本申請要求以下的權(quán)益：2014年12月5日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/087,854；2015年6月10日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/173,706；2015年11月16日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/256,041；2015年1月14日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/103,513；2015年4月21日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/150,508；2015年6月10日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/173,710；2015年11月16日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/256,039；2015年6月25日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/184,811；2015年6月24日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/183,935；以及于2015年12月4日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/263,329，其全部內(nèi)容通過引用并入本文以提供公開內(nèi)容的連續(xù)性。

本公開內(nèi)容涉及用于降低過量的氨并將氨和/或氮轉(zhuǎn)化為旁路副產(chǎn)物(alternatebyproduct)的組合物和治療方法。在某些方面，本公開內(nèi)容涉及能夠特別是在低氧條件下，諸如在哺乳動(dòng)物消化道中降低過量的氨的遺傳工程化的細(xì)菌。在某些方面，本文公開的組合物和方法可用于調(diào)節(jié)或治療與高氨血癥相關(guān)的紊亂，例如尿素循環(huán)障礙(ureacycledisorder)和肝性腦病。

氨是高度毒性的并在所有器官的代謝期間產(chǎn)生(walker，2012)。高氨血癥是由于解毒減少和/或氨的產(chǎn)生增加引起的。在哺乳動(dòng)物中，尿素循環(huán)通過將氨酶促地轉(zhuǎn)化為尿素來對氨解毒，尿素然后在尿液中去除。氨解毒減少可能是由于尿素循環(huán)障礙(ucd)引起的，其中尿素循環(huán)酶是有缺陷的，諸如精氨基琥珀酸尿癥、精氨酸酶缺乏癥、氨甲酰磷酸合成酶缺乏癥、瓜氨酸血癥、n-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥(等，2012)。美國國家尿素循環(huán)障礙基金會(huì)(nationalureacycledisordersfoundation)估計(jì)，ucd的患病率為每8,500出生中1例。另外，幾種非ucd紊亂，諸如肝性腦病、門體分流和有機(jī)酸疾病(organicaciddisorder)也可引起高氨血癥。高氨血癥可以產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)，例如癲癇、共濟(jì)失調(diào)、中風(fēng)樣病變、昏迷、精神病、視力損失、急性腦病、腦水腫、以及嘔吐、呼吸性堿中毒、低體溫或死亡(等，2012；等，2013)。

氨也是氨基酸的氮源，氨基酸是通過各種生物合成途徑合成的。例如，精氨酸生物合成將包含一個(gè)氮原子的谷氨酸轉(zhuǎn)化為包含四個(gè)氮原子的精氨酸。在精氨酸生物合成途徑中形成的中間代謝物，諸如瓜氨酸，也摻入氮。因此，精氨酸生物合成的增強(qiáng)可用于將身體中的過量的氮摻入到無毒分子中以調(diào)節(jié)或治療與高氨血癥相關(guān)的狀況。類似地，組氨酸生物合成、甲硫氨酸生物合成、賴氨酸生物合成、天冬酰胺生物合成、谷氨酰胺生物合成和色氨酸生物合成也能夠摻入過量的氮，并且這些途徑的增強(qiáng)可用于調(diào)節(jié)或治療與高氨血癥相關(guān)的狀況。

目前用于高氨血癥和ucd的療法旨在降低氨過量，但被廣泛認(rèn)為是次優(yōu)的(nagamani等，2012；hoffmann等，2013；torres-vega等，2014)。大多數(shù)ucd患者需要由蛋白限制組成的基本上改良的飲食。然而，必須謹(jǐn)慎監(jiān)測低蛋白飲食；當(dāng)?shù)鞍讛z入過于限制時(shí)，身體會(huì)分解肌肉，并因此產(chǎn)生氨。另外，許多患者需要補(bǔ)充氨清除藥物，諸如苯丁酸鈉、苯甲酸鈉和苯丁酸甘油酯，并且這些藥物中的一種或更多種必須每天施用3至4次(leonard，2006；diaz等2013)。這些藥物的副作用包括惡心、嘔吐、易怒、厭食和女性月經(jīng)失調(diào)(menstrualdisturbance)(leonard，2006)。在兒童中，食物和藥物的遞送可能需要通過手術(shù)在胃內(nèi)植入的胃造口管或通過鼻子手動(dòng)插入到胃中的鼻胃管。當(dāng)這些治療選項(xiàng)失敗時(shí)，可能需要肝移植(美國國家尿素循環(huán)障礙基金會(huì))。因此，對于與高氨血癥相關(guān)的疾病(包括尿素循環(huán)障礙)的有效、可靠和/或長期的治療存在顯著的未滿足的需求。

本發(fā)明提供了能夠降低過量的氨并將氨和/或氮轉(zhuǎn)化為旁路副產(chǎn)物的遺傳工程化的細(xì)菌。在某些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌降低過量的氨，并在低氧環(huán)境(例如消化道)中選擇性地將氨和/或氮轉(zhuǎn)化成旁路副產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是非病原性的并且可以被引入消化道中，以便降低毒性氨。高氨血癥患者中過量的氨的多達(dá)70％在胃腸道積累。本發(fā)明的另一方面提供了基于增加的氨水平和/或氮消耗或無毒副產(chǎn)物(例如精氨酸或瓜氨酸)的產(chǎn)生來選擇或靶向遺傳工程化的細(xì)菌的方法。本發(fā)明還提供了包含遺傳工程化的細(xì)菌的藥物組合物，以及調(diào)節(jié)和治療與高氨血癥相關(guān)的紊亂(例如尿素循環(huán)障礙和肝性腦病)的方法。

附圖簡述

圖1a和1b描繪了在非誘導(dǎo)(圖1a)和誘導(dǎo)(圖1b)條件下本發(fā)明的argr缺失細(xì)菌的一個(gè)實(shí)施方案中精氨酸調(diào)節(jié)子的狀態(tài)。圖1a描繪了在需氧條件下由于以下的相對低的精氨酸產(chǎn)生：精氨酸(橢圓形中的“arg”)與arga(波紋)相互作用抑制(由“x”表示)arga活性，同時(shí)氧氣(o2)阻止(由“x”表示)fnr(虛線加框的fnr)二聚化和活化fnr啟動(dòng)子(灰色fnr盒)和在其控制下的arga^fbr基因。圖1b描繪了在厭氧條件下由于以下的上調(diào)的精氨酸產(chǎn)生：fnr二聚化(兩個(gè)虛線加框的fnr)和誘導(dǎo)fnr啟動(dòng)子(灰色fnr盒)介導(dǎo)的arga^fbr(arga^fbr上方的波紋)(其對精氨酸的抑制具有抗性)的表達(dá)。這克服了(彎曲的箭頭)由于精氨酸(橢圓形中的“arg”)與arga(描繪arga的框上方的波紋)相互作用引起的野生型arga的抑制。精氨酸調(diào)節(jié)子中的每種基因都由包含基因名稱的矩形描繪。與一個(gè)或一組矩形相鄰的每個(gè)箭頭描繪了負(fù)責(zé)驅(qū)動(dòng)此類基因以箭頭方向的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。鄰近一個(gè)或一系列矩形的較粗線描繪argr結(jié)合位點(diǎn)，由于該細(xì)菌中的argr缺失，這些位點(diǎn)未被利用。每個(gè)矩形上方的箭頭描繪了每種基因的表達(dá)產(chǎn)物。

圖2a和2b描繪了本發(fā)明的替代示例性實(shí)施方案。圖2a描繪了在需氧條件下的實(shí)施方案，其中在氧氣的存在下，fnr蛋白(fnr盒)作為單體保留并且不能結(jié)合并活化fnr啟動(dòng)子(“fnr”)，這驅(qū)動(dòng)精氨酸反饋抗性arga^fbr基因的表達(dá)。野生型arga蛋白是功能性的，但通過與精氨酸結(jié)合而易受負(fù)反饋抑制，從而保持精氨酸水平處于或低于正常水平。每種精氨酸生物合成基因(arga、arge、argc、argb、argh、argd、argi、argg、cara和carb)的啟動(dòng)子區(qū)域中的所有精氨酸阻遏物(argr)結(jié)合位點(diǎn)已被突變(黑條；黑色“x“)以降低或消除與argr的結(jié)合。圖2b描繪了在厭氧條件下的相同實(shí)施方案，其中在氧氣的不存在下，fnr蛋白(fnr盒)二聚化并結(jié)合和活化fnr啟動(dòng)子(“fnr”)。這驅(qū)動(dòng)精氨酸反饋抗性arga^fbr基因的表達(dá)(基因表達(dá)產(chǎn)物)，其對精氨酸(橢圓形中的“arg”)的反饋抑制具有抗性。每種精氨酸生物合成基因(arga、arge、argc、argb、argh、argd、argi、argg、cara和carb)的啟動(dòng)子區(qū)域中的所有精氨酸阻遏物(argr)結(jié)合位點(diǎn)已被突變(黑條)以降低或消除與argr的結(jié)合(黑色“x”)，從而防止被精氨酸-argr復(fù)合物抑制。這允許高水平精氨酸產(chǎn)生。圖1a和1b中精氨酸生物合成基因的組織(organization)代表在大腸桿菌菌株nissle中發(fā)現(xiàn)的那些。

圖3描繪了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案。在該實(shí)施方案中，在驅(qū)動(dòng)tet阻遏物(tetr)由tetr基因的表達(dá)的啟動(dòng)子中包含argr結(jié)合位點(diǎn)(黑條)的構(gòu)建體被連接至包含tetr結(jié)合位點(diǎn)(tetr和x之間的黑條)、驅(qū)動(dòng)基因x的表達(dá)的第二啟動(dòng)子。在低精氨酸濃度下，tetr被表達(dá)并抑制基因x的表達(dá)。在高精氨酸濃度下，argr與精氨酸締合并結(jié)合argr結(jié)合位點(diǎn)，由此抑制tetr由tetr基因的表達(dá)。這繼而去除了tetr抑制，從而允許基因x表達(dá)(黑色波紋)。

圖4描繪了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案。在該實(shí)施方案中，在驅(qū)動(dòng)tet阻遏物(tetr)由tetr基因的表達(dá)的啟動(dòng)子中包含argr結(jié)合位點(diǎn)(黑條)的構(gòu)建體被連接至包含tetr結(jié)合位點(diǎn)(與tetr橢圓形結(jié)合的黑條)、驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白(“gfp”)表達(dá)的第二啟動(dòng)子。在低精氨酸濃度下，tetr被表達(dá)并抑制gfp的表達(dá)。在高精氨酸濃度下，argr與精氨酸締合并結(jié)合argr結(jié)合位點(diǎn)，由此抑制tetr由tetr基因的表達(dá)。這繼而去除了tetr抑制，允許gfp表達(dá)。通過突變包含該構(gòu)建體的宿主，可以使用熒光活化細(xì)胞分選(“facs”)基于gfp表達(dá)選擇高精氨酸生產(chǎn)者。

圖5描繪了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案。在該實(shí)施方案中，在驅(qū)動(dòng)tet阻遏物(未顯示)由tetr基因的表達(dá)的啟動(dòng)子中包含argr結(jié)合位點(diǎn)(被argr-arg復(fù)合物結(jié)合的黑條)的構(gòu)建體被連接至包含tetr結(jié)合位點(diǎn)(黑條)、驅(qū)動(dòng)宿主存活所必需的營養(yǎng)缺陷型蛋白的表達(dá)(“aux”)的第二啟動(dòng)子。在高精氨酸濃度下，argr-精氨酸復(fù)合物與argr結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，由此抑制tetr由tetr基因的表達(dá)。這繼而允許表達(dá)aux，允許宿主存活。在低精氨酸濃度下，tetr由tetr基因表達(dá)并抑制aux的表達(dá)，從而殺死宿主。圖5中的構(gòu)建體通過其對aux表達(dá)的控制，通過使其對于宿主細(xì)胞存活是必需的，迫使高精氨酸(“arg”)產(chǎn)生。

圖6描繪了大腸桿菌nissle中每種精氨酸生物合成操縱子(operon)的包含argr結(jié)合位點(diǎn)的野生型基因組序列及其突變體。對于每種野生型序列，arg盒以斜體表示，并且每種基因的起始密碼子被rna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)被加下劃線(cunin，1983；maas，1994)。在argr結(jié)合期間被保護(hù)免受dna甲基化的堿基被突出顯示，并且在argr結(jié)合期間被保護(hù)免受羥基自由基攻擊的堿基被加粗(charlier等，1992)。突出顯示和加粗的堿基是用于破壞argr結(jié)合的突變的主要靶。

圖7描繪了包含fnr響應(yīng)性啟動(dòng)子序列的示例性調(diào)節(jié)區(qū)域序列的核酸序列。加下劃線的序列是預(yù)測的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，且加粗的序列是用于克隆的限制性位點(diǎn)。包含fnr啟動(dòng)子的示例性序列包括，但不限于，seqidno:16、seqidno:17、nirb1啟動(dòng)子(seqidno:18)、nirb2啟動(dòng)子(seqidno:19)、nirb3啟動(dòng)子(seqidno:20)、ydfz啟動(dòng)子(seqidno:21)、融合至強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的nirb啟動(dòng)子(seqidno:22)、融合至強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的ydfz啟動(dòng)子(seqidno:23)、選自fnrs1(seqidno:24)和fnrs2(seqidno:25)的厭氧誘導(dǎo)的小rna基因fnrs啟動(dòng)子、融合至crp結(jié)合位點(diǎn)的nirb啟動(dòng)子(seqidno:26)和融合至crp結(jié)合位點(diǎn)的fnrs啟動(dòng)子(seqidno:27)。

圖8a描繪了示例性的arga^fbr序列的核酸序列。圖8b描繪了示例性的fnr啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的arga^fbr質(zhì)粒的核酸序列。fnr啟動(dòng)子序列被加粗，且arga^fbr序列被

圖9描繪了示例性fnr啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的arga^fbr序列的核酸序列。fnr啟動(dòng)子序列被加粗，且核糖體結(jié)合位點(diǎn)被突出顯示，并且arga^fbr序列被

圖10描繪了在融合至強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的示例性fnr啟動(dòng)子(fnrs)的控制下的arga^fbr基因的示意圖。

圖11描繪了在融合至強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的示例性fnr啟動(dòng)子(nirb)的控制下的arga^fbr基因的另一個(gè)示意圖。也可存在其他調(diào)節(jié)元件。

圖12描繪了在融合至弱核糖體結(jié)合位點(diǎn)的示例性fnr啟動(dòng)子(nirb)的控制下的arga^fbr基因的示意圖。

圖13a和13b描繪了融合至crp結(jié)合位點(diǎn)的fnr響應(yīng)性啟動(dòng)子的示例性實(shí)施方案。圖13a描繪了fnr-crp啟動(dòng)子區(qū)域的圖譜，其中限制性位點(diǎn)以粗體顯示。圖13b描繪了在融合至crp結(jié)合位點(diǎn)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)兩者的示例性fnr啟動(dòng)子(nirb啟動(dòng)子)的控制下的arga^fbr基因的示意圖。也可存在其他調(diào)節(jié)元件。

圖14a和14b描繪了融合至crp結(jié)合位點(diǎn)的fnr響應(yīng)性啟動(dòng)子的替代示例性實(shí)施方案。圖14a描繪了fnr-crp啟動(dòng)子區(qū)域的圖譜，其中限制位點(diǎn)以粗體顯示。圖14b描繪了在融合至crp結(jié)合位點(diǎn)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)兩者的示例性fnr啟動(dòng)子(fnrs啟動(dòng)子)的控制下的arga^fbr基因的示意圖。

圖15描繪了大腸桿菌nissle中argg基因的調(diào)節(jié)區(qū)域和5'部分的野生型基因組序列及其組成型突變體。每種序列的啟動(dòng)子區(qū)域加被加下劃線，并且argg基因的5'部分被在野生型序列中，argr結(jié)合位點(diǎn)被大寫和加下劃線。在突變序列中，5'非翻譯區(qū)域被大寫和加下劃線。在組成型啟動(dòng)子控制下表達(dá)argg的細(xì)菌能夠產(chǎn)生精氨酸。在野生型、argr阻遏型啟動(dòng)子控制下表達(dá)argg的細(xì)菌能夠產(chǎn)生瓜氨酸。

圖16描繪了大腸桿菌nissle中組成型表達(dá)的argg構(gòu)建體的示例性實(shí)施方案。組成型啟動(dòng)子是bba_j23100，以灰色加框。用于克隆的限制性位點(diǎn)被加粗。

圖17描繪了大腸桿菌nissle中的野生型argg操縱子及其組成型表達(dá)突變體的圖譜。arg盒存在于野生型操縱子中，但不存在于突變體中。argg在bba_j23100啟動(dòng)子的控制下組成型表達(dá)。

圖18描繪了示例性bad啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的arga^fbr構(gòu)建體的核酸序列。所有加粗的序列為nissle基因組dna。arac基因的一部分被加粗和加下劃線，且arga^fbr基因被且其間的加粗的序列是由阿拉伯糖的存在活化的啟動(dòng)子。核糖體結(jié)合位點(diǎn)呈斜體，終止子序列被突出顯示，并且frt位點(diǎn)被加框。arad基因的一部分以虛線加框。

圖19描繪了示例性bad啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的arga^fbr構(gòu)建體的示意圖。在該實(shí)施方案中，將arga^fbr基因被插入在arac和arad基因之間。arga^fbr側(cè)翼是核糖體結(jié)合位點(diǎn)、frt位點(diǎn)和一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子序列。

圖20描繪了psc101質(zhì)粒的圖譜。限制性位點(diǎn)以粗體顯示。

圖21a描繪了psc101質(zhì)粒的核酸序列。圖21b描繪了fnrs啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的arga^fbrpsc101質(zhì)粒的核苷酸序列。arga^fbr序列被加框，核糖體結(jié)合位點(diǎn)被突出顯示，并且fnrs啟動(dòng)子被大寫并加粗。

圖22描繪了大腸桿菌1917nissle染色體內(nèi)的示例性整合位點(diǎn)的圖譜。這些位點(diǎn)表示可以將回路成分(circuitcomponents)插入到染色體而不干擾必需基因表達(dá)的區(qū)域。反斜杠(/)用于表明，插入將發(fā)生在趨異或趨同(divergentlyorconvergently)表達(dá)的基因之間。生物合成基因(諸如thya)內(nèi)的插入可用于產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)缺陷型。在一些實(shí)施方案中，將單獨(dú)的回路成分插入到多于一個(gè)的指定位點(diǎn)中。

圖23描繪了組成型表達(dá)紅色熒光蛋白(rfp)的三種細(xì)菌菌株。在菌株1-3中，rfp基因已被插入細(xì)菌染色體內(nèi)的不同位點(diǎn)，并在熒光下產(chǎn)生不同程度的亮度。未修飾的大腸桿菌nissle(菌株4)是非熒光的。

圖24描繪了在誘導(dǎo)(+atc)和非誘導(dǎo)(-atc)條件下由鏈霉素抗性對照nissle(syn-ucd103)、syn-ucd201、syn-ucd202和syn-ucd203產(chǎn)生的體外精氨酸水平的條形圖。syn-ucd201包含δargr和無arga^fbr。syn-ucd202包含高拷貝質(zhì)粒上的δargr和四環(huán)素誘導(dǎo)型arga^fbr。syn-ucd203包含低拷貝質(zhì)粒上的δargr和四環(huán)素驅(qū)動(dòng)的arga^fbr。

圖25描繪了在誘導(dǎo)條件下由鏈霉素抗性對照nissle(syn-ucd103)、syn-ucd104、syn-ucd204和syn-ucd105產(chǎn)生的精氨酸和瓜氨酸的體外水平的條形圖。syn-ucd104包含野生型argr、低拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素誘導(dǎo)型arga^fbr、四環(huán)素誘導(dǎo)型argg以及每種精氨酸生物合成操縱子(除了argg)的每種arg盒中的突變。syn-ucd204包含δargr以及在低拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下表達(dá)的arga^fbr。syn-ucd105包含野生型argr、低拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素誘導(dǎo)型arga^fbr、組成型表達(dá)的argg(bba_j23100組成型啟動(dòng)子)、以及每種精氨酸生物合成操縱子(除了argg)的每種arg盒中的突變。

圖26描繪了在氧氣的存在(+o2)或不存在(-o2)下，在誘導(dǎo)(+atc)和非誘導(dǎo)(-atc)條件下由鏈霉素抗性nissle(syn-ucd103)、syn-ucd205和syn-ucd204產(chǎn)生的體外精氨酸水平的條形圖。syn-ucd103是對照nissle構(gòu)建體。syn-ucd205包含δargr以及在低拷貝質(zhì)粒上的fnr誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(fnrs2)的控制下表達(dá)的arga^fbr。syn204包含δargr以及在低拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下表達(dá)的arga^fbr。

圖27描繪了nissle體內(nèi)停留的圖。將鏈霉素抗性nissle經(jīng)由口服管飼施用至小鼠而無抗生素預(yù)處理。在施用后監(jiān)測來自總計(jì)六只小鼠的糞粒(fecalpellet)，以確定施用的nissle仍然停留于小鼠胃腸道內(nèi)的量。條代表施用至小鼠的細(xì)菌數(shù)目。線代表連續(xù)10天每天從糞便樣品回收的nissle的數(shù)目。

圖28a、28b和28c描繪了高氨血癥taa小鼠中氨水平的條形圖。圖28a描繪了用未修飾的對照nissle或syn-ucd202處理的高氨血癥小鼠中的氨水平的條形圖，syn-ucd202是遺傳工程化的菌株，其中arg阻遏物基因被缺失，并且arga^fbr基因在高拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。測試了總計(jì)96只小鼠，且誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。在第4天和第5天，用syn-ucd202處理的小鼠中的氨水平低于用未修飾的對照nissle處理的小鼠中的氨水平。圖28b描繪了顯示在肝性腦病的taa小鼠模型中syn-ucd204相對于鏈霉素抗性對照nissle(syn-ucd103)和僅媒介物對照的體內(nèi)功效(氨消耗)的條形圖。圖28c描繪了在taa處理后24-48小時(shí)之間血氨濃度變化百分比的條形圖。

圖29描繪了高氨血癥spf^ash小鼠中氨水平的條形圖。將56只spf^ash小鼠分為4組。初始抽血后，組1喂食正常食物，組2-4飼喂70％蛋白食物。各組每天兩次用水、鏈霉素抗性nissle對照(syn-ucd103)或syn-ucd204管飼，并在第一次管飼后4小時(shí)抽取血液。包含δargr和在低拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下表達(dá)的arga^fbr的syn-ucd204，將血氨顯著降低至低于高氨血癥閾值的水平。

圖30描繪尿素循環(huán)酶的示例性示意圖。

圖31描繪了氨消耗動(dòng)力學(xué)和給藥的圖表。該信息可用于確定ucd患者中為了吸收治療相關(guān)量(therapeuticallyrelevantamount)的氨需要產(chǎn)生的精氨酸的量。可以對瓜氨酸產(chǎn)生進(jìn)行類似的計(jì)算。

圖32描繪了經(jīng)由將氨轉(zhuǎn)化為所需產(chǎn)物諸如瓜氨酸或精氨酸來治療ucd和以高氨血癥為特征的紊亂的合成遺傳回路的示例性示意圖。

圖33a和33b描繪了可用于產(chǎn)生正反饋營養(yǎng)缺陷型(positivefeedbackauxotroph)并選擇高精氨酸產(chǎn)生的示例性構(gòu)建體的圖。圖33a描繪了驅(qū)動(dòng)thya表達(dá)的astc啟動(dòng)子的圖譜。圖33b描繪了在astc啟動(dòng)子控制下的thya基因的示意圖。調(diào)節(jié)區(qū)域包含用于crp、argr和rna聚合酶(rnap)的結(jié)合位點(diǎn)，并且還可以包含另外的調(diào)節(jié)元件。

圖34描繪了可被破壞或缺失以產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型菌株的示例細(xì)菌基因的表格。這些包括但不限于寡核苷酸合成、氨基酸合成和細(xì)胞壁合成所需的基因。

圖35描繪了說明如在管飼后24小時(shí)和48小時(shí)檢測到的小鼠消化道中多種氨基酸營養(yǎng)缺陷型存活的表格。這些營養(yǎng)缺陷型使用大腸桿菌的非nissle菌株bw25113產(chǎn)生。

圖36描繪了本公開內(nèi)容的一個(gè)非限制性實(shí)施方案，其中外源環(huán)境條件或一種或更多種環(huán)境信號活化異源基因和至少一種重組酶由一種或更多種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)。重組酶然后將毒素基因翻轉(zhuǎn)(flip)為活化的構(gòu)象，并且重組酶的天然動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生毒素表達(dá)的時(shí)間延遲，允許異源基因被完全表達(dá)。在毒素表達(dá)后，它殺死細(xì)胞。

圖37描繪了本公開內(nèi)容的另一個(gè)非限制性實(shí)施方案，其中外源環(huán)境條件或一種或更多種環(huán)境信號活化異源基因、抗毒素和至少一種重組酶由一種或更多種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)。重組酶然后將毒素基因翻轉(zhuǎn)為活化的構(gòu)象，但積累的抗毒素的存在抑制毒素的活性。在外源環(huán)境條件或信號不再存在后，就會(huì)關(guān)閉抗毒素的表達(dá)。毒素被組成型表達(dá)，繼續(xù)積累，并殺死細(xì)菌細(xì)胞。

圖38描繪了本公開內(nèi)容的另一個(gè)非限制性實(shí)施方案，其中外源環(huán)境條件或一種或更多種環(huán)境信號活化異源基因和至少一種重組酶由一種或更多種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)。然后重組酶將至少一種切除酶翻轉(zhuǎn)為活化的構(gòu)象。然后至少一種切除酶切除一種或更多種必需基因，導(dǎo)致衰老和最終的細(xì)胞死亡。重組酶和切除基因的天然動(dòng)力學(xué)引起時(shí)間延遲，其動(dòng)力學(xué)可以根據(jù)待切除的必需基因的數(shù)目和選擇進(jìn)行改變和優(yōu)化，允許在大約數(shù)小時(shí)或數(shù)天內(nèi)發(fā)生細(xì)胞死亡。多種嵌套重組酶(nestedrecombinase)(如圖60中示出)的存在可用于進(jìn)一步控制細(xì)胞死亡的時(shí)機(jī)。

圖39描繪了本公開內(nèi)容的非限制性實(shí)施方案，其中抗毒素由組成型啟動(dòng)子表達(dá)，且異源基因的表達(dá)由外源環(huán)境信號活化。在阿拉伯糖的不存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子采用阻遏轉(zhuǎn)錄的構(gòu)象。在阿拉伯糖的存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)歷構(gòu)象變化，這允許arac轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并活化arabad啟動(dòng)子，該arabad啟動(dòng)子誘導(dǎo)tetr的表達(dá)，從而阻止毒素的表達(dá)。然而，當(dāng)不存在阿拉伯糖時(shí)，tetr不表達(dá)，且毒素被表達(dá)，最終克服抗毒素并殺死細(xì)胞。調(diào)節(jié)抗毒素表達(dá)的組成型啟動(dòng)子應(yīng)該是比驅(qū)動(dòng)毒素表達(dá)的啟動(dòng)子更弱的啟動(dòng)子。arac在該回路中在組成型啟動(dòng)子控制下。

圖40描繪了本公開內(nèi)容的另一個(gè)非限制性實(shí)施方案，其中異源基因的表達(dá)由外源環(huán)境信號活化。在阿拉伯糖的不存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子采用阻遏轉(zhuǎn)錄的構(gòu)象。在阿拉伯糖的存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)歷構(gòu)象變化，這允許arac轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并活化arabad啟動(dòng)子，該arabad啟動(dòng)子誘導(dǎo)tetr(tet阻遏物)和抗毒素的表達(dá)?？苟舅卦谥亟M細(xì)菌細(xì)胞中形成，同時(shí)tetr阻止毒素的表達(dá)(其在具有tetr結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子控制下)。然而，當(dāng)不存在阿拉伯糖時(shí)，不表達(dá)抗毒素和tetr兩者。由于阻遏毒素表達(dá)的tetr不存在，所以毒素被表達(dá)并殺死細(xì)胞。arac在該回路中在組成型啟動(dòng)子控制下。

圖41描繪了對于argr基因缺失并表達(dá)反饋抗性arga^fbr基因的工程化細(xì)菌菌株的示例性實(shí)施方案。該菌株可用于消耗氨和產(chǎn)生精氨酸。

圖42描繪了對于argr基因缺失并表達(dá)反饋抗性arga^fbr基因的工程化細(xì)菌菌株的示例性實(shí)施方案。該菌株還包含染色體上的一種或更多種營養(yǎng)缺陷型修飾。該菌株可用于消耗氨和產(chǎn)生精氨酸。

圖43描繪了對于argr和argg基因缺失并表達(dá)反饋抗性arga^fbr基因的工程化細(xì)菌菌株的示例性實(shí)施方案。該菌株可用于消耗氨和產(chǎn)生瓜氨酸。

圖44描繪了對于argr和argg基因缺失并表達(dá)反饋抗性arga^fbr基因的工程化細(xì)菌菌株的示例性實(shí)施方案。該菌株還包含染色體上的一種或更多種營養(yǎng)缺陷型修飾。該菌株可用于消耗氨和產(chǎn)生瓜氨酸。

圖45描繪了缺乏argr結(jié)合位點(diǎn)并表達(dá)反饋抗性的arga^fbr基因的工程化細(xì)菌菌株的示例性實(shí)施方案。該菌株可用于消耗氨和產(chǎn)生精氨酸。

圖46描繪了缺乏argr結(jié)合位點(diǎn)并表達(dá)反饋抗性的arga^fbr基因的工程化細(xì)菌菌株的示例性實(shí)施方案。該菌株還包含染色體上的一種或更多種營養(yǎng)缺陷型修飾。該菌株可用于消耗氨和產(chǎn)生精氨酸。

圖47描繪了在除了argg以外的所有精氨酸生物合成操縱子中缺乏argr結(jié)合位點(diǎn)，并表達(dá)反饋抗性arga^fbr基因的工程化細(xì)菌菌株的示例性實(shí)施方案。該菌株可用于消耗氨和產(chǎn)生瓜氨酸。

圖48描繪了在除了argg以外的所有精氨酸生物合成操縱子中缺乏argr結(jié)合位點(diǎn)，并表達(dá)反饋抗性arga^fbr基因的工程化細(xì)菌菌株的示例性實(shí)施方案。該菌株還包含染色體上的一種或更多種營養(yǎng)缺陷型修飾。該菌株可用于消耗氨和產(chǎn)生瓜氨酸。

圖49a示出了野生型clba構(gòu)建體的示意圖。圖49b描繪了clba敲除構(gòu)建體的示意圖。

圖50描繪了野生型clba構(gòu)建體和clba敲除構(gòu)建體的示例性序列。

圖51描繪了在基線、2小時(shí)和4小時(shí)時(shí)來自syn-ucd101、syn-ucd102和空白對照的培養(yǎng)基中的體外氨水平的條形圖。syn-ucd101和syn-ucd102兩者都能體外消耗氨。

圖52描繪了在基線、2小時(shí)和4小時(shí)時(shí)來自syn-ucd201、syn-ucd203和空白對照的培養(yǎng)基中的體外氨水平的條形圖。syn-ucd201和syn-ucd203兩者都能體外消耗氨。

圖53描述了geneguard作為工程化安全性成分的使用。所有工程化dna存在于可以有條件地被破壞的質(zhì)粒上。參見，例如，wright等，“geneguard：amodularplasmidsystemdesignforbiosafety，“acssyntheticbiology(2015)4：307-316。

圖54描繪了示例性l-高絲氨酸和l-甲硫氨酸生物合成途徑。圓形表示被metj阻遏的基因，且metj的缺失導(dǎo)致這些基因的組成型表達(dá)和途徑的活化。

圖55描繪了示例性組氨酸生物合成途徑。

圖56描繪了示例性賴氨酸生物合成途徑。

圖57描繪了示例性天冬酰胺生物合成途徑。

圖58描繪了示例性谷氨酰胺生物合成途徑。

圖59描繪了示例性色氨酸生物合成途徑。

圖60描繪了本公開內(nèi)容的一個(gè)非限制性實(shí)施方案，其中外源環(huán)境條件或一種或更多種環(huán)境信號活化異源基因和第一重組酶由一種或更多種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)。然后，重組酶將第二重組酶從反向取向翻轉(zhuǎn)為活性構(gòu)象?；罨牡诙亟M酶將毒素基因翻轉(zhuǎn)為活化的構(gòu)象，并且重組酶的天然動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生毒素表達(dá)的時(shí)間延遲，允許異源基因被完全表達(dá)。在毒素表達(dá)后，它殺死細(xì)胞。

圖61描繪了具有圖60中描述的殺死開關(guān)(kill-switch)實(shí)施方案的被工程化為靶向尿素循環(huán)障礙(ucd)的合成生物(syntheticbiotic)。在該實(shí)例中，將int重組酶和kid-kis毒素-抗毒素系統(tǒng)用于重組細(xì)菌細(xì)胞中，用于治療ucd。將重組細(xì)菌細(xì)胞工程化為消耗過量的氨以產(chǎn)生有益的副產(chǎn)物以改善患者的結(jié)果。重組細(xì)菌細(xì)胞還包含高度可控的殺死開關(guān)以確保安全性。響應(yīng)于低氧環(huán)境(例如，諸如消化道中發(fā)現(xiàn)的那樣)，fnr啟動(dòng)子誘導(dǎo)int重組酶的表達(dá)，并還誘導(dǎo)kis抗毒素的表達(dá)。int重組酶引起kid毒素基因翻轉(zhuǎn)為活化的構(gòu)象，但積累的kis抗毒素的存在抑制了表達(dá)的kid毒素的活性。在氧氣的存在下(例如消化道外)，抗毒素的表達(dá)被關(guān)閉。由于毒素被組成型表達(dá)，它繼續(xù)積累和殺死細(xì)菌細(xì)胞。

