明涉及家畜基因工程疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種紅斑丹毒絲菌抗原蛋白sbp及應(yīng)用。

技術(shù)背景

紅斑丹毒絲菌感染豬導(dǎo)致豬丹毒，是上世紀(jì)90年代豬三大傳染病之一。之后由于商業(yè)化疫苗的使用，豬丹毒逐漸得到有效的控制。但2010年以來，豬丹毒在我國部分省市重新流行。2012年豬丹毒病例已逐漸增多。至2013年我國湖南、湖北、江西、廣西、四川、廣東、浙江等多個(gè)省份均出現(xiàn)了豬丹毒的大范圍流行，給豬場(chǎng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

青霉素一直是治療豬丹毒的有效藥物。然而，湖南動(dòng)物疾病中心何世成等人于2011年分離到3株耐青霉素紅斑丹毒絲菌。申請(qǐng)人對(duì)分離自湖北地區(qū)發(fā)病豬場(chǎng)的31株紅斑丹毒絲菌的耐藥性(李敬濤，湖北部分地區(qū)紅斑丹毒絲菌分離株耐藥性分析，養(yǎng)殖與飼料[j].2015.2，11-14)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：臨床分離株對(duì)常用的卡那霉素、鏈霉素、阿米卡星、多粘菌素b、萬古霉素、慶大霉素6種抗生素耐藥率為100％。這說明臨床上長(zhǎng)期使用抗生素已導(dǎo)致紅斑丹毒絲菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性。

紅斑丹毒絲菌商業(yè)化疫苗主要為滅活疫苗和弱毒疫苗。但不同菌株的毒力基因表型存在較大差異，滅活疫苗對(duì)異源菌株的保護(hù)力不佳。而弱毒疫苗不能清除定居在扁桃體或關(guān)節(jié)里的紅斑丹毒絲菌，同時(shí)母源抗體和藥物很容易干擾疫苗的效力，且弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)的可能性，對(duì)免疫豬群存在很大的風(fēng)險(xiǎn)。因此開發(fā)新型亞單位疫苗有利于更好的防控豬丹毒。

目前豬丹毒的亞單位疫苗研究還比較少。已報(bào)道的紅斑丹毒絲菌的保護(hù)性抗原主要為spaa。但是該蛋白分子量比較大，獲得全長(zhǎng)蛋白比較困難，成本比較高。對(duì)n端截短蛋白的保護(hù)性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其也能給仔豬提供不錯(cuò)的保護(hù)力，但是spaan端保守性不高，不同臨床分離紅斑丹毒絲菌菌株的spaa蛋白n端存在差異，因此spaa截短蛋白能否保護(hù)豬群免受當(dāng)前中國國內(nèi)流行的不同紅斑丹毒絲菌感染還不確定。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)臨床分離的紅斑丹毒絲菌強(qiáng)度菌株和弱毒菌株的細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：本發(fā)明提供的sbp蛋白在強(qiáng)毒菌株中高表達(dá)，強(qiáng)毒菌株中高表達(dá)的蛋白一般是潛在的毒力相關(guān)蛋白或是亞單位疫苗侯選體。因此，本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增了31株紅斑丹毒絲菌臨床分離菌株的sbp基因并測(cè)序，發(fā)現(xiàn)sbp基因序列在不同臨床分離株中高度保守，序列一致。鑒于此，本發(fā)明著手于紅斑丹毒絲菌sbp蛋白的免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)，尋找能提供高效免疫力、生物安全性高的抗原成分，保護(hù)豬群抵抗當(dāng)前流行毒株的侵襲。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種紅斑丹毒絲菌抗原蛋白sbp，其氨基酸序列為seqidno.2所示。其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為seqidno.1所示。

