發(fā)明領域

本說明書涉及從藻類生產(chǎn)脂質的領域。其提供可用于生產(chǎn)具有高脂質含量和低葉綠素含量的藻類和藻類生物質的新方法。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的藻類生物質對培養(yǎng)用于生物燃料生產(chǎn)或其它精煉產(chǎn)品的藻類特別有用。

背景

在我們的全世界經(jīng)濟中藻類被看作是最有前途的生物質和生物燃料原材料生產(chǎn)者之一。據(jù)估計藻類油的區(qū)域生產(chǎn)潛能在世界上最佳的那些之中：現(xiàn)實估計顯示藻類油可以以20-30t/ha/年產(chǎn)量大規(guī)模生產(chǎn)。這可與其它植物油的生產(chǎn)力相比較，其范圍從低于1到至多6t/ha/年(例如菜籽油、棕櫚油)。另外，藻類培養(yǎng)可位于不肥沃的、低質量的土地區(qū)域。除了土地使用益處之外，溫室氣體減少潛能高：計算顯示與化石燃料相比來自基于藻類油的生物燃料的排放可低于70-80%。認識到這些益處是重要的，因為生物燃料工業(yè)始終以更加可持續(xù)的原材料和土地使用以及發(fā)現(xiàn)新方法以減少溫室排放為目標。因此，所有的新原材料選項必須在進入大規(guī)模生產(chǎn)之前仔細評估。

雖然藻類被充分理解為用于生物燃料原材料生產(chǎn)的潛在和環(huán)境友好的選項，但至今資本費用和運行費用對于低價值的燃料市場太高。因此所有方法步驟需要實現(xiàn)總資本需求縮減的新的創(chuàng)新。資本費用主要由油生產(chǎn)力水平所驅動。術語“油生產(chǎn)力”的更深入分析顯示其由兩部分組成：生物質生產(chǎn)和脂質生產(chǎn)。這些性質之間的權衡在科學文獻中有良好記載，并且油生產(chǎn)力可通過仔細選擇品系、通過選擇正確的培養(yǎng)方案以及通過優(yōu)化收獲時間改善。為了降低資本投資，增加油生產(chǎn)力的方法是最重要的。

當從藻類生物質中提取油時，細胞葉綠素傾向于進入油級分并且葉綠素的濃度在最終的油中可高達1-3%。在植物油處理中，30-100ppm的葉綠素濃度已被認為是高的并且已觀察到在預處理和在油的催化加工中引起問題。葉綠素不能通過脫膠從油中除去并且漂白也是不經(jīng)濟的(甚至在植物油處理中)，因為其需要增加的量的漂白粘土，導致大量油損失。在油的精煉步驟中，葉綠素強烈吸附在催化劑的孔隙入口，其導致較慢的氫化速率。因此開發(fā)用于在短時間內生產(chǎn)足夠大量脂質的經(jīng)濟上可行的藻類脂質生產(chǎn)方法是困難的。

先前增加藻類脂質含量的方法通常使用氮限制，其也已被報道減少細胞葉綠素水平。脂質累積發(fā)生在細胞分裂和碳固定不平衡的應激條件期間，并且通常氮限制被認為是脂質累積的主要原因。當?shù)拗崎_始時，無新的含氮蛋白質可被代謝并且其它化合物，例如脂質和烴的生產(chǎn)增加。

光馴化為一種普遍注意到的現(xiàn)象，其中光合色素在強光下減少以平衡收獲的光量與細胞可利用的能量的量。傳統(tǒng)上藻類研究集中于探索不同光水平中的生長速率和評估不同光條件下的光合效率。

藻類中的高脂質生產(chǎn)力迄今已通過兩步培養(yǎng)方法達到：首先生產(chǎn)包含藻類的生物質，然后驅使細胞缺乏一些無機物(氮、磷或二氧化硅)。在該饑餓階段期間，細胞開始在其細胞內儲存脂質或淀粉，因為它們生產(chǎn)正常生物質的能力受限。