圖62描繪了本公開內(nèi)容的另一個(gè)非限制性實(shí)施方案，其中異源基因的表達(dá)由外源環(huán)境信號活化。在阿拉伯糖的不存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子采用阻遏轉(zhuǎn)錄的構(gòu)象。在阿拉伯糖的存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)歷構(gòu)象變化，這允許arac轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并活化arabad啟動(dòng)子，該arabad啟動(dòng)子誘導(dǎo)tetr(tet阻遏物)和抗毒素的表達(dá)。抗毒素在重組細(xì)菌細(xì)胞中形成，同時(shí)tetr阻止毒素的表達(dá)(其在具有tetr結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子控制下)。然而，當(dāng)不存在阿拉伯糖時(shí)，不表達(dá)抗毒素和tetr兩者。由于阻遏毒素表達(dá)的tetr不存在，所以毒素被表達(dá)并殺死細(xì)胞。圖62還描繪了本公開內(nèi)容的另一個(gè)非限制性實(shí)施方案，其中在重組細(xì)菌中未發(fā)現(xiàn)的必需基因的表達(dá)由外源環(huán)境信號活化。在阿拉伯糖的不存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子采用阻遏在arabad啟動(dòng)子控制下的必需基因的轉(zhuǎn)錄的構(gòu)象，且細(xì)菌細(xì)胞不能存活。在阿拉伯糖的存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)歷構(gòu)象變化，這允許arac轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并活化arabad啟動(dòng)子，該arabad啟動(dòng)子誘導(dǎo)必需基因的表達(dá)并保持細(xì)菌細(xì)胞的存活力。

圖63描繪了本公開內(nèi)容的非限制性實(shí)施方案，其中抗毒素由組成型啟動(dòng)子表達(dá)，且異源基因的表達(dá)由外源環(huán)境信號活化。在阿拉伯糖的不存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子采用阻遏轉(zhuǎn)錄的構(gòu)象。在阿拉伯糖的存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)歷構(gòu)象變化，這允許arac轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并活化arabad啟動(dòng)子，該arabad啟動(dòng)子誘導(dǎo)tetr的表達(dá)，從而阻止毒素的表達(dá)。然而，當(dāng)不存在阿拉伯糖時(shí)，tetr不表達(dá)，且毒素被表達(dá)，最終克服抗毒素并殺死細(xì)胞。調(diào)節(jié)抗毒素表達(dá)的組成型啟動(dòng)子應(yīng)該是比驅(qū)動(dòng)毒素表達(dá)的啟動(dòng)子更弱的啟動(dòng)子。

圖64描繪了本公開內(nèi)容的重組細(xì)菌的安全性設(shè)計(jì)的概述，包括重組細(xì)菌的固有安全性以及工程化安全廢棄物管理(包括殺死開關(guān)和/或營養(yǎng)缺陷型)。

實(shí)施方案的描述

本發(fā)明包括遺傳工程化的細(xì)菌、其藥物組合物、以及調(diào)節(jié)或治療與高氨血癥相關(guān)的紊亂(例如尿素循環(huán)障礙和肝性腦病)的方法。遺傳工程化的細(xì)菌能夠特別是在低氧條件下，諸如哺乳動(dòng)物消化道中降低過量的氨。在某些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌通過將體內(nèi)過量的氮摻入到無毒分子(例如精氨酸、瓜氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或色氨酸)來降低過量的氨。

為使本公開內(nèi)容可更容易地理解，首先定義某些術(shù)語。這些定義應(yīng)根據(jù)本公開內(nèi)容的剩余部分并且如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的進(jìn)行閱讀。除非另有限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意思。在整個(gè)詳細(xì)描述中陳述另外的定義。

“高氨血癥(hyperammonemia)”、“高氨血癥(hyperammonemic)”或“過量的氨”用于指增加的體內(nèi)氨濃度。高氨血癥是由于解毒減少和/或氨的產(chǎn)生增加引起的。解毒減少可起因于尿素循環(huán)障礙(ucd)，諸如精氨基琥珀酸尿癥、精氨酸酶缺乏癥、氨甲酰磷酸合成酶缺乏癥、瓜氨酸血癥、n-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥；或起因于肝臟的旁路，例如開放性肝管(openductushepaticus)；和/或起因于谷氨酰胺合成酶缺乏癥(hoffman等，2013；等，2013)。氨的產(chǎn)生增加可起因于感染、藥物、神經(jīng)源性膀胱和腸細(xì)菌過度生長引起(等，2013)。與高氨血癥相關(guān)的其他紊亂和狀況包括但不限于肝臟疾病(liverdisorder)諸如肝性腦病、急性肝衰竭或慢性肝衰竭；有機(jī)酸疾??；異戊酸尿癥；3-甲基巴豆酰甘氨酸尿癥；甲基丙二酸血癥；丙酸尿癥；脂肪酸氧化缺陷；肉堿循環(huán)缺陷；肉堿缺乏癥；β-氧化缺乏癥；賴氨酸尿性蛋白耐受不良；吡咯啉-5-羧酸合成酶缺乏癥；丙酮酸羧化酶缺乏癥；鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶缺乏癥；碳酸酐酶缺乏癥；高胰島素血癥-高氨血癥綜合征；線粒體疾病(mitochondriaidisorders)；丙戊酸療法；天冬酰胺酶療法；全腸胃外營養(yǎng)；用含甘氨酸溶液進(jìn)行膀胱鏡檢查；肺/骨髓移植后；門體分流；尿路感染；輸尿管擴(kuò)張；多發(fā)性骨髓瘤；和化學(xué)療法(hoffman等，2013；等，2013；pham等，2013；lazier等，2014)。在健康受試者中，血漿氨濃度通常小于約50微摩/l(leonard，2006)。在一些實(shí)施方案中，高氨血癥的診斷信號是血漿氨濃度為至少約50微摩/l、至少約80微摩/l、至少約150微摩/l、至少約180微摩/l或至少約200微摩/l(leonard，2006；hoffman等，2013；等，2013)。

“氨”用于指氣態(tài)氨(nh3)、離子氨(nh4⁺)或其混合物。在體液中，氣態(tài)氨和離子銨平衡存在：

一些臨床實(shí)驗(yàn)室測試分析總氨(nh3+nh4⁺)(walker，2012)。在本發(fā)明的任何實(shí)施方案中，除非另有指示，否則“氨”可指氣態(tài)氨、離子氨和/或總氨。

氨的“解毒”用于指天然或合成的一種或更多種過程，藉此毒性氨被去除和/或轉(zhuǎn)化為一種或更多種無毒分子，包括但不限于：精氨酸、瓜氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸或尿素。例如，尿素循環(huán)酶促地將氨轉(zhuǎn)化為尿素以尿液排出體外。由于氨是許多氨基酸的氮源，氨基酸經(jīng)由許多生物化學(xué)途徑合成，一種或更多種這些氨基酸生物合成途徑的增強(qiáng)可用于將過量的氮摻入到無毒分子中。例如，精氨酸生物合成將包含一個(gè)氮原子的谷氨酸轉(zhuǎn)化為包含四個(gè)氮原子的精氨酸，由此將過量的氮摻入到無毒分子中。在人類中，精氨酸不被大腸再吸收，且因此大腸中過量的精氨酸不被認(rèn)為是有害的。同樣地，瓜氨酸不被大腸再吸收，且因此大腸中過量的瓜氨酸不被認(rèn)為是有害的。精氨酸生物合成也可以被修飾以產(chǎn)生瓜氨酸作為最終產(chǎn)物；瓜氨酸包含三個(gè)氮原子，且因此修飾的途徑也能夠?qū)⑦^量的氮摻入到無毒分子中。

“精氨酸調(diào)節(jié)子”、“精氨酸生物合成調(diào)節(jié)子”和“arg調(diào)節(jié)子”可互換使用，指給定細(xì)菌物種中的操縱子的集合，所述給定細(xì)菌物種包含編碼負(fù)責(zé)在精氨酸生物合成途徑中將谷氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸和/或中間代謝物例如瓜氨酸的酶的基因。精氨酸調(diào)節(jié)子還包括與這些操縱子相關(guān)的操縱基因(operator)、啟動(dòng)子、arg盒和/或調(diào)節(jié)區(qū)域。精氨酸調(diào)節(jié)子包括但不限于編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸合成酶、n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂合酶、氨甲酰磷酸合酶的操縱子、其操縱基因、其啟動(dòng)子、其arg盒、和/或其調(diào)節(jié)區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，除了n-乙酰谷氨酸合成酶和/或n-乙酰鳥氨酸酶以外或代替n-乙酰谷氨酸合成酶和/或n-乙酰鳥氨酸酶，精氨酸調(diào)節(jié)子包含編碼鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的操縱子和相關(guān)的操縱基因、啟動(dòng)子、arg盒和/或調(diào)節(jié)區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，精氨酸調(diào)節(jié)子的一種或更多種操縱子或基因可以存在于細(xì)菌中的質(zhì)粒上。在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌可以包含精氨酸調(diào)節(jié)子中任何基因或操縱子的多個(gè)拷貝，其中一個(gè)或更多個(gè)拷貝可以如本文描述被突變或以其他方式改變。

一種基因可以編碼一種酶，例如n-乙酰谷氨酸合成酶(arga)。兩種或更多種基因可以編碼一種酶的不同亞基，例如氨甲酰磷酸合酶的亞基a和亞基b(cara和carb)。在一些細(xì)菌中，兩種或更多種基因可以各自獨(dú)立地編碼相同的酶，例如鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(argf和argi)。在一些細(xì)菌中，精氨酸調(diào)節(jié)子包含但不限于編碼n-乙酰谷氨酸合成酶的arga；編碼n-乙酰谷氨酸激酶的argb；編碼n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶的argc；編碼乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的argd；編碼n-乙酰鳥氨酸酶的arge；編碼精氨基琥珀酸合酶的argg；編碼精氨基琥珀酸裂合酶的argh；argf和argi中的一種或兩種，其每一種獨(dú)立地編碼鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶；編碼氨甲酰磷酸合酶的小亞基的cara；編碼氨甲酰磷酸合酶的大亞基的carb；其操縱子；其操縱基因；其啟動(dòng)子；其arg盒；和/或調(diào)節(jié)區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，精氨酸調(diào)節(jié)子包含編碼鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(除了n-乙酰谷氨酸合成酶和/或n-乙酰鳥氨酸酶或代替n-乙酰谷氨酸合成酶和/或n-乙酰鳥氨酸酶)的argj、其操縱子、其操縱基因、其啟動(dòng)子、其arg盒和/或其調(diào)節(jié)區(qū)域。

“精氨酸操縱子”、“精氨酸生物合成操縱子”和“arg操縱子”可互換使用，指在包含至少一種啟動(dòng)子和至少一種arg盒的共有的調(diào)節(jié)區(qū)域的控制下編碼精氨酸生物合成酶的一種或更多種基因的簇。在一些實(shí)施方案中，一種或更多種基因被共轉(zhuǎn)錄和/或共翻譯。編碼負(fù)責(zé)精氨酸生物合成的酶的基因的任何組合可以天然地或合成地被組織成操縱子。例如，在枯草芽孢桿菌(b.subtilis)中，在包含啟動(dòng)子和arg盒的共有的調(diào)節(jié)區(qū)域的控制下，編碼n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰鳥氨酸酶、n-乙酰谷氨酸激酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、氨甲酰磷酸合酶和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的基因被組織成單種操縱子argcaebd-carab-argf(參見，例如，表2)。在大腸桿菌k12和nissle中，編碼n-乙酰鳥氨酸酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、n-乙酰谷氨酸激酶和精氨基琥珀酸裂合酶的基因被組織成兩種雙極操縱子argecbh。編碼負(fù)責(zé)精氨酸生物合成的酶的操縱子可以被分布在跨越染色體的不同基因座處。在未修飾的細(xì)菌中，每種操縱子可被精氨酸經(jīng)由argr阻遏。在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌中，精氨酸和/或中間副產(chǎn)物產(chǎn)生可以通過修飾由如本文提供的精氨酸生物合成操縱子編碼的酶的表達(dá)來改變。每種精氨酸操縱子可以存在于質(zhì)?；蚣?xì)菌染色體上。另外，任何精氨酸操縱子或在精氨酸操縱子內(nèi)的基因或調(diào)節(jié)區(qū)域的多個(gè)拷貝可以存在于細(xì)菌中，其中操縱子或基因或調(diào)節(jié)區(qū)域的一個(gè)或更多個(gè)拷貝可以如本文描述被突變或以其他方式改變。在一些實(shí)施方案中，將遺傳工程化的細(xì)菌工程化為包含相同產(chǎn)物(例如，操縱子或基因或調(diào)節(jié)區(qū)域)的多個(gè)拷貝以增強(qiáng)拷貝數(shù)或以包含進(jìn)行多種不同功能的操縱子的多種不同成分。

“arg盒共有序列”指arg盒核酸序列，已知其核酸以高頻率存在于argr、arga、argb、argc、argd、arge、argf、argg、argh、argi、argj、cara和/或carb的一種或更多種調(diào)節(jié)區(qū)域中。如以上描述的，每種arg操縱子包含調(diào)節(jié)區(qū)域，所述調(diào)節(jié)區(qū)域包含與啟動(dòng)子重疊并且阻遏物蛋白與其結(jié)合的至少一個(gè)18個(gè)核苷酸不完全回文序列(稱為arg盒)(tian等，1992)。arg盒的核苷酸序列可以隨每種操縱子而變化，并且共有arg盒序列是a/tntgaata/ta/tt/at/aattcant/a(maas，1994)。精氨酸阻遏物結(jié)合一種或更多種arg盒以積極抑制與該一種或更多種arg盒可操作地連接的精氨酸生物合成酶的轉(zhuǎn)錄。

“突變體精氨酸調(diào)節(jié)子”或“突變的精氨酸調(diào)節(jié)子”用于指包含一種或更多種核酸突變的精氨酸調(diào)節(jié)子，所述一種或更多種核酸突變降低或消除精氨酸介導(dǎo)的對編碼負(fù)責(zé)在精氨酸生物合成途徑中將谷氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸和/或中間副產(chǎn)物例如瓜氨酸的酶的操縱子的每一種的阻遏，使得突變體精氨酸調(diào)節(jié)子比來自在相同條件下的相同細(xì)菌亞型的未修飾的調(diào)節(jié)子產(chǎn)生更多的精氨酸和/或中間副產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體例如arga^fbr，和在用于編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂合酶和氨基甲酰磷酸合酶的一種或更多種操縱子的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，由此使調(diào)節(jié)子去阻遏并增強(qiáng)精氨酸和/或中間副產(chǎn)物生物合成。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含突變體精氨酸阻遏物，所述突變體精氨酸阻遏物包含一種或更多種核酸突變，使得精氨酸阻遏物功能減少或失活，或遺傳工程化的細(xì)菌不具有精氨酸阻遏物(例如，精氨酸阻遏物基因已被缺失)，導(dǎo)致調(diào)節(jié)子的去阻遏和精氨酸和/或中間副產(chǎn)物生物合成的增強(qiáng)。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體例如arga^fbr，在用于編碼精氨酸生物合成酶和/或突變或缺失的精氨酸阻遏物的操縱子的每一種的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體例如arga^fbr和在用于編碼精氨酸生物合成酶的操縱子的每一種的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體例如arga^fbr和突變或缺失的精氨酸阻遏物。在一些實(shí)施方案中，突變體精氨酸調(diào)節(jié)子包含編碼野生型n-乙酰谷氨酸合成酶的操縱子和用于所述操縱子的至少一種arg盒中的一種或更多種核酸突變。在一些實(shí)施方案中，突變體精氨酸調(diào)節(jié)子包含編碼野生型n-乙酰谷氨酸合成酶和突變或缺失的精氨酸阻遏物的操縱子。在一些實(shí)施方案中，突變體精氨酸調(diào)節(jié)子包含編碼鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(除了n-乙酰谷氨酸合成酶和/或n-乙酰鳥氨酸酶以外或代替n-乙酰谷氨酸合成酶和/或n-乙酰鳥氨酸酶)的操縱子和用于所述操縱子的至少一種arg盒中的一種或更多種核酸突變。

arg盒與每種精氨酸生物合成操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域中的啟動(dòng)子重疊。在突變體精氨酸調(diào)節(jié)子中，一種或更多種精氨酸生物合成操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域被充分突變?yōu)槠茐幕匚腶rg盒序列并降低argr結(jié)合，但仍包含與非突變體調(diào)節(jié)區(qū)域的啟動(dòng)子足夠高的同源性以作為天然操縱子特異性啟動(dòng)子被識別。操縱子在至少一種arg盒中包含至少一種核酸突變，使得argr與arg盒和操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域的結(jié)合被降低或消除。在一些實(shí)施方案中，在argr結(jié)合期間被保護(hù)免受dna甲基化的堿基和被保護(hù)免受羥基自由基攻擊的堿基是用于破壞argr結(jié)合的突變的主要靶(參見，例如，圖6)。突變的調(diào)節(jié)區(qū)域的啟動(dòng)子保留與非突變調(diào)節(jié)區(qū)域的啟動(dòng)子足夠高的同源性，使得rna聚合酶以足夠的親和力與其結(jié)合以促進(jìn)可操作地連接的精氨酸生物合成酶的轉(zhuǎn)錄。在一些實(shí)施方案中，突變體的啟動(dòng)子的g/c:a/t比值與野生型啟動(dòng)子的g/c:a/t比值相差不多于10％。

在一些實(shí)施方案中，多于一種arg盒可以存在于單種操縱子中。在這些實(shí)施方案的一個(gè)方面，操縱子中的至少一種arg盒被改變?yōu)楫a(chǎn)生所需的對操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域的降低的argr結(jié)合。在這些實(shí)施方案的另一方面，操縱子中的arg盒的每一種被改變?yōu)楫a(chǎn)生所需的對操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域的降低的argr結(jié)合。

“降低的”argr結(jié)合用于指與對在相同條件下的相同亞型的細(xì)菌中的未修飾的arg盒和調(diào)節(jié)區(qū)域的阻遏物結(jié)合相比，對操縱子中arg盒的阻遏物結(jié)合的降低或?qū)λ霾倏v子的調(diào)節(jié)區(qū)域的總阻遏物結(jié)合的降低。在一些實(shí)施方案中，比對在相同條件下的相同亞型的細(xì)菌中的未修飾的arg盒和調(diào)節(jié)區(qū)域的argr結(jié)合，對操縱子的突變體arg盒和調(diào)節(jié)區(qū)域的argr結(jié)合至少低約50％、至少低約60％、至少低約70％、至少低約80％、至少低約90％或至少低約95％。在一些實(shí)施方案中，對突變體arg盒和調(diào)節(jié)區(qū)域的降低的argr結(jié)合導(dǎo)致操縱子中一種或更多種基因的mrna表達(dá)增加了至少約1.5倍、至少約2倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約600倍、至少約700倍、至少約800倍、至少約900倍、至少約1,000倍或至少約1,500倍。

“argr”或“精氨酸阻遏物”用于指能夠通過調(diào)節(jié)精氨酸調(diào)節(jié)子中精氨酸生物合成基因的轉(zhuǎn)錄而抑制精氨酸生物合成的蛋白。當(dāng)野生型細(xì)菌中編碼精氨酸阻遏物蛋白(“argr”)的基因的表達(dá)增加時(shí)，精氨酸生物合成減少。當(dāng)野生型細(xì)菌中argr的表達(dá)減少時(shí)，或者如果argr被缺失或突變?yōu)槭Щ罹彼嶙瓒粑锕δ?，則精氨酸生物合成增加。

“缺乏任何功能性argr”的細(xì)菌和“argr缺失細(xì)菌”用于指與來自在相同條件下的相同亞型的細(xì)菌的未修飾的精氨酸阻遏物相比，其中每種精氨酸阻遏物活性被顯著降低或消除的細(xì)菌。降低或消除的精氨酸阻遏物活性可導(dǎo)致例如增加的精氨酸生物合成基因的轉(zhuǎn)錄和/或增加的精氨酸和/或中間副產(chǎn)物例如瓜氨酸的濃度。其中精氨酸阻遏物活性被降低或消除的細(xì)菌可以通過修飾細(xì)菌argr基因或通過修飾argr基因的轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生。例如，染色體argr基因可以被缺失，可以被突變，或者argr基因可以被不表現(xiàn)野生型阻遏物活性的argr基因替代。

“可操作地連接”指核酸序列，例如編碼反饋抗性arga的基因，其以允許表達(dá)核酸序列的方式(例如以順式作用)連接至調(diào)節(jié)區(qū)域序列。

“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”指被可操作地連接至一種或更多種基因的調(diào)節(jié)區(qū)域，其中基因的表達(dá)在所述調(diào)節(jié)區(qū)域的誘導(dǎo)物存在下被增加。

“外源環(huán)境條件”指在其下以上描述的啟動(dòng)子被誘導(dǎo)的設(shè)置或情形。在一些實(shí)施方案中，外源環(huán)境條件對哺乳動(dòng)物的消化道是特異性的。在一些實(shí)施方案中，外源環(huán)境條件對哺乳動(dòng)物的上胃腸道是特異性的。在一些實(shí)施方案中，外源環(huán)境條件對哺乳動(dòng)物的下胃腸道是特異性的。在一些實(shí)施方案中，外源環(huán)境條件對哺乳動(dòng)物的小腸是特異性的。在一些實(shí)施方案中，外源環(huán)境條件是低氧、微需氧或厭氧條件，諸如哺乳動(dòng)物消化道道的環(huán)境。在一些實(shí)施方案中，外源環(huán)境條件是對哺乳動(dòng)物消化道特異的分子或代謝物，例如丙酸酯。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包含氧水平依賴性啟動(dòng)子。細(xì)菌已經(jīng)演化出能夠感測氧水平的轉(zhuǎn)錄因子。不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以由不同的氧水平觸發(fā)并且以不同的動(dòng)力學(xué)發(fā)生。“氧水平依賴性啟動(dòng)子”或“氧水平依賴性調(diào)節(jié)區(qū)域”指一種或更多種氧水平感測轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合的核酸序列，其中相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和/或活化活化下游基因表達(dá)。

氧水平依賴性轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)例包括但不限于fnr、anr和dnr。相應(yīng)的fnr響應(yīng)性啟動(dòng)子、anr響應(yīng)性啟動(dòng)子和dnr響應(yīng)性啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，castiglione等，2009；eiglmeier等，1989；galimand等，1991；hasegawa等，1998；hoeren等，1993；salmon等，2003)，且非限制性實(shí)例示于表1中。

表1.轉(zhuǎn)錄因子和響應(yīng)性基因和調(diào)節(jié)區(qū)域的實(shí)例

如本文使用的，“非天然”核酸序列指細(xì)菌中通常不存在的核酸序列，例如內(nèi)源序列的額外拷貝，或異源序列，諸如來自不同物種、菌株或細(xì)菌的亞株的序列，或與來自相同亞型的細(xì)菌的未修飾序列相比被修飾和/或突變的序列。在一些實(shí)施方案中，非天然核酸序列是合成的、非天然存在的序列(參見，例如，purcell等，2013)。非天然核酸序列可以是調(diào)節(jié)區(qū)域、啟動(dòng)子、基因和/或基因盒中的一種或更多種基因。在一些實(shí)施方案中，“非天然”指在自然界中彼此未以相同關(guān)系被發(fā)現(xiàn)的兩種或更多種核酸序列。非天然核酸序列可以存在于質(zhì)粒或染色體上。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包含這樣的基因盒，所述基因盒被可操作地連接至在自然界中與所述基因盒不相關(guān)的直接或間接誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如可操作地連接至丁酸源(butyrogenic)基因盒的fnr響應(yīng)性啟動(dòng)子。

“組成型啟動(dòng)子”指能夠促進(jìn)在其控制下和/或與其可操作地連接的編碼序列或基因的連續(xù)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子和變體是本領(lǐng)域熟知的，且包括但不限于組成型大腸桿菌σ^s啟動(dòng)子bba_j23100(例如，osmy啟動(dòng)子(國際遺傳工程機(jī)器(igem)標(biāo)準(zhǔn)生物部件注冊表名稱bba_j45992；bba_j45993))、組成型大腸桿菌σ³²啟動(dòng)子(例如，htpg熱休克啟動(dòng)子(bba_j45504))、組成型大腸桿菌σ⁷⁰啟動(dòng)子(例如，lacq啟動(dòng)子(bba_j54200；bba_j56015)、大腸桿菌creabcd磷酸感測操縱子啟動(dòng)子(bba_j64951)、glnrs啟動(dòng)子(bba_k088007)、lacz啟動(dòng)子(bba_k119000；bba_k119001)；m13k07基因i型啟動(dòng)子(bba_m13101)；m13k07基因ii型啟動(dòng)子(bba_m13102)、m13k07基因iii型啟動(dòng)子(bba_m13103)、m13k07基因iv型啟動(dòng)子(bba_m13104)、m13k07基因v型啟動(dòng)子(bba_m13105)、m13k07基因vi型啟動(dòng)子(bba_m13106)、m13k07基因viii型啟動(dòng)子(bba_m13108)、m13110(bba_m13110))、組成型枯草芽孢桿菌σ^a啟動(dòng)子(例如，啟動(dòng)子veg(bba_k143013)、啟動(dòng)子43(bba_k143013)、pliag(bba_k823000)、plepa(bba_k823002)、pveg(bba_k823003))、組成型枯草芽孢桿菌σ^b啟動(dòng)子(例如，啟動(dòng)子ctc(bba_k143010)、啟動(dòng)子gsib(bba_k143011))、沙門氏菌(salmonella)啟動(dòng)子(例如，來自沙門氏菌的pspv2(bba_k112706)、來自沙門氏菌的pspv(bba_k112707))、噬菌體t7啟動(dòng)子(例如，t7啟動(dòng)子(bba_i712074；bba_i719005；bba_j34814；bba_j64997；bba_k113010；bba_k113011；bba_k113012；bba_r0085；bba_r0180；bba_r0181；bba_r0182；bba_r0183；bba_z0251；bba_z0252；bba_z0253))和噬菌體sp6啟動(dòng)子(例如，sp6啟動(dòng)子(bba_j64998))。

如本文使用的，“過度產(chǎn)生”精氨酸或中間副產(chǎn)物(例如瓜氨酸)的遺傳工程化的細(xì)菌指包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子的細(xì)菌。例如，工程化的細(xì)菌可以包含arga的反饋抗性形式，并且當(dāng)精氨酸反饋抗性arga被表達(dá)時(shí)，能夠比在相同條件下的相同亞型的未修飾細(xì)菌產(chǎn)生更多精氨酸和/或中間副產(chǎn)物。遺傳工程化的細(xì)菌可以可選地或另外包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，所述突變體精氨酸調(diào)節(jié)子在用于編碼精氨酸生物合成酶的操縱子的每一種的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變。遺傳工程化的細(xì)菌可以可選地或另外包含突變或缺失的精氨酸阻遏物。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌比在相同條件下的相同亞型的未修飾細(xì)菌多產(chǎn)生至少約1.5倍、至少約2倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約600倍、至少約700倍、至少約800倍、至少約900倍、至少約1,000倍、或至少約1,500倍的精氨酸。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌比在相同條件下的相同亞型的未修飾細(xì)菌多產(chǎn)生至少約1.5倍、至少約2倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約600倍、至少約700倍、至少約800倍、至少約900倍、至少約1,000倍、或至少約1,500倍的瓜氨酸或其他中間副產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌中的一種或更多種精氨酸生物合成基因的mrna轉(zhuǎn)錄物水平比在相同條件下的相同亞型的未修飾細(xì)菌中的mrna轉(zhuǎn)錄物水平高至少約1.5倍、至少約2倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約600倍、至少約700倍、至少約800倍、至少約900倍、至少約1,000倍、或至少約1,500倍。在某些實(shí)施方案中，未修飾的細(xì)菌將不具有可檢測水平的精氨酸、中間副產(chǎn)物和/或此類操縱子中的基因轉(zhuǎn)錄。然而，在具有突變體精氨酸調(diào)節(jié)子的相應(yīng)遺傳工程化的細(xì)菌中，將可檢測到精氨酸的蛋白和/或精氨酸的轉(zhuǎn)錄水平和/或中間副產(chǎn)物?？赏ㄟ^直接測量基因的mrna水平來檢測轉(zhuǎn)錄水平。測量精氨酸和/或中間副產(chǎn)物水平以及由精氨酸生物合成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物水平的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，精氨酸和瓜氨酸可以通過質(zhì)譜法測量。

“消化道(gut)”指負(fù)責(zé)食物轉(zhuǎn)移和消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)和排泄廢棄物的器官、腺體、道和系統(tǒng)。在人類中，消化道包括起于口并終于肛門的胃腸道，并且還包括食道、胃、小腸和大腸。消化道還包括輔助器官(accessoryorgan)和腺體，諸如脾臟、肝臟、膽囊和胰腺。上胃腸道包括食道、胃和小腸的十二指腸。下胃腸道包括小腸的剩余部分，即空腸和回腸，以及所有大腸，即盲腸、結(jié)腸、直腸和肛管。細(xì)菌可以在整個(gè)腸種，例如在胃腸道，特別是在腸中被發(fā)現(xiàn)。

“非病原性細(xì)菌”指不能在宿主中引起疾病或有害響應(yīng)的細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，非病原性細(xì)菌是共生細(xì)菌。非病原性細(xì)菌的實(shí)例包括但不限于芽孢桿菌屬(bacillus)、擬桿菌屬(bacteroides)、雙歧桿菌屬(bifidobacterium)、短桿菌屬(brevibacteria)、梭菌屬(clostridium)、腸球菌屬(enterococcus)、大腸桿菌(escherichiacoli)、乳桿菌屬(lactobacillus)、乳球菌屬(lactococcus)、酵母屬(saccharomyces)和葡萄球菌屬(staphylococcus)，例如凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、脆弱擬桿菌(bacteroidesfragilis)、枯草擬桿菌(bacteroidessubtili)、多形擬桿菌(bacteroidesthetaiotaomicron)、兩歧雙歧桿菌(bifidobacteriumbifidum)、嬰兒雙歧桿菌(bifidobacteriuminfantis)、乳雙歧桿菌(bifidobacteriumlactis)、長雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)、屎腸球菌(enterococcusfaecium)、嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)、保加利亞乳桿菌(lactobacillusbulgaricus)、干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)、約翰遜氏乳桿菌(lactobacillusjohnsonii)、副干酪乳桿菌(lactobacillusparacasei)、植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)、羅伊乳桿菌(lactobacillusreuteri)、鼠李糖乳桿菌(lactobacillusrhamnosus)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)和鮑氏酵母菌(saccharomycesboulardii)(sonnenborn等，2009；dinleyici等，2014；美國專利號6,835,376；美國專利號6,203,797；美國專利號5,589,168；美國專利號7,731,976)。天然病原性細(xì)菌可以被遺傳工程化為提供降低或消除致病性。

“益生菌”用于指活的、非病原性微生物，例如細(xì)菌，其可以對包含適當(dāng)量該微生物的宿主生物體賦予健康益處。在一些實(shí)施方案中，宿主生物體是哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，宿主生物體是人類。目前，非病原性細(xì)菌的一些物種、菌株和/或亞型被認(rèn)為是益生菌。益生細(xì)菌的實(shí)例包括但不限于雙歧桿菌屬、大腸桿菌、乳桿菌屬和酵母屬，例如雙歧雙歧桿菌、屎腸球菌、大腸桿菌菌株nissle、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌和鮑氏酵母菌(dinleyici等，2014；美國專利號5,589,168；美國專利號6,203,797；美國專利6,835,376)。益生菌可以是細(xì)菌的變體或突變菌株(arthur等，2012；cuevas-ramos等，2010；olier等，2012；nougayrede等，2006)。非病原性菌可以被遺傳工程化為增強(qiáng)或改善所需的生物學(xué)特性，例如存活力(survivability)。非病原性細(xì)菌可以被遺傳工程化為提供益生菌特性。益生細(xì)菌可以被遺傳工程化為增強(qiáng)或改善益生菌特性。

如本文使用的，“穩(wěn)定維持的”或“穩(wěn)定的”細(xì)菌用于指攜帶非天然遺傳物質(zhì)例如反饋抗性arga基因、突變體精氨酸阻遏物和/或其他突變體精氨酸調(diào)節(jié)子的細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述非天然遺傳物質(zhì)被摻入到宿主基因組中或在自身復(fù)制的染色體外質(zhì)粒上繁殖，使得非天然遺傳物質(zhì)被保留、表達(dá)和繁殖。穩(wěn)定的細(xì)菌能夠在體外例如在培養(yǎng)基，和/或在體內(nèi)例如在消化道中存活和/或生長。例如，穩(wěn)定的細(xì)菌可以是包含arga^fbr基因的遺傳工程化的細(xì)菌，其中攜帶arga^fbr基因的質(zhì)?；蛉旧w穩(wěn)定地被維持在細(xì)菌中，使得arga^fbr可以在細(xì)菌中表達(dá)，且細(xì)菌能夠在體外和/或在體內(nèi)存活和/或生長。

如本文使用的，術(shù)語“治療”及其同源詞指疾病或紊亂或其至少一種可辨別的癥狀的改善。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“治療”指至少一個(gè)可測量的物理參數(shù)的改善(不必由患者可辨別)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“治療”指物理地(例如，可辨別癥狀的穩(wěn)定)、生理上(例如，物理參數(shù)的穩(wěn)定)或兩者抑制疾病或紊亂的進(jìn)展。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“治療”指減緩疾病或紊亂的進(jìn)展或者逆轉(zhuǎn)疾病或紊亂的進(jìn)展。如本文使用的，“預(yù)防”及其同源詞指延遲給定疾病或紊亂的發(fā)作或降低獲得給定疾病或紊亂的風(fēng)險(xiǎn)。

需要治療的個(gè)體可包括已具有特定醫(yī)學(xué)紊亂的個(gè)體，以及處于具有該紊亂的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體或可最終獲得該紊亂的個(gè)體。通過以下評價(jià)治療需要：例如，與紊亂的發(fā)展相關(guān)的一種或更多種危險(xiǎn)因素的存在、紊亂的存在或進(jìn)展或具有該紊亂的受試者對治療的可能接受性。原發(fā)性高氨血癥是由于ucd引起的，這些ucd是常染色體隱性或x連鎖的先天的代謝錯(cuò)誤，對其沒有已知的治愈。高氨血癥也可繼發(fā)于尿素循環(huán)的其他破壞，例如毒性代謝物、感染和/或底物缺乏。治療高氨血癥可以包括降低或消除過量的氨和/或相關(guān)癥狀，并不一定包括消除潛在的高氨血癥相關(guān)紊亂。

如本文使用的，“藥物組合物”指本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌與其他成分諸如生理上合適的載體和/或賦形劑的制劑。

可互換使用的措辭“生理上可接受的載體”和“藥學(xué)上可接受的載體”指不會(huì)對生物體引起顯著刺激并且不會(huì)消除所施用的細(xì)菌化合物的生物學(xué)活性和特性的載體或稀釋劑。這些措辭包括佐劑。