本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供了一種紅斑丹毒絲菌抗原蛋白sbp在制備豬丹毒疫苗中的應(yīng)用，利用本發(fā)明提供的蛋白無菌處理后與佐劑按比例混合，肌肉免疫仔豬，發(fā)現(xiàn)其可有效提高攻毒后仔豬存活率。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種紅斑丹毒絲菌抗原蛋白sbp，其氨基酸序列為seqidno.2所示?？衫贸Ｒ?guī)方案，例如合成，原核表達(dá)等方式獲得該蛋白。

seqidno.2所示氨基酸序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列也為本發(fā)明的保護(hù)范圍，優(yōu)選的所述的核苷酸序列為seqidno.1所示。

一種紅斑丹毒絲菌抗原蛋白sbp在制備豬丹毒亞單位疫苗的應(yīng)用，包括利用該蛋白無菌處理后與佐劑按比例混合，制備為豬丹毒亞單位疫苗；或是該疫苗與其他已知疫苗組合制備為多聯(lián)疫苗。

與現(xiàn)有疫苗相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

弱毒疫苗毒力減弱的機(jī)制不清楚，存在毒力返強(qiáng)的可能性，對(duì)易感豬群存在潛在的威脅。滅活疫苗可以為同源紅斑丹毒絲菌提供較好的保護(hù)效果，但不同菌株的毒力基因存在差異，其對(duì)異源菌株的保護(hù)效果很弱。本發(fā)明提供的亞單位疫苗具有好的保護(hù)效果，生物安全性高。

附圖說明

圖1重組質(zhì)粒pet-28a-sbp雙酶切鑒定圖。

圖2為實(shí)施例1中制備的sbp蛋白檢測(cè)示意圖。

圖2a重組抗原純化sds-page電泳；圖2bwestern-blot分析示意圖。

圖3亞單位疫苗sbp免疫仔豬后體溫檢測(cè)。

圖4亞單位疫苗sbp免疫仔豬后抗體滴度。

圖5免疫仔豬攻毒后癥狀。

圖6免疫仔豬攻毒后存活率。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述試劑如未特別說明，均購自商業(yè)渠道或?yàn)楸绢I(lǐng)域的常規(guī)配制試劑。所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案。

實(shí)施例1：

紅斑丹毒絲菌抗原蛋白(本發(fā)明或稱sbp蛋白)的制備：

本發(fā)明實(shí)施例以原核表達(dá)為例，對(duì)該蛋白的表達(dá)進(jìn)行說明：

大腸桿菌(escherichiacoli)bl21/pet-28a-sbp的構(gòu)建，表達(dá)并純化目的蛋白

1)構(gòu)建表達(dá)載體

將sbp基因(seqidno.1所示序列)按常規(guī)方法插入pet-28a(+)的bamhi和xhoi酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組載體pet-28a-sbp。轉(zhuǎn)化至dh5a感受態(tài)菌株中，挑取陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，利用bamhi+xhoi雙酶切質(zhì)粒，酶切后出現(xiàn)預(yù)期大小的外源片段即為正確的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果如圖1所示，雙酶切的條帶符合sbp基因的大小。將重組質(zhì)粒pet-28a-sbp轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞bl-21(de3)中，采用菌落pcr的方法，挑選陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定同時(shí)將質(zhì)粒送上海生工生物公司測(cè)序，比對(duì)正確，即為sbp蛋白的表達(dá)菌株。

2)表達(dá)、純化目的蛋白

將大腸桿菌bl21/pet-28a-sbp接種于5mllb液體培養(yǎng)基中(含25μg/mlkan)，于37℃搖床培養(yǎng)。從培養(yǎng)好的菌液中取100μl接種于100ml的新鮮lb液體培養(yǎng)基中(含25μg/mlkan)，置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)約3h至od600達(dá)到0.8，加iptg至終濃度為0.2mmol/l，繼續(xù)培養(yǎng)3h后收集菌體。

將誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌8000r/min離心15min。沉淀用50mlbingdingbuffer(20mmtris-hclph7.9，5mmimidazole，0.5mnacl)重懸，冰浴30min，冰浴條件下進(jìn)行超聲碎破至菌液清亮，4℃12,000r/min離心15min取上清。上清包含有sbp重組蛋白，將上清用蛋白純化儀amershanbioscienceupc-900進(jìn)行純化，得到純化的sbp重組蛋白。