饑餓階段在具有高藻類生物質的培養(yǎng)中不容易達到并且其耗費長時間，從數(shù)天到數(shù)周。已經(jīng)評估肥育(fattening)期(脂質累積期間)從藻類培養(yǎng)的饑餓開始可耗費幾天到幾周，這對于培養(yǎng)藻類用于燃料生產(chǎn)太久。先前的方法并未成功將藻類細胞足夠迅速地從生長期轉變至油生產(chǎn)期以提供用于生物燃料生產(chǎn)的富含脂質的藻類生物質。

wo2012/006302公開了培養(yǎng)微藻類chlorococcumpamirum和增加油生產(chǎn)的方法。油累積通過氮或磷缺乏培養(yǎng)基或通過在整個培養(yǎng)期間用具有高于至少200μmolm^-2s^-1(p.5-6)的強度的光連續(xù)照射微藻類細胞誘導。用這些方法，藻類油含量可在一周至十天內增加。在整個培養(yǎng)階段期間將氮缺乏與恒定的高強度光照組合進一步增加油累積的速率但不增加最終的油含量(實施例3)。

us2012/0077253公開了在光生物反應器中用最佳和恒定的生長速率培養(yǎng)藻類持續(xù)更長時期的方法[0054-0056]。藻類細胞物質(cellmass)在培養(yǎng)期間進行監(jiān)測和控制以通過增加或減少光暴露和/或藻類物質(algalmass)保持發(fā)射光子與細胞密度的比率在定義的范圍內。所述方法僅通過在藻類品系的理想的特定光照射范圍內培養(yǎng)和通過避免光輻照度中的高峰值提供最佳油生產(chǎn)[0066]。在生長期期間，必須維持期需的特定照射水平[0067]。

脂質累積為培養(yǎng)藻類生物質中的重要步驟，因為貯存脂質通常為中性脂質，例如甘油三酯，其可在生物燃料處理中容易地用作原料。相反，結構脂質主要為極性脂質，例如磷脂和糖脂。因此在饑餓期間細胞的中性脂質的絕對量增加并且中性對極性脂質的份額增加。

因此本發(fā)明的一個目標為解決或減輕現(xiàn)有技術的至少一些上述問題。

發(fā)明概述

本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，通過耗盡細胞的營養(yǎng)物，特別是氮至引起營養(yǎng)物應激的水平，和基本上同時暴露細胞于高強度光，藻類細胞中葉綠素的量可減少并且脂質含量可增加。采用本發(fā)明方法，至脂質累積期的改變比采用常規(guī)方法更迅速地達到，其縮短培養(yǎng)和脂質生產(chǎn)所需的總時間，并且使得本發(fā)明方法對生產(chǎn)用于生物燃料生產(chǎn)的富含脂質的藻類特別有用并且經(jīng)濟上可行。

根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供生產(chǎn)藻類細胞的方法，包括以下步驟：

a.在支持生長的培養(yǎng)條件和光量下培養(yǎng)藻類細胞；

b.耗盡藻類細胞的至少一種無機營養(yǎng)物；和

c.連續(xù)暴露藻類細胞于比步驟a.中更高的光量；

其中步驟b.和步驟c.基本上同時開始。

所述方法具有培養(yǎng)的藻類細胞從生物質到脂質累積期較快轉換的優(yōu)點。因此，本發(fā)明方法可用于生產(chǎn)用于生物燃料生產(chǎn)的藻類生物質。

其它優(yōu)點為藻類細胞的脂質與葉綠素比率顯著增加。遭受到創(chuàng)新的營養(yǎng)物饑餓和強光處理的細胞快速地，甚至在幾小時內從生長階段轉變至脂質生產(chǎn)階段，它們包含比用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法(但是通常在幾天至幾周期間)達到的多140%的脂質和較低的葉綠素含量，這將它們的脂質:葉綠素比率提高17倍。