術(shù)語“賦形劑”指被添加至藥物組合物中以進(jìn)一步促進(jìn)活性成分施用的惰性物質(zhì)。實(shí)例包括但不限于碳酸氫鈣、磷酸鈣、多種糖和淀粉類型、纖維素衍生物、明膠、植物油、聚乙二醇和表面活性劑，包括例如聚山梨醇酯20。

術(shù)語“治療有效劑量”和“治療有效量”用于指導(dǎo)致狀況(例如高氨血癥)的癥狀發(fā)作的預(yù)防、延遲或者狀況(例如高氨血癥)的癥狀改善的化合物的量。治療有效量可以例如足以治療、預(yù)防、降低與升高的氨濃度相關(guān)的紊亂的嚴(yán)重程度、延遲與升高的氨濃度相關(guān)的紊亂的發(fā)作和/或降低發(fā)生與升高的氨濃度相關(guān)的紊亂的一種或更多種癥狀的風(fēng)險(xiǎn)。治療有效量以及治療有效的施用頻率可以通過本領(lǐng)域已知的并在以下討論的方法來確定。

除非另有明確相反指示，否則如本文使用的冠詞“一(a)”和“一(an)”應(yīng)理解為意指“至少一個(gè)”。

當(dāng)在列表中的要素之間使用時(shí)，措辭“和/或”意圖意指(1)僅存在單個(gè)列出的要素，或(2)存在多于一個(gè)的列表的要素。例如，“a、b和/或c”指示，選擇可以為單獨(dú)的a；單獨(dú)的b；單獨(dú)的c；a和b；a和c；b和c；或a、b和c。措辭“和/或”可以與列表中的“至少一個(gè)”或“一個(gè)或更多個(gè)”要素互換使用。

細(xì)菌

本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌能夠降低過量的氨并將氨和/或氮轉(zhuǎn)化為旁路副產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是非病原性細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是共生細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是益生細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是經(jīng)修飾或突變?yōu)榻档突蛳虏⌒缘奶烊徊≡约?xì)菌。示例性細(xì)菌包括但不限于芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、短桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、大腸桿菌、乳桿菌屬、乳球菌屬、酵母屬和葡萄球菌屬，例如凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、脆弱擬桿菌、枯草擬桿菌、多形擬桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、長雙歧桿菌、丁酸梭菌、屎腸球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、約翰遜氏乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、乳酸乳球菌和鮑氏酵母菌。在某些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌選自以下組成的組：脆弱擬桿菌、多形擬桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、丁酸梭菌、大腸桿菌nissle、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊乳桿菌、以及乳酸乳球菌。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是大腸桿菌菌株nissle1917(e.colinissle)，一種“已演化為最佳表征的益生菌之一”(ukena等，2007)的腸桿菌科(enterobacteriaceae)的革蘭氏陰性細(xì)菌。該菌株的特征在于其完全無害(schultz，2008)，并且具有g(shù)ras(遺傳上認(rèn)為是安全的(generallyrecognizedassafe)狀態(tài)(reister等，2014，加了著重)?；蚪M測序證實(shí)，大腸桿菌nissle缺乏突出的毒力因子(例如，大腸桿菌α-溶血素、p-菌毛粘附素(p-fimbrialadhesin))(schultz，2008)。另外，已經(jīng)顯示大腸桿菌nissle不攜帶病原性粘附因子，不產(chǎn)生任何腸毒素或細(xì)胞毒素，不是侵入性的，而且不是尿道病原性的(uropathogenic)(sonnenborn等，2009)。早在1917年，大腸桿菌nissle被包裝為藥物膠囊(稱為mutaflor)用于治療用途。從那時(shí)起，大腸桿菌nissle已被用于體內(nèi)治療人類中的潰瘍性結(jié)腸炎(rembacken等，1999)，用于體內(nèi)治療人類炎性腸病、克羅恩病和儲(chǔ)袋炎(pouchitis)(schultz，2008)，并在體外抑制腸侵入性沙門氏菌屬(salmonella)、軍團(tuán)菌屬(legionella)、耶爾森氏菌屬(yersinia)和志賀氏菌屬(shigella)(altenhoefer等，2004)。普遍認(rèn)為，大腸桿菌nissle的治療功效和安全性已得到令人信服地證實(shí)(ukena等，2007)。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，本文公開的遺傳修飾可以被修改并適用于細(xì)菌的其他物種、菌株和亞型。例如，已知精氨酸介導(dǎo)的調(diào)節(jié)在非常趨異的細(xì)菌，即革蘭氏陰性細(xì)菌諸如大腸桿菌、腸道沙門氏菌鼠傷寒血清型(salmonellaentericaserovartyphimurium)、棲熱孢菌屬(thermotoga)和moritellaprofunda以及革蘭氏陽性細(xì)菌，諸如枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)和棒狀鏈霉菌(streptomycesclavuligerus)以及其他細(xì)菌中顯著良好保守(nicoloff等，2004)。此外，精氨酸阻遏物在細(xì)菌基因組中普遍保守，且其識別信號(arg盒)(弱回文序列(palindrome))也在基因組之間保守(makarova等，2001)。

未修飾的大腸桿菌nissle和本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌可例如被消化道或血清中的防御因子(sonnenborn等，2009)破壞。細(xì)菌在體內(nèi)的停留時(shí)間可以使用實(shí)施例19中描述的方法確定。在一些實(shí)施方案中，為人類受試者計(jì)算停留時(shí)間。提供了使用包含野生型argr和野生型精氨酸調(diào)節(jié)子的鏈霉素抗性的大腸桿菌nissle的非限制性實(shí)例(參見圖27)。在一些實(shí)施方案中，計(jì)算本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌的體內(nèi)停留時(shí)間。

降低過量的氨

精氨酸生物合成途徑

在諸如大腸桿菌(e.coli)的細(xì)菌中，精氨酸生物合成途徑能夠在包括酶n-乙酰谷氨酸合成酶、n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酸磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、氨甲酰磷酸合酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶和精氨基琥珀酸裂合酶的八步酶促法中將谷氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸(cunin等，1986)。前五個(gè)步驟包括n-乙?；援a(chǎn)生鳥氨酸前體。在第六步中，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(也稱為鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)催化瓜氨酸的形成。最后兩個(gè)步驟包括氨甲酰磷酸鹽利用以由瓜氨酸產(chǎn)生精氨酸。

在一些細(xì)菌，例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)和淋病奈瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae)中，精氨酸生物合成中的第一步和第五步可以由雙功能性酶鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶催化。最初當(dāng)大腸桿菌中鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(argj)被證明補(bǔ)充n-乙酰谷氨酸合成酶(arga)和n-乙酰鳥氨酸酶(arge)兩者營養(yǎng)缺陷型基因突變時(shí)，鑒定了這種雙功能性(mountain等，1984；crabeel等1997)。

arga編碼n-乙酰谷氨酸合成酶，argb編碼n-乙酰谷氨酸激酶，argc編碼n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶，argd編碼乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，arge編碼n-乙酰鳥氨酸酶，argf編碼鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，argi也編碼鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，argg編碼精氨基琥珀酸合酶，argh編碼精氨基琥珀酸裂合酶，且argj編碼鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。cara編碼具有谷氨酰胺酶活性的氨甲酰磷酸合酶的小a亞基，且carb編碼氨甲酰磷酸合酶的大b亞基，其催化從氨合成氨甲酰磷酸。這些精氨酸生物合成基因(即arga、argb、argc、argd、arge、argf、argg、argh、argi、argj、cara和carb)中的一種或更多種的不同組合，可以天然地或合成地被組織為一種或更多種操縱子，并且此類組織可以在細(xì)菌物種、菌株和亞型之間變化(參見，例如，表2)。每種操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域包含至少一種arg盒，且每調(diào)節(jié)區(qū)域arg盒的數(shù)目可以在操縱子和細(xì)菌之間變化。

編碼這些酶的所有基因經(jīng)由精氨酸與argr的相互作用以形成與每種基因的調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄的復(fù)合物來經(jīng)歷精氨酸的阻遏。n-乙酰谷氨酸合成酶也在蛋白水平上經(jīng)歷單獨(dú)的精氨酸的變構(gòu)反饋抑制(tuchman等，1997；caldara等，2006；caldara等，2008；caldovic等，2010)。

調(diào)節(jié)細(xì)菌中精氨酸生物合成的基因跨越染色體散布并被組織為由單種阻遏物控制的多種操縱子，所述阻遏物被maas和clark(1964)稱之為“調(diào)節(jié)子”。每種操縱子由包含與啟動(dòng)子重疊并且阻遏物蛋白與其結(jié)合的至少一個(gè)18個(gè)核苷酸不完全回文序列(稱為arg盒)的調(diào)節(jié)區(qū)域調(diào)節(jié)(tian等，1992；tian等，1994)。argr基因編碼阻遏物蛋白，其結(jié)合一種或更多種arg盒(lim等，1987)。精氨酸作為活化精氨酸阻遏物的共同阻遏物起作用。調(diào)節(jié)每種操縱子的arg盒可以不相同，且共有arg盒序列是a/tntgaata/ta/tt/at/aattcant/a(maas，1994)。另外，argr的調(diào)節(jié)區(qū)域包含兩種啟動(dòng)子，其中一種啟動(dòng)子與兩種arg盒重疊并且被自動(dòng)調(diào)節(jié)。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子并比在相同條件下的相同亞型的未修飾的細(xì)菌產(chǎn)生更多的精氨酸和/或中間副產(chǎn)物例如瓜氨酸。突變體精氨酸調(diào)節(jié)子包含一種或更多種核酸突變，所述一種或更多種核酸突變經(jīng)由對arg盒的argr結(jié)合和/或?qū)-乙酰谷氨酸合成酶的精氨酸結(jié)合降低或阻止精氨酸介導(dǎo)的對編碼負(fù)責(zé)在精氨酸生物合成途徑中將谷氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸的酶的一種或更多種操縱子的阻遏，由此增強(qiáng)精氨酸和/或中間副產(chǎn)物生物合成。

在替代實(shí)施方案中，細(xì)菌經(jīng)遺傳工程化為經(jīng)由另一種代謝途徑消耗過量的氨，所述另一種代謝途徑例如組氨酸生物合成途徑、甲硫氨酸生物合成途徑、賴氨酸生物合成途徑、天冬酰胺生物合成途徑、谷氨酰胺生物合成途徑和色氨酸生物合成途徑。

組氨酸生物合成途徑

組氨酸生物合成例如由位于大腸桿菌中的單種操縱子內(nèi)的8種基因進(jìn)行。操縱子的八種基因中的三種(hisd、hisb和hisi)編碼雙功能性酶，且兩種(hish和hisf)編碼多肽鏈，其一起形成一種酶以催化單個(gè)步驟，總計(jì)進(jìn)行10種酶促反應(yīng)(alifano等，1996)。hisg基因的產(chǎn)物atp磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶在蛋白水平被組氨酸抑制。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包含反饋抗性hisg?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)將細(xì)菌誘變和/或篩選用于反饋抗性hisg突變體。被工程化為包含反饋抗性hisg的細(xì)菌將具有升高的組氨酸產(chǎn)生水平，從而增加氨消耗并降低高氨血癥?？蛇x地，組氨酸生物合成所需的一種或更多種基因可以被置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如fnr誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，并允許增加限速酶的產(chǎn)生。對組氨酸生物合成途徑的任何其他合適的修飾可用于增加氨消耗。

甲硫氨酸生物合成途徑

細(xì)菌甲硫氨酸調(diào)節(jié)子控制由高絲氨酸三步(即酰化、磺酰化和甲基化)合成甲硫氨酸。metj基因編碼調(diào)節(jié)蛋白，其當(dāng)與甲硫氨酸或其衍生物組合時(shí)，引起在甲硫氨酸調(diào)節(jié)子內(nèi)的基因在轉(zhuǎn)錄水平的阻遏(saint-girons等，1984；shoeman等，1985)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包括缺失的、破壞的或突變的metj。被工程化為缺失、破壞或突變metj的細(xì)菌將具有升高的甲硫氨酸產(chǎn)生水平，從而增加氨消耗并降低高氨血癥。對甲硫氨酸生物合成途徑的任何其他合適的修飾可用于增加氨消耗。

賴氨酸生物合成途徑

微生物通過兩種途徑之一合成賴氨酸。二氨基庚二酸(diaminopimelate)(dap)途徑用于由天冬氨酸和丙酮酸合成賴氨酸(dogovski等，2012)，且氨基己二酸途徑用于由α-酮戊二酸和乙酰輔酶a合成賴氨酸。二氫吡啶二羧酸合酶(dhdps)酶催化dap途徑的第一步，并經(jīng)歷賴氨酸的反饋抑制(liu等，2010；reboul等，2012)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包含反饋抗性dhdps。被工程化為包含反饋抗性dhdps的細(xì)菌將具有升高的賴氨酸產(chǎn)生水平，從而增加氨消耗并降低高氨血癥。可選地，可以通過將賴氨酸生物合成所需的一種或更多種基因置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如fnr誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下來優(yōu)化賴氨酸生產(chǎn)。對賴氨酸生物合成途徑的任何其他合適的修飾可用于增加氨消耗。

天冬酰胺生物合成途徑

天冬酰胺分別經(jīng)由草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬酰胺合成酶直接由草酰乙酸和天冬氨酸合成。在該途徑的第二步中，l-谷氨酰胺或氨用作氨基基團(tuán)供體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌與在相同條件下的相同亞型的未修飾的細(xì)菌相比過度產(chǎn)生天門冬酰胺，由此消耗過量的氨并降低高氨血癥?？蛇x地，可以通過將這些基因中的一種或兩種置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如fnr誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下來優(yōu)化天冬酰胺合成。對天冬酰胺生物合成途徑的任何其他合適的修飾可用于增加氨的消耗。

谷氨酰胺生物合成途徑

由氨和酮戊二酸合成谷氨酰胺和谷氨酸被三種酶進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)節(jié)。谷氨酸脫氫酶在單一步驟中催化酮戊二酸的還原胺化產(chǎn)生谷氨酸。谷氨酰胺合成酶催化谷氨酸和氨的atp依賴性縮合形成谷氨酰胺(lodeiro等，2008)。谷氨酰胺合成酶也與谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(也稱為谷氨酸合酶)一起在循環(huán)反應(yīng)中起作用由谷氨酰胺和酮戊二酸產(chǎn)生谷氨酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌與在相同條件下的相同亞型的未修飾的細(xì)菌相比，表達(dá)在升高水平的谷氨酰胺合成酶。被工程化為具有增加的谷氨酰胺合成酶表達(dá)的細(xì)菌將具有升高的谷氨酰胺產(chǎn)生水平，從而增加氨的消耗并降低高氨血癥?？蛇x地，可以修飾谷氨酸脫氫酶和/或谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)以有利于氨的消耗。由于谷氨酰胺合成酶的產(chǎn)生在轉(zhuǎn)錄水平受氮調(diào)節(jié)(feng等，1992；vanheeswijk等，2013)，將谷氨酰胺合成酶基因置于不同誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如fnr誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，也可用于改善谷氨酰胺產(chǎn)生。對谷氨酰胺和谷氨酸生物合成途徑的任何其他合適的修飾可用于增加氨的消耗。

色氨酸生物合成途徑

在大多數(shù)細(xì)菌中，由分支酸前體合成色氨酸所需的基因被組織為單種轉(zhuǎn)錄單元，即trp操縱子。當(dāng)高水平的色氨酸存在時(shí)，trp操縱子在由色氨酸阻遏物(trpr)抑制的單種啟動(dòng)子的控制下。在高水平的帶電色氨酸t(yī)rna的存在下，trp操縱子的轉(zhuǎn)錄也可被終止。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包含缺失的、破壞的或突變的trpr基因。trpr基因的缺失、破壞或突變以及隨后的trpr功能失活將導(dǎo)致色氨酸產(chǎn)生和氨消耗兩者水平升高?？蛇x地，色氨酸生物合成所需的一種或更多種酶可被置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如fnr誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。對色氨酸生物合成途徑的任何其他合適的修飾可用于增加氨消耗。

包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子的工程化細(xì)菌

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸生物合成途徑并能夠降低過量的氨。在更具體的方面，遺傳工程化的細(xì)菌包含其中編碼精氨酸生物合成酶的一種或更多種操縱子被去阻遏的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子以比在相同條件下的相同亞型的未修飾的細(xì)菌相比產(chǎn)生更多的精氨酸或中間副產(chǎn)物例如瓜氨酸。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌過度產(chǎn)生精氨酸。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌過度產(chǎn)生瓜氨酸；這可以是另外有益的，因?yàn)楣习彼崮壳坝米魈囟蛩匮h(huán)障礙的治療劑(美國國家尿素循環(huán)障礙基金會(huì))。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌在精氨酸生物合成途徑中過度產(chǎn)生旁路中間副產(chǎn)物，諸如本文所述的任何中間體。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌通過比在相同條件下的相同細(xì)菌亞型的未修飾細(xì)菌產(chǎn)生更多的精氨酸、瓜氨酸和/或其他中間副產(chǎn)物來消耗過量的氨。精氨酸和/或中間副產(chǎn)物生物合成的增強(qiáng)可用于將體內(nèi)過量的氮摻入無毒分子中，以便治療與高氨血癥相關(guān)的狀況(包括尿素循環(huán)障礙和肝性腦病)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，操縱子內(nèi)的精氨酸生物合成基因的組織跨越細(xì)菌的物種、菌株和亞型而變化，例如在大腸桿菌k12中的雙極argecbh、枯草芽孢桿菌中的argcaebd-carab-argf、以及植物乳桿菌中的雙極carab-argcjbdf。來自不同細(xì)菌的操縱子組織的非限制性實(shí)例示于表2中(在一些情況下，基因是通過與大腸桿菌中的已知序列的序列同源性推定和/或鑒定的；在一些情況下，并非精氨酸調(diào)節(jié)子中的所有基因是已知的和/或如下示出的)。在某些情況下，精氨酸生物合成酶跨越細(xì)菌的物種、菌株和亞型而變化。

表2：arg操縱子組織的實(shí)例

每種操縱子由包含至少一種啟動(dòng)子和至少一種arg盒的調(diào)節(jié)區(qū)域調(diào)節(jié)，所述arg盒控制所述操縱子中精氨酸生物合成基因的阻遏和表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸調(diào)節(jié)子，所述精氨酸調(diào)節(jié)子包含一種或更多種核酸突變，所述一種或更多種核酸突變降低或消除精氨酸介導(dǎo)的對編碼負(fù)責(zé)在精氨酸生物合成途徑中將谷氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸和/或中間副產(chǎn)物的酶的一種或更多種操縱子的阻遏。降低或消除精氨酸介導(dǎo)的阻遏可以通過降低或消除argr阻遏物結(jié)合(例如，通過突變或缺失精氨酸阻遏物或通過突變編碼精氨酸生物合成酶的每種操縱子的至少一種arg盒)和/或?qū)-乙酰谷氨酸合成酶的精氨酸結(jié)合(例如，通過突變n-乙酰谷氨酸合成酶為產(chǎn)生精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體，例如arga^fbr)來實(shí)現(xiàn)。

arg盒

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含在用于編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂合酶和氨甲酰磷酸合酶的一種或更多種操縱子的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，由此使調(diào)節(jié)子去阻遏并增強(qiáng)精氨酸和/或中間副產(chǎn)物生物合成。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含突變體精氨酸阻遏物，所述突變體精氨酸阻遏物包含一種或更多種核酸突變，使得精氨酸阻遏物功能被減少或失活，或遺傳工程化的細(xì)菌不具有精氨酸阻遏物(例如，精氨酸阻遏物基因已被缺失)，導(dǎo)致調(diào)節(jié)子的去阻遏和精氨酸和/或中間副產(chǎn)物生物合成的增強(qiáng)。在這些實(shí)施方案中的任一個(gè)中，遺傳工程化的細(xì)菌還可以包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體，例如arga^fbr。因此，在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含在用于編碼精氨酸生物合成酶的一種或更多種操縱子的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體，例如arga^fbr。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含突變或缺失的精氨酸阻遏物和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體，例如arga^fbr。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體例如arga^fbr，在用于編碼精氨酸生物合成酶和/或突變或缺失的精氨酸阻遏物的每種操縱子的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌編碼精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶，并且還包含在用于編碼n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂合酶、氨甲酰磷酸合酶和野生型n-乙酰谷氨酸合酶的操縱子中的每種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，使得argr結(jié)合被降低或消除，由此去阻遏調(diào)節(jié)子并增強(qiáng)精氨酸和/或中間副產(chǎn)物生物合成。

在一些實(shí)施方案中，用于編碼精氨基琥珀酸合酶(argg)的操縱子的arg盒維持與argr結(jié)合的能力，由此驅(qū)動(dòng)瓜氨酸生物合成。例如，編碼精氨基琥珀酸合酶(argg)的操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域可以是組成型，由此驅(qū)動(dòng)精氨酸的生物合成。在替代實(shí)施方案中，一種或更多種替代操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域可以是組成型的。然而，在某些細(xì)菌中，編碼多種酶的基因可被組織在雙極操縱子中或在共有的調(diào)節(jié)區(qū)域的控制下；在這些情況下，調(diào)節(jié)區(qū)域可能需要被解卷積(deconvoluted)以構(gòu)建組成型活躍的調(diào)節(jié)區(qū)域。例如，在大腸桿菌k12和nissle中，arge和argcbh被組織在兩個(gè)雙極操縱子argecbh中，并且可以使那些調(diào)節(jié)區(qū)域解卷積，以便產(chǎn)生arge和/或argcbh的組成型形式。

在一些實(shí)施方案中，包含精氨酸生物合成基因的一種或更多種操縱子中的所有arg盒被突變?yōu)榻档突蛳齛rgr結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，編碼精氨酸生物合成酶的一種或更多種操縱子中的所有arg盒被突變?yōu)榻档突蛳齛rgr結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，包含精氨酸生物合成基因的每種操縱子中的所有arg盒被突變?yōu)榻档突蛳齛rgr結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，編碼精氨酸生物合成酶的每種操縱子中的所有arg盒被突變?yōu)榻档突蛳齛rgr結(jié)合。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌編碼由argr阻遏型調(diào)節(jié)區(qū)域驅(qū)動(dòng)的精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶、精氨基琥珀酸合酶，并且還包含在用于編碼n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂合酶、氨甲酰磷酸合酶和任選地野生型n-乙酰谷氨酸合成酶的操縱子的每一種的每種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，使得argr結(jié)合被降低或消除，由此使調(diào)節(jié)子去阻遏并增強(qiáng)瓜氨酸生物合成。在一些實(shí)施方案中，能夠產(chǎn)生瓜氨酸的遺傳工程化的細(xì)菌是特別有利的，因?yàn)楣习彼徇€用作治療某些尿素循環(huán)障礙的治療有效的補(bǔ)充物(美國國家尿素循環(huán)障礙基金會(huì))。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌編碼由組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶、精氨基琥珀酸合酶，并且還包含在用于編碼n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸裂合酶、氨甲酰磷酸合酶和任選地野生型n-乙酰谷氨酸合成酶的每種操縱子的每種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，使得argr結(jié)合被降低或消除，由此使調(diào)節(jié)子去阻遏并增強(qiáng)精氨酸生物合成。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子和反饋抗性arga，并且當(dāng)精氨酸反饋抗性arga被表達(dá)時(shí)，能夠比在相同條件下的相同亞型的未修飾的細(xì)菌產(chǎn)生更多精氨酸和/或中間副產(chǎn)物。

精氨酸阻遏物結(jié)合位點(diǎn)(arg盒)

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌另外包含在用于編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂合酶和氨甲酰磷酸合酶的一種或更多種操縱子的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，使得精氨酸調(diào)節(jié)子去阻遏，且精氨酸和/或中間副產(chǎn)物例如瓜氨酸的生物合成得到增強(qiáng)。

在一些實(shí)施方案中，突變體精氨酸調(diào)節(jié)子包含編碼鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的操縱子和用于所述操縱子的至少一種arg盒中的一種或更多種核酸突變。一種或更多種核酸突變導(dǎo)致回文arg盒序列的破壞，使得對與在相同條件下的相同亞型的細(xì)菌中的未修飾的arg盒和調(diào)節(jié)區(qū)域的argr結(jié)合相比，對操縱子的該arg盒和調(diào)節(jié)區(qū)域的argr結(jié)合被降低或消除。在一些實(shí)施方案中，在argr結(jié)合期間被保護(hù)免受dna甲基化和羥基自由基攻擊的核酸是用于破壞argr結(jié)合的突變的主要靶。在一些實(shí)施方案中，突變體精氨酸調(diào)節(jié)子在用于編碼以上描述的精氨酸生物合成酶的操縱子的每一種的一種或更多種arg盒中包含至少三種核酸突變。arg盒與啟動(dòng)子重疊，且在突變體精氨酸調(diào)節(jié)子中，突變體啟動(dòng)子區(qū)域的g/c:a/t比值與野生型啟動(dòng)子區(qū)域的g/c:a/t比值相差不多于10％(圖6)。啟動(dòng)子保留與非突變啟動(dòng)子足夠高的同源性，使得rna聚合酶以足夠的親和力結(jié)合以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。

在大腸桿菌nissle中，對于每種精氨酸生物合成操縱子，包含arg盒的野生型基因組序列及其突變體示于圖6中。對于示例性野生型序列，arg盒以斜體表示，并且每種基因的起始密碼子被rna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)被加下劃線(cunin，1983；maas，1994)。在一些實(shí)施方案中，加下劃線的序列不改變。在argr結(jié)合期間被保護(hù)免受dna甲基化的堿基被突出顯示，并且在argr結(jié)合期間被保護(hù)免受羥基自由基攻擊的堿基被加粗(charlier等，1992)。突出顯示和加粗的堿基是用于破壞argr結(jié)合的突變的主要靶。

在一些實(shí)施方案中，多于一種arg盒可以存在于單種操縱子中。在這些實(shí)施方案的一個(gè)方面，操縱子中的至少一種arg盒被突變?yōu)楫a(chǎn)生所需的對操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域的降低的argr結(jié)合。在這些實(shí)施方案的另一方面，操縱子中的arg盒的每一種被突變?yōu)楫a(chǎn)生所需的對操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域的降低的argr結(jié)合。例如，大腸桿菌nissle中的carab操縱子包含兩種arg盒，并且一種或兩種arg盒序列可被突變。大腸桿菌nissle中的argg操縱子包含三種arg盒，且一種、兩種或三種arg盒序列可被突變、破壞或缺失。在一些實(shí)施方案中，所有三種arg盒序列都被突變、破壞或缺失，并且組成型啟動(dòng)子，例如bba_j23100被插入到argg操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，每調(diào)節(jié)區(qū)域的arg盒的數(shù)目可以跨越細(xì)菌而變化，并且arg盒的核苷酸序列可以針對每種操縱子而變化。

在一些實(shí)施方案中，對操縱子的突變體arg盒和調(diào)節(jié)區(qū)域的argr結(jié)合親和力比對在相同條件下的相同亞型的細(xì)菌中的未修飾的arg盒和調(diào)節(jié)區(qū)域的argr結(jié)合親和力至少低約50％、至少低約60％、至少低約70％、至少低約80％、至少低約90％或至少低約95％。在一些實(shí)施方案中，對突變體arg盒和調(diào)節(jié)區(qū)域的降低的argr結(jié)合將相關(guān)操縱子中的基因的mrna表達(dá)增加了至少約1.5倍、至少約2倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約600倍、至少約700倍、至少約800倍、至少約900倍、至少約1,000倍或至少約1,500倍。

在一些實(shí)施方案中，定量pcr(qpcr)用于擴(kuò)增、檢測和/或定量精氨酸生物合成基因的mrna表達(dá)水平。對精氨酸生物合成基因(例如arga、argb、argc、argd、arge、argf、argg、argh、argi、argj、cara和carb)特異性的引物可以被設(shè)計(jì)并用于根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法檢測樣品中的mrna(fraga等，2008)。在一些實(shí)施方案中，將熒光團(tuán)添加至可能包含argmrna的樣品反應(yīng)混合物中，并且使用熱循環(huán)儀以特定波長的光照射樣品反應(yīng)混合物，并檢測隨后的熒光團(tuán)發(fā)射。將反應(yīng)混合物加熱并冷卻至預(yù)定溫度持續(xù)預(yù)定的時(shí)間段。在某些實(shí)施方案中，加熱和冷卻重復(fù)預(yù)定的循環(huán)數(shù)。在一些實(shí)施方案中，將反應(yīng)混合物加熱并冷卻至90-100℃、60-70℃和30-50℃持續(xù)預(yù)定的循環(huán)數(shù)。在某一個(gè)實(shí)施方案中，將反應(yīng)混合物加熱并冷卻至93-97℃、55-65℃和35-45℃持續(xù)預(yù)定的循環(huán)數(shù)。在一些實(shí)施方案中，在qpcr的每個(gè)循環(huán)之后定量積累的擴(kuò)增子。在其熒光超過閾值的循環(huán)數(shù)是閾值循環(huán)(ct)。對每種樣品產(chǎn)生至少一種ct結(jié)果，且ct結(jié)果可用于確定精氨酸生物合成基因的mrna表達(dá)水平。

在一些實(shí)施方案中，在用于編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂合酶和氨甲酰磷酸合酶的一種或更多種操縱子的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的遺傳工程化的細(xì)菌還包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體，例如arga^fbr。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含arga的反饋抗性形式、以及在用于編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂合酶、鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和氨甲酰磷酸合酶的一種或更多種操縱子的每種arg盒中的一種或更多種核酸突變。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含由argr阻遏型調(diào)節(jié)區(qū)域驅(qū)動(dòng)的arga的反饋抗性形式、精氨基琥珀酸合酶、以及在用于編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸裂合酶、鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和氨甲酰磷酸合酶的操縱子的每一種的每種arg盒中的一種或更多種核酸突變。在這些實(shí)施方案中，細(xì)菌能夠產(chǎn)生瓜氨酸。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含由組成型啟動(dòng)子表達(dá)的arga的反饋抗性形式、精氨基琥珀酸合酶、以及在用于編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂合酶、鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和氨甲酰磷酸合酶的操縱子的每一種的每種arg盒中的一種或更多種核酸突變。在這些實(shí)施方案中，細(xì)菌能夠產(chǎn)生精氨酸。

表3顯示其中一種或更多種核酸突變降低或消除精氨酸介導(dǎo)的對精氨酸操縱子的每一種的阻遏的突變構(gòu)建體的實(shí)例。突變構(gòu)建體包含由氧水平依賴性啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的arga的反饋抗性形式。每種突變體精氨酸調(diào)節(jié)子在用于編碼n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂合酶、氨甲酰磷酸合酶和野生型n-乙酰谷氨酸合成酶的一種或更多種操縱子的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變，使得argr結(jié)合被降低或消除，由此增強(qiáng)精氨酸和/或中間副產(chǎn)物生物合成。突變體精氨酸調(diào)節(jié)子構(gòu)建體的非限制性實(shí)例示于表3中。

表3：arg盒突變體構(gòu)建體的實(shí)例

突變可存在于質(zhì)?；蛉旧w上。在一些實(shí)施方案中，精氨酸調(diào)節(jié)子由單種阻遏物蛋白調(diào)節(jié)。在細(xì)菌的特殊物種、菌株和/或亞型中，已經(jīng)提出，精氨酸調(diào)節(jié)子可以被兩個(gè)推定的阻遏物調(diào)節(jié)(nicoloff等，2004)。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的精氨酸調(diào)節(jié)子由多于一種的阻遏物蛋白調(diào)節(jié)。

在某些實(shí)施方案中，突變體精氨酸調(diào)節(jié)子在遺傳工程化的細(xì)菌的一種物種、菌株或亞型中表達(dá)。在替代實(shí)施方案中，突變體精氨酸調(diào)節(jié)子在遺傳工程化的細(xì)菌的兩種或更多種物種、菌株和/或亞型中表達(dá)。

精氨酸阻遏物(argr)

本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸調(diào)節(jié)子，所述精氨酸調(diào)節(jié)子包含一種或更多種核酸突變，所述一種或更多種核酸突變降低或消除精氨酸介導(dǎo)的對編碼負(fù)責(zé)在精氨酸生物合成途徑中將谷氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸和/或中間副產(chǎn)物的酶的一種或更多種操縱子的阻遏。在一些實(shí)施方案中，精氨酸介導(dǎo)的阻遏的降低或消除可以通過以下來實(shí)現(xiàn)：通過降低或消除argr阻遏物結(jié)合，例如通過突變用于編碼精氨酸生物合成酶的一種或更多種操縱子的至少一種arg盒(如以上所討論的)或通過突變或缺失精氨酸阻遏物(在此討論)和/或通過降低或消除對n-乙酰谷氨酸合成酶的精氨酸結(jié)合(例如，通過突變n-乙酰谷氨酸合成酶為產(chǎn)生精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體，例如，arga^fbr)。

因此，在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌缺乏功能性的argr阻遏物，并因此降低或消除了精氨酸生物合成操縱子的每一種的argr阻遏物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄阻遏。在一些實(shí)施方案中，工程化的細(xì)菌包含突變體精氨酸阻遏物，所述突變體精氨酸阻遏物包含一種或更多種核酸突變，使得精氨酸阻遏物功能被降低或失活。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌不具有精氨酸阻遏物(例如，精氨酸阻遏物基因已被缺失)，導(dǎo)致調(diào)節(jié)子的去阻遏和精氨酸和/或中間副產(chǎn)物生物合成的增強(qiáng)。在一些實(shí)施方案中，通常存在于相應(yīng)野生型細(xì)菌中的功能性argr基因的每個(gè)拷貝被一個(gè)或更多個(gè)核苷酸缺失、插入或取代獨(dú)立地缺失或使其失活。在一些實(shí)施方案中，通常存在于相應(yīng)野生型細(xì)菌中的功能性argr基因的每個(gè)拷貝被缺失。

在一些實(shí)施方案中，精氨酸調(diào)節(jié)子由單種阻遏物蛋白調(diào)節(jié)。在細(xì)菌的特殊物種、菌株和/或亞型中，已經(jīng)提出，精氨酸調(diào)節(jié)子可以被兩種不同的推定的阻遏物調(diào)節(jié)(nicoloff等，2004)。因此，在某些實(shí)施方案中，各自包含不同氨基酸序列的兩種不同的argr蛋白在遺傳工程化的細(xì)菌中被突變或缺失。