獲得的重組蛋白sbp(包括seqidno.2所示序列)進(jìn)行sds-page分析(如圖2a所示)，條帶大小為48kd，符合sbp蛋白的大小。用western-blot方法(見《分子克隆手冊(cè)》)分析重組抗原蛋白sbp的免疫原性，結(jié)果如圖2b所示sbp蛋白可以和sbp免疫鼠陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有較好的免疫原性，用于以下實(shí)施例。

實(shí)施例2：亞單位疫苗成分及常規(guī)檢驗(yàn)

抗原組分：sbp蛋白溶液(蛋白的表達(dá)、鑒定、純化及定量如實(shí)施例1所述)。

劑型：油包水型(w/o)

佐劑組成：白礦油(marcol52)

吐溫80(crillet4)

司盤80(crill4)

油相：白礦油加熱至透明后與司盤80按體積比94：6配制。

水相：sbp蛋白溶液與吐溫80組成，吐溫80占水相的0.4％(體積比)。

疫苗乳化：sbp蛋白加入吐溫80混勻制成水相，水相與油相按1：1.5體積混合乳化。使抗原蛋白sbp的終濃度為1mg/ml，用于以下實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明提供的sbp蛋白疫苗或稱為sbp亞單位疫苗。

疫苗性狀檢測(cè)：乳化后疫苗滴入清水中，第一滴散開，第二滴油珠狀，晃動(dòng)液面油珠不破乳。

無菌檢測(cè)：取少許疫苗涂布tsa平皿，37℃溫箱培養(yǎng)18小時(shí)無菌落長(zhǎng)出。

穩(wěn)定性檢驗(yàn)：3000rpm/min離心15分鐘，離心后乳化疫苗未分層。

實(shí)施例3：

一種紅斑丹毒絲菌抗原蛋白sbp在制備豬丹毒亞單位疫苗的應(yīng)用：

1)實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30日齡仔豬(紅斑丹毒絲菌抗體檢測(cè)為陰性)，購自武漢天種青草湖養(yǎng)殖有限公司。

攻毒菌株：紅斑丹毒絲菌se38株(以下簡(jiǎn)稱se38，李敬濤，湖北部分地區(qū)紅斑丹毒絲菌分離株耐藥性分析，養(yǎng)殖與飼料[j].2015.2，11-14)。

實(shí)驗(yàn)分組：30日齡仔豬分為3組：免疫1組(sbp)、免疫2組(sbp)、佐劑對(duì)照組(實(shí)施例2所述佐劑成分與tris-hcl混合)，每組6頭。免疫1組、佐劑對(duì)照組用于攻毒，免疫2組用于檢測(cè)抗體水平，連續(xù)檢測(cè)8個(gè)月。

免疫方式：頸部和臀部多點(diǎn)注射，免疫劑量為2ml/頭，每2周免疫1次，共2次，所用疫苗為實(shí)施例2制備的sbp亞單位疫苗。

2)亞單位疫苗對(duì)仔豬的生物安全性評(píng)價(jià)

首次免疫后連續(xù)7天監(jiān)測(cè)體溫，觀察免疫后仔豬的采食及精神情況。免疫后仔豬沒有明顯應(yīng)激癥狀，免疫后第二天免疫1組、佐劑組體溫均輕微上升，上升幅度不超過1℃。至第三天體溫基本恢復(fù)正常，期間仔豬采食量未見減少，體溫的短暫上升對(duì)仔豬的生長(zhǎng)影響較小，體溫變化如圖3所示。

3)免疫后仔豬抗體水平檢測(cè)

免疫1組、佐劑對(duì)照組首次免疫后，連續(xù)四周每周耳靜脈采血，用于血清特異性抗體的檢測(cè)；免疫2組每個(gè)月采血一次，用于血清特異性抗體的長(zhǎng)期檢測(cè)。采集的血液凝集后，3000rpm/min離心，分離血清，保存于-80℃冰箱備用。