根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供使用上述方法生產(chǎn)的藻類。

包含本發(fā)明藻類細胞的藻類和藻類物質含有比使用至今已知的現(xiàn)有方法培養(yǎng)的相應藻類細胞更多的脂質和更少的葉綠素。

根據(jù)上述方法生產(chǎn)的藻類特別適用于生物燃料生產(chǎn)。包含采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的藻類細胞的生物質可在較短的培養(yǎng)時間內生產(chǎn)，并且藻類細胞富含脂質和包含比用現(xiàn)有技術方法可達到的更少的葉綠素。

根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供可通過從使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的藻類提取脂質獲得的脂質提取物。脂質提取可使用本領域已知的從藻類細胞提取脂質的任何方法進行。

根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，提供可通過將來自藻類(其使用上述方法生產(chǎn))的脂質和/或上述脂質提取物轉化為生物燃料獲得的生物燃料。

根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，提供本發(fā)明的藻類和/或本發(fā)明的脂質提取物在燃料生產(chǎn)中的用途。由于增加的脂質含量和減少的葉綠素含量，以及從生長期到脂質生產(chǎn)期的較快轉換，該用途特別有利，因為其縮短燃料生產(chǎn)中的總體處理時間并且通過減少對去除葉綠素的需求而簡化生產(chǎn)。

根據(jù)第六個方面，提供生產(chǎn)可再生生物燃料的方法，包括：根據(jù)本發(fā)明方法培養(yǎng)藻類細胞、從培養(yǎng)的藻類中分離脂質組分和使分離的脂質組分經(jīng)受化學反應以生成烴或脂肪酸的烷基酯，由此生產(chǎn)可再生生物燃料。

根據(jù)第七個方面，提供增加藻類細胞中的中性脂質與葉綠素比率的方法，包括

a.在支持生長的培養(yǎng)條件和光量下培養(yǎng)藻類細胞；

b.耗盡藻類細胞的至少一種無機營養(yǎng)物；和

c.連續(xù)暴露藻類細胞于比步驟a.中更高的光量；

其中步驟b.和步驟c.基本上同時開始。

根據(jù)第八個方面，提供脂質提取物減少生物燃料轉化單元中催化劑阻塞的用途，其中將藻類油轉化為生物燃料組分。本發(fā)明脂質提取物也可用于改善脂質到生物燃料的催化轉化。本發(fā)明脂質提取物通過改善藻類脂質到生物燃料轉化所需的催化劑的性能在生物燃料生產(chǎn)中特別有用，因為根據(jù)本發(fā)明方法所生產(chǎn)的藻類脂質葉綠素含量較低并且中性脂質含量較高。

不限于上述優(yōu)勢，本發(fā)明方法，產(chǎn)品和用途相對于可用現(xiàn)有培養(yǎng)方法所實現(xiàn)的得到改善，因為本發(fā)明方法更迅速地將藻類細胞從生長階段改變到脂質生產(chǎn)階段，并且產(chǎn)生具有增加的脂質與葉綠素比率的藻類。

本發(fā)明的不同實施方案將僅關于本發(fā)明的一些方面說明或已經(jīng)僅關于本發(fā)明的一些方面說明。技術人員理解，本發(fā)明一個方面的任何實施方案可應用于本發(fā)明的相同方面或本發(fā)明的其它方面。

附圖簡述

圖1公開第一個光實驗期間葉綠素和硝酸鹽(no3-n)濃度的進展。日變化是因為用新鮮的培養(yǎng)基稀釋。在12和17天時，將培養(yǎng)物用無氮培養(yǎng)基稀釋，引起no3濃度下降。當子樣品已經(jīng)采集用于不同光處理時，光偏移實驗期以灰色條帶示出。將葉綠素分析測量或從熒光估計。硝酸鹽在11-15天時測量。

圖2公開了光偏移實驗期期間的光劑量和取樣時間的安排。對于夜晚期將光關閉。

圖3公開了光實驗1。不同光水平下指數(shù)和穩(wěn)定生長期(氮饑餓)二者中三角褐指藻(p.tricornutum)ccap1055/1細胞數(shù)、chl(葉綠素)熒光(相對的)、尼羅紅熒光(相對的)、細胞特異性尼羅紅熒光、光合效率qy(相對的)、干重和硝酸鹽的進展。注意y刻度的不同。