在一些實(shí)施方案中，包含突變或缺失的精氨酸阻遏物的遺傳修飾的細(xì)菌另外包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體，例如arga^fbr。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含反饋抗性形式的arga，缺乏任何功能性精氨酸阻遏物，并且能夠產(chǎn)生精氨酸。在某些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還缺乏功能性argg并且能夠產(chǎn)生瓜氨酸。在一些實(shí)施方案中，argr基因在遺傳工程化的細(xì)菌中被缺失。在一些實(shí)施方案中，argr基因被突變?yōu)槭Щ頰rgr功能。在一些實(shí)施方案中，argg基因在遺傳工程化的細(xì)菌中被缺失。在一些實(shí)施方案中，argg基因被突變?yōu)槭Щ頰rgr功能。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含arga^fbr和缺失的argr。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含arga^fbr、缺失的argr和缺失的argg。在一些實(shí)施方案中，缺失的argr和/或缺失的argg從細(xì)菌基因組中被缺失，并且arga^fbr存在于質(zhì)粒中。在一些實(shí)施方案中，缺失的argr和/或缺失的argg從細(xì)菌基因組中被缺失，并且arga^fbr被染色體整合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，遺傳修飾的細(xì)菌包含染色體整合的arga^fbr、缺失的基因組argr和缺失的基因組argg。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，遺傳修飾的細(xì)菌包含存在于質(zhì)粒上的arga^fbr、缺失的基因組argr和缺失的基因組argg。在缺失argg的任何實(shí)施方案中，產(chǎn)生瓜氨酸而不是精氨酸。

在一些實(shí)施方案中，在表達(dá)arga的反饋抗性形式的條件下，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌與在相同條件下的相同亞型的未修飾細(xì)菌相比多產(chǎn)生至少約1.5倍、至少約2倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約600倍、至少約700倍、至少約800倍、至少約900倍、至少約1,000倍或至少約1,500倍更多的精氨酸、瓜氨酸、其他中間副產(chǎn)物和/或操縱子中基因的轉(zhuǎn)錄物。

在一些實(shí)施方案中，定量pcr(qpcr)用于擴(kuò)增、檢測和/或定量精氨酸生物合成基因的mrna表達(dá)水平。對精氨酸生物合成基因(例如arga、argb、argc、argd、arge、argf、argg、argh、argi、argj、cara和carb)特異性的引物可以被設(shè)計(jì)并用于根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法檢測樣品中的mrna(fraga等，2008)。在一些實(shí)施方案中，將熒光團(tuán)添加至可能包含argmrna的樣品反應(yīng)混合物中，并且使用熱循環(huán)儀以特定波長的光照射樣品反應(yīng)混合物，并檢測隨后的熒光團(tuán)發(fā)射。將反應(yīng)混合物加熱并冷卻至預(yù)定溫度持續(xù)預(yù)定的時(shí)間段。在某些實(shí)施方案中，加熱和冷卻重復(fù)預(yù)定的循環(huán)數(shù)。在一些實(shí)施方案中，將反應(yīng)混合物加熱并冷卻至90-100℃、60-70℃和30-50℃持續(xù)預(yù)定的循環(huán)數(shù)。在某一個(gè)實(shí)施方案中，將反應(yīng)混合物加熱并冷卻至93-97℃、55-65℃和35-45℃持續(xù)預(yù)定的循環(huán)數(shù)。在一些實(shí)施方案中，在qpcr的每個(gè)循環(huán)之后定量積累的擴(kuò)增子。在其熒光超過閾值的循環(huán)數(shù)是閾值循環(huán)(ct)。對每種樣品產(chǎn)生至少一種ct結(jié)果，且ct結(jié)果可用于確定精氨酸生物合成基因的mrna表達(dá)水平。

反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體，例如arga^fbr。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，所述突變體精氨酸調(diào)節(jié)子包含精氨酸反饋抗性arga，并且當(dāng)精氨酸反饋抗性arga被表達(dá)時(shí)，能夠比在相同條件下的相同亞型的未修飾的細(xì)菌產(chǎn)生更多的精氨酸和/或中間副產(chǎn)物。精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶蛋白(arga^fbr)比來自反饋敏感親本菌株的酶對l-精氨酸的敏感性顯著更低(參見，例如，eckhardt等，1975；rajagopal等，1998)。反饋抗性arga基因可以存在于質(zhì)粒或染色體上。在一些實(shí)施方案中，來自質(zhì)粒的表達(dá)可用于增加arga^fbr表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，來自染色體的表達(dá)可用于增加arga^fbr表達(dá)的穩(wěn)定性。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的任何遺傳工程化的細(xì)菌在一個(gè)或更多個(gè)整合位點(diǎn)整合到細(xì)菌染色體中。例如，編碼精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶的序列的一個(gè)或更多個(gè)拷貝可以整合到細(xì)菌染色體中。具有整合到染色體中的精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶的多個(gè)拷貝允許更大量的n-乙酰谷氨酸合酶的產(chǎn)生，并且還允許微調(diào)表達(dá)水平?？蛇x地，除了精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶以外，本文描述的不同回路，諸如任何殺死開關(guān)回路可以以一個(gè)或更多個(gè)不同的整合位點(diǎn)整合到細(xì)菌染色體中，以進(jìn)行多種不同的功能。

多種不同的反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶蛋白是本領(lǐng)域已知的，并且可以被組合在遺傳工程化的細(xì)菌中。在一些實(shí)施方案中，arga^fbr基因在組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，arga^fbr基因在由外源環(huán)境條件誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，外源環(huán)境條件對哺乳動(dòng)物的消化道是特異性的。在一些實(shí)施方案中，外源環(huán)境條件是對哺乳動(dòng)物消化道特異性的分子或代謝物，例如丙酸酯或膽紅素。在一些實(shí)施方案中，外源環(huán)境條件是低氧或厭氧條件，諸如哺乳動(dòng)物消化道的環(huán)境。

細(xì)菌已經(jīng)演化出能夠感測氧水平的轉(zhuǎn)錄因子。不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以由不同的氧水平觸發(fā)并且以不同的動(dòng)力學(xué)發(fā)生。氧水平依賴性啟動(dòng)子是一種或更多種氧水平感測轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合的核酸序列，其中相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和/或活化活化下游基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，arga^fbr基因在氧水平依賴性啟動(dòng)子的控制下。在更具體的方面，arga^fbr基因處于在低氧或厭氧環(huán)境(諸如哺乳動(dòng)物消化道的環(huán)境)下活化的氧水平依賴性啟動(dòng)子的控制下。

在某些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含在富馬酸鹽和硝酸鹽還原酶調(diào)節(jié)物(fnr)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的arga^fbr。在大腸桿菌中，fnr是控制從需氧至厭氧代謝開關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄活化因子(unden等，1997)。在厭氧狀態(tài)下，fnr二聚化為活性dna結(jié)合蛋白，其活化數(shù)百個(gè)負(fù)責(zé)適應(yīng)厭氧生長的基因。在需氧狀態(tài)下，fnr被氧阻止二聚化并且是失活的。在替代實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含在旁路氧水平依賴性啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的arga^fbr，所述啟動(dòng)子例如精氨酸脫亞氨酶(deiminiase)和硝酸鹽還原的厭氧調(diào)節(jié)anr啟動(dòng)子(ray等，1997)、異化硝酸鹽呼吸調(diào)節(jié)物(dissimilatorynitraterespirationregulator)dnr啟動(dòng)子(trunk等，2010)。在這些實(shí)施方案中，精氨酸生物合成途徑在低氧或厭氧環(huán)境(例如在消化道)中被特別活化。

在銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)中，精氨酸脫亞氨酶和硝酸鹽還原(anr)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的厭氧調(diào)節(jié)是“在氧限制或厭氧條件下誘導(dǎo)型的生理功能的表達(dá)所必需的”(winteler等，1996；sawers1991)。銅綠假單胞菌anr與大腸桿菌fnr同源，且“共有fnr位點(diǎn)(ttgat----atcaa)被anr和fnr有效識別”(winteler等，1996)。像fnr一樣，在厭氧狀態(tài)下，anr活化許多負(fù)責(zé)適應(yīng)厭氧生長的基因。在需氧狀態(tài)下，anr是失活的。熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)和門多薩假單胞菌(pseudomonasmendocina)都具有anr的功能類似物(zimmermann等，1991)。由anr調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，例如arcdabc操縱子的啟動(dòng)子(參見，例如，hasegawa等，1998)。

fnr家族還包括異化硝酸鹽呼吸調(diào)節(jié)物(dnr)(arai等，1995)，即一種與anr聯(lián)合用于“銅綠假單胞菌厭氧硝酸鹽呼吸”所需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物(hasegawa等，1998)。對于某些基因，fnr結(jié)合基序“僅可能被dnr識別”(hasegawa等，1998)?？梢允褂糜赏庠喘h(huán)境條件和相應(yīng)的調(diào)節(jié)區(qū)域控制的任何合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。非限制性實(shí)例包括arca/b、resd/e、nrea/b/c和airsr，且其他是本領(lǐng)域已知的。

在一些實(shí)施方案中，arga^fbr在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子響應(yīng)于環(huán)境例如哺乳動(dòng)物的消化道中的特定分子或代謝物。例如，短鏈脂肪酸丙酸酯是定位于消化道的主要微生物發(fā)酵代謝物(hosseini等，2011)。在一個(gè)實(shí)施方案中，arga^fbr基因表達(dá)在丙酸酯誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。在更具體的實(shí)施方案中，arga^fbr基因表達(dá)在丙酸酯誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，所述丙酸酯誘導(dǎo)型啟動(dòng)子被哺乳動(dòng)物腸中丙酸酯的存在活化。在健康和/或疾病狀態(tài)下的哺乳動(dòng)物消化道中發(fā)現(xiàn)的任何分子或代謝物可用于誘導(dǎo)arga^fbr表達(dá)。非限制性實(shí)例包括丙酸酯、膽紅素、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、凝血因子ii、vii、ix和x、堿性磷酸酶、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、肝炎抗原和抗體、α甲胎蛋白、抗線粒體、平滑肌和抗核抗體、鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白、銅、血漿銅藍(lán)蛋白、氨和錳。在替代實(shí)施方案中，arga^fbr基因表達(dá)在pbad啟動(dòng)子的控制下，其在糖阿拉伯糖存在下被活化(參見，例如，圖18)。

具有肝性腦病(he)和其他肝臟疾病或紊亂的受試者具有慢性肝損傷，這導(dǎo)致其血液和腸中的氨水平高。除了氨以外，這些患者在其血液和腸中還具有升高水平的膽紅素、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、凝血因子ii、vii、ix和x、堿性磷酸酶、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、肝炎抗原和抗體、α甲胎蛋白、抗線粒體、平滑肌和抗核抗體、鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白、銅、銅血漿藍(lán)蛋白、氨和錳。響應(yīng)于這些he相關(guān)分子之一或其代謝物的啟動(dòng)子可用于工程化將僅在he患者的腸中被誘導(dǎo)表達(dá)arga^fbr的本公開內(nèi)容的細(xì)菌。這些啟動(dòng)子將不被預(yù)期在ucd患者中被誘導(dǎo)。

在一些實(shí)施方案中，arga^fbr基因在通過暴露于四環(huán)素被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)一步優(yōu)化基因表達(dá)，例如通過優(yōu)化核糖體結(jié)合位點(diǎn)，操作轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物和/或增加mrna穩(wěn)定性。

在一些實(shí)施方案中，當(dāng)精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶具有活性時(shí)，與來自在相同條件下的相同亞型的細(xì)菌的野生型n-乙酰谷氨酸合成酶相比，遺傳工程化的細(xì)菌中n-乙酰谷氨酸合成酶的精氨酸反饋抑制被降低了至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或至少約95％。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含攜帶arga^fbr基因的穩(wěn)定維持的質(zhì)?；蛉旧w，使得arga^fbr可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并且宿主細(xì)胞能夠在體外例如在培養(yǎng)基中和/或在體內(nèi)例如消化道中存活和/或生長。在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌可以包含反饋抗性arga基因的多個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方案中，反饋抗性arga基因在低拷貝質(zhì)粒上表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，低拷貝質(zhì)?？捎糜谠黾颖磉_(dá)的穩(wěn)定性。在一些實(shí)施方案中，低拷貝質(zhì)?？捎糜跍p少在非誘導(dǎo)條件下的滲漏表達(dá)(leakyexpression)。在一些實(shí)施方案中，反饋抗性arga基因在高拷貝質(zhì)粒上表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，高拷貝質(zhì)?？捎糜谠黾觓rga^fbr表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，反饋抗性arga基因在染色體上表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌被遺傳工程化為包括多種作用機(jī)制(moa)，例如產(chǎn)生相同產(chǎn)物的多個(gè)拷貝的回路或進(jìn)行多個(gè)不同功能的回路。插入位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于圖22中示出的male/k、insb/i、arac/bad、lacz、dapa、cea、及其他。例如，遺傳工程化的細(xì)菌可以包括插入在四個(gè)不同插入位點(diǎn)例如male/k、insb/i、arac/bad和lacz的arga^fbr的四個(gè)拷貝。可選地，遺傳工程化的細(xì)菌可以包括插入在三個(gè)不同插入位點(diǎn)例如male/k、insb/i和lacz的arga^fbr的三個(gè)拷貝，以及插入在三個(gè)不同的插入位點(diǎn)dapa、cea和arac/bad的三個(gè)突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，例如兩個(gè)產(chǎn)生瓜氨酸且一個(gè)產(chǎn)生精氨酸。

在一些實(shí)施方案中，質(zhì)?；蛉旧w還包含野生型argr結(jié)合位點(diǎn)，例如arg盒。在一些情況下，功能性argr的存在和/或形成可導(dǎo)致在除arg盒以外的位點(diǎn)的靶外(off-target)結(jié)合，這可引起基因表達(dá)的靶外變化。還包含功能性arg盒的質(zhì)粒或染色體可用于降低或消除靶外argr結(jié)合，即通過作為argr池(sink)。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)粒或染色體不包含功能性argr結(jié)合位點(diǎn)，例如質(zhì)?；蛉旧w包含修飾的arg盒或不包含arg盒。

在一些實(shí)施方案中，反饋抗性arga基因存在于質(zhì)粒上并且被可操作地連接至在低氧或厭氧條件下誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，反饋抗性arga基因存在于染色體中并且被可操作地連接至在低氧或厭氧條件下誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，反饋抗性arga基因存在于質(zhì)粒上并且被可操作地連接至由對哺乳動(dòng)物消化道特異性的分子或代謝物誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，反饋抗性arga基因存在于染色體上并且被可操作地連接至由對哺乳動(dòng)物消化道特異性的分子或代謝物誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，反饋抗性arga基因存在于染色體上并且被可操作地連接至通過暴露于四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，反饋抗性arga基因存在于質(zhì)粒上并且被可操作地連接至通過暴露于四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包括多種作用機(jī)制(moa)，例如產(chǎn)生相同產(chǎn)物的多個(gè)拷貝的回路(以增強(qiáng)拷貝數(shù))或進(jìn)行多個(gè)不同功能的回路。插入位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于圖22中示出的male/k、insb/i、arac/bad、lacz、dapa、cea、及其他。

在一些實(shí)施方案中，除了相應(yīng)的氧水平依賴性啟動(dòng)子以外，遺傳工程化的細(xì)菌還包含變異或突變的氧水平依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，例如，fnr、anr或dnr。變異或突變的氧水平依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物增加了在低氧或厭氧環(huán)境中被可操作地連接的基因的轉(zhuǎn)錄。在一些實(shí)施方案中，相應(yīng)的野生型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物保留野生型活性。在替代實(shí)施方案中，相應(yīng)的野生型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物被缺失或突變?yōu)榻档突蛳吧突钚浴Ｔ谀承?shí)施方案中，突變體氧水平依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物是包含增強(qiáng)二聚化和fnr活性的氨基酸取代的fnr蛋白(參見，例如，moore等，2006)。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含來自在低氧或厭氧環(huán)境中降低和/或消耗氨的不同細(xì)菌物種的氧水平依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物其。在某些實(shí)施方案中，突變體氧水平依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物是來自淋病奈瑟氏菌(n.gonorrhoeae)的fnr蛋白(參見，例如，isabella等，2011)。在一些實(shí)施方案中，相應(yīng)的野生型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物保持完整并保留野生型活性。在替代實(shí)施方案中，相應(yīng)的野生型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物被缺失或突變?yōu)榻档突蛳吧突钚浴?/p>

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含在氧水平依賴性啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的arga^fbr，以及在如以上討論的包含一種或更多種arg盒突變的突變體調(diào)節(jié)區(qū)域的控制下表達(dá)的野生型arga。在某些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含在氧水平依賴性啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的arga^fbr，并且不包含野生型arga。在又其他實(shí)施方案中，突變體精氨酸調(diào)節(jié)子包含在氧水平依賴性啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的arga^fbr，并且還包含沒有任何arg盒突變的野生型arga。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌由質(zhì)粒和/或染色體表達(dá)arga^fbr。在一些實(shí)施方案中，arga^fbr基因在組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，arga^fbr基因在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，arga^fbr在低氧或厭氧環(huán)境下被活化的氧水平依賴性啟動(dòng)子，例如fnr啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。fnr啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的arga^fbr質(zhì)粒的核酸序列示于圖8中，其中fnr啟動(dòng)子序列被加粗且arga^fbr序列被

fnr啟動(dòng)子序列是本領(lǐng)域已知的，并且任何合適的fnr啟動(dòng)子序列可用于本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌中。任何合適的fnr啟動(dòng)子可以與任何合適的反饋抗性arga(示例性序列seqidno:8a)組合。非限制性fnr啟動(dòng)子序列在圖7中提供。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包含以下一種或更多種：seqidno:16、seqidno:17、nirb1啟動(dòng)子(seqidno:18)、nirb2啟動(dòng)子(seqidno:19)、nirb3啟動(dòng)子(seqidno:20)、ydfz啟動(dòng)子(seqidno:21)、融合至強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的nirb啟動(dòng)子(seqidno:22)、融合至強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的ydfz啟動(dòng)子(seqidno:23)、fnrs，一種厭氧誘導(dǎo)的小rna基因(fnrs1啟動(dòng)子seqidno:24或fnrs2啟動(dòng)子seqidno:25)、融合至crp結(jié)合位點(diǎn)的nirb啟動(dòng)子(seqidno:26)和融合至crp結(jié)合位點(diǎn)的fnrs(seqidno:27)。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含seqidno:28的核酸序列或其功能性片段。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含除了冗余的遺傳密碼以外，與seqidno:28編碼相同的多肽的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含與seqidno:28的dna序列至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、或至少約99％同源的核酸序列，或者除了冗余的遺傳密碼以外，與seqidno:28編碼相同的多肽的核酸序列。

在其他實(shí)施方案中，arga^fbr在融合至轉(zhuǎn)錄活化物例如crp的結(jié)合位點(diǎn)的氧水平依賴性啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。crp(環(huán)狀amp受體蛋白或分解代謝活化蛋白或cap)通過當(dāng)存在可快速代謝的碳水化合物諸如葡萄糖時(shí)阻遏負(fù)責(zé)吸收、代謝和同化較不利的碳源的基因，在細(xì)菌中起主要的調(diào)節(jié)作用(wu等，2015)。對葡萄糖的這種偏好被稱為葡萄糖阻遏，以及碳分解代謝阻遏(deutscher，2008；和stülke，2008)。在一些實(shí)施方案中，arga^fbr表達(dá)由融合至crp結(jié)合位點(diǎn)的氧水平依賴性啟動(dòng)子控制。在一些實(shí)施方案中，arga^fbr表達(dá)由融合至crp結(jié)合位點(diǎn)的fnr啟動(dòng)子控制。在這些實(shí)施方案中，當(dāng)環(huán)境中不存在葡萄糖時(shí)，環(huán)狀amp與crp結(jié)合。這種結(jié)合引起crp的構(gòu)象變化，并允許crp與其結(jié)合位點(diǎn)緊密結(jié)合。crp結(jié)合然后通過經(jīng)由直接的蛋白-蛋白相互作用將rna聚合酶募集至fnr啟動(dòng)子來活化arga^fbr基因的轉(zhuǎn)錄。在葡萄糖的存在下，環(huán)狀amp不與crp結(jié)合，并且arga^fbr基因的轉(zhuǎn)錄被阻遏。在一些實(shí)施方案中，融合至轉(zhuǎn)錄活化物的結(jié)合位點(diǎn)的氧水平依賴性啟動(dòng)子(例如，fnr啟動(dòng)子)用于確保當(dāng)例如通過在體外向生長培養(yǎng)基中添加葡萄糖而存在足量的葡萄糖時(shí)，在厭氧條件下arga^fbr不表達(dá)。

精氨酸分解代謝

在實(shí)施本發(fā)明時(shí)的一個(gè)重要考慮是確保氨不會(huì)作為精氨酸和/或瓜氨酸分解代謝的副產(chǎn)物過度產(chǎn)生。在尿素循環(huán)的最終酶促步驟中，精氨酸酶催化精氨酸水解裂解為鳥氨酸和尿素(cunin等，1986)?？梢杂上兰?xì)菌產(chǎn)生的尿素酶催化尿素裂解為二氧化碳和氨(summerskill，1966；aoyagi等，1966；cunin等，1986)。因此，尿素酶活性可能產(chǎn)生可能“對人類組織有毒性”的氨(konieczna等，2012)。在包括大腸桿菌nissle的一些細(xì)菌中，基因arcd編碼精氨酸/鳥氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，這也可釋放氨(vanderwauven等，1984；gamper等，1991；meng等，1992)。

asta是參與釋放氨的精氨酸為琥珀酸的轉(zhuǎn)化的酶。spea是參與精氨酸為鯡精胺(agmatine)的轉(zhuǎn)化的酶，鯡精胺可進(jìn)一步被分解代謝產(chǎn)生氨。因此，在一些情況下，防止精氨酸的分解可能是有利的。在一些實(shí)施方案中，包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子的遺傳工程化的細(xì)菌另外包含降低或消除精氨酸分解代謝的突變，由此降低或消除進(jìn)一步的氨生產(chǎn)。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含降低或消除arcd活性的突變。在某些實(shí)施方案中，arcd被缺失。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含降低或消除asta活性的突變。在某些實(shí)施方案中，asta被缺失。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含降低或消除spea活性的突變。在某些實(shí)施方案中，spea被缺失。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的化的細(xì)菌還包含降低或消除精氨酸酶活性的突變。在某些實(shí)施方案中，精氨酸酶被缺失。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含降低或消除尿素酶活性的突變。在某些實(shí)施方案中，尿素酶被缺失。在一些實(shí)施方案中，參與精氨酸分解代謝的一種或更多種其他基因被突變或缺失。

必需基因和營養(yǎng)缺陷型

如本文使用的，術(shù)語“必需基因”指對細(xì)胞生長和/或存活所必需的基因。細(xì)菌必需基因是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，并且可以通過基因的定向缺失和/或隨機(jī)誘變和篩選來鑒定(參見，例如，zhang和lin，2009,deg5.0,adatabaseofessentialgenesinbothprokaryotesandeukaryotes,nucl.acidsres.,37:d455-d458和gerdes等，essentialgenesonmetabolicmaps,curr.opin.biotechnol.,17(5):448-456，其各自的全部內(nèi)容通過引用明確地并入本文)。

“必需基因”可取決于生物體在其內(nèi)生活的情形和環(huán)境。例如，必需基因的突變、修飾或切除可導(dǎo)致本公開內(nèi)容的重組細(xì)菌變?yōu)闋I養(yǎng)缺陷型。營養(yǎng)缺陷型修飾旨在使細(xì)菌在對存活或生長所必需的外源添加營養(yǎng)物質(zhì)的不存在下死亡，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈ιa(chǎn)該必需營養(yǎng)物質(zhì)所需的基因。

營養(yǎng)缺陷型修飾旨在使細(xì)菌在對存活或生長所必需的外源添加營養(yǎng)物質(zhì)的不存在下死亡，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈Ξa(chǎn)生該必需營養(yǎng)物質(zhì)所需的基因。在一些實(shí)施方案中，本文描述的任何遺傳工程化的細(xì)菌還包含對細(xì)胞存活和/或生長所需的基因中的缺失或突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，必需基因是dna合成基因，例如thya。在另一個(gè)實(shí)施方案中，必需基因是細(xì)胞壁合成基因，例如dapa。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，必需基因是氨基酸基因，例如sera或meta?？砂邢蚣?xì)胞存活和/或生長所需的任何基因，包括但不限于cyse、glna、ilvd、leub、lysa、sera、meta、glya、hisb、ilva、phea、proa、thrc、trpc、tyra、thya、uraa、dapa、dapb、dapd、dape、dapf、flhd、metb、metc、proab和thi1，只要在細(xì)菌中不產(chǎn)生相應(yīng)的野生型基因產(chǎn)物。例如，胸腺嘧啶是細(xì)菌細(xì)胞生長所需的核酸；在它的不存在下，細(xì)菌經(jīng)歷細(xì)胞死亡。thya基因編碼胸苷酸(thimidylate)合成酶，一種通過將dump轉(zhuǎn)化為dtmp來催化胸腺嘧啶合成中的第一步的酶(sat等，2003)。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的細(xì)菌細(xì)胞是thya營養(yǎng)缺陷型，其中thya基因被缺失和/或被不相關(guān)基因替代。僅有當(dāng)例如通過在體外向生長培養(yǎng)基中添加胸腺嘧啶而存在足夠量的胸腺嘧啶時(shí)，或者在體內(nèi)人類消化道中天然存在的高胸腺嘧啶水平存在下，thya營養(yǎng)缺陷型才能生長。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的細(xì)菌細(xì)胞是在當(dāng)細(xì)菌存在于哺乳動(dòng)物消化道中時(shí)被補(bǔ)充的基因中的營養(yǎng)缺陷型。在沒有足夠量的胸腺嘧啶的情況下，thya營養(yǎng)缺陷型死亡。在一些實(shí)施方案中，營養(yǎng)缺陷型修飾用于確保，細(xì)菌細(xì)胞在營養(yǎng)缺陷型基因產(chǎn)物的不存在下(例如，腸外)不能存活。

二氨基庚二酸(dap)是在賴氨酸生物合成途徑內(nèi)合成的氨基酸，并且是細(xì)菌細(xì)胞壁生長所需的(meadow等，1959；clarkson等，1971)。在一些實(shí)施方案中，本文描述的任何遺傳工程化的細(xì)菌是dapd營養(yǎng)缺陷型，其中dapd被缺失和/或被不相關(guān)基因替代。僅有當(dāng)例如通過在體外向生長培養(yǎng)基中添加dap而存在足夠量的dap時(shí)，dapd營養(yǎng)缺陷型才能生長。在沒有足夠量的dap的情況下，dapd營養(yǎng)缺陷型死亡。在一些實(shí)施方案中，營養(yǎng)缺陷型修飾用于確保，細(xì)菌細(xì)胞在營養(yǎng)缺陷型基因產(chǎn)物的不存在下(例如，腸外)不能存活。

在其他實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的遺傳工程化的細(xì)菌是uraa營養(yǎng)缺陷型，其中uraa被缺失和/或被不相關(guān)基因替代。uraa基因編碼uraa，一種促進(jìn)嘧啶尿嘧啶(pyrimidineuracil)吸收和隨后代謝的膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(andersen等，1995)。僅有當(dāng)例如通過在體外向生長培養(yǎng)基中添加尿嘧啶而存在足夠量的尿嘧啶時(shí)，uraa營養(yǎng)缺陷型才能生長。在沒有足夠量的尿嘧啶的情況下，uraa營養(yǎng)缺陷型死亡。在一些實(shí)施方案中，營養(yǎng)缺陷型修飾用于確保，細(xì)菌在營養(yǎng)缺陷型基因產(chǎn)物的不存在下(例如，腸外)不能存活。

在復(fù)雜的群落中，細(xì)菌共有dna是可能的。在非常罕見的情形下，營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌菌株可以從非營養(yǎng)缺陷型菌株接受dna，這修復(fù)基因組缺失并永久拯救營養(yǎng)缺陷型。因此，對具有多于一種營養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌菌株進(jìn)行工程化可以大大減少dna轉(zhuǎn)運(yùn)將發(fā)生足夠多次來拯救營養(yǎng)缺陷型的可能性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包含細(xì)胞存活和/或生長所需的兩種或更多種基因中的缺失或突變。

必需基因的其他實(shí)例包括但不限于yhbv、yagg、hemb、secd、secf、ribd、ribe、thil、dxs、ispa、dnax、adk、hemh、lpxh、cyss、fold、rplt、infc、thrs、nade、gapa、yeaz、asps、args、pgsa、yefm、metg、fole、yejm、gyra、nrda、nrdb、folc、accd、fabb、gltx、liga、zipa、dape、dapa、der、hiss、ispg、suhb、tada、acps、era、rnc、ftsb、eno、pyrg、chpr、lgt、fbaa、pgk、yqgd、metk、yqgf、plsc、ygit、pare、ribb、cca、ygjd、tdcf、yral、yiha、ftsn、muri、murb、bira、sece、nusg、rplj、rpll、rpob、rpoc、ubia、plsb、lexa、dnab、ssb、alsk、gros、psd、orn、yjee、rpsr、chps、ppa、vals、yjgp、yjgq、dnac、ribf、lspa、isph、dapb、fola、imp、yabq、ftsl、ftsi、mure、murf、mray、murd、ftsw、murg、murc、ftsq、ftsa、ftsz、lpxc、secm、seca、can、folk、heml、yadr、dapd、map、rpsb、infb、nusa、ftsh、obge、rpma、rplu、ispb、mura、yrbb、yrbk、yhbn、rpsi、rplm、degs、mred、mrec、mreb、accb、accc、yrdc、def、fmt、rplq、rpoa、rpsd、rpsk、rpsm、entd、mrdb、mrda、nadd、hlepb、rpoe、pssa、yfio、rpls、trmd、rpsp、ffh、grpe、yfjb、csra、ispf、ispd、rplw、rpld、rplc、rpsj、fusa、rpsg、rpsl、trps、yrff、asd、rpoh、ftsx、ftse、ftsy、frr、dxr、ispu、rfak、kdta、coad、rpmb、dfp、dut、gmk、spot、gyrb、dnan、dnaa、rpmh、rnpa、yidc、tnab、glms、glmu、wzye、hemd、hemc、yigp、ubib、ubid、hemg、secy、rplo、rpmd、rpse、rplr、rplf、rpsh、rpsn、rple、rplx、rpln、rpsq、rpmc、rplp、rpsc、rplv、rpss、rplb、cdsa、yael、yaet、lpxd、fabz、lpxa、lpxb、dnae、acca、tils、pros、yaff、tsf、pyrh、ola、rlpb、leus、lnt、glns、flda、cyda、infa、cydc、ftsk、lola、sers、rpsa、msba、lpxk、kdsb、mukf、muke、mukb、asns、faba、mvin、rne、yceq、fabd、fabg、acpp、tmk、holb、lolc、lold、lole、purb、ymfk、mine、mind、pth、rsa、ispe、lolb、hema、prfa、prmc、kdsa、topa、riba、fabi、racr、dica、ydfb、tyrs、ribc、ydil、phet、phes、yhhq、bcsb、glyq、yibj和dgpsa。其他必需基因是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的遺傳工程化的細(xì)菌是合成的配體依賴性必需基因(slide)細(xì)菌細(xì)胞。slide細(xì)菌細(xì)胞是在一種或更多種必需基因中具有突變的合成的營養(yǎng)缺陷型，其僅在特定配體存在下生長(參見lopez和anderson“syntheticauxotrophswithligand-dependentessentialgenesforabl21(de3biosafetystrain,”acssyntheticbiology(2015)doi:10.1021/acssynbio.5b00085，其全部內(nèi)容通過引用明確地并入本文)。

在一些實(shí)施方案中，slide細(xì)菌細(xì)胞包含必需基因中的突變。在一些實(shí)施方案中，必需基因選自由以下組成的組：phes、dnan、tyrs、metg和adk。在一些實(shí)施方案中，必需基因是包含一個(gè)或更多個(gè)以下突變的dnan：h191n、r240c、i317s、f319v、l340t、v347i和s345c。在一些實(shí)施方案中，必需基因是包含突變h191n、r240c、i317s、f319v、l340t、v347i和s345c的dnan。在一些實(shí)施方案中，必需基因是包含一個(gè)或更多個(gè)以下突變的phes：f125g、p183t、p184a、r186a和i188l。在一些實(shí)施方案中，必需基因是包含突變f125g、p183t、p184a、r186a和i188l的phes。在一些實(shí)施方案中，必需基因是包含一個(gè)或更多個(gè)以下突變的tyrs：l36v、c38a和f40g。在一些實(shí)施方案中，必需基因是包含突變l36v、c38a和f40g的tyrs。在一些實(shí)施方案中，必需基因是包含一個(gè)或更多個(gè)以下突變的metg：e45q、n47r、i49g和a51c。在一些實(shí)施方案中，必需基因是包含突變e45q、n47r、i49g和a51c的metg。在一些實(shí)施方案中，必需基因是包含一個(gè)或更多個(gè)以下突變的adk：i4l、l5i和l6g。在一些實(shí)施方案中，必需基因是包含突變i4l、l5i和l6g的adk。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌被配體補(bǔ)充。在一些實(shí)施方案中，配體選自由以下組成的組：苯并噻唑、吲哚、2-氨基苯并噻唑、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸和l-組氨酸甲酯。例如，包含metg中的突變(e45q、n47r、i49g和a51c)的細(xì)菌細(xì)胞被苯并噻唑、吲哚、2-氨基苯并噻唑、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸或l-組氨酸甲酯補(bǔ)充。包含dnan中的突變(h191n、r240c、i317s、f319v、l340t、v347i和s345c)的細(xì)菌細(xì)胞被苯并噻唑、吲哚或2-氨基苯并噻唑補(bǔ)充。包含phes中的突變(f125g、p183t、p184a、r186a和i188l)的細(xì)菌細(xì)胞被苯并噻唑或2-氨基苯并噻唑補(bǔ)充。包含tyrs中的突變(l36v、c38a和f40g)的細(xì)菌細(xì)胞被苯并噻唑或2-氨基苯并噻唑補(bǔ)充。包含adk中的突變(i4l、l5i和l6g)的細(xì)菌細(xì)胞被苯并噻唑或吲哚補(bǔ)充。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含使其對配體為營養(yǎng)缺陷型的多于一種的突變必需基因。在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌細(xì)胞包含兩種必需基因中的突變。例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌細(xì)胞包含tyrs中的突變(l36v、c38a和f40g)和metg中的突變(e45q、n47r、i49g和a51c)。在其他實(shí)施方案中，細(xì)菌細(xì)胞包括三種必需基因中的突變。例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌細(xì)胞包含tyrs中的突變(l36v、c38a和f40g)、metg中的突變(e45q、n47r、i49g和a51c)和phes中的突變(f125g、p183t、p184a、r186a和i188l)。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是其必需基因使用圖39、49、62和63示出的阿拉伯糖系統(tǒng)替代的條件營養(yǎng)缺陷型。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的遺傳工程化的細(xì)菌是營養(yǎng)缺陷型，并且還包含殺死開關(guān)回路，諸如本文描述的殺死開關(guān)成分和系統(tǒng)中的任何一種。例如，重組細(xì)菌可以包含細(xì)胞存活和/或生長所需的必需基因中的缺失或突變，所述必需基因例如dna合成基因例如thya，細(xì)胞壁合成基因例如dapa和/或氨基酸基因例如sera或meta，并且還可以包含毒素基因，所述毒素基因由響應(yīng)于環(huán)境條件和/或信號(諸如描述的阿拉伯糖系統(tǒng))表達(dá)的一種或更多種轉(zhuǎn)錄活化物調(diào)節(jié)，或所述毒素基因由在感測外源環(huán)境條件和/或信號(諸如本文和圖39、40和50中描述的重組酶系統(tǒng))后表達(dá)的一種或更多種重組酶調(diào)節(jié)。其他實(shí)施方案被描述于以下中：wright等“geneguard：amodularplasmidsystemdesignforbiosafety，“acssyntheticbiology(2015)4:307-16，其全部內(nèi)容通過引用明確地并入本文)。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的遺傳工程化的化細(xì)菌是營養(yǎng)缺陷型，并且還包含殺死開關(guān)回路，諸如本文描述的殺死開關(guān)成分和系統(tǒng)中的任何一種、以及另一種生物安全系統(tǒng)，諸如條件性復(fù)制起點(diǎn)(conditionaloriginofreplication)(參見wright等，同上)。