將純化的重組蛋白sbp加入包被液(1.59gna2co3，2.93gnahco3，加ddh20定容至 1l)中調(diào)整蛋白濃度，包被elisa板(蛋白濃度為100ng/孔)，4℃過夜；去掉包被液，pbst洗滌3次后每孔加入120ul封閉液(含有5％脫脂乳的pbst溶液)，pbst洗滌3次；加入待檢血清，用封閉液按1:4、1:8……1:2²⁰依次兩倍倍比稀釋，37℃溫育1h后pbst洗滌3次；每孔加入100ul按1:5000稀釋的羊抗鼠二抗，37℃溫育30min后pbst洗滌5次；加入底物a、b顯色10min后加入終止液，酶標(biāo)儀讀取od630nm。每孔測(cè)定值od630nm≥0.39，判定為陽性；每孔測(cè)定值od630nm＜0.39，判定為陰性。

仔豬抗體水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：首免第一周誘導(dǎo)的抗體水平較弱，平均值為2⁵，隨后幾周誘導(dǎo)的抗體水平逐漸升高，在首免第四周(即二免兩周)高達(dá)2¹⁶，如圖4所示；

4)免疫仔豬攻毒后保護(hù)力測(cè)定

二免兩周后的仔豬進(jìn)行抗體水平檢測(cè)后，皮下注射se38菌液，攻毒劑量為9×10⁸cfu/頭(3ld100)。連續(xù)觀察14天，記錄臨床特征及存活率。

攻毒后，佐劑組仔豬全部發(fā)病，在攻毒第二天即出現(xiàn)體溫升高，隨后陸續(xù)有仔豬出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、站立顫抖、食欲廢絕、消瘦，全身皮膚呈現(xiàn)菱形紅斑等癥狀(如圖5a所示)，該組仔豬在攻毒后一周內(nèi)全部死亡；而免疫1組有3頭仔豬發(fā)病，其中兩頭仔豬出現(xiàn)佐劑組仔豬相同癥狀，并于7天內(nèi)死亡，另外一頭仔豬發(fā)病癥狀較輕，皮膚僅限于攻毒部位處出現(xiàn)紅斑隨后恢復(fù)正常(如圖5b)所示，免疫1組攻毒后存活4頭，存活率為66.7％(如圖6所示)。攻毒十天后，將免疫1組存活仔豬處以安樂死并進(jìn)行剖檢，選擇心、肝、脾、肺、腎組織進(jìn)行分菌，均未分離到se38菌株。說明本發(fā)明制備的sbp亞單位疫苗可以為仔豬提供較好的保護(hù)效果，并有助于感染后仔豬體內(nèi)紅斑丹毒絲菌的清除。

5)免疫后仔豬抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律

免疫后，對(duì)免疫2組進(jìn)行為期7個(gè)月的抗體水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：首次免疫2周后抗體開始上升，28天全部表現(xiàn)較高的抗體水平，抗體滴度達(dá)到1:2¹⁶，首次免疫后第28-90天為抗體高峰期，之后抗體滴度開始下降，至免疫180天，抗體滴度還能達(dá)到1:2⁸，免疫210天雖能檢測(cè)到抗體，但抗體滴度非常低。由此說明免疫sbp蛋白后仔豬抗體至少可維持6個(gè)月(表1)。

表1：免疫后仔豬抗體滴度檢測(cè)

本亞單位疫苗對(duì)我國臨床分離的強(qiáng)毒紅斑丹毒絲菌能提供66.7％的保護(hù)率，有助于感染后仔豬體內(nèi)紅斑丹毒絲菌的清除，且本實(shí)驗(yàn)室當(dāng)前分離到的31株(李敬濤，湖北部分地區(qū)紅斑丹毒絲菌分離株耐藥性分析，養(yǎng)殖與飼料[j].2015.2，11-14)紅斑丹毒絲菌中均可以擴(kuò)增到高度保守的sbp基因(同源性≥98)。說明該亞單位疫苗可以用于當(dāng)前我國豬丹毒的防制。經(jīng)過添加其他蛋白疫苗有望獲得更好的保護(hù)效果。