圖4公開了光實驗1的生長速率。左上角：指數(shù)期(0-27小時)細胞數(shù)目的增長；右上角：穩(wěn)定期(0-11小時)細胞數(shù)目的增長；左下角：指數(shù)期(0-27小時)脂質(作為尼羅紅)的增長；右下角：穩(wěn)定期(0-11小時)脂質的增長。注意y標度差異。

圖5公開了指數(shù)和穩(wěn)定期期間光實驗中脂質與葉綠素比率的進展。下圖中將實驗開始時的值按比例調節(jié)為1。穩(wěn)定期的按比例調節(jié)結果顯示由于強光處理所致脂質:chl比超過14-17倍的增加。

圖6公開了光實驗2。在34h的時間段期間在不同光水平/處理中氮饑餓下三角褐指藻ccap1055/1細胞數(shù)目、chl熒光、尼羅紅熒光、細胞特異性尼羅紅熒光、光合效率、脂質(尼羅紅)與葉綠素濃度比、干重和硝酸鹽的進展。

圖7公開了光實驗3。在37h的時間段期間在兩個不同的光水平中氮饑餓下普通小球藻(c.vulgaris)細胞數(shù)目、chl熒光、尼羅紅熒光、細胞特異性尼羅紅熒光和作為葉綠素濃度指示的葉綠素吸收的進展。

圖8公開了光實驗3。從指數(shù)期到穩(wěn)定期轉變期間光實驗中脂質與葉綠素比率的進展。

詳述

在本發(fā)明方法中支持生長的培養(yǎng)條件為在其中藻類細胞生長和分裂的培養(yǎng)條件?？梢允褂猛ǔＳ糜谠孱惻囵B(yǎng)的任何生長培養(yǎng)基。支持生長的光量為藻類細胞接收的光強度，其足以允許細胞在所選的支持藻類細胞生長的條件下生長和分裂并且不抑制藻類細胞物質的累積。

無機營養(yǎng)物的耗盡可通過在達到期需的生物質濃度之后不用無機營養(yǎng)物補充生長培養(yǎng)基實現(xiàn)，借此無機營養(yǎng)物被藻類細胞耗盡。或者，細胞可通過離心或通過其它適合從生長培養(yǎng)基中分離活細胞的方法收獲，并轉移至新的耗盡至少一種無機營養(yǎng)物的生長培養(yǎng)基。然而，任何合適的方法可用于達到其中細胞處在不含至少一種無機營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中的情況。

在本發(fā)明某些實施方案中，無機營養(yǎng)物耗盡的水平足夠低以在藻類細胞中誘導營養(yǎng)物應激。耗盡的無機營養(yǎng)物可為氮并且誘導營養(yǎng)物應激的水平可為din=0(din=溶解的無機氮)，其可通過本領域已知的方法測定。該水平可與無機氮的檢測水平一樣低，或din=0。

步驟c.中連續(xù)暴露藻類細胞于高于步驟a.中用于培養(yǎng)細胞的光量可使用任何光源進行，所述光源能夠提供足夠的光以達到本發(fā)明的目標。

步驟b.與步驟c.基本上同時開始。優(yōu)選地，光暴露步驟c.在當細胞培養(yǎng)基中溶解的無機營養(yǎng)物在檢測限之下的時間之前的一次細胞分裂和之后的一次細胞分裂期間發(fā)生的時間點開始。在一個實施方案中光暴露恰在大多數(shù)藻類細胞在無機營養(yǎng)物耗盡前分裂最后一次之前開始。如本領域所熟知的，一次細胞分裂的時期可根據(jù)培養(yǎng)條件而不同并且一次細胞分裂的時期可根據(jù)本領域已知的方法測定。因此，開始步驟c.的光處理的適當時間點可通過測量無機營養(yǎng)物的濃度和細胞分裂活性的時期很容易地測定。因此，技術人員能夠基本上同時開始步驟b.和c.，即距無機營養(yǎng)物的量下降或經(jīng)估計下降到低于檢測限的時間點不早于且不晚于一次細胞分裂。