在其他實(shí)施方案中，營養(yǎng)缺陷型修飾也可用于篩選消耗過量氨的突變細(xì)菌。在更具體的方面，營養(yǎng)缺陷型修飾可用于篩選通過過度產(chǎn)生精氨酸而消耗過量的氨的突變細(xì)菌。如本文描述的，參與精氨酸代謝的許多基因經(jīng)由其與argr的相互作用經(jīng)歷精氨酸的阻遏。astc基因啟動(dòng)子是獨(dú)特的，因?yàn)榕c轉(zhuǎn)錄阻遏物不同，精氨酸-argr復(fù)合物作為轉(zhuǎn)錄活化物起作用。astc編碼是產(chǎn)生氨的精氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(ast)途徑的第三種酶的琥珀酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和大腸桿菌中第一astcadbe操縱子(schneider等，1998)。在某些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌對于基因是營養(yǎng)缺陷型的，并且在astc啟動(dòng)子的控制下表達(dá)營養(yǎng)缺陷型基因產(chǎn)物。在這些實(shí)施方案中，營養(yǎng)缺陷型經(jīng)歷正反饋機(jī)制，并用于選擇通過過度產(chǎn)生精氨酸消耗過量的氨的突變細(xì)菌。正反饋營養(yǎng)缺陷型的非限制性實(shí)例示于圖33a和圖33b中。

遺傳調(diào)節(jié)回路

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含用于表達(dá)本文描述的構(gòu)建體的多層遺傳調(diào)節(jié)回路(參見，例如，美國臨時(shí)申請?zhí)?2/184,811，其通過引用以其整體并入本文)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于選擇過度產(chǎn)生精氨酸的遺傳工程化的細(xì)菌的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于選擇經(jīng)由旁路代謝途徑(例如，組氨酸生物合成途徑、甲硫氨酸生物合成途徑、賴氨酸生物合成途徑、天冬酰胺生物合成途徑、谷氨酰胺生物合成途徑和色氨酸生物合成途徑)消耗過量的氨的遺傳工程化的細(xì)菌的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子和argr調(diào)節(jié)的雙阻遏物活化遺傳調(diào)節(jié)回路的遺傳工程化的細(xì)菌。雙阻遏物活化遺傳調(diào)節(jié)回路可用于篩選降低氨或拯救營養(yǎng)缺陷型的突變細(xì)菌。在一些構(gòu)建體中，高水平的精氨酸和由精氨酸產(chǎn)生的argr的活化可引起可檢測標(biāo)記物或細(xì)胞存活所需的必需基因的表達(dá)。

雙阻遏物活化調(diào)節(jié)回路包含第一argr和第二阻遏物，例如tet阻遏物。在這些實(shí)施方案的一個(gè)方面，argr抑制第二阻遏物的轉(zhuǎn)錄，所述第二阻遏物抑制可用于篩選消耗過量的氨的突變體的感興趣的特定基因的轉(zhuǎn)錄(例如，可檢測的產(chǎn)物)，和/或細(xì)胞存活所需的必需基因的轉(zhuǎn)錄。可以使用任何可檢測的產(chǎn)物，包括但不限于熒光素酶、β-半乳糖苷酶和熒光蛋白諸如gfp。在一些實(shí)施方案中，第二阻遏物是tet阻遏物蛋白(tetr)。在該實(shí)施方案中，包含野生型arg盒的argr阻遏型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)tetr的表達(dá)，并且tetr阻遏型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)至少一種感興趣的基因(例如，gfp)的表達(dá)。在argr結(jié)合(其在低精氨酸濃度下發(fā)生)的不存在下，tetr被轉(zhuǎn)錄，并且tetr阻遏gfp表達(dá)。在argr結(jié)合(其在高精氨酸濃度下發(fā)生)的存在下，tetr表達(dá)被阻遏，并且產(chǎn)生gfp。可用于這些實(shí)施方案中的其他第二阻遏物的實(shí)例包括但不限于arsr、ascg、laci、cscr、deor、dgor、frur、galr、gatr、ci、lexa、rafr、qacr和ptxs(us20030166191)。在一些實(shí)施方案中，將包含開關(guān)的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子經(jīng)歷誘變，并且通過過度產(chǎn)生精氨酸而降低氨的突變體基于可檢測產(chǎn)物的水平，例如當(dāng)可檢測產(chǎn)物發(fā)熒光時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)熒光活化細(xì)胞分選(facs)來選擇。

在一些實(shí)施方案中，感興趣的基因是細(xì)菌存活和/或生長所需的基因?？梢允褂萌魏未祟惢颍ǖ幌抻赾yse、glna、ilvd、leub、lysa、sera、meta、glya、hisb、ilva、phea、proa、thrc、trpc、tyra、thya、uraa、dapa、dapb、dapd、dape、dapf、flhd、metb、metc、proab和thi1，只要相應(yīng)的野生型基因已被去除或突變，從而不產(chǎn)生基因產(chǎn)物(除了在argr控制下)。在一些實(shí)施方案中，包含野生型arg盒的argr阻遏型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)tetr蛋白的表達(dá)，并且tetr阻遏型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)細(xì)菌的存活和/或生長所需的至少一種基因例如thya、uraa的表達(dá)(sat等，2003)。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是當(dāng)細(xì)菌存在于哺乳動(dòng)物消化道中時(shí)不被補(bǔ)充的基因中的營養(yǎng)缺陷型，其中所述基因由存在于細(xì)菌中的第二誘導(dǎo)型基因補(bǔ)充；第二基因的轉(zhuǎn)錄是argr阻遏型的，并在足夠高濃度的精氨酸存在下被誘導(dǎo)(從而補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷型基因)。在一些實(shí)施方案中，將包含雙阻遏物活化回路的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子經(jīng)歷誘變，并且降低過量的氨的突變體通過在存活和/或生長所需的基因產(chǎn)物的不存在下生長來選擇。在一些實(shí)施方案中，包含雙阻遏物活化回路的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子用于確保在高水平精氨酸的不存在下(例如腸外)細(xì)菌不能存活。

宿主-質(zhì)粒相互依賴性

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌還包含已被修飾為產(chǎn)生宿主-質(zhì)粒相互依賴性的質(zhì)粒。在某些實(shí)施方案中，相互依賴的宿主-質(zhì)粒平臺是geneguard(wright等，2015)。在一些實(shí)施方案中，geneguard質(zhì)粒包含(i)條件性復(fù)制起點(diǎn)，其中必需的復(fù)制引發(fā)蛋白以反式提供；(ii)由宿主經(jīng)由基因組易位拯救并且還與富集培養(yǎng)基相容的營養(yǎng)缺陷型修飾；和/或(iii)編碼廣譜毒素的核酸序列。通過使質(zhì)粒dna本身對不表達(dá)抗毒素的菌株(例如，野生型細(xì)菌)不利，毒素基因可用于針對質(zhì)粒擴(kuò)散選擇。在一些實(shí)施方案中，geneguard質(zhì)粒在沒有抗生素選擇的情況下穩(wěn)定至少100代。在一些實(shí)施方案中，geneguard質(zhì)粒不破壞宿主的生長。geneguard質(zhì)粒用于大大降低本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌中無意的質(zhì)粒繁殖。

相互依賴的宿主-質(zhì)粒平臺可以單獨(dú)使用或與其他生物安全機(jī)制諸如本文描述的那些(例如殺死開關(guān)、營養(yǎng)缺陷型)組合使用。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含geneguard質(zhì)粒。在其他實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含geneguard質(zhì)粒和/或一種或更多種殺死開關(guān)。在其他實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含geneguard質(zhì)粒和/或一種或更多種營養(yǎng)缺陷型。在又其他實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含geneguard質(zhì)粒、一種或更多種殺死開關(guān)和/或一種或更多種營養(yǎng)缺陷型。

殺死開關(guān)

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌還包含殺死開關(guān)(參見，例如，美國臨時(shí)申請?zhí)?2/183,935和62/263,329，其通過引用以其整體并入本文)。殺死開關(guān)旨在響應(yīng)于外部刺激主動(dòng)殺死工程化微生物。與營養(yǎng)缺陷型突變不同，在營養(yǎng)缺陷型突變中細(xì)菌死亡是因?yàn)樗鼈內(nèi)狈Υ婊畋匦璧臓I養(yǎng)物質(zhì)，殺死開關(guān)由環(huán)境中誘導(dǎo)微生物內(nèi)引起細(xì)胞死亡的毒性分子產(chǎn)生的特定的因素觸發(fā)。

被工程化有殺死開關(guān)的細(xì)菌已被設(shè)計(jì)用于體外研究目的，例如以限制生物燃料生產(chǎn)微生物在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境外的擴(kuò)散。為了體內(nèi)施用以治療疾病或紊亂而工程化的細(xì)菌也可被編程為在一種或更多種異源基因例如治療基因的表達(dá)和遞送之后的特定時(shí)間死亡，或者在受試者經(jīng)歷了治療效果之后死亡。例如，在一些實(shí)施方案中，殺死開關(guān)被活化以在arg^afbr的氧水平依賴性表達(dá)后的一定時(shí)間段之后殺死細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，殺死開關(guān)在arg^afbr的氧水平依賴性表達(dá)后，例如在精氨酸或瓜氨酸的產(chǎn)生之后以延遲方式被活化?？蛇x地，細(xì)菌可以被工程化為在細(xì)菌擴(kuò)散到疾病部位外之后死亡。具體地，殺死開關(guān)可以用于以下：防止微生物長期定殖受試者，防止微生物擴(kuò)散到受試者內(nèi)的感興趣區(qū)域外(例如腸外)，或防止微生物擴(kuò)散離開受試者進(jìn)入環(huán)境(例如，通過受試者的糞便擴(kuò)散到環(huán)境中)?？捎糜跉⑺篱_關(guān)中的此類毒素的實(shí)例包括但不限于細(xì)菌素、細(xì)胞溶素和通過裂解細(xì)胞膜、降解細(xì)胞dna或其他機(jī)制引起細(xì)胞死亡的其他分子。此類毒素可以單獨(dú)使用或組合使用。控制其生產(chǎn)的開關(guān)可以基于例如轉(zhuǎn)錄活化(撥動(dòng)開關(guān)(toggleswitch)；參見，例如，gardner等，2000)、翻譯(核糖核酸調(diào)節(jié)物(riboregulator))或dna重組(基于重組酶的開關(guān))，并且可以感測環(huán)境刺激諸如厭氧或活性氧類(reactiveoxygenspecies)。這些開關(guān)可以被單環(huán)境因素活化，或者可需要以and、or、nand和nor邏輯配置的數(shù)種活化物來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。例如，通過四環(huán)素、異丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)和阿拉伯糖來活化and核糖核酸調(diào)節(jié)物開關(guān)，以誘導(dǎo)細(xì)胞溶素的表達(dá)，這使細(xì)胞膜透化并殺死細(xì)胞。iptg誘導(dǎo)內(nèi)溶素(endolysin)和穿孔素(holin)mrna的表達(dá)，然后通過添加阿拉伯糖和四環(huán)素使內(nèi)溶素和穿孔素去阻遏。所有三種誘導(dǎo)物必須存在才能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。殺死開關(guān)的實(shí)例在本領(lǐng)域中是已知的(callura等，2010)。在一些實(shí)施方案中，殺死開關(guān)被活化，以在arg^afbr的氧水平依賴性表達(dá)后一定時(shí)間段之后殺死細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，殺死開關(guān)在氧依賴于arg^afbr的氧水平依賴性表達(dá)后以延遲方式被活化。

殺死開關(guān)可以被設(shè)計(jì)為使得毒素響應(yīng)于環(huán)境條件或外部信號而產(chǎn)生(例如，細(xì)菌響應(yīng)于外部信號而被殺死)，或者可選地設(shè)計(jì)為使得在環(huán)境條件不再存在或外部信號停止后產(chǎn)生毒素。

因此，在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的遺傳工程化的細(xì)菌還被編程為在感測到例如在低氧環(huán)境中的外源環(huán)境信號之后死亡。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的遺傳工程化的細(xì)菌，例如表達(dá)arg^afbr和阻遏物argr的細(xì)菌，包含編碼一種或更多種重組酶的一種或更多種基因，所述基因的表達(dá)響應(yīng)于環(huán)境條件或信號而被誘導(dǎo)，且引起一個(gè)或更多個(gè)重組事件，這最終導(dǎo)致殺死細(xì)胞的毒素的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)重組事件是編碼細(xì)菌毒素的反向異源基因(invertedheterologousgene)的te翻轉(zhuǎn)，然后在所述基因被第一重組酶翻轉(zhuǎn)之后組成型表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌毒素的組成型表達(dá)殺死遺傳工程化的細(xì)菌。在這些類型的殺死開關(guān)系統(tǒng)中，在工程化細(xì)菌細(xì)胞感測到外源環(huán)境條件并表達(dá)感興趣的異源基因后，重組細(xì)菌細(xì)胞不再存活。

在其中本公開內(nèi)容的遺傳工程化的細(xì)菌，例如表達(dá)arg^afbr和阻遏物argr的細(xì)菌，響應(yīng)于環(huán)境條件或信號表達(dá)一種或更多種重組酶，引起至少一個(gè)重組事件的另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還響應(yīng)于外源環(huán)境條件或信號表達(dá)編碼抗毒素的異源基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)重組事件是通過第一重組酶翻轉(zhuǎn)編碼細(xì)菌毒素的反向異源基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼細(xì)菌毒素的反向異源基因位于第一正向重組酶識別序列和第一反向重組酶識別序列之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼細(xì)菌毒素的異源基因在被第一重組酶翻轉(zhuǎn)之后被組成型表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗毒素抑制毒素的活性，由此延遲遺傳工程化的細(xì)菌的死亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)外源環(huán)境條件不再存在時(shí)，當(dāng)編碼抗毒素的異源基因不再表達(dá)時(shí)，遺傳工程化的細(xì)菌被細(xì)菌毒素殺死。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)重組事件是通過第一重組酶翻轉(zhuǎn)編碼第二重組酶的反向異源基因，隨后通過第二重組酶翻轉(zhuǎn)編碼細(xì)菌毒素的反向異源基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼第二重組酶的反向異源基因位于第一正向重組酶識別序列和第一反向重組酶識別序列之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼細(xì)菌毒素的反向異源基因位于第二正向重組酶識別序列和第二反向重組酶識別序列之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼第二重組酶的異源基因在其被第一重組酶翻轉(zhuǎn)之后被組成型表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼細(xì)菌毒素的異源基因在其被第二重組酶翻轉(zhuǎn)之后被組成型表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌被細(xì)菌毒素殺死。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳工程化細(xì)菌還響應(yīng)于外源環(huán)境條件表達(dá)編碼抗毒素的異源基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)外源環(huán)境條件存在時(shí)，抗毒素抑制毒素的活性，由此延遲遺傳工程化的細(xì)菌的死亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)外源環(huán)境條件不再存在時(shí)，當(dāng)編碼抗毒素的異源基因不再表達(dá)時(shí)，遺傳工程化的細(xì)菌被細(xì)菌毒素殺死。

在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)重組事件是通過第一重組酶翻轉(zhuǎn)編碼第二重組酶的反向異源基因，隨后通過第二重組酶翻轉(zhuǎn)編碼第三重組酶的反向異源基因，隨后通過第三重組酶翻轉(zhuǎn)編碼細(xì)菌毒素的反向異源基因。

在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)重組事件是通過第一重組酶翻轉(zhuǎn)編碼第一切除酶的反向異源基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼第一切除酶的反向異源基因位于第一正向重組酶識別序列和第一反向重組酶識別序列之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼第一切除酶的異源基因在其被第一重組酶翻轉(zhuǎn)之后被組成型表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一切除酶切除第一必需基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，編程的重組細(xì)菌細(xì)胞在切除第一必需基因之后是不存活的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，第一重組酶還翻轉(zhuǎn)編碼第二切除酶的反向異源基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中編碼第二切除酶的反向異源基因位于第二正向重組酶識別序列和第二反向重組酶識別序列之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼第二切除酶的異源基因在其被第一重組酶翻轉(zhuǎn)之后被組成型表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)谝槐匦杌蚝偷诙匦杌騼烧弑磺谐龝r(shí)，遺傳工程化的細(xì)菌死亡或不再存活。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)谝槐匦杌虮磺谐虻诙匦杌虮坏谝恢亟M酶切除時(shí)，遺傳工程化的細(xì)菌死亡或不再存活。

在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌在至少一個(gè)重組事件發(fā)生之后死亡。在另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌在至少一個(gè)重組事件發(fā)生之后不再存活。

在這些實(shí)施方案中的任一個(gè)中，重組酶可以是選自由以下組成的組的重組酶：bxbi、phic31、tp901、bxbi、phic31、tp901、hk022、hp1、r4、int1、int2、int3、int4、int5、int6、int7、int8、int9、int10、int11、int12、int13、int14、int15、int16、int17、int18、int19、int20、int21、int22、int23、int24、int25、int26、int27、int28、int29、int30、int31、int32、int33和int34、或其生物學(xué)活性片段。

在以上描述的殺死開關(guān)回路中，毒素在環(huán)境因素或信號的存在下被產(chǎn)生。在殺死開關(guān)回路的另一方面，毒素可在環(huán)境因素的存在下被阻遏(未產(chǎn)生)，且然后在環(huán)境條件或外部信號不再存在后被產(chǎn)生。在其中毒素在外部因素或信號的存在下被阻遏(并且在外部信號被去除后被活化)的示例性殺死開關(guān)示于圖39、40、62和63中。本公開內(nèi)容提供了重組細(xì)菌細(xì)胞，所述重組細(xì)菌細(xì)胞在感測到外源環(huán)境中的阿拉伯糖或其他糖后表達(dá)一種或更多種異源基因。在這方面，重組細(xì)菌細(xì)胞包含編碼arac轉(zhuǎn)錄因子的arac基因、以及在arabad啟動(dòng)子控制下的一種或更多種基因。在阿拉伯糖的不存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子采用阻遏在arabad啟動(dòng)子控制下的基因轉(zhuǎn)錄的構(gòu)象。在阿拉伯糖的存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)歷構(gòu)象變化，這允許其結(jié)合并活化arabad啟動(dòng)子，這誘導(dǎo)所需基因的表達(dá)。

因此，在其中一種或更多種異源基因在感測到外源環(huán)境中的阿拉伯糖后表達(dá)的一些實(shí)施方案中，一種或更多種異源基因直接或間接在arabad啟動(dòng)子的控制下。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)的異源基因選自以下一種或更多種：異源治療基因、編碼抗毒素的異源基因、編碼阻遏物蛋白或多肽例例如tetr阻遏物的異源基因、編碼在細(xì)菌細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的必需蛋白的異源基因、和/或編碼調(diào)節(jié)蛋白或多肽的異源基因。

阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，包括para、parab、parac和parabad。在一個(gè)實(shí)施方案中，阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來自大腸桿菌。在一些實(shí)施方案中，parac啟動(dòng)子和parabad啟動(dòng)子作為雙向啟動(dòng)子起作用，其中parabad啟動(dòng)子在一個(gè)方向上控制異源基因的表達(dá)，并且parac(非常接近于parabad啟動(dòng)子并且在parabad啟動(dòng)子的相對鏈上)在另一個(gè)方向上控制異源基因表達(dá)。在阿拉伯糖的存在下，誘導(dǎo)來自兩種啟動(dòng)子的兩種異源基因的轉(zhuǎn)錄。然而，在阿拉伯糖的不存在下，不誘導(dǎo)來自兩種啟動(dòng)子的兩種異源基因的轉(zhuǎn)錄。

在本公開內(nèi)容的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的工程化細(xì)菌包含具有至少以下序列的殺死開關(guān)：被可操作地連接至編碼四環(huán)素阻遏物蛋白(tetr)的異源基因的parabad啟動(dòng)子、被可操作地連接至編碼arac轉(zhuǎn)錄因子的異源基因的parac啟動(dòng)子、以及被可操作地連接至由四環(huán)素阻遏物蛋白阻遏的啟動(dòng)子(ptetr)的編碼細(xì)菌毒素的異源基因。在阿拉伯糖的存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子活化parabad啟動(dòng)子，這活化tetr蛋白的轉(zhuǎn)錄，tetr蛋白又阻遏毒素的轉(zhuǎn)錄。然而，在阿拉伯糖的不存在下，arac抑制由parabad啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，并且不表達(dá)tetr蛋白。在這種情況下，異源毒素基因的表達(dá)被活化，并且表達(dá)毒素。毒素在重組細(xì)菌細(xì)胞中形成，且重組細(xì)菌細(xì)胞被殺死。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼arac轉(zhuǎn)錄因子的arac基因在組成型啟動(dòng)子的控制下，并且因此被組成型表達(dá)。

在本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)菌細(xì)胞還包含在組成型啟動(dòng)子控制下的抗毒素。在這種情況下，在阿拉伯糖的存在下，毒素不被表達(dá)是由于tetr蛋白的阻遏，且抗毒素蛋白在細(xì)胞中形成。然而，在阿拉伯糖的不存在下，tetr蛋白不被表達(dá)，并且毒素的表達(dá)被誘導(dǎo)。毒素開始在重組細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)形成。在毒素蛋白以與細(xì)胞中抗毒素蛋白相同或比其更高的量存在后，重組細(xì)菌細(xì)胞不再存活，并且重組細(xì)菌細(xì)胞將被毒素殺死。

在本公開內(nèi)容的另一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)菌細(xì)胞還包含在parabad啟動(dòng)子控制下的抗毒素。在這種情況下，在阿拉伯糖的存在下，tetr和抗毒素被表達(dá)，抗毒素在細(xì)胞中形成，且毒素不被表達(dá)是由于被tetr蛋白阻遏。然而，在阿拉伯糖的不存在下，tetr蛋白和抗毒素兩者都不表達(dá)，并且毒素的表達(dá)被誘導(dǎo)。毒素開始在重組細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)形成。在毒素蛋白被表達(dá)后，重組細(xì)菌細(xì)胞不再存活，且重組細(xì)菌細(xì)胞將被毒素殺死。

在本公開內(nèi)容的另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的工程化細(xì)菌包含具有至少以下序列的殺死開關(guān)：被可操作地連接至編碼重組細(xì)菌細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)(和存活所需)的必需多肽的異源基因的parabad啟動(dòng)子、和被可操作地連接至編碼arac轉(zhuǎn)錄因子的異源基因的parac啟動(dòng)子。在阿拉伯糖的存在下，arac轉(zhuǎn)錄因子活化parabad啟動(dòng)子，這活化編碼必需多肽的異源基因的轉(zhuǎn)錄，允許重組細(xì)菌細(xì)胞存活。然而，在阿拉伯糖的不存在下，arac抑制由parabad啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，并且存活所需的必需蛋白不被表達(dá)。在這種情況下，重組細(xì)菌細(xì)胞在阿拉伯糖的不存在下死亡。在一些實(shí)施方案中，被可操作地連接至編碼重組細(xì)菌細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的必需多肽的異源基因的parabad啟動(dòng)子的序列可以與以上緊接著描述的tetr/毒素殺死開關(guān)系統(tǒng)聯(lián)合存在于細(xì)菌細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，被可操作地連接至編碼重組細(xì)菌細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的必需多肽的異源基因的parabad啟動(dòng)子的序列可以與以上緊接著描述的tetr/毒素/抗毒素殺死開關(guān)系統(tǒng)聯(lián)合存在于細(xì)菌細(xì)胞中。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的工程化細(xì)菌，例如表達(dá)arg^afbr和阻遏物argr的細(xì)菌，還包含編碼任何以上描述殺死開關(guān)回路的成分的基因。

在任何以上描述的實(shí)施方案中，細(xì)菌毒素選自由以下組成的組：細(xì)胞溶素、hok、fst、tisb、ldrd、kid、syme、mazf、flma、ibs、xcv2162、dinj、ccdb、mazf、pare、yafo、zeta、hicb、relb、yhav、yoeb、chpbk、hipa、小菌素b、小菌素b17、小菌素c、小菌素c7-c51、小菌素j25、小菌素colv、小菌素24、小菌素l、小菌素d93、小菌素l、小菌素e492、小菌素h47、小菌素i47、小菌素m、大腸桿菌素a、大腸桿菌素e1、大腸桿菌素k、大腸桿菌素n、大腸桿菌素u、大腸桿菌素b、大腸桿菌素ia、大腸桿菌素ib、大腸桿菌素5、大腸桿菌素10、大腸桿菌素s4、大腸桿菌素y、大腸桿菌素e2、大腸桿菌素e7、大腸桿菌素e8、大腸桿菌素e9、大腸桿菌素e3、大腸桿菌素e4、大腸桿菌素e6；大腸桿菌素e5、大腸桿菌素d、大腸桿菌素m和陰溝腸道菌素(cloacin)df13、或其生物學(xué)活性片段。

在任何以上描述的實(shí)施方案中，抗毒素選自由以下組成的組：抗細(xì)胞溶素、sok、rnaii、istr、rdld、kis、symr、maze、flmb、sib、ptarna1、yafq、ccda、maze、pard、yafn、epsilon、hica、rele、prlf、yefm、chpbi、hipb、mcce、mcce^ctd、mccf、cai、imme1、cki、cni、cui、cbi、iia、imm、cfi、im10、csi、cyi、im2、im7、im8、im9、im3、im4、imme6、陰溝腸道菌素免疫蛋白(cim)、imme5、immd和cmi、或其生物學(xué)活性片段。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌毒素對遺傳工程化的細(xì)菌是殺細(xì)菌的。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌毒素對遺傳工程化的細(xì)菌是抑細(xì)菌的。

在一些實(shí)施方案中，本文提供的工程化細(xì)菌具有包含一種或更多種核酸突變的精氨酸調(diào)節(jié)子，所述一種或更多種核酸突變降低或消除精氨酸介導(dǎo)的對編碼負(fù)責(zé)在精氨酸生物合成途徑中將谷氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸和/或中間副產(chǎn)物例如瓜氨酸的酶的每種操縱子的阻遏，使得突變體精氨酸調(diào)節(jié)子比來自在相同條件下的相同細(xì)菌亞型的未修飾的調(diào)節(jié)子產(chǎn)生更多的精氨酸和/或中間副產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體，例如arga^fbr。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含在用于編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂合酶和氨甲酰磷酸合酶的操縱子的每一種的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，由此使調(diào)節(jié)子去阻遏并增強(qiáng)精氨酸和/或中間副產(chǎn)物生物合成。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體。在一些實(shí)施方案中，精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體由氧水平依賴性啟動(dòng)子控制。在一些實(shí)施方案中，精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體由在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自富馬酸鹽和硝酸鹽還原酶調(diào)節(jié)物(fnr)啟動(dòng)子、精氨酸脫亞氨酶和硝酸鹽還原(anr)啟動(dòng)子和異化硝酸鹽呼吸調(diào)節(jié)物(dnr)啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體是arga^fbr。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含在用于編碼精氨酸生物合成酶的操縱子的每一種的至少一種arg盒中的一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，其中細(xì)菌包含編碼被突變?yōu)榕c來自在相同條件下的相同細(xì)菌亞型的野生型n-乙酰谷氨酸合成酶相比降低精氨酸反饋抑制的功能性n-乙酰谷氨酸合成酶的基因，其中編碼突變的n-乙酰谷氨酸合成酶的基因的表達(dá)由在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制，其中突變體精氨酸調(diào)節(jié)子包含一種或更多種操縱子，所述一種或更多種操縱子包含編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酸磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、氨甲酰磷酸合酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶和精氨基琥珀酸裂合酶的基因，以及其中每種操縱子包含一種或更多種突變的arg盒，其特征在于經(jīng)由argr阻遏物結(jié)合降低精氨酸介導(dǎo)的操縱子的阻遏的一種或更多種核酸突變，并保留足夠親和力的rna聚合酶結(jié)結(jié)合以促進(jìn)操縱子中的基因的轉(zhuǎn)錄。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是包含在用于編碼精氨酸生物合成酶的操縱子的每一種的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體的營養(yǎng)缺陷型。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在用于編碼精氨酸生物合成酶的操縱子的每一種的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體的遺傳工程化的細(xì)菌是選自以下的營養(yǎng)缺陷型：cyse,glna、ilvd、leub、lysa、sera、meta、glya、hisb、ilva、phea、proa、thrc、trpc、tyra、thya、uraa、dapa、dapb、dapd、dape、dapf、flhd、metb、metc、proab和thi1營養(yǎng)缺陷型。在一些實(shí)施方案中，工程化化的細(xì)菌具有多于一種營養(yǎng)缺陷型，例如，它們可以是δthya和δdapa營養(yǎng)缺陷型。

在一些實(shí)施方案中，包含在用于編碼精氨酸生物合成酶的操縱子的每一種的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體的遺傳工程化的細(xì)菌還包含殺死開關(guān)回路，諸如本文提供的任何殺死開關(guān)回路。例如，在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的編碼一種或更多種重組酶的一種或更多種基因和反向毒素序列。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含編碼抗毒素的一種或更多種基因。在一些實(shí)施方案中，工程化的細(xì)菌還包含在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的編碼一種或更多種重組酶的一種或更多種基因和一種或更多種反向切除基因，其中切除基因編碼缺失必需基因的酶。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含編碼抗毒素的一種或更多種基因。在一些實(shí)施方案中，工程化的細(xì)菌還包含在具有tetr阻遏物結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子控制下的編碼毒素的一種或更多種基因和在由阿拉伯糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(諸如parabad)控制下的編碼tetr的基因。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含編碼抗毒素的一種或更多種基因。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是包含在用于編碼精氨酸生物合成酶的操縱子的每一種的至少一種arg盒中包含一種或更多種核酸突變的突變體精氨酸調(diào)節(jié)子和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體的營養(yǎng)缺陷型，且還包含殺死開關(guān)回路，諸如本文描述的任何殺死開關(guān)回路。

在以上描述的遺傳工程化的細(xì)菌的一些實(shí)施方案中，編碼精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶的基因存在于細(xì)菌中的質(zhì)粒上，并且在質(zhì)粒上被可操作地連接至在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在其他實(shí)施方案中，編碼精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶的基因存在于細(xì)菌染色體中，并且在染色體中被可操作地連接至在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含突變體精氨酸阻遏物，所述突變體精氨酸阻遏物包含一種或更多種核酸突變，使得精氨酸阻遏物功能被減少或失活，或者遺傳工程化的細(xì)菌不具有精氨酸阻遏物(例如，精氨酸阻遏物基因已被缺失)，導(dǎo)致調(diào)節(jié)子的去阻遏和精氨酸和/或中間副產(chǎn)物生物合成的增強(qiáng)。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體。在一些實(shí)施方案中，精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體由氧水平依賴性啟動(dòng)子控制。在一些實(shí)施方案中，精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體由在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自富馬酸鹽和硝酸鹽還原酶調(diào)節(jié)物(fnr)啟動(dòng)子、精氨酸脫亞氨酶和硝酸鹽還原(anr)啟動(dòng)子和異化硝酸鹽呼吸調(diào)節(jié)物(dnr)啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體是arga^fbr。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含突變或缺失的精氨酸阻遏物和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸調(diào)節(jié)子，其中細(xì)菌包含編碼具有與來自在相同條件下的相同細(xì)菌亞型的野生型n-乙酰谷氨酸合成酶相比降低的精氨酸反饋抑制的功能性n-乙酰谷氨酸合成酶的基因，其中編碼精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶的基因的表達(dá)由被外源環(huán)境條件誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制，并且其中所述細(xì)菌已被遺傳工程化為缺乏功能性argr阻遏物。

在一些實(shí)施方案中，包含突變或缺失的精氨酸阻遏物和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體的遺傳工程化的細(xì)菌是營養(yǎng)缺陷型。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含突變或缺失的精氨酸阻遏物和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體的遺傳工程化的細(xì)菌是選自以下的營養(yǎng)缺陷型：cyse、glna、ilvd、leub、lysa、sera、meta、glya、hisb、ilva、phea、proa、thrc、trpc、tyra、thya、uraa、dapa、dapb、dapd、dape、dapf、flhd、metb、metc、proab和thi1營養(yǎng)缺陷型。在一些實(shí)施方案中，工程化的細(xì)菌具有多于一種營養(yǎng)缺陷型，例如，它們可以是δthya和δdapa營養(yǎng)缺陷型。