實(shí)施例4：

超劑量接種的安全性試驗(yàn)

試驗(yàn)動(dòng)物：30日齡仔豬(紅斑丹毒絲菌抗體檢測(cè)為陰性)，購自武漢天種青草湖養(yǎng)殖有限公司。

免疫疫苗：實(shí)施例2中制備的sbp亞單位疫苗。

免疫劑量與免疫方式：4ml(2倍于正常劑量)在仔豬臀部肌肉處注射。

試驗(yàn)結(jié)果：免疫后連續(xù)觀察一周，免疫仔豬僅在免疫后第一天出現(xiàn)體溫小幅度(1℃以內(nèi))上升，第二天便恢復(fù)正常。免疫后仔豬食欲、精神狀態(tài)都正常，表明本發(fā)明的亞單位疫苗對(duì)仔豬超劑量免疫接種是安全的。

sequencelisting

<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種紅斑丹毒絲菌抗原蛋白sbp及應(yīng)用

<130>一種紅斑丹毒絲菌抗原蛋白sbp及應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1221

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gattctgaagaagtaaccattaaatattggaacttcccaaactttaccaatgatcaagaa60

tttccagattcagcagattacgatgcagcgcttattaaagcatttgaggaaaaaaaccca120

accattaaggttgattaccaaaaaattgactttacagatggtcctgcaaaagttgaaacc180

gcaattcaatcaaaaacaaatcctgatgtaatctatgatgctccaggtcgtgttattgac240

tgggcttcaaaaggatacctcaaagaatttgcagatgttgatacaaaacaacttgatgca300

tcagcagtaaaagcaagtagtcttgataataaactctatctttacccacaagggattgca360

ccgttcttaatggctgtaaataccaatgtaacagataagttaggaatcacagatttactt420

ccattagataaagaagataatccaggacgtaattggactgttgatgaatttgaaacattc480

ttaaaagcagttaaagaaaaagatccagaaatgattccgacattactttatgcgaaatca540

gctgcaggggatcaaggtcctcgtgcctttgtttcaaacttatacggctcatggattaca600

gatgaagcaatctcagaatataccattaataacgaacaaggtgttaaaggtctagaatgg660

gtagctaaagcttcaaaagagggattacttggaagtggacaaggtcttgaatcaaaagat720

ggtcaagaatacttcaaatccaataaaaccgcaatttcaattctttcatctccaggactt780

cgtacacaacacatgcaaggttcagacatgaatgcacgtttcttaccttatccaaatgat840

gcgaaagcacctaaatatgaattcttagttgcaggtccagccgtatttgacaacggtgat900

gatgcgaaagcagcagcagctcaaaaattcgcagacttcatgatcaatgatgaagtatgg960

ggtaaacgtacacttcttgcaacaggaaacttctcagcacaacaaggtcaaactggatta1020

tatgatgatgcagaacttaaattcgcagaatcactaacacctcaatttggtccttactac1080

aataccattgaaggttatgcaaaaatgcgtccttactggttcccaatgttacaatctgta1140

atgagtggtgaagcagaaccgaaagccgcagcggatgcatttgtagaaaaagcaaataat1200

acaataaaagaagcacaatag1221

<210>2

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<212>prt

<213>人工序列

<400>2

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151015

asnaspglnglupheproaspseralaasptyraspalaalaleuile

202530

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354045

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505560

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65707580

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130135140

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

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260265270

argpheleuprotyrproasnaspalalysalaprolystyrgluphe

275280285

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290295300

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305310315320

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325330335

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340345350

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355360365

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370375380

alagluprolysalaalaalaaspalaphevalglulysalaasnasn

385390395400

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405