本發(fā)明方法提供具有高脂質含量和低葉綠素含量的藻類細胞生物質。這種生物質在生物燃料生產(chǎn)中有利，因為其減少從生物質中去除葉綠素的需要并且提供更多的脂質以轉化成生物燃料。

在一個實施方案中，上述方法用于增加藻類中或產(chǎn)自藻類的脂質提取物中的中性脂質與葉綠素比率。

在一個示例性實施方案中，本發(fā)明方法中耗盡的無機營養(yǎng)物可為氮、磷或二氧化硅。耗盡無機氮是優(yōu)選的，因為其為在藻類細胞中誘導脂質累積的普遍使用并且非常有效的方法。然而，其它營養(yǎng)物，例如磷或二氧化硅，也可用于誘導脂質累積。

在一個示例性實施方案中，上述步驟c.持續(xù)至少3小時。步驟c.也可進行長于3小時，例如3.5h、4h、4.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h、9h、9.5h、10h、10.5h、11h、11.5h、12h或更長。然而，與對照藻類相比，3小時足以增加脂質含量和減少葉綠素含量至使藻類適合于生物燃料生產(chǎn)的水平。

在一個示例性實施方案中，藻類細胞在誘導營養(yǎng)物耗盡之后12h或更久采集。在一個優(yōu)選的示例性實施方案中，藻類細胞在誘導營養(yǎng)物耗盡后12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36h采集。

在另一個示例性實施方案中，藻類細胞在誘導營養(yǎng)物耗盡之后1、2、3、4、5、6或7天采集。

在一個示例性實施方案中，步驟c.中藻類細胞暴露的光量相應于或超過ek，即光合作用不再受光限制的輻照度的量。光飽和參數(shù)ek作為ek=μmax/α給出，其中α為對于給定的藻類在生長速率與輻照度之間關系的起始斜率。在某一輻照度水平，生長速率達到平穩(wěn)期。光飽和的生長速率表示為μmax。技術人員能夠容易地使用本領域已知的方法測定任何藻類物種的ek。在一個實施方案中，步驟c.通過暴露藻類于具有相應于或超過所述藻類的ek、1.5xek、2xek或3xek的光水平的強度的光量下進行。優(yōu)選地光量在步驟c.中具有等于或低于在μmax時所需的強度。

在一個示例性實施方案中，步驟c.中光量可為至少100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、560、600、650、700、750、800、850、900、950、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950或2000μmol光子m^-2s^-1。

在一個實施方案中，步驟a.中細胞暴露的光量具有低于所述藻類的ek的強度。

在一個示例性實施方案中，培養(yǎng)使用晝夜光周期進行。本發(fā)明晝夜光周期的實例為12h光照期和12h黑暗期(12-12周期)、11-13周期、8-16周期或任何天然存在的光-暗期，或模擬白天和黑夜之間的正常周期性的周期。光暴露期在步驟c.中給予并且包括在光照期中以保持本發(fā)明方法期間的總周期長度不變。

在一個示例性實施方案中，強光處理在白天時期開始時給予并且光量在其余的白天時期中保持基本恒定。優(yōu)選地，細胞接收的光量在光處理期間保持在基本恒定的高水平并在其余的白天時期中保持在基本恒定的較低水平。

在一個示例性實施方案中，上述步驟c.在每一連續(xù)的白天時期開始時重復，只要方法繼續(xù)并直至收獲藻類生物質。

藻類細胞優(yōu)選在其尚未進入穩(wěn)定生長期時開始暴露于光處理。然而，在細胞已達到穩(wěn)定期的情況下用本發(fā)明方法也可增加脂質含量和減少葉綠素含量。在任何一種情況下光處理均直至營養(yǎng)物耗盡開始才給予。