在一些實(shí)施方案中，包含突變或缺失的精氨酸阻遏物和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體的遺傳工程化的細(xì)菌還包含殺死開關(guān)回路，諸如本文提供的任何殺死開關(guān)回路。例如，在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的編碼一種或更多種重組酶的一種或更多種基因、和反向毒素序列。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含編碼抗毒素的一種或更多種基因。在一些實(shí)施方案中，工程化的細(xì)菌還包含在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的編碼一種或更多種重組酶的一種或更多種基因和一種或更多種反向切除基因，其中切除基因編碼缺失必需基因的酶。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含編碼抗毒素的一種或更多種基因。在一些實(shí)施方案中，工程化的細(xì)菌還包含在具有tetr阻遏物結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子下的編碼毒素的一種或更多種基因和在由阿拉伯糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(諸如parabad)控制下的編碼tetr的基因。在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌還包含編碼抗毒素的一種或更多種基因。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是包含突變或缺失的精氨酸阻遏物和精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合酶突變體的營養(yǎng)缺陷型，且還包括殺死開關(guān)回路，諸如本文描述的任何殺死開關(guān)回路。

在以上描述的遺傳工程化的細(xì)菌的一些實(shí)施方案中，編碼精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶的基因存在于細(xì)菌中的質(zhì)粒上，并且在質(zhì)粒上被可操作地連接至在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在其他實(shí)施方案中，編碼精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶的基因存在于細(xì)菌染色體中，并且在染色體中被可操作地連接至在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

氨轉(zhuǎn)運(yùn)

可以在本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌中將氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)或修飾為增強(qiáng)進(jìn)入細(xì)胞的氨轉(zhuǎn)運(yùn)。amtb是將氨轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌細(xì)胞中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌還包含天然amtb基因的多個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌還包含來自不同細(xì)菌物種的amtb基因。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包含來自不同細(xì)菌物種的amtb基因的多個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌中的天然amtb基因不被修飾。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌包含由其天然啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或比天然啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子，例如glnrs啟動(dòng)子、p(bla)啟動(dòng)子、或組成型啟動(dòng)子控制的amtb基因。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌中的天然amtb基因不被修飾，并且天然amtb基因的一個(gè)或更多個(gè)另外的拷貝被插入到基因組中在控制arga^fbr表達(dá)的相同誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子、或與控制arga^fbr表達(dá)的啟動(dòng)子不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的控制下。在替代實(shí)施方案中，天然amtb基因不被修飾，并且來自不同細(xì)菌物種的非天然amtb基因的拷貝被插入到基因組中在控制arga^fbr表達(dá)的相同誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子、或與控制arga^fbr表達(dá)的啟動(dòng)子不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的控制下。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌中的天然amtb基因不被修飾，并且天然amtb基因的一個(gè)或更多個(gè)另外的拷貝存在于細(xì)菌中的質(zhì)粒上并在控制arga^fbr表達(dá)的相同誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子、或與控制arga^fbr表達(dá)的啟動(dòng)子不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的控制下。在替代實(shí)施方案中，天然amtb基因不被修飾，并且來自不同細(xì)菌物種的非天然amtb基因的拷貝存在于細(xì)菌中的質(zhì)粒上并在控制arga^fbr表達(dá)的相同誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子、或與控制arga^fbr表達(dá)的啟動(dòng)子不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的控制下。

在一些實(shí)施方案中，誘變天然amtb基因，選擇表現(xiàn)出增加的氨轉(zhuǎn)運(yùn)的突變體，并且將誘變的amtb基因分離并插入到遺傳工程化的細(xì)菌中。在一些實(shí)施方案中，誘變天然amtb基因，選擇表現(xiàn)出增加的氨轉(zhuǎn)運(yùn)的突變體，并且那些突變體用于產(chǎn)生本發(fā)明的細(xì)菌。本文描述的氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白修飾可以存在于質(zhì)?；蛉旧w上。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是大腸桿菌nissle，且大腸桿菌nissle中的天然amtb基因不被修飾；天然大腸桿菌nissleamtb基因的一個(gè)或更多個(gè)另外的拷貝被插入到大腸桿菌nissle基因組中在控制arga^fbr表達(dá)的相同誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子或與控制arga^fbr表達(dá)的啟動(dòng)子不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的控制下。在替代實(shí)施方案中，大腸桿菌nissle中的天然amtb基因不被修飾，并且來自不同細(xì)菌例如植物乳桿菌的非天然amtb基因的拷貝被插入到大腸桿菌nissle基因組中在控制arga^fbr表達(dá)的相同誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子或與控制arga^fbr表達(dá)的啟動(dòng)子不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的控制下。

在一些實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌是大腸桿菌nissle，且大腸桿菌nissle中的天然amtb基因不被修飾；天然大腸桿菌nissleamtb基因的一個(gè)或更多個(gè)另外的拷貝存在于細(xì)菌中的質(zhì)粒上，并在控制arga^fbr表達(dá)的相同誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子或與控制arga^fbr表達(dá)的啟動(dòng)子不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的控制下。在替代實(shí)施方案中，大腸桿菌nissle中的天然amtb基因不被修飾，并且來自不同細(xì)菌例如植物乳桿菌的非天然amtb基因的拷貝存在于細(xì)菌中的質(zhì)粒上并在控制arga^fbr表達(dá)的相同誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如fnr啟動(dòng)子或與控制arga^fbr表達(dá)的啟動(dòng)子不同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的控制下。

藥物組合物和制劑

包含本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌的藥物組合物可用于治療、管理、改善和/或預(yù)防與高氨血癥相關(guān)的紊亂或與高氨血癥相關(guān)的癥狀。提供了本發(fā)明的藥物組合物，所述本發(fā)明的藥物組合物包含單獨(dú)或與預(yù)防劑、治療劑和/或藥學(xué)上可接受的載體組合的一種或更多種遺傳工程化的細(xì)菌。

在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含被工程化為包含本文描述的遺傳修飾例如突變體精氨酸調(diào)節(jié)子的細(xì)菌的一種物種、菌株或亞型。在替代實(shí)施方案中，藥物組合物包含各自被工程化為包含本文描述的遺傳修飾，例如突變體精氨酸調(diào)節(jié)子的細(xì)菌的兩種或更多種物種、菌株和/或亞型。

本發(fā)明的藥物組合物可使用一種或更多種生理學(xué)上可接受的載體(包括賦形劑和輔劑)以常規(guī)方式來配制，該載體有利于將活性成分加工為用于藥物使用的組合物。配制藥物組合物的方法是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，“remington'spharmaceuticalsciences”，mackpublishingco.，easton，pa)。在一些實(shí)施方案中，將藥物組合物經(jīng)歷壓片、凍干、直接壓制、常規(guī)混合、溶解、制粒、研磨、乳化、包封、包埋或噴霧干燥以形成片劑、粒劑、納米顆粒、納米膠囊、微膠囊、微片劑、小藥丸(pellets)、或粉末，其可以是腸溶包衣或未包衣的。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于施用途徑。

本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌可以被配制為以任何合適的劑型(例如，用于口服施用的液體、膠囊、小藥囊(sachet)、硬膠囊、軟膠囊、片劑、腸溶包衣片劑、懸浮粉劑、粒劑或基質(zhì)持續(xù)釋放制劑)和任何合適類型的施用(例如，口服、局部、立即釋放、脈沖釋放、延遲釋放或持續(xù)釋放)的藥物組合物。遺傳工程化的細(xì)菌的合適劑量量可以范圍從約10⁵個(gè)至10¹²個(gè)細(xì)菌。組合物可以每天、每周或每月一次或多次被施用。遺傳工程化的細(xì)菌可以被配制為包含一種或更多種藥學(xué)上可接受的載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、表面活性劑、中性或陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)復(fù)合物、脂質(zhì)體、滲透增強(qiáng)劑、載體化合物和其他藥學(xué)上可接受的載體或劑的藥物組合物。

本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌可以被局部施用并且被配制為呈軟膏、乳膏、經(jīng)皮貼劑、洗劑、凝膠、洗發(fā)劑、噴霧劑、氣霧劑、溶液、乳狀液的形式或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他形式。參見，例如，“remington'spharmaceuticalsciences”，mackpublishingco.，easton，pa。在一個(gè)實(shí)施方案中，對于不可噴霧的局部劑型，采用包含與局部應(yīng)用相容并且具有大于水的動(dòng)態(tài)粘度的載體或一種或更多種賦形劑的粘性至半固體或固體形式。合適的制劑包括但不限于可以與用于影響多種特性例如滲透壓的輔劑(例如，防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、緩沖液或鹽)一起滅菌或混合的溶液、懸浮液、乳狀劑、乳膏、軟膏劑、粉劑、搽劑(liniments)、油膏(salves)等。其他合適的局部劑型包括可噴霧氣霧劑制劑，其中活性成分與固體或液體惰性載體組合，被包裝于具有加壓的揮發(fā)物(例如，氣態(tài)推進(jìn)劑諸如氟利昂)的混合物或擠壓瓶中。保濕劑或濕潤劑也可被添加至藥物組合物和劑型中。此類另外的成分的實(shí)例是本領(lǐng)域熟知的。

本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌可以被口服施用并且被配制為片劑、丸劑、糖衣丸(dragees)、膠囊、液體、凝膠、糖漿劑(syrup)、漿體、懸浮液等。用于口服使用的藥物組合物可以使用固體賦形劑制造，任選地研磨所得的混合物，和(如果需要)在添加合適的輔劑之后，加工顆粒的混合物，以獲得片劑或糖衣丸芯。適合的賦形劑包括但不限于填充劑諸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素組合物諸如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；和/或生理上可接受的聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)或聚乙二醇(peg)。還可添加崩解劑，諸如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或其鹽諸如藻酸鈉。

片劑或膠囊可以與藥學(xué)上可接受的賦形劑通過常規(guī)方法一起制備，所述藥學(xué)上可接受的賦形劑諸如結(jié)合劑(例如，預(yù)膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、樹膠、高嶺土和黃蓍膠)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，鈣、鋁、鋅、硬脂酸、聚乙二醇、月桂基硫酸鈉、淀粉、苯甲酸鈉、l-亮氨酸、硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如，淀粉、馬鈴薯淀粉、羥基乙酸淀粉鈉、糖類、纖維素衍生物、二氧化硅粉末)；或潤濕劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。片劑可通過本領(lǐng)域熟知的方法包衣。可存在包衣殼，且常見的膜包括但不限于，聚丙交酯、聚乙醇酸、聚酸酐、其他可生物降解聚合物、藻酸鹽-聚賴氨酸-藻酸鹽(alginate-polylysine-alginate)(apa)、藻酸鹽-聚亞甲基-共-胍-藻酸鹽(a-pmcg-a)、羥基甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯(hydroxymethylacrylate-methylmethacrylate)(hema-mma)、多層hema-mma-maa、聚丙烯腈氯乙烯(polyacrylonitrilevinylchloride)(pan-pvc)、丙烯腈/甲代烯丙基磺酸鈉(acrylonitrile/sodiummethallylsulfonate)(an-69)、聚乙二醇/聚五甲基環(huán)五硅氧烷/聚二甲基硅氧烷(peg/pd5/pdms)、聚n,n-二甲基丙烯酰胺(pdmaam)、硅質(zhì)包封物、硫酸纖維素/藻酸鈉/聚亞甲基-共-胍(cs/a/pmcg)、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、藻酸鈣、k-卡拉膠-槐豆膠凝膠珠、結(jié)冷膠(gellan)-黃原膠珠、聚(丙交酯-共-乙交酯)、卡拉膠、淀粉聚酸酐、淀粉聚甲基丙烯酸酯、聚氨基酸和腸溶包衣聚合物。

在一些實(shí)施方案中，將遺傳工程化的細(xì)菌腸溶包衣以釋放到消化道或消化道的特定區(qū)域，例如大腸。從胃至結(jié)腸的典型ph曲線是約1-4(胃)、5.5-6(十二指腸)、7.3-8.0(回腸)和5.5-6.5(結(jié)腸)。在一些疾病中，可以修改ph曲線。在一些實(shí)施方案中，包衣在特定ph環(huán)境中降解以指定釋放部位。在一些實(shí)施方案中，使用至少兩種包衣。在一些實(shí)施方案中，外部包衣和內(nèi)部包衣在不同的ph水平降解。

用于口服施用的液體制劑可以采用溶液、糖漿劑、懸浮液或在使用之前用水或其他合適的媒介物構(gòu)成的干燥產(chǎn)品的形式。此類液體制劑可以與藥學(xué)上可接受的劑通過常規(guī)方法一起制備：所述藥學(xué)上可接受的劑諸如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿劑、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分級的植物油)；和防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制劑還可以適當(dāng)?shù)匕彌_鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。用于口服施用的制劑可以適當(dāng)?shù)乇慌渲朴糜诒景l(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌的緩慢釋放、控制釋放或持續(xù)釋放。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌可以例如與惰性稀釋劑或可同化的可食用載體一起口服施用。化合物也可以被封閉在硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓制為片劑，或直接摻入到受試者的飲食中。對于口服治療施用，化合物可以與賦形劑混合并以可攝入片劑、含服片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿劑、薄餅(wafers)等形式使用。為了通過除了腸胃外施用以外的方式施用本發(fā)明的化合物，可能需要將化合物用材料包衣或?qū)⒒衔锱c材料共同施用，以防止其失活。

在一些實(shí)施方案中，組合物被配制為經(jīng)由納米顆粒、納米膠囊、微膠囊或微片劑(其被腸溶包衣或未包衣)用于腸內(nèi)施用、空腸內(nèi)施用、十二指腸內(nèi)施用、回腸內(nèi)施用、胃分流施用或結(jié)腸內(nèi)施用。本發(fā)明的藥物組合物也可以使用例如常規(guī)栓劑基質(zhì)諸如可可脂或其他甘油酯被配制為直腸組合物諸如栓劑或保留灌腸劑。組合物可以是在油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳狀液，并且可以包含懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。

本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌可以被鼻內(nèi)施用，被配制為氣霧劑形式、噴霧劑、霧或液滴形式，并且以從加壓包裝或噴霧器呈現(xiàn)的氣霧劑噴霧的形式借助于合適的推進(jìn)劑(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體)方便地遞送。加壓氣霧劑劑量單位可以通過提供閥來確定遞送計(jì)量的量?？膳渲朴糜谠谖肫骰虼等肫?insufflator)中使用的(例如，明膠的)膠囊和藥筒，該膠囊和藥筒包含化合物和合適的粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌可以作為貯庫制劑被施用和配制。此類長效制劑可以通過植入或通過注射來施用。例如，可用合適的聚合的或疏水的材料(例如，作為可接受的油中的乳狀液)或離子交換樹脂配制組合物，或?qū)⑵渑渲瞥晌⑷艿难苌?例如，作為微溶的鹽)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供呈單一劑型的藥學(xué)上可接受的組合物。單一劑型可以呈液體或固體形式。單一劑型可以被直接施用至患者而不經(jīng)修改，或者可以在施用之前被稀釋或重構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，單一劑型可以以推注形式被施用，例如單次注射、單次口服劑量，包括包含多個(gè)片劑、膠囊、丸劑等的口服劑量。在替代實(shí)施方案中，單一劑型可以例如通過輸注在一定時(shí)間段內(nèi)被施用。

本發(fā)明的藥物組合物的單一劑型可以通過以下來制備：將藥物組合物分配為較小的等分試樣、分配到單劑量容器、分配為單劑量液體形式或單劑量固體形式，諸如片劑、粒劑、納米顆粒、納米膠囊、微膠囊、微片劑、小藥丸或粉末，其可以是腸溶包衣或未包衣的。呈固體形式的單一劑量可以在施用至患者之前通過加入液體(通常是無菌水或鹽水溶液)來重構(gòu)。

可以調(diào)整劑量方案以提供治療響應(yīng)。例如，可以在一次施用單次推注，可以在預(yù)定時(shí)間段內(nèi)施用幾個(gè)分開的劑量，或者可以如治療情況所指示的降低或增加劑量。劑量的規(guī)格由活性化合物的獨(dú)特特征和待實(shí)現(xiàn)的具體治療效果決定。劑量值可以隨著待緩解的狀況的類型和嚴(yán)重程度而變化。對于任何特定的受試者，可以根據(jù)個(gè)體需要和治療臨床醫(yī)師的專業(yè)判斷隨時(shí)間調(diào)整具體的劑量方案。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可以在受控釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)中遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用泵來實(shí)現(xiàn)受控或持續(xù)釋放。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用聚合物材料來實(shí)現(xiàn)本公開內(nèi)容的療法的受控或持續(xù)釋放(參見，例如，美國專利號5,989,463)。用于持續(xù)釋放制劑的聚合物的實(shí)例包括但不限于，聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(plg)、聚酸酐、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(pla)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)和聚原酸酯。用于持續(xù)釋放制劑中的聚合物可以是惰性的，不含可浸出(leachable)的雜質(zhì)，在儲(chǔ)存時(shí)是穩(wěn)定的、無菌的和可生物降解的。在一些實(shí)施方案中，控制釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)可以被置于預(yù)防或治療靶附近，因此僅需要全身劑量的一部分?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的技術(shù)。

本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌可以作為中性或鹽形式被施用和配制。藥學(xué)上可接受的鹽包括由陰離子形成的鹽，諸如源自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由陽離子形成的那些，諸如源自鈉、鉀、銨、鈣、鐵的氫氧化物(ferrichydroxides)、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些。

各成分單獨(dú)供應(yīng)或以單位劑型混合在一起供應(yīng)，例如作為在指示活性劑的量的氣密密封容器諸如安瓿或小藥囊中的干燥凍干粉末或無水濃縮物。如果施用的方式為通過注射，可以提供安瓿的無菌注射用水或鹽水，以便可以在施用之前混合各成分。

本發(fā)明的藥物組合物可以被包裝于指示活性劑的量的氣密密封容器，諸如安瓿或小藥囊中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或更多種藥物組合物作為在氣密密封的容器中的干燥滅菌的凍干粉末或無水濃縮物供應(yīng)，并且可以被重構(gòu)(例如用水或鹽水)為適當(dāng)?shù)臐舛纫杂糜谑┯弥潦茉囌?。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或更多種預(yù)防或治療劑或藥物組合物作為在儲(chǔ)存于2℃和8℃之間的氣密密封容器中的干燥的無菌凍干粉末供應(yīng)，并在被重構(gòu)之后1小時(shí)內(nèi)、3小時(shí)內(nèi)、5小時(shí)內(nèi)、6小時(shí)內(nèi)、12小時(shí)內(nèi)、24小時(shí)內(nèi)、48小時(shí)內(nèi)、72小時(shí)內(nèi)、或1周內(nèi)施用。凍干劑型可以包括冷凍保護(hù)劑，主要是0％-10％的蔗糖(最佳為0.5％-1.0％)。其他合適的冷凍保護(hù)劑包括海藻糖和乳糖。其他合適的疏松劑(bulkingagent)包括甘氨酸和精氨酸(其任一種可以以0％-0.05％的濃度被包含)及聚山梨醇酯-80(最佳地以0.005％-0.01％的濃度被包含)。另外的表面活性劑包括但不限于聚山梨醇酯20和brij表面活性劑。藥物組合物可以被制備為可注射溶液，并且還可以包含可用作佐劑的劑，諸如用于增加吸收或分散的那些，例如，透明質(zhì)酸酶。

劑量可以取決于幾個(gè)因素，包括疾病的嚴(yán)重程度和響應(yīng)性、施用途徑、治療時(shí)間(幾天至幾個(gè)月至幾年)、以及到改善疾病的時(shí)間。本文提供的化合物的毒性和治療功效可以通過細(xì)胞培養(yǎng)或動(dòng)物模型中的標(biāo)準(zhǔn)藥物程序來確定。例如，可以確定ld50、ed50、ec50和ic50，并且可以計(jì)算毒性和治療效果之間的劑量比值(ld50/ed50)作為治療指數(shù)?？梢允褂帽憩F(xiàn)出毒性副作用的組合物，其中仔細(xì)修改以使?jié)撛诘膿p傷最小化以降低副作用。劑量最初可以從細(xì)胞培養(yǎng)測定和動(dòng)物模型估計(jì)。從體外和體內(nèi)測定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制在人類中使用的劑量范圍。

治療方法

本發(fā)明的另一方面提供了治療與高氨血癥相關(guān)的疾病或紊亂的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于降低、改善或消除與這些疾病或紊亂相關(guān)的一種或更多種癥狀的方法。在一些實(shí)施方案中，紊亂是尿素循環(huán)障礙，諸如精氨基琥珀酸尿癥、精氨酸酶缺乏癥、氨甲酰磷酸合成酶缺乏癥、瓜氨酸血癥、n-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥。在替代實(shí)施方案中，該紊亂是肝臟疾病，諸如肝性腦病、急性肝衰竭或慢性肝衰竭；有機(jī)酸疾??；異戊酸尿癥；3-甲基巴豆酰甘氨酸尿癥；甲基丙二酸血癥；丙酸尿癥；脂肪酸氧化缺陷；肉堿循環(huán)缺陷；肉堿缺乏癥；β-氧化缺乏癥；賴氨酸尿性蛋白耐受不良；吡咯啉-5-羧酸合成酶缺乏癥；丙酮酸羧化酶缺乏癥；鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶缺乏癥；碳酸酐酶缺乏癥；高胰島素血癥-高氨血癥綜合征；線粒體疾??；丙戊酸療法；天冬酰胺酶療法；全腸胃外營養(yǎng)；用含甘氨酸溶液進(jìn)行膀胱鏡檢查；肺/骨髓移植后；門體分流；尿路感染；輸尿管擴(kuò)張；多發(fā)性骨髓瘤；化學(xué)療法；感染；神經(jīng)源性膀胱；或腸道細(xì)菌過度生長。在一些實(shí)施方案中，與其相關(guān)的癥狀包括但不限于癲癇、共濟(jì)失調(diào)、中風(fēng)樣病變、昏迷、精神病、視力損失、急性腦病、腦水腫以及嘔吐、呼吸性堿中毒和低體溫。

該方法可以包括用本文描述的細(xì)菌的至少一種遺傳工程化的物種、菌株或亞型制備藥物組合物，并將該藥物組合物以治療有效量施用至受試者。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌例如以液體懸浮液口服施用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌在凝膠帽中凍干并口服施用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌經(jīng)由飼管(feedingtube)或胃分流(gastricshunt)施用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌通過直腸施用，例如通過灌腸施用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌局部、腸內(nèi)、空腸內(nèi)、十二指腸內(nèi)、回腸內(nèi)和/或結(jié)腸內(nèi)施用。

在某些實(shí)施方案中，將藥物組合物施用至受試者降低受試者中的氨濃度。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法可以將受試者中的氨濃度與未治療或?qū)φ帐茉囌叩乃较啾冉档土酥辽偌s10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些實(shí)施方案中，通過比較在施用藥物組合物之前和之后的受試者中的氨濃度來測量降低。在一些實(shí)施方案中，治療或改善高氨血癥的方法允許狀況或紊亂的一種或更多種癥狀改善了至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。

在藥物組合物施用之前、期間和之后，可以在以下中測量受試者中的氨濃度：生物學(xué)樣品諸如血液、血清、血漿、尿液、糞便物、腹膜液、腸粘膜刮屑，從組織收集的樣品和/或從以下一個(gè)或更多個(gè)的內(nèi)含物收集的樣品：胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸和肛管。在一些實(shí)施方案中，該方法可包括施用本發(fā)明的組合物以將受試者中的氨濃度降低至不可檢測的水平，或比治療之前受試者的氨濃度的小約1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％或80％。

在某些實(shí)施方案中，包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子的遺傳工程化的細(xì)菌是大腸桿菌nissle。遺傳工程化的細(xì)菌可以在施用之后幾小時(shí)或幾天內(nèi)被破壞，例如被消化道道或血清中的防御因子(sonnenborn等，2009)，或者通過活化殺死開關(guān)。因此，包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子的藥物組合物可以以治療有效劑量和頻率被再施用。小鼠體內(nèi)nissle停留的長度示于圖27中。在替代實(shí)施方案中，遺傳工程化的細(xì)菌在施用之后數(shù)小時(shí)或數(shù)天內(nèi)不被破壞，并且可以在消化道繁殖并定殖。

藥物組合物可以單獨(dú)施用或與一種或更多種另外的治療劑組合施用，所述一種或更多種另外的治療劑包括但不限于，苯丁酸鈉、苯甲酸鈉和苯丁酸甘油酯酯。在選擇一種或更多種另外的治療劑中的重要考慮因素是，該劑應(yīng)該與本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌相容，例如，該劑必須不殺死細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物與食物一起施用。在替代實(shí)施方案中，藥物組合物在食用食物之前或之后施用。藥物組合物可以與一種或更多種膳食改變劑(dietarymodifications)例如低蛋白飲食和氨基酸補(bǔ)充劑組合施用?？梢曰谖蓙y的癥狀嚴(yán)重程度和進(jìn)展來選擇藥物組合物的劑量和施用頻率。治療臨床醫(yī)生可以選擇適當(dāng)?shù)闹委熡行┝亢?或施用頻率。

體內(nèi)治療

本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌可以在體內(nèi)例如在動(dòng)物模型中進(jìn)行評價(jià)?？梢允褂门c高氨血癥相關(guān)的疾病或狀況的任何合適的動(dòng)物模型(參見，例如，deignan等，2008；nicaise等，2008)，例如急性肝衰竭和高氨血癥的小鼠模型。這種急性肝衰竭和高氨血癥可以通過用巰基乙酰胺(thiolacetamide)(taa)處理來誘導(dǎo)(nicaise等，2008)。另一個(gè)示例性動(dòng)物模型是spf^ash(毛皮稀疏伴隨皮膚與毛發(fā)異常(sparsefurwithabnormalskinandhair))小鼠，其由于鳥氨酸轉(zhuǎn)氨基甲酰酶基因中的錯(cuò)義突變顯示升高的血漿氨水平(doolittle等，1974；hodges和rosenberg，1989)。本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌可以例如通過口服管飼施用至動(dòng)物，并且例如通過測量血液樣品中的氨和/或糞便樣品中的精氨酸、瓜氨酸或其他副產(chǎn)物來確定治療功效。

示例性實(shí)施方案

1.一種遺傳工程化的細(xì)菌，所述遺傳工程化的細(xì)菌包含精氨酸調(diào)節(jié)子，

其中所述細(xì)菌包含編碼具有與來自在相同條件下的相同細(xì)菌亞型的野生型n-乙酰谷氨酸合成酶相比降低的精氨酸反饋抑制的功能性n-乙酰谷氨酸合成酶的基因，其中編碼精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶的基因的表達(dá)由被外源環(huán)境條件誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制；且

其中所述細(xì)菌已被遺傳工程化為缺乏功能性argr。

2.根據(jù)實(shí)施方案1所述的細(xì)菌，其中控制所述精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶的表達(dá)的所述啟動(dòng)子在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)。

3.根據(jù)實(shí)施方案1或2中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中通常存在于相應(yīng)的野生型細(xì)菌中的功能性argr基因的每個(gè)拷貝已通過一個(gè)或更多個(gè)核苷酸缺失、插入或取代獨(dú)立地缺失或使其失活。

4.根據(jù)實(shí)施方案3所述的細(xì)菌，其中通常存在于相應(yīng)的野生型細(xì)菌中的功能性argr基因的每個(gè)拷貝已被缺失。

5.根據(jù)實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中通常存在于相應(yīng)的野生型細(xì)菌中的功能性argg基因的每個(gè)拷貝已通過一個(gè)或更多個(gè)核苷酸缺失、插入或取代獨(dú)立地缺失或使其失活。

6.根據(jù)實(shí)施方案5所述的細(xì)菌，其中通常存在于相應(yīng)野生型細(xì)菌中的功能性argg基因的每個(gè)拷貝已被缺失。

7.根據(jù)實(shí)施方案1-7中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中在誘導(dǎo)控制所述精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶的表達(dá)的啟動(dòng)子的條件下，存在于包含功能性arg盒的操縱子中并編碼精氨酸生物合成酶的每種基因的轉(zhuǎn)錄與在相同條件下的野生型細(xì)菌中的相應(yīng)基因相比被增加。

8.根據(jù)實(shí)施方案2-7中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是fnr啟動(dòng)子。

9.根據(jù)實(shí)施方案2-7中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶基因具有選自以下的dna序列：

a)seqidno:28，

b)除了冗余的遺傳密碼以外，編碼與由seqidno:28編碼的多肽相同的多肽的dna序列，以及

c)與a)或b)的dna序列具有至少80％同源性的dna序列。

10.根據(jù)實(shí)施方案1-9中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是非病原性細(xì)菌。

11.根據(jù)實(shí)施方案10所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是益生細(xì)菌。

12.根據(jù)實(shí)施方案10所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌選自由以下組成的組：擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭菌屬、埃希氏桿菌屬、乳桿菌屬和乳球菌屬。

13.根據(jù)實(shí)施方案12所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌菌株nissle。

14.根據(jù)實(shí)施方案2-13中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中編碼所述精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶的所述基因存在于所述細(xì)菌中的質(zhì)粒上，并且在所述質(zhì)粒上被可操作地連接至在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

15.根據(jù)實(shí)施方案2-13中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中編碼所述精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶的所述基因存在于所述細(xì)菌的染色體中，并且在所述染色體中被可操作地連接至在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

16.根據(jù)實(shí)施方案1-15中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是當(dāng)所述細(xì)菌存在于哺乳動(dòng)物消化道中時(shí)被補(bǔ)充的基因中的營養(yǎng)缺陷型。

17.根據(jù)實(shí)施方案16所述的細(xì)菌，其中哺乳動(dòng)物的消化道是人類的消化道。

18.一種藥學(xué)上可接受的組合物，所述藥學(xué)上可接受的組合物包含根據(jù)實(shí)施方案1-17中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌；和藥學(xué)上可接受的載體。

19.根據(jù)實(shí)施方案18所述的藥學(xué)上可接受的組合物，其中所述組合物被配制用于口服施用或直腸施用。

20.一種制備根據(jù)實(shí)施方案19所述的藥學(xué)上可接受的組合物的方法，所述方法包括以下步驟：

a)使根據(jù)實(shí)施方案1-17中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌在不誘導(dǎo)控制所述精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶的表達(dá)的所述啟動(dòng)子的條件下在生長培養(yǎng)基培養(yǎng)物中生長；

b)使所得的細(xì)菌與生長培養(yǎng)基分離；以及

c)將分離的細(xì)菌懸浮于藥學(xué)上可接受的載體中。

21.一種治療有相應(yīng)需要的受試者中的高氨血癥相關(guān)的紊亂或其癥狀的方法，所述方法包括將根據(jù)實(shí)施方案18所述的組合物施用至所述受試者持續(xù)足以減輕所述高氨血癥相關(guān)的紊亂的嚴(yán)重程度的時(shí)間段的步驟。

22.根據(jù)實(shí)施方案21所述的方法，其中所述高氨血癥相關(guān)的紊亂是尿素循環(huán)障礙。

23.根據(jù)實(shí)施方案22所述的方法，其中所述尿素循環(huán)障礙是精氨基琥珀酸尿癥、精氨酸酶缺乏癥、氨甲酰磷酸合成酶缺乏癥、瓜氨酸血癥、n-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥或鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥。

24.根據(jù)實(shí)施方案21所述的方法，其中所述高氨血癥相關(guān)的紊亂是肝臟疾??；有機(jī)酸疾??；異戊酸尿癥；3-甲基巴豆酰甘氨酸尿癥；甲基丙二酸血癥；丙酸尿癥；脂肪酸氧化缺陷；肉堿循環(huán)缺陷；肉堿缺乏癥；β-氧化缺乏癥；賴氨酸尿性蛋白耐受不良；吡咯啉-5-羧酸合成酶缺乏癥；丙酮酸羧化酶缺乏癥；鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶缺乏癥；碳酸酐酶缺乏癥；高胰島素血癥-高氨血癥綜合征；線粒體疾?。槐焖岑煼?；天冬酰胺酶療法；全腸胃外營養(yǎng)；用含甘氨酸溶液進(jìn)行膀胱鏡檢查；肺/骨髓移植后；門體分流；尿路感染；輸尿管擴(kuò)張；多發(fā)性骨髓瘤；化學(xué)療法；感染；神經(jīng)源性膀胱；或腸道細(xì)菌過度生長。

25.根據(jù)實(shí)施方案24所述的方法，其中所述肝臟疾病是肝性腦病、急性肝衰竭或慢性肝衰竭。

26.根據(jù)實(shí)施方案25所述的方法，其中所述高氨血癥相關(guān)的紊亂的癥狀選自由以下組成的組：癲癇、共濟(jì)失調(diào)、中風(fēng)樣病變、昏迷、精神病、視力喪失損失、急性腦病、腦水腫以及嘔吐、呼吸性堿中毒和低體溫。

27.一種遺傳工程化的細(xì)菌，所述遺傳工程化的細(xì)菌包含突變體精氨酸調(diào)節(jié)子，

其中所述細(xì)菌包含編碼被突變?yōu)榕c來自在相同條件下的相同細(xì)菌亞型的野生型n-乙酰谷氨酸合成酶相比降低精氨酸反饋抑制的功能性n-乙酰谷氨酸合成酶的基因，其中編碼突變的n-乙酰谷氨酸合成酶的所述基因的表達(dá)由在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制；

其中所述突變體精氨酸調(diào)節(jié)子包含一種或更多種操縱子，所述操縱子包含編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酸磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、氨甲酰磷酸合酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶和精氨基琥珀酸裂合酶的基因，且

其中除了包含編碼精氨基琥珀酸合酶的基因的操縱子以外的每種操縱子包含一種或更多種突變的arg盒，其特征在于降低經(jīng)由argr結(jié)合的精氨酸介導(dǎo)的操縱子的阻遏的一種或更多種核酸突變，并保留足夠親和力的rna聚合酶結(jié)合以促進(jìn)所述操縱子中的基因的轉(zhuǎn)錄。

28.根據(jù)實(shí)施方案27所述的遺傳工程化的細(xì)菌，其中包含編碼精氨基琥珀酸合酶的基因的操縱子包含一種或更多種突變的arg盒，其特征降低經(jīng)由argr結(jié)合的精氨酸介導(dǎo)的操縱子的阻遏的一種或更多種核酸突變，并保留足夠親和力的rna聚合酶結(jié)合以促進(jìn)所述精氨基琥珀酸合酶基因的轉(zhuǎn)錄。

29.根據(jù)實(shí)施方案27所述的遺傳工程化的細(xì)菌，其中包含編碼精氨基琥珀酸合酶的基因的操縱子包含調(diào)節(jié)所述精氨基琥珀酸合酶基因的轉(zhuǎn)錄的組成型活性啟動(dòng)子。

30.根據(jù)實(shí)施方案27-29中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中編碼功能性n-乙酰谷氨酸合成酶的基因被突變?yōu)榕c來自在相同條件下的相同細(xì)菌亞型的野生型n-乙酰谷氨酸合成酶相比降低精氨酸反饋抑制。

31.根據(jù)實(shí)施方案27-30中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中與來自在相同條件下的包含野生型精氨酸調(diào)節(jié)子的相同細(xì)菌亞型的細(xì)菌相比，argr結(jié)合被降低。

32.根據(jù)實(shí)施方案27中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中與在相同條件下的相應(yīng)的野生型細(xì)菌相比，降低經(jīng)由argr結(jié)合的精氨酸介導(dǎo)的阻遏增加了編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酸磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、氨甲酰磷酸合酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶和精氨基琥珀酸裂合酶的基因的每一種的轉(zhuǎn)錄。

33.根據(jù)實(shí)施方案28所述的細(xì)菌，其中與在相同條件下的相應(yīng)的野生型細(xì)菌相比，降低經(jīng)由argr結(jié)合的精氨酸介導(dǎo)的阻遏增加了編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酸磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、氨甲酰磷酸合酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶和精氨基琥珀酸裂合酶的基因的每一種的轉(zhuǎn)錄。

34.根據(jù)實(shí)施方案27所述的細(xì)菌，其中編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酸磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、氨甲酰磷酸合酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶和精氨基琥珀酸裂合酶的操縱子的每一種在所述操縱子的每種arg盒中包含一種或更多種核酸突變。

35.根據(jù)實(shí)施方案28所述的細(xì)菌，其中編碼精氨酸生物合成酶n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酸磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、氨甲酰磷酸合酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶和精氨基琥珀酸裂合酶的操縱子的每一種在所述操縱子中的每種arg盒中包含一種或更多種核酸突變。

36.根據(jù)實(shí)施方案27-35中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，所述細(xì)菌還包含編碼野生型鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的一種或更多種操縱子，其中編碼野生型鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的每種操縱子包含一種或更多種突變的arg盒，其特征在于降低經(jīng)由argr結(jié)合的精氨酸介導(dǎo)的操縱子的阻遏的一種或更多種核酸突變，并保留足夠親和力的rna聚合酶結(jié)合以促進(jìn)所述操縱子中的基因的轉(zhuǎn)錄。

37.根據(jù)實(shí)施方案27-36中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是fnr啟動(dòng)子。

38.根據(jù)實(shí)施方案27-37中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌另外包含編碼野生型n-乙酰谷氨酸合成酶的一種或更多種操縱子，其中編碼野生型n-乙酰谷氨酸合成酶的每種操縱子包含一種或更多種突變的arg盒，其特征在于降低經(jīng)由argr結(jié)合的精氨酸介導(dǎo)的操縱子的阻遏的一種或更多種核酸突變，并保留足夠親和力的rna聚合酶結(jié)合以促進(jìn)所述操縱子中的基因的轉(zhuǎn)錄；其中所述遺傳工程化的細(xì)菌不包含野生型n-乙酰谷氨酸合成酶啟動(dòng)子。

39.根據(jù)實(shí)施方案27-39中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中編碼n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酸磷酸還原酶、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥氨酸酶、氨甲酰磷酸合酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合酶和精氨基琥珀酸裂合酶的基因被分組到存在于大腸桿菌nissle中的操縱子。

40.根據(jù)實(shí)施方案27-39中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中每種操縱子包含啟動(dòng)子區(qū)域，并且其中所述突變體精氨酸調(diào)節(jié)子的每種啟動(dòng)子區(qū)域具有的g/c:a/t比值與在相應(yīng)的野生型啟動(dòng)子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的g/c:a/t比值相差不多于10％。

41.根據(jù)實(shí)施方案27-40中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中每種突變的arg盒的特征在于與相應(yīng)的野生型arg盒相比至少三個(gè)核苷酸突變。

42.根據(jù)實(shí)施方案27-41中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述突變體n-乙酰谷氨酸合成酶基因具有選自以下的dna序列：

a)seqidno:28，

b)其除了冗余的遺傳密碼以外，與seqidno:28編碼相同的多肽的dna序列，以及

c)與a)或b)的dna序列具有至少80％同源性的dna序列。

43.根據(jù)實(shí)施方案27-42中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，所述細(xì)菌包含編碼n-乙酰谷氨酸激酶、n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶和精氨基琥珀酸裂合酶的單種操縱子，其中所述單種操縱子包含seqidno:5的突變的dna序列，其中所述突變在seqidno:5的核苷酸37、38、45、46、47的一個(gè)或更多個(gè)中；以及在seqidno:5的核苷酸55、56、57、67、68、69的一個(gè)或更多個(gè)中。

44.根據(jù)實(shí)施方案43所述的細(xì)菌，其中所述單種操縱子包含seqidno:6的dna序列。

45.根據(jù)實(shí)施方案27-44中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中編碼乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的所述操縱子包含seqidno:11的突變的dna序列，其中所述突變在seqidno:11的核苷酸20、21、29、30、31的一個(gè)或更多個(gè)中；以及在seqidno:11的核苷酸41、42、50、52的一個(gè)或更多個(gè)中。

46.根據(jù)實(shí)施方案45所述的細(xì)菌，其中編碼乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的所述操縱子包含seqidno:12的dna序列。

47.根據(jù)實(shí)施方案27-46中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中編碼n-乙酰鳥氨酸酶的所述操縱子包含seqidno:7的突變的dna序列，其中所述突變在seqidno:7的核苷酸92、93、94、104、105、106的一個(gè)或更多個(gè)中；以及在seqidno:7的核苷酸114、115、116、123、124的一個(gè)或更多個(gè)中。

48.根據(jù)實(shí)施方案46所述的細(xì)菌，其中編碼n-乙酰鳥氨酸酶的所述操縱子包含seqidno:8的dna序列。

49.根據(jù)實(shí)施方案27-48中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中編碼鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的所述操縱子包含seqidno:3的突變的dna序列，其中所述突變在seqidno:3的核苷酸12、13、14、18、20的一個(gè)或更多個(gè)中；以及seqidno:3的核苷酸34、35、36、45、46的一個(gè)或更多個(gè)中。

50.根據(jù)實(shí)施方案49所述的細(xì)菌，其中編碼鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的所述操縱子包含seqidno:4的dna序列。

51.根據(jù)實(shí)施方案27-50中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中編碼氨甲酰磷酸合酶的操縱子的突變的啟動(dòng)子區(qū)域包含seqidno:9的突變的dna序列，其中所述突變在seqidno:9的核苷酸33、34、35、43、44、45的一個(gè)或更多個(gè)中；以及在seqidno:9的核苷酸51、52、53、60、61、62的一個(gè)或更多個(gè)中。

52.根據(jù)實(shí)施方案51所述的細(xì)菌，其中編碼氨甲酰磷酸合酶的所述操縱子包含seqidno:10的dna序列。

53.根據(jù)實(shí)施方案27-52中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中編碼n-乙酰谷氨酸合成酶的操縱子的突變的啟動(dòng)子區(qū)域包含seqidno:1的突變的dna序列，其中所述突變在seqidno:1的核苷酸12、13、14、21、22、23的一個(gè)或更多個(gè)中以及在seqidno:1的核苷酸33、34、35、42、43、44的一個(gè)或更多個(gè)中。

54.根據(jù)實(shí)施方案53所述的細(xì)菌，其中編碼n-乙酰谷氨酸合成酶的所述操縱子包含seqidno:2的dna序列。

55.根據(jù)實(shí)施方案28所述的細(xì)菌，其中編碼精氨基琥珀酸合酶的操縱子的突變的啟動(dòng)子區(qū)域包含seqidno:13的突變的dna序列，其中所述突變在seqidno:13的核苷酸9、11、19、21的一個(gè)或更多個(gè)中；在seqidno:13的核苷酸129、130、131、140、141、142的一個(gè)或更多個(gè)中；以及在seqidno:13的核苷酸150、151、152、161、162、163的一個(gè)或更多個(gè)中。

56.根據(jù)實(shí)施方案27所述的細(xì)菌，其中編碼精氨基琥珀酸合酶的所述操縱子包含seqidno:31的dna序列。

57.根據(jù)實(shí)施方案28所述的細(xì)菌，其中編碼精氨基琥珀酸合酶的所述操縱子包含seqidno:32的dna序列。

58.根據(jù)實(shí)施方案27-57中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌選自由以下組成的組：擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭菌屬、埃希氏桿菌屬、乳桿菌屬和乳球菌屬。

59.根據(jù)實(shí)施方案27-58中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌nissle。

60.根據(jù)實(shí)施方案27-59中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述操縱子的至少一種存在于所述細(xì)菌中的質(zhì)粒上；并且其中相應(yīng)于所述質(zhì)粒上的精氨酸調(diào)節(jié)子基因的所述精氨酸調(diào)節(jié)子基因的所有染色體拷貝不編碼活性酶。

61.根據(jù)實(shí)施方案60所述的細(xì)菌，其中編碼突變的n-乙酰谷氨酸合成酶的所述基因存在于所述細(xì)菌中的質(zhì)粒上，并且在所述質(zhì)粒上被可操作地連接至在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

62.根據(jù)實(shí)施方案27-59中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中編碼突變的n-乙酰谷氨酸合成酶的所述基因存在于所述細(xì)菌的染色體中，并且在所述染色體中被可操作地連接至在低氧或厭氧條件下被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

63.根據(jù)實(shí)施方案27-62中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是當(dāng)所述細(xì)菌存在于哺乳動(dòng)物消化道道中時(shí)被補(bǔ)充的第一基因中的營養(yǎng)缺陷型。

64.根據(jù)實(shí)施方案63所述的細(xì)菌，其中哺乳動(dòng)物的消化道是人類的消化道。

65.根據(jù)實(shí)施方案27-64中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中：

a)所述細(xì)菌是當(dāng)所述細(xì)菌存在于哺乳動(dòng)物消化道中時(shí)不被補(bǔ)充的第二基因中的營養(yǎng)缺陷型；

b)所述第二基因由存在于所述細(xì)菌中的誘導(dǎo)型的第三基因補(bǔ)充；且

c)所述第三基因的轉(zhuǎn)錄在足夠高濃度的精氨酸存在下被誘導(dǎo)，從而補(bǔ)充所述第二基因中的營養(yǎng)缺陷型。

66.根據(jù)實(shí)施方案65所述的細(xì)菌，其中：

a)所述第三基因的轉(zhuǎn)錄被第二阻遏物阻遏；

b)所述第二阻遏物的轉(zhuǎn)錄被精氨酸-精氨酸阻遏物復(fù)合物阻遏。

67.根據(jù)實(shí)施方案66所述的細(xì)菌，其中所述第三基因和所述第二阻遏物各存在于質(zhì)粒上。

68.一種藥學(xué)上可接受的組合物，所述藥學(xué)上可接受的組合物包含根據(jù)實(shí)施方案27-67中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌；和藥學(xué)上可接受的載體。

69.一種制備根據(jù)實(shí)施方案68所述的藥學(xué)上可接受的組合物的方法，所述方法包括以下步驟：

a)使根據(jù)實(shí)施方案27-67中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌在需氧條件下在生長培養(yǎng)基培養(yǎng)物中生長；

b)使所得的細(xì)菌與生長培養(yǎng)基分離；以及

c)將分離的細(xì)菌懸浮于藥學(xué)上可接受的載體中。

70.一種治療有相應(yīng)需要的受試者中的高氨血癥相關(guān)的紊亂或其癥狀的方法，所述方法包括將根據(jù)實(shí)施方案68所述的組合物施用至所述受試者持續(xù)足以減輕所述高氨血癥相關(guān)的紊亂的嚴(yán)重程度的時(shí)間段的步驟。

71.根據(jù)實(shí)施方案70所述的方法，其中所述高氨血癥相關(guān)的紊亂是尿素循環(huán)障礙。

72.根據(jù)實(shí)施方案71所述的方法，其中所述尿素循環(huán)障礙是精氨基琥珀酸尿癥、精氨酸酶缺乏癥、氨甲酰磷酸合成酶缺乏癥、瓜氨酸血癥、n-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥或鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥。

73.根據(jù)實(shí)施方案70所述的方法，其中所述高氨血癥相關(guān)的紊亂是肝臟疾?。挥袡C(jī)酸疾病；異戊酸尿癥；3-甲基巴豆酰甘氨酸尿癥；甲基丙二酸血癥；丙酸尿癥；脂肪酸氧化缺陷；肉堿循環(huán)缺陷；肉堿缺乏癥；β-氧化缺乏癥；賴氨酸尿性蛋白耐受不良；吡咯啉-5-羧酸合成酶缺乏癥；丙酮酸羧化酶缺乏癥；鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶缺乏癥；碳酸酐酶缺乏癥；高胰島素血癥-高氨血癥綜合征；線粒體疾??；丙戊酸療法；天冬酰胺酶療法；全腸胃外營養(yǎng)；用含甘氨酸溶液進(jìn)行膀胱鏡檢查；肺/骨髓移植后；門體分流；尿路感染；輸尿管擴(kuò)張；多發(fā)性骨髓瘤；化學(xué)療法；感染；神經(jīng)源性膀胱；或腸道細(xì)菌過度生長。

74.根據(jù)實(shí)施方案73所述的方法，其中所述肝臟疾病是肝性腦病、急性肝衰竭或慢性肝衰竭。

75.根據(jù)實(shí)施方案70所述的方法，其中所述高氨血癥相關(guān)的紊亂的癥狀選自由以下組成的組：癲癇、共濟(jì)失調(diào)、中風(fēng)樣病變、昏迷、精神病、視力損失、急性腦病、腦水腫以及嘔吐、呼吸性堿中毒和低體溫。

76.根據(jù)實(shí)施方案27-75中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌另外包含編碼可檢測產(chǎn)物的dna序列，其中編碼所述可檢測產(chǎn)物的dna序列的轉(zhuǎn)錄在精氨酸存在下被誘導(dǎo)。

77.根據(jù)實(shí)施方案76所述的細(xì)菌，其中：

a)編碼所述可檢測產(chǎn)物的dna序列的轉(zhuǎn)錄被第三阻遏物阻遏；且

b)第三阻遏物的轉(zhuǎn)錄被精氨酸-精氨酸阻遏物復(fù)合物阻遏。

78.一種選擇產(chǎn)生高水平精氨酸的細(xì)菌的方法，所述方法包括：

a)提供根據(jù)實(shí)施方案77所述的細(xì)菌；

b)培養(yǎng)所述細(xì)菌持續(xù)第一時(shí)間段；

c)使培養(yǎng)物經(jīng)歷誘變；

d)培養(yǎng)誘變的培養(yǎng)物持續(xù)第二時(shí)間段；以及

e)選擇表達(dá)所述可檢測產(chǎn)物的細(xì)菌，由此選擇產(chǎn)生高水平精氨酸的細(xì)菌。

79.根據(jù)實(shí)施方案78所述的方法，其中所述可檢測產(chǎn)物是熒光蛋白，且選擇包括使用熒光活化細(xì)胞分選儀。

整個(gè)說明書中引用的參考文獻(xiàn)的完整引用包括：

1.altenhoefer等theprobioticescherichiacolistrainnissle1917interfereswithinvasionofhumanintestinalepithelialcellsbydifferententeroinvasivebacterialpathogens.femsimmunolmedmicrobiol.2004apr9；40(3)：223-9.pmid：15039098；

2.andersen等uraciluptakeinescherichiacoiik-12：isolationofuraamutantsandcloningofthegene.jbacteriol.1995apr；177(8)：2008-13.pmid：7721693；

3.arthur等intestinalinflammationtargetscancer-inducingactivityofthemicrobiota.science.2012oct5；338(6103)：120-3.pmid：22903521；

4.aoyagi等gastrointestinalureaseinman.activityofmucosalurease.gut.1966dec；7(6)：631-5.pmid：5957514；

5.arai等expressionofthenirandnorgenesfordenitrificationofpseudomonasaeruginosarequiresanovelcrp/fnr-relatedtranscriptionalregulator，dnr，inadditiontoanr.febslett.1995aug28；371(1)：73-6.pmid：7664887；

6.caldara等thearginineregulonofescherichiacoli：whole-systemtranscriptomeanalysisdiscoversnewgenesandprovidesanintegratedviewofarginineregulation.microbiology.2006nov；152(pt11)：3343-54.pmid：17074904；

7.caldara等argininebiosynthesisinescherichiacoli：experimentalperturbationandmathematicalmodeling.jbiolchem.2008mar7；283(10)：6347-58.pmid：18165237；

8.caldovic等n-acetylglutamatesynthase：structure，functionanddefects.molgenetmetab.2010；100suppl1：s13-9.review.pmid：20303810；

9.callura等tracking，tuning，andterminatingmicrobialphysiologyusingsyntheticriboregulators.procnatlacadsciusa.2010sep7；107(36)：15898-903.pmid：20713708；

10.castiglione等thetranscriptionfactordnrfrompseudomonasaeruginosaspecificallyrequiresnitricoxideandhaemfortheactivationofatargetpromoterinescherichiacoli.microbiology.2009sep；155(pt9)：2838-44.pmid：19477902；

11.charlier等arginineregulonofescherichiacolik-12.astudyofrepressor-operatorinteractionsandofinvitrobindingaffinitiesversusinvivorepression.jmolbiol.1992jul20；226(2)：367-86.pmid：1640456；

12.crabeel等characterizationofthesaccharomycescerevisiaearg7geneencodingornithineacetyltransferase，anenzymealsoendowedwithacetylglutamatesynthaseactivity.eurjbiochem.1997dec1；250(2)：232-41.pmid：9428669；

13.cuevas-ramos等escherichiacoliinducesdnadamageinvivoandtriggersgenornicinstabilityinmamrmaliancells.procnatlacadsciusa.2010jun22；107(25)：11537-42.pmid：20534522；

14.cunin等molecularbasisformodulatedregulationofgeneexpressioninthearginineregulonofescherichiacollk-12.nucleicacidsres.1983aug11；11(15)：5007-19.pmid：6348703；

15.cunin等biosynthesisandmetabolismofarginineinbacteria.microbiolrev.1986sep；50(3)：314-52.review.erratumin：microbiolrev.1987mar；51(1)：178.pmid：3534538；

16.deignan等contrastingfeaturesofureacycledisordersinhumanpatients.molgenetmetab.2008jan；93(1)；714.pmid：17933574；

17.deutscher.themechanismsofcarboncataboliterepressioninbacteria.curropinmicrobiol.2008apr；11(2)：87-93.pmid：18359269；

18.diaz等ammoniacontrolandneurocognitiveoutcomeamongureacycledisorderpatientstreatedwithglycerolphenylbutyrate.hepatology.2013jun；57(6)：2171-9.pmid：22961727；

19.dinleyici等saccharomycesboulardiicncm1-745lndifferentclinicalconditions.expertopinbiolther.2014nov；14(11)：1593-609.pmid：24995675；

20.doolittle.anewalleleofthesparsefurgeneinthemouse.jhered.1974may-jun；65(3)：194-5.pmid：4603259；

21.eckhardt等isolationandcharacterizationofmutantswithafeedbackresistantn-acetylglutamatesynthaseinescherichiacolik12.molgenngenet，1975jun19；138(3)：225-32.pmid：1102931

22.eiglmeier等moleculargeneticanalysisoffnr-dependentpromoters.molmicrobiol.1989jul；3(7)：869-78.pmid：2677602；

23.fraga等(2008).real-timepcr.currentprotocolsessentiallaborotorytechniques(10.3.1-10.3.33).johnwiley&sons，lnc.；

24.galimand等positivefnr-likecontrolofanaerobicargininedegradationandnitraterespirationinpseudomonasaeruginosa.jbacteriol.1991mar；173(5)：1598-606.pmid：1900277；

25.gamper等anaerobicregulationoftranscriptioninitiationinthearcdabcoperonofpseudomonasaeruginosa.jbacteriol.1991aug；173(15)：4742-50.pmid：1906871；

26.gardner等constructionofagenetictoggleswitchinescherichiacoli.nature.2000；403：339-42.pmid：10659857；

27.b等carboncataboliterepressioninbacteria：manywaystomakethemostoutofnutrients.natrevmicrobiol.2008aug；6(8)：613-24.pmid：18628769；

28.等suggestedguidelinesforthediagnosisandmanagementofureacycledisorders.orphanetjraredis.2012may29；7：32.review.pmid：22642880；

29.j.clinicalandbiochemicalaspectsofprimaryandsecondaryhyperammonemicdisorders.archbiochembiophys.2013aug15；536(2)：101-8.review.pmid：23628343；

30.hasegawa等activationofaconsensusfnr-dependentpromoterbydnrofpseudomonasaeruginosainresponsetonitrite.femsmicrobiollett.1998sep15；166(2)：213-7.pmid：9770276；

31.hodges等thespfashmouse：amissensemutationintheornithinetranscarbamylasegenealsocausesaberrantmrnasplicing，procnatlacadsciusa.1989jun；86(11)：4142-6.pmid：2471197；

32.hoeren等sequenceandexpressionofthegeneencodingtherespiratorynitrous-oxidereductasefromparacoccusdenitrificans.eurjbiochem.1993nov15；218(1)：49-57.pmid：8243476；

33.hoffmann等defectsinaminoacidcatabolismandtheureacycle.handbclinneurol.2013；113：1755-73.review.pmid：23622399；

34.hosseini等proprionateasahealth-promotingmicrobialmetaboliteinthehumangut.nutrrev.2011may；69(5)：245-58.pmid：21521227；

35.isabella等deepsequencing-basedanalysisoftheanaerobicstimuloninneisseriagonorrhoeae.bmcgenomics.2011jan20；12：51.pmid：21251255；

36.konieczna等bacterialureaseanditsroleinlong-lastinghumandiseases.currproteinpeptsci.2012dec；13(8)：789-806.review.pmid：23305365；

37.lazier等hyperammonemicencephalopathyinanadenocarcinomapatientmanagedwithcarglumicacid.curroncol.2014oct；21(5)：e736-9.pmid：25302046；

38.leonard(2006).disordersoftheureacycleandrelatedenzymes.lnbornmetabollicdiseases，第4版(等263-272頁).springermedizinverlagheidelberg；

39.lim等nucleotidesequenceoftheargrgeneofescherichiacollk-12andisolationofitsproduct，thearginlnerepressor.procnatlacadsciusa.1987oct；84(19)：6697-701.pmid：3116542；

40.makarova等conservationofthebindingsitefortheargininerepressorinallbacteriallineages.genomebiol.2001；2(4).pmid：11305941；

41.maas等studiesonthemechanismofrepressionofargininebiosynthesisinescherichiacoll.dominanceofrepressibilityindiploids.jmolbiol.1964mar；8：365-70.pmid：14168690；

42.maas.theargininerepressorofescherichiacoli.microbiolrev.1994dec；58(4)：631-40.pmid：7854250；

43.meng等nucleotidesequenceoftheescherichiacolicadoperon：asystemforneutralizationoflowextracellularph.jbacteriol.1992apr；174(8)：2659-69.pmid：1556085；

44.moore等regulationoffnrdimerizationbysubunitchargerepulsion.jbiolchem.2006nov3；281(44)：33268-75.pmid：16959764；

45.mountain等cloningofabacillussubtilisrestrictionfragrnentcomplementingauxotrophicmutantsofeightescherichiacoligenesofargininebiosynthesis.molgengenet.1984；197(1)：82-9.pmid：6096675；

46.nagamani等optimizingtherapyforargininosuccinicaciduria.molgenetmetab.2012sep；107(1-2)：10-4.review.pmid：22841516；

47.nicaise等controlofacute，chronic，andconstitutivehyperammonemiabywild-typeandgeneticallyengineeredlactobacillusplantaruminrodents.hepatology.2008oct；48(4)：1184-92.pmid：18697211；

48.nicoloff等twoargininerepressorsregulateargininebiosynthesisinlactobacillusplantarum，jbacteriol.2004sep；186(18)：6059-69.pmid：15342575；

49.nougayrede等escherichiacoliinducesdnadouble-strandbreaksineukaryoticcells.science.2006aug11；313(5788)：848-51.pmid：16902142；

50，olier等genotoxicityofescherichiacolinissle1917straincannotbedissociatedfromitsprobioticactivity.gutmicrobes.2012nov-dec；3(6)：501-9.pmld：22895085；

51.pham等multiplemyeloma-inducedhyperammonemicencephalopathy：anentityassociatedwithhighin-patientmortality.leukres.2013oct；37(10)：1229-32.review.pmid：23932549；

52.rajagopal等useofinduciblefeedback-resistantn-acetylgiutamatesynthetase(arga)genesforenhancedargininebiosynthesisbygeneticallyengineeredescherichiacolik-12strains.applenvironmicrobiol.1998may；64(5)：1805-11.pmid：9572954；

53.ray等theeffectsofmutationoftheanrgeneontheaerobicrespiratorychainofpseudomonasaeruginosa.femsmicrobiollett.1997nov15；156(2)：227-32.pmid：9513270；

54.reister等completegenomesequenceofthegram-negativeprobioticescherichiacolistrainnissle1917.jbiotechnol.2014oct10；187：106-7.pmid：25093936；

55.rembacken等non-pathogenicescherichiacoliversusmesalazineforthetreatmentofulcerativecolitis：aranaomisedtrial.lancet.1999aug21；354(9179)：635-9.pmid：10466665；

56.remington′spharmaceuticalsciences，第22版.mackpublishingco.；

57.salmon等globalgeneexpressionprofilinginescherichiacolik12.theeffectsofoxygenavailabilityandfnr.jbiolchem.2003aug8；278(32)：29837-55.pmid：12754220；

58.sat等theescherichiacolimazefsuicidemodulemediatesthyminelessdeath.jbacteriol，2003mar；185(6)：1g03-7.pmid：12618443；

59.sawers.identificationandmolecularcharacterizationofatranscriptionalregulatorfrompseudomonasaeruginosapao1exhibitingstructuralandfunctionalsimilaritytothefnrproteinofescherichiacoli.molmicrobiol.1991jun；5(6)：1469-81.pmid：1787797；

60.schneider等argininecatabolismandtheargininesuccinyltransferasepathwayinescherichiacoli.jbacteriol.1998aug；180(16)：4278-86.pmid：9696779；

61.schultz.clinicaluseofe.colinissle1917ininflammatoryboweldisease.inflammboweldis.2008jul；14(7)：1012-8.review.pmid：18240278；

62.sonnenborn等thenon-pathogenicescherichiacolistrainnissle1917-featuresofaversatileprobiotic.microbialecologyinhealthanddisease.2009；21：122-58；

63.suiter等fitnessconsequencesofaregulatorypolymorphisminaseasonalenvironment.procnatlacadsciusa.2003oct28；100(22)：12782-6.pmid：14555766；

64.summerskill.ontheoriginandtransferofammoniainthehumangastrointestinaltract.medicine(baltimore).1966nov；45(6)：491-6.pmid：5925900；

65.szwajkajzer等quantitativeanalysisofdnabindingbytheescherichiacoliargininerepressor.jmolbiol.2001oct5；312(5)：949-62.pmid：11580241；

66.tian等bindingoftheargininerepressorofescherichiacolik12toitsoperatorsites.jmolbiol.1992jul20；226(2)：387-97.pmid：1640457；

67.tian等explanationfordifferenttypesofregulationofargininebiosynthesisinescherichiacolibandescherichiacolik12causedbyadifferencebetweentheirargininerepressors.jmolbiol.1994jan7；235(1)：221-30.fmid：8289243；

68.torres-vega等deliveryofglutaminesynthetasegenebybaculovirusvectors：aproofofconceptforthetreatmentofacutehyperammonemia.genether.2014oct23；22(1)：58-64.pmid：25338921；

69.trunk等anaerobicadaptationinpseudomonasaeruginosa：definitionoftheanranddnrregulons.environmicrobiol.2010jun；12(6)：1719-33.pmid：20553552；

70.tuchman等enhancedproductionofarginineandureabygeneticallyengineeredescherichiacolik-12strains.applenvironmicrobiol.1997jan；63(1)：33-8.pmid：8979336；

71.ukena等probioticescherichiacolinissle1917inhibitsleakygutbyenhancingmucosalintegrity.plosone.2007dec12；2(12)：e1308.pmid：18074031；

72.unden等alternativerespiratorypathwaysofescherichiacoli：energeticsandtranscriptionalregulationinresponsetoelectronacceptors.biochimbiophysacta.1997jul4；1320(3)：217-34.review.pmid：9230919；

73.vanderwauven等pseudomonasaeruginosamutantsaffectedinanaerobicgrowthonarginine：evidenceforafour-geneclusterencodingtheargininedeirninasepathway.jbacteriol.1984dec；160(3)：928-34.pmid：6438064；

74.walker.severehyperammonaemiainadultsnotexplainedbyliverdisease.annclinbiochem.2012may；49(pt3)：214-28.review.pmid：22349554；

75.winteler等thehomologousregulatorsanrofpseudomonasaeruginosaandfnrofescherichiacolihaveoverlappingbutdistinctspecificitiesforanaerobicallyinduciblepromoters.microbiology.1996mar；142(pt3)：685-93.pmid：8868444；

76.wu等directregulationofthenaturalcompetenceregulatorgenetfoxbycyclicamp(camp)andcampreceptorproteininvibiios.scirep.2015oct7；5：14921.pmid：26442598；

77.zimmermann等anaerobicgrowthandcyanidesynthesisofpseudomonasaeruginosadependonanr，aregulatorygenehomologouswithfnrofescherichiacoli.molmicrobiol.1991jun；5(6)：1483-90.pmid：1787798；

78.wrighto，delmansm，stangb，ellist.geneguard：amodularplasmidsystemdesignedforbiosafety.acssynthbiol.2015mar20；4(3)：307-16.pmid：24847673；

79.alifano等histidinebiosyntheticpathwayandgenes：structure，regulation，andevolution.microbiolrev.1996mar；60(1)：44-69.pmid：8852895；

80.liuy，whiterh，whitmanwb.methanococciusethediaminopimelateaminotransferase(dapl)pathwayforlysinebiosynthesis.jbacteriol.2010jul；192(13)：3304-10.pmid：20418392；

81.dogovski等(2012)enzymologyofbacteriallysinebiosynthesis，biochemistry，prof.denizekinci(編著)，isbn：978-953-51-0076-8，lntech，從以下可得；http：//www.intechopen.com/books/biochemistry/enzymology-of-bacterial-lysine-biosynthesis；

82.feng等roleofphosphorylatedmetabolicintermediatesintheregulationofglutaminesynthetasesynthesisinescherichiacoli.jbacteriol.1992oct；174(19)：6061-70.pmid：1356964；

83.lodeiro等robustnessinescherichiacoliglutamateandglutaminesynthesisstudiedbyakineticmodel.jbiolphys.2008apr；34(1-2)：91-106.pmid：19669495；

84.reboul等structuralanddynamicrequirementsforoptimalactivityoftheessentialbacterialenzymedihydrodipicolinatesynthase.ploscomputbiol.2012；8(6)：e1002537.pmid：22685390；

85.saint-girons等structureandautoregulationofthemetjregulatorygeneinescherichiacoli.jbiolchem.1984nov25；259(22)：14282-5.pmid：6094549；

86.shoeman等regulationofmethioninesynthesisinescherichiacoli：effectofmetjgeneproductands-adenosylmethionineontheexpressionofthemetfgene.procnatlacadsciusa.1985jun；82(11)：3601-5.pmid：16593564；

87.vanheeswijk等nitrogenassimilationinescherichiacoli：puttingmoleculardataintoasystemsperspective.microbiolmolbiolrev.2013dec；77(4)：628-95.pmid：24296575.

實(shí)施例

以下實(shí)施例提供了本公開內(nèi)容的說明性實(shí)施方案。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到可以在不改變本公開內(nèi)容的精神或范圍的情況下進(jìn)行許多修改和變化。此類修改和變化被涵蓋在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。這些實(shí)施例不以任何方式限制本公開內(nèi)容。

精氨酸阻遏物結(jié)合位點(diǎn)(arg盒)

實(shí)施例1.arg盒突變

大腸桿菌nissle中包含每種精氨酸生物合成操縱子的argr結(jié)合位點(diǎn)的野生型基因組序列示于圖6中。根據(jù)以下參數(shù)設(shè)計(jì)對這些序列的修改。對于每種野生型序列，arg盒以斜體顯示。精氨酸調(diào)節(jié)子的arg盒與每種操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域重疊。被加下劃線的序列代表rna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，并且那些序列沒有被改變。在argr結(jié)合期間被保護(hù)免受dna甲基化的堿基被突出顯示，并且在argr結(jié)合期間被保護(hù)免受羥基自由基攻擊的堿基被加粗。突出顯示和加粗的堿基是用于破壞argr結(jié)合的突變的主要靶。

實(shí)施例2.λred重組

λred重組用于進(jìn)行染色體修飾，例如arg盒突變。λred是使用來自噬菌體λ的重組酶將一段定制dna插入到大腸桿菌染色體的程序。將pkd46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌nissle宿主菌株中。將大腸桿菌nissle細(xì)胞在lb培養(yǎng)基中生長過夜。將過夜培養(yǎng)物在5mllb培養(yǎng)基中以1:100稀釋，并生長直至使其達(dá)到od600為0.4-0.6。將所有管、溶液和比色皿預(yù)冷至4℃。將大腸桿菌細(xì)胞在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于1ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.5ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.1ml的4℃水中。將電穿孔儀(electroporator)設(shè)置為2.5kv。將1ngpkd46質(zhì)粒dna添加至大腸桿菌細(xì)胞中，通過移液混合，并移液到無菌、冷的比色皿中。將干燥的比色皿置于樣品室中，并施加電脈沖。立即添加1ml室溫soc培養(yǎng)基，并且將混合物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)管中，并在30℃孵育1小時(shí)。將細(xì)胞分散在選擇性培養(yǎng)基板上并在30℃孵育過夜。

圖6中示出的包含所需arg盒序列的dna序列從基因合成公司訂購。對于arga操縱子，突變體調(diào)節(jié)區(qū)域包含以下核酸序列(seqidno:2)：

gcaaaaaaacactttaaaaacttaataatttcctttaatcacttaaagaggtgtaccgtg。

λ酶用于通過同源重組將該構(gòu)建體插入到大腸桿菌nissle的基因組中。將構(gòu)建體基于其dna序列插入到大腸桿菌nissle的基因組中的特定位點(diǎn)。為了將構(gòu)建體插入到特定位點(diǎn)，鑒定了構(gòu)建體側(cè)翼的同源dna序列。dna的同源序列包括在突變序列的兩側(cè)的約50個(gè)堿基。同源序列作為合成基因的一部分定購?？蛇x地，可以通過pcr添加同源序列。該構(gòu)建體用于替代大腸桿菌nissle基因組中arga上游的天然序列。該構(gòu)建體包含可通過重組去除的抗生素抗性標(biāo)志。所得的突變體arga構(gòu)建體包含arga上游約50個(gè)堿基的同源性，可通過重組去除的卡那霉素抗性標(biāo)志，gcaaaaaaacactttaaaaacttaataatttcctttaatcacttaaagaggtgtaccgtg以及與arga約50個(gè)堿基的同源性。

在一些實(shí)施方案中，將arg盒如以上描述在argg調(diào)節(jié)區(qū)域中突變，并使用λred重組將bba_j23100組成型啟動(dòng)子(syn-ucd105)插入到調(diào)節(jié)區(qū)域。這些細(xì)菌能夠產(chǎn)生精氨酸。在替代實(shí)施方案中，argg調(diào)節(jié)區(qū)域(seqidno:31)保持argr阻遏型(syn-ucd104)，且細(xì)菌能夠產(chǎn)生瓜氨酸。

實(shí)施例3.轉(zhuǎn)化大腸桿菌nissle

將突變的arg盒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到包含pkd46的大腸桿菌nissle中。將所有管、溶液和比色皿預(yù)冷至4℃。將過夜培養(yǎng)物在5ml包含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中以1:100稀釋并生長直至使其達(dá)到od600為0.1。添加0.05ml100xl-阿拉伯糖儲(chǔ)備溶液以誘導(dǎo)pkd46λred表達(dá)。將培養(yǎng)物生長直至使其達(dá)到od600為0.4-0.6。將大腸桿菌細(xì)胞在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于1ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.5ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.1ml的4℃水中。將電穿孔儀設(shè)置為2.5kv。將0.5μg突變的arg盒構(gòu)建體添加至細(xì)胞中，通過移液混合，并移液到無菌、冷的比色皿中。將干燥的比色皿置于樣品室中，并施加電脈沖。立即添加1ml室溫soc培養(yǎng)基，并且將混合物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)管中，并在37℃孵育1小時(shí)。將細(xì)胞分散在包含卡那霉素的lb板上并孵育過夜。

實(shí)施例4.驗(yàn)證突變體

通過菌落pcr驗(yàn)證突變的存在。用移液管吸頭挑取菌落，并通過上下移液將其重懸于20μl冷ddh2o中。將3μl懸浮液移液到帶有適當(dāng)?shù)目股刂甘景?indexplate)上以供以后使用。將指示板在37℃生長過夜。使用5μl10xpcr緩沖液、0.6μl10mmdntp、0.4μl50mmmg2so4、6.0μl10x增強(qiáng)劑和3.0μlddh2o制備pcr主混合物(每個(gè)pcr反應(yīng)15μl主混合物)。通過將2μl對arga突變體構(gòu)建體獨(dú)特的引物(100μm儲(chǔ)備液)混合到16μlddh2o中來制備10μm引物混合物。對于每20μl反應(yīng)，將15μlpcr主混合物、2.0μl菌落懸浮液(模板)、2.0μl引物混合物2.0μl和1.0μlpfxplatinumdnapol混合在pcr管中。pcr熱循環(huán)儀編程如下，其中步驟2-4重復(fù)34次：1)94℃，5:00min，2)94℃，0:15min，3)55℃，0:30min，4)68℃，2:00min，5)68℃，7:00min，并且然后冷卻至4℃。使用10μl每種擴(kuò)增子和2.5μl5x染料通過凝膠電泳分析pcr產(chǎn)物。僅當(dāng)突變已插入到基因組時(shí)，才能形成pcr產(chǎn)物。

實(shí)施例5.去除選擇標(biāo)志

用pcp20去除抗生素抗性基因。將具有突變的arg盒的每種菌株在37℃在包含抗生素的lb培養(yǎng)基中生長，直至使其達(dá)到od600為0.4-0.6。將所有管、溶液和比色皿預(yù)冷至4℃。將細(xì)胞在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于1ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.5ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.1ml的4℃水中。將電穿孔儀設(shè)置為2.5kv。將1ngpcp20質(zhì)粒dna添加至細(xì)胞中，通過移液混合，并移液到無菌、冷的比色皿中。將干燥的比色皿置于樣品室中，并施加電脈沖。立即添加1ml室溫soc培養(yǎng)基，并且將混合物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)管中，并在30℃孵育1-3小時(shí)。將細(xì)胞分散在包含卡那霉素的lb板上并孵育過夜。過夜未生長至足夠的od600的菌落再孵育另外24小時(shí)。將200μl細(xì)胞分散在氨芐青霉素板上，將200μl細(xì)胞分散在卡那霉素板上，并且兩者都在37℃生長過夜。氨芐青霉素板包含帶有pcp20的細(xì)胞?？敲顾匕逄峁┝硕嗌偌?xì)胞在電穿孔中存活的指示。來自氨芐青霉素板的轉(zhuǎn)化體在43℃非選擇性純化并允許生長過夜。

實(shí)施例6.驗(yàn)證轉(zhuǎn)化體

測試純化的轉(zhuǎn)化體對氨芐青霉素和卡那霉素的敏感性。從在43℃生長的板挑取菌落，并將其重懸在10μl的lb培養(yǎng)基中。將3μl細(xì)胞懸浮液移液到三個(gè)板中的每一個(gè)上：1)在37℃孵育的帶有卡那霉素的lb板，其測試宿主菌株基因組中kanr基因的存在或不存在；2)在30℃孵育的帶有氨芐青霉素的lb板，其測試來自pcp20質(zhì)粒的ampr基因的存在或不存在；和3)在37℃孵育的無抗生素的lb板。如果對于特定菌落在卡那霉素或氨芐青霉素板上未觀察到生長，則kanr基因和pcp20質(zhì)粒兩者都損失，并且將菌落保留用于進(jìn)一步分析。將保留的菌落重新劃線到lb板上以獲得單菌落并在37℃生長過夜。通過測序基因組的arga區(qū)域來證實(shí)突變的基因組arg盒的存在。

對于圖6中示出的arg盒突變和操縱子的每一種，重復(fù)λred重組、轉(zhuǎn)化大腸桿菌nissle、驗(yàn)證突變、去除選擇標(biāo)志以及驗(yàn)證/測序轉(zhuǎn)化體的方法。所得細(xì)菌在用于編碼精氨酸生物合成酶的一種或更多種操縱子的每種arg盒中包含突變，使得對arg盒的argr結(jié)合降低，并且對所述操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域的總argr結(jié)合降低。

實(shí)施例7.精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶(arga^fbr)

除了以上描述的arg盒突變以外，大腸桿菌nissle細(xì)菌還包含在以下每種啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶(arga^fbr，seqidno:28)基因：四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、選自seqidno:16-27的fnr啟動(dòng)子。如本文討論的，可以使用其他啟動(dòng)子。

arga^fbr基因在高拷貝質(zhì)粒、低拷貝質(zhì)?；蛉旧w上表達(dá)。syn-ucd101包含質(zhì)粒上的野生型argr、野生型arga、四環(huán)素誘導(dǎo)型arga^fbr以及用于每種精氨酸生物合成操縱子的每種arg盒中的突變。質(zhì)粒不包含功能性argr結(jié)合位點(diǎn)，即arg盒。syn-ucd101用于產(chǎn)生syn-ucd102，其包含質(zhì)粒上的野生型argr、野生型arga、四環(huán)素誘導(dǎo)型arga^fbr以及用于每種精氨酸生物合成操縱子的每種arg盒中的突變。該質(zhì)粒還包含功能性argr結(jié)合位點(diǎn)，即arg盒。在一些情況下，功能性argr的存在和/或形成可導(dǎo)致在除arg盒以外的位點(diǎn)的靶外結(jié)合。在該質(zhì)粒中引入功能性arg盒可用于降低或消除靶外argr結(jié)合，即通過作為argr池。

syn-ucd104包含在低拷貝質(zhì)粒上的野生型argr、野生型arga、四環(huán)素誘導(dǎo)型arga^fbr、四環(huán)素誘導(dǎo)型argg、以及用于每種精氨酸生物合成操縱子(除了argg以外)的每種arg盒中的突變。syn-ucd105包含在低拷貝質(zhì)粒上的野生型argr、野生型arga、四環(huán)素誘導(dǎo)型arga^fbr、組成型表達(dá)的argg(seqidno:31，其包含bba_j23100組成型啟動(dòng)子)、以及用于每種精氨酸生物合成操縱子的每種arg盒中的突變。syn-ucd103是對照nissle構(gòu)建體。

將arga^fbr基因以大腸桿菌nissle中的一個(gè)或更多個(gè)以下插入位點(diǎn)插入到細(xì)菌基因組中：male/k、arac/bad、lacz、thya、malp/t。可以使用任何合適的插入位點(diǎn)，參見，例如，圖22。插入位點(diǎn)可以是基因組中的任何地方，例如在存活和/或生長所需的基因中，諸如thya(以產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型)；在基因組的活躍區(qū)域，諸如基因組復(fù)制位點(diǎn)附近；和/或在趨異的啟動(dòng)子之間，以便降低諸如在阿拉伯糖操縱子的arab和arac之間的非預(yù)期轉(zhuǎn)錄的風(fēng)險(xiǎn)，。在插入位點(diǎn)，設(shè)計(jì)與插入位點(diǎn)和arga^fbr構(gòu)建體同源的dna引物。通過pcr產(chǎn)生包含與靶位點(diǎn)具有同源性的構(gòu)建體的線性dna片段，并如以上描述進(jìn)行λred重組。

所得的大腸桿菌nissle細(xì)菌被遺傳工程化為包含經(jīng)由對n-乙酰谷氨酸合成酶的argr結(jié)合和精氨酸結(jié)合來降低精氨酸介導(dǎo)的對一種或更多種編碼精氨酸生物合成酶的操縱子的阻遏的核酸突變，由此增強(qiáng)精氨酸和/或瓜氨酸生物合成(圖25)。

精氨酸阻遏物(argr)

實(shí)施例8.argr序列

大腸桿菌nissle中的野生型argr核苷酸序列和argr缺失后的核苷酸序列如下示出。

實(shí)施例9.缺失argr

將pkd46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌nissle宿主菌株中。將大腸桿菌nissle細(xì)胞在lb培養(yǎng)基中生長過夜。將過夜培養(yǎng)物在5mllb培養(yǎng)基中以1:100稀釋，并生長直至使其達(dá)到od600為0.4-0.6。將所有管、溶液和比色皿預(yù)冷至4℃。將大腸桿菌細(xì)胞在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于1ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.5ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.1ml的4℃水中。將電穿孔儀設(shè)置為2.5kv。將1ngpkd46質(zhì)粒dna添加至大腸桿菌細(xì)胞中，通過移液混合，并移液到無菌、冷的比色皿中。將干燥的比色皿置于樣品室中，并施加電脈沖。立即添加1ml室溫soc培養(yǎng)基，并且將混合物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)管中，并在30℃孵育1小時(shí)。將細(xì)胞分散在選擇性培養(yǎng)基板上并在30℃孵育過夜。

通過pcr將argr基因上游和下游約50個(gè)堿基的同源性添加至pkd4質(zhì)粒中的卡那霉素抗性基因中以產(chǎn)生以下kanr構(gòu)建體：(argr上游～50個(gè)堿基)(終止子)(kanr基因側(cè)翼為來自pkd4的frt位點(diǎn))(argr下游的dna)。

在一些實(shí)施方案中，argr和argg基因兩者如以上描述使用λred重組缺失，并且細(xì)菌能夠產(chǎn)生瓜氨酸。

實(shí)施例10.轉(zhuǎn)化大腸桿菌nissle

將kanr構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到包含pkd46的大腸桿菌nissle中以缺失argr。將所有管、溶液和比色皿預(yù)冷至4℃。將過夜培養(yǎng)物在5ml包含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中以1:100稀釋并生長直至使其達(dá)到od600為0.1。添加0.05ml100xl-阿拉伯糖儲(chǔ)備溶液以誘導(dǎo)pkd46λred表達(dá)。將培養(yǎng)物生長直至使其達(dá)到od600為0.4-0.6。將大腸桿菌細(xì)胞在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于1ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.5ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.1ml的4℃水中。將電穿孔儀設(shè)置為2.5kv。將0.5μgkanr構(gòu)建體添加至細(xì)胞中，通過移液混合，并移液到無菌、冷的比色皿中。將干燥的比色皿置于樣品室中，并施加電脈沖。立即添加1ml室溫soc培養(yǎng)基，并且將混合物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)管中，并在37℃孵育1小時(shí)。將細(xì)胞分散在包含卡那霉素的lb板上并孵育過夜。

實(shí)施例11.驗(yàn)證突變體

通過菌落pcr驗(yàn)證突變的存在。用移液管吸頭挑取菌落，并通過上下移液將其重懸于20μl冷ddh2o中。將3μl懸浮液移液到帶有適當(dāng)?shù)目股刂甘景迳弦怨┮院笫褂?。將指示板?7℃生長過夜。使用5μl10xpcr緩沖液、0.6μl10mmdntp、0.4μl50mmmg2so4、6.0μl10x增強(qiáng)劑和3.0μlddh2o制備pcr主混合物(每個(gè)pcr反應(yīng)15μl主混合物)。通過將2μl對kanr基因獨(dú)特的引物(100μm儲(chǔ)備液)混合到16μlddh2o中來制備10μm引物混合物。對于每20μl反應(yīng)，將15μlpcr主混合物、2.0μl菌落懸浮液(模板)、2.0μl引物混合物2.0μl和1.0μlpfxplatinumdnapol混合在pcr管中。pcr熱循環(huán)儀編程如下，其中步驟2-4重復(fù)34次：1)94℃，5:00min，2)94℃，0:15min，3)55℃，0:30min，4)68℃，2:00min，5)68℃，7:00min，并且然后冷卻至4℃。使用10μl每種擴(kuò)增子和2.5μl5x染料通過凝膠電泳分析pcr產(chǎn)物。僅當(dāng)kanr基因已插入到基因組時(shí)，才能形成pcr產(chǎn)物。

實(shí)施例12.去除選擇標(biāo)志

用pcp20去除抗生素抗性基因。將具有缺失的argr的菌株在包含抗生素的lb培養(yǎng)基中在37℃生長直至使其達(dá)到od600為0.4-0.6。將所有管、溶液和比色皿預(yù)冷至4℃。將細(xì)胞在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于1ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.5ml的4℃水中。將大腸桿菌在4℃以2,000rpm離心5min，去除上清液，并將細(xì)胞重懸于0.1ml的4℃水中。將電穿孔儀設(shè)置為2.5kv。將1ngpcp20質(zhì)粒dna添加至細(xì)胞中，通過移液混合，并移液到無菌、冷的比色皿中。將干燥的比色皿置于樣品室中，并施加電脈沖。立即添加1ml室溫soc培養(yǎng)基，并且將混合物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)管中，并在30℃孵育1-3小時(shí)。將200μl細(xì)胞分散在氨芐青霉素板上，將200μl細(xì)胞分散在卡那霉素平板上，并且兩者都在37℃生長過夜。氨芐青霉素板包含帶有pcp20的細(xì)胞。將細(xì)胞孵育過夜，并且過夜未生長至足夠的od600的菌落再孵育另外24小時(shí)?？敲顾匕逄峁┝硕嗌偌?xì)胞在電穿孔中存活的指示。來自氨芐青霉素板的轉(zhuǎn)化體在43℃非選擇性純化并允許生長過夜。

實(shí)施例13.驗(yàn)證轉(zhuǎn)化體

測試純化的轉(zhuǎn)化體對氨芐青霉素和卡那霉素的敏感性。從在43℃生長的板挑取菌落，并將其重懸在10μl的lb培養(yǎng)基中。將3μl細(xì)胞懸浮液移液到三個(gè)板中的每一個(gè)上：1)在37℃孵育的帶有卡那霉素的lb板，其測試宿主菌株基因組中kanr基因的存在或不存在；2)在30℃孵育的帶有氨芐青霉素的lb板，其測試來自pcp20質(zhì)粒的ampr基因的存在或不存在；和3)在37℃孵育的無抗生素的lb板。如果對于特定菌落在卡那霉素或氨芐青霉素板上未觀察到生長，則kanr基因和pcp20質(zhì)粒兩者都損失，并且將菌落保留用于進(jìn)一步分析。將保留的菌落重新劃線到lb板上以獲得單菌落并在37℃下生長過夜。通過測序基因組的argr區(qū)域來確認(rèn)argr的缺失。

實(shí)施例14.精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶(arga^fbr)

除了以上描述的argr缺失以外，大腸桿菌nissle細(xì)菌還包含在以下每種啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的精氨酸反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶(arga^fbr，seqidno:28)基因：四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、選自seqidno:16-27的fnr啟動(dòng)子。如本文討論的，可以使用其他啟動(dòng)子。

arga^fbr基因在高拷貝質(zhì)粒、低拷貝質(zhì)?；蛉旧w上表達(dá)。syn-ucd201、syn-ucd202和syn-ucd203的每一個(gè)中的argr被缺失(δargr)。syn-ucd201還包含野生型arga，但缺乏誘導(dǎo)型arga^fbr。syn-ucd202包含δargr和在高拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下表達(dá)的arga^fbr。syn-ucd203包含δargr和在低拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下表達(dá)的arga^fbr。syn-ucd204包含δargr和在低拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下表達(dá)的arga^fbr。syn-ucd205包含δargr和在低拷貝質(zhì)粒上的fnr誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(fnrs2)的控制下表達(dá)的arga^fbr。

將arga^fbr基因以大腸桿菌nissle中的一個(gè)或更多個(gè)以下插入位點(diǎn)插入到細(xì)菌基因組中：male/k、arac/bad、lacz、thya、malp/t。可以使用任何合適的插入位點(diǎn)，參見，例如，圖22。插入位點(diǎn)可以是基因組中的任何地方，例如在存活和/或生長所需的基因中，諸如thya(以產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型)；在基因組的活躍區(qū)域，諸如基因組復(fù)制位點(diǎn)附近；和/或在趨異的啟動(dòng)子之間，以便降低諸如在阿拉伯糖操縱子的arab和arac之間的非預(yù)期轉(zhuǎn)錄的風(fēng)險(xiǎn)，。在插入位點(diǎn)，設(shè)計(jì)與插入位點(diǎn)和arga^fbr構(gòu)建體同源的dna引物。通過pcr產(chǎn)生包含與靶位點(diǎn)具有同源性的構(gòu)建體的線性dna片段，并如以上描述進(jìn)行λred重組。所得的大腸桿菌nissle細(xì)菌已經(jīng)缺失argr并插入反饋抗性n-乙酰谷氨酸合成酶，由此增加精氨酸或瓜氨酸生物合成。

實(shí)施例15.定量氨

將以上描述的遺傳工程化的細(xì)菌在5mllb中生長過夜。第二天，將細(xì)胞沉淀并在m9+葡萄糖中洗滌，沉淀，并重懸于3mlm9+葡萄糖中。將細(xì)胞培養(yǎng)物伴隨振搖(250rpm)孵育4小時(shí)，并在37℃在coy厭氧室(供應(yīng)90％n2、5％co2、5％h2)中需氧或無氧孵育。在基線(t＝0)、2小時(shí)和4小時(shí)，測量每種細(xì)胞培養(yǎng)物的od600，以確定每種細(xì)胞的相對豐度。

在t＝0、2小時(shí)和4小時(shí)，在novabiomedicalbioprofileanalyzer300上分析每種細(xì)胞培養(yǎng)物的1ml等分試樣，以確定培養(yǎng)基中氨的濃度。syn-ucd101和syn-ucd102兩者都能體外消耗氨。圖28a、b和c描繪了使用syn-ucd202、syn-ucd204、syn-ucd103和空白對照的氨濃度條形圖。

實(shí)施例16.定量精氨酸和瓜氨酸

在一些實(shí)施方案中，將以上描述的遺傳工程化的細(xì)菌在37℃在lb中伴隨振搖生長過夜。將細(xì)菌在5mllb中以1:100稀釋，并在37℃伴隨振搖生長1.5小時(shí)。細(xì)菌培養(yǎng)物如下誘導(dǎo)：(1)在37℃在coy厭氧室的厭氧條件(供應(yīng)90％n2、5％co2、5％h2和20mm硝酸鹽)下，將包含fnr誘導(dǎo)型arga^fbr的細(xì)菌在37℃在lb中誘導(dǎo)多達(dá)4小時(shí)；(2)將包含四環(huán)素誘導(dǎo)型arga^fbr的細(xì)菌用無水四環(huán)素(100ng/ml)誘導(dǎo)；(3)將包含阿拉伯糖誘導(dǎo)型arga^fbr的細(xì)菌在缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基中用1％阿拉伯糖誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)之后，從培養(yǎng)箱中取出細(xì)菌細(xì)胞，并以最大速度離心5分鐘。將細(xì)胞重懸于1mlm9葡萄糖中，并測量od600。將細(xì)胞稀釋直至od600在0.6-0.8之間。將重懸的細(xì)胞在37℃在m9葡萄糖培養(yǎng)基中伴隨震搖需氧生長。取出100ul細(xì)胞重懸浮液，并在時(shí)間＝0時(shí)測量od600。將100ul等分試樣在圓底96孔板中冷凍于-20℃用于質(zhì)譜分析(lc-ms/ms)。在每個(gè)隨后的時(shí)間點(diǎn)，取出100ul的細(xì)胞懸浮液并測量od600；將100ul等分試樣在圓底96孔板中冷凍于-20℃用于質(zhì)譜分析。分析樣品中的精氨酸和/或瓜氨酸濃度。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，如通過質(zhì)譜法相對于od600確定的歸一化濃度用于確定每單位時(shí)間的精氨酸和/或瓜氨酸生產(chǎn)速率。

在一些實(shí)施方案中，將來自甘油儲(chǔ)備液的以上描述的遺傳工程化的細(xì)菌在瓊脂上劃線用于單菌落。挑取菌落并使其在3mllb中生長4小時(shí)或過夜，然后以2,500rcf離心5min。培養(yǎng)物在具有0.5％葡萄糖的m9培養(yǎng)基中洗滌。將培養(yǎng)物重懸于3ml具有0.5％葡萄糖的m9培養(yǎng)基中，并測量od600。培養(yǎng)物在具有0.5％葡萄糖、具有或不具有atc(100ng/ml)、具有或不具有20mm谷氨酰胺的m9培養(yǎng)基中稀釋，使得所有od600在0.4和0.5之間。取出每種樣品的0.5ml等分試樣，以14,000rpm離心5min，并且將清液取出并保存。將上清液冷凍于-80℃，并且將細(xì)胞沉淀冷凍于-80℃(t＝0)。將剩余的細(xì)胞伴隨振搖(250rpm)生長4-6小時(shí)，并在37℃在coy厭氧室(供應(yīng)90％n2、5％co2、5％h2)中需氧或無氧孵育。每兩個(gè)小時(shí)從每種樣品中取出一份0.5ml等分試樣，并測量od600。將等分試樣以14,000rpm離心5min，并取出上清液。將上清液冷凍于-80℃，將細(xì)胞沉淀冷凍于-80℃(t＝2、4和6小時(shí))。將樣品置于冰上，并使用質(zhì)譜法確定精氨酸和瓜氨酸水平。

對于細(xì)菌培養(yǎng)物上清液，在水中制備500、100、20、4和0.8ug/ml精氨酸和瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的樣品。在圓底96孔板中，將20ul樣品(細(xì)菌上清液或標(biāo)準(zhǔn)品)添加至80ul具有最終濃度為2μg/ml的l-精氨酸-¹³c6,¹⁵n4(sigma)和l-瓜氨酸-2,3,3,4,4,5,5-d7(cdn同位素)內(nèi)標(biāo)的水中。將板用pierceaseal箔熱密封并充分混合。在v-底96孔聚丙烯板中，將5μl稀釋的樣品添加至95μl衍生化混合物(85μl10mmnahco3ph9.7和10μl10mg/ml丹磺酰氯(dansyl-chloride)(稀釋在乙腈中)。將該板用thermaseal箔熱密封并充分混合。將樣品在60℃孵育45min用于衍生化，并以4000rpm離心5min。在圓底96孔板中，將20μl衍生化的樣品添加至180μl具有0.1％甲酸的水中。將該板用clearaseal片熱密封并充分混合。

使用thermotsqquantummax三重四極桿質(zhì)譜儀通過與串聯(lián)質(zhì)譜偶聯(lián)的液相色譜(lc-ms/ms)測量精氨酸和瓜氨酸。下表提供了lc-ms/ms方法的總結(jié)。

圖51描繪了在基線、2小時(shí)和4小時(shí)時(shí)來自syn-ucd101、syn-ucd102和空白對照的培養(yǎng)基中的體外氨水平的條形圖。syn-ucd101和syn-ucd102兩者都能體外消耗氨。

圖52描繪了在誘導(dǎo)(+atc)和非誘導(dǎo)(-atc)條件下由未修飾的nissle、syn-ucd201、syn-ucd202和syn-ucd203產(chǎn)生的體外精氨酸水平的條形圖。與未修飾的nissle和syn-ucd201相比，syn-ucd202和syn-ucd203兩者都能體外產(chǎn)生精氨酸。與syn-ucd202相比，syn-ucd203在非誘導(dǎo)條件下表現(xiàn)出較低水平的精氨酸產(chǎn)生。

圖24描繪了在誘導(dǎo)(+atc)和非誘導(dǎo)(-atc)條件下由syn-ucd103、syn-ucd201、syn-ucd202和syn-ucd203產(chǎn)生的體外精氨酸水平的條形圖。syn-ucd201包含δargr和無arga^fbr。syn-ucd202包含δargr和高拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素誘導(dǎo)型arga^fbr。syn-ucd203包含δargr和低拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素驅(qū)動(dòng)的arga^fbr。

圖25描繪了在誘導(dǎo)條件下由syn-ucd103、syn-ucd104、syn-ucd204和syn-ucd105產(chǎn)生的精氨酸和瓜氨酸的體外水平的條形圖。

圖26描繪了在氧氣的存在(+o2)或不存在(-o2)下，在誘導(dǎo)(+atc)和非誘導(dǎo)(-atc)條件下由syn-ucd103、syn-ucd205和syn-ucd204產(chǎn)生的體外精氨酸水平的條形圖。

圖27描繪了nissle體內(nèi)停留的圖。將鏈霉素抗性nissle經(jīng)由口服管飼施用至小鼠無需抗生素預(yù)處理。在施用后監(jiān)測來自總計(jì)六只小鼠的糞粒，以確定施用的nissle仍然停留于小鼠胃腸道內(nèi)的量。條代表施用至小鼠的細(xì)菌數(shù)目。線代表連續(xù)10天每天從糞便樣品回收的nissle的數(shù)目。

圖28a描繪了用未修飾的對照nissle或syn-ucd202處理的高氨血癥小鼠中的氨水平的條形圖，syn-ucd202是遺傳工程化的菌株，其中arg阻遏物基因被缺失，并且arga^fbr基因在高拷貝質(zhì)粒上的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。圖28b描繪了顯示在肝性腦病的taa小鼠模型中syn-ucd204相對于鏈霉素抗性對照nissle(syn-ucd103)和僅媒介物對照的體內(nèi)功效(氨消耗)的條形圖。圖28c描繪了在taa處理后24-48小時(shí)之間血氨濃度變化百分比的條形圖。

圖29描繪了用鏈霉素抗性nissle對照(syn-ucd103)或syn-ucd204處理的高氨血癥spf^ash小鼠中氨水平的條形圖。

測量了在atc或厭氧誘導(dǎo)物的存在或不存在下，遺傳工程化的細(xì)菌中的細(xì)胞內(nèi)精氨酸和分泌(上清)精氨酸產(chǎn)生，并與在相同條件下的相同菌株的對照細(xì)菌進(jìn)行比較。

測量了在atc或厭氧誘導(dǎo)物的存在或不存在下，遺傳工程化的細(xì)菌中遺傳工程化的細(xì)菌中在六個(gè)小時(shí)內(nèi)的總精氨酸產(chǎn)生，并與相同條件下的相同菌株的對照細(xì)菌進(jìn)行比較。

實(shí)施例17.遺傳工程化的細(xì)菌在高氨血癥和急性肝衰竭小鼠模型中的功效

野生型c57bl6/j小鼠用硫醇乙酰胺(taa)處理，巰基乙酰胺(taa)引起急性肝衰竭和高氨血癥(nicaise等，2008)。用未修飾的對照nissle細(xì)菌或如以上描述被工程化為產(chǎn)生高水平的精氨酸或瓜氨酸的nissle細(xì)菌處理小鼠。

在第1天，將50ml的細(xì)菌培養(yǎng)物生長過夜并沉淀。將沉淀以約10¹¹cfu/ml的終濃度重懸于5mlpbs中。通過下頜取血測量小鼠中的血氨水平，且氨水平由pocketchem氨分析儀(arkray)確定。將小鼠用100μl細(xì)菌(約10¹⁰cfu)管飼。將小鼠飲用水改為包含0.1mg/ml無水四環(huán)素(atc)和5％的蔗糖用于適口性。

在第2天，如以上描述制備細(xì)菌管飼溶液，并用100μl細(xì)菌管飼小鼠。小鼠繼續(xù)接受包含0.1mg/mlatc和5％蔗糖的飲用水。

在第3天，如以上描述制備細(xì)菌管飼溶液，并用100μl細(xì)菌管飼小鼠。小鼠繼續(xù)接受包含0.1mg/mlatc和5％蔗糖的飲用水。小鼠接受100μltaa(在0.5％nacl中，250mg/kg體重)的腹膜內(nèi)(ip)注射。

在第4天，如以上描述制備細(xì)菌管飼溶液，并用100μl細(xì)菌管飼小鼠。小鼠繼續(xù)接受包含0.1mg/mlatc和5％蔗糖的飲用水。小鼠接受100μltaa(在0.5％nacl中，250mg/kg體重)的另一次ip注射。通過下頜取血測量小鼠中的血氨水平，且氨水平由pocketchem氨分析儀(arkray)確定。

在第5天，通過下頜取血測量小鼠中的血氨水平，且氨水平由pocketchem氨分析儀(arkray)確定。從小鼠收集糞粒，以通過液相色譜-質(zhì)譜(lc-ms)確定精氨酸含量。比較了用遺傳工程化的nissle和未修飾對照nissle處理的小鼠中的氨水平。

實(shí)施例18.遺傳工程化的細(xì)菌在高氨血癥和ucd的小鼠模型中的功效

鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶是尿素循環(huán)酶，且包含spf-ash突變的小鼠表現(xiàn)出部分鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥，其作為人類ucd的模型。用未修飾的對照nissle細(xì)菌或如以上描述被工程化為產(chǎn)生高水平的精氨酸或瓜氨酸的nissle細(xì)菌處理小鼠。

用本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌(syn-ucd103、syn-ucd204)或以100ulpoqd的h2o對照處理60只spf-ash小鼠：h2o對照，正常食物(n＝15)；h2o對照，高蛋白食物(n＝15)；syn-ucd103，高蛋白食物(n＝15)；syn-ucd204，高蛋白食物(n＝15)。在第1天，將小鼠稱重并分選為組，以使每籠小鼠重量的變化最小化。將小鼠管飼，并且將具有20mg/latc的水添加至籠中。在第2天，小鼠在早晨和下午被管飼。在第3天，小鼠在早晨被管飼，并稱重，并且在給藥后4h抽取血液以獲得基線氨水平。小鼠在下午被管飼，且食物被更換為70％的蛋白食物。在第4天，小鼠在早晨和下午被管飼。在第5天，小鼠在早晨被管飼，并稱重，并在給藥后4h抽血以獲得氨水平。在第6天和第7天，小鼠在早晨被管飼。在第8天，小鼠在早晨被管飼，并稱重，并在給藥后4h抽血以獲得氨水平。在第9天，小鼠在早晨和下午被管飼。在第10天，小鼠在早晨被管飼，并稱重，并在給藥后4h抽血以獲得氨水平。在第12天，小鼠在早晨和下午被管飼。在第13天，小鼠在早晨被管飼，并稱重，并在給藥后4h抽血以獲得氨水平。分析血氨水平、體重和存活率(圖29)。

實(shí)施例19.nissle停留

未修飾的大腸桿菌nissle和本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌可例如被消化道或血清中的防御因子破壞?？梢杂?jì)算細(xì)菌在體內(nèi)的停留時(shí)間。下面描述使用大腸桿菌nissle的鏈霉素抗性菌株的非限制性實(shí)例。在替代實(shí)施方案中，計(jì)算本發(fā)明的遺傳工程化的細(xì)菌的停留時(shí)間。

將c57bl/6小鼠在動(dòng)物設(shè)施中適應(yīng)1周。在適應(yīng)一周以后(即第0天)，在1-3天將鏈霉素抗性nissle(syn-ucd103)經(jīng)由口服管飼施用至小鼠。小鼠未用抗生素預(yù)處理。施用的細(xì)菌，即接種物的量示于表4中。為了確定接種物的cfu，將接種物連續(xù)稀釋，并鋪板在包含鏈霉素(300μg/ml)的lb板上。將板在37℃孵育過夜，并計(jì)數(shù)菌落。

表4：經(jīng)由口服管飼施用的cfu

在第2-10天，從最多達(dá)6只小鼠收集糞粒(id號1-6；表5)。在包含pbs的管中稱重糞粒并均質(zhì)化。為了確定糞粒中nissle的cfu，將均質(zhì)化的糞粒連續(xù)稀釋，并鋪板于包含鏈霉素(300μg/ml)的lb板上。將平板在37℃孵育過夜，并計(jì)數(shù)菌落。

還收集第1天的糞粒，并鋪板在包含鏈霉素(300μg/ml)的lb板上，以確定是否存在小鼠胃腸道天然的為鏈霉素抗性的任何菌株。施用的nissle仍然停留于小鼠胃腸道內(nèi)的時(shí)間過程和量示于表5中。

圖27描繪了nissle體內(nèi)停留的圖。將鏈霉素抗性nissle經(jīng)由口服管飼施用至小鼠無需抗生素預(yù)處理。在施用后監(jiān)測來自總計(jì)六只小鼠的糞粒，以確定施用的nissle仍然停留于小鼠胃腸道內(nèi)的量。條代表施用至小鼠的細(xì)菌數(shù)目。線代表連續(xù)10天每天從糞便樣品回收的nissle的數(shù)目。

表5：nissle體內(nèi)停留