實施例

提供下述實施例以說明本發(fā)明的各個方面。其不意在限制本發(fā)明，本發(fā)明由所附的權利要求定義。

藻類細胞中的光和饑餓作用在活躍生長的藻類細胞(指數(shù)生長)和達到穩(wěn)定期的藻類細胞二者中均進行研究。檢驗四種光水平，即60、200、600和1700μmol光子m^-2s^-1，其代表穿透藻類培養(yǎng)至2.2、1.4、0.7和0cm深處的正常日光水平(假設藻類生物質濃度為1gdwl^-1，葉綠素含量為1%dw)?；A光水平60μmol光子m^-2s^-1為參考對照值，增加的光的影響與其比較。因為水平200光子m^-2s^-1足夠高以在作為脂質生產(chǎn)者的藻類細胞生理學和行為中觀察到明顯作用，所以我們能夠鑒定導致強影響的最小光水平與物種特異性生長-輻照度關聯(lián)的關系。單獨實驗用連續(xù)光劑量和用秒或分鐘標度的脈沖運行。當額外光連續(xù)給予至少3小時時，獲得最佳結果，即最快改變至脂質累積期和最高的藻類細胞的脂質：葉綠素比率。

藻類生物質以最大特定生長速率生產(chǎn)，并且小心監(jiān)測氮水平以便當培養(yǎng)基中無機氮在檢測限之下時立即開始光活化實驗。實驗的細胞密度是有意低的以避免細胞遮蔽以及在整個培養(yǎng)時間期間為所有細胞提供相同的光條件。

使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的藻類比參考條件下獲得的藻類具有高脂質含量和更低的葉綠素含量。本發(fā)明藻類在用于生物燃料生產(chǎn)時特別有用，因為，除高脂質含量外，藻類細胞包含較少的葉綠素，葉綠素在脂質生產(chǎn)中引起問題并且難以從藻類生物質中去除。

實施例1

第一個實施例使用三角褐指藻ccap1055/1進行，因為其具有高生長速率，易于培養(yǎng)并且葉綠素分析可靠。將細胞在n-充滿的培養(yǎng)基中使用6psu(8.12mgno3-n)的鹽度培養(yǎng)。將藻類在60μmolqm^-2s^-1培養(yǎng)并且通過用營養(yǎng)物充滿的培養(yǎng)基稀釋保持在指數(shù)期。將藻類濃度保持較低以避免自遮蔽。每日稀釋使葉綠素水平保持相對低(大約100-200μgl^-1)，因此培養(yǎng)單元內部的光條件在整個實驗中保持相似(圖1)。在這些葉綠素水平下，大致80-90%的氮處于無機形式(no3)，僅10-20%在細胞中吸收。培養(yǎng)體積在實驗期間逐漸增加，從開始的1.8l到實驗時期的15-17l。這允許我們具有幾個單元(每一1.5l)用于光偏移實驗。光偏移實驗在12天(指數(shù)生長期)時和在17天(穩(wěn)定生長期)時開始(圖1)。在實驗中，將藻類培養(yǎng)物分成幾個子樣品，在不同光處理下孵育。持續(xù)27小時的光處理使用四種光水平(60、200、600&1700μmolqm^-2s^-1，led光源sl3500，光子系統(tǒng)儀器(photonsystemsinstruments))進行，最低的和最高的光水平具有重復培養(yǎng)物。在所有光實驗中，光在夜晚關閉(在12h測量后關閉并且打開取樣用于24h測量)(圖2)。將培養(yǎng)物保持在2l聚碳酸酯瓶子中，連續(xù)充氣(空氣泵容量550ml/h)，當使用這樣的低生物質時其足以保持ph和無機碳水平恒定。使用高通風，將大部分溶解的氧除去并摻入足夠的二氧化碳以保證在我們的試驗中co2不是生長限制因素。無機磷在光偏移實驗期間測量，并且其總是超過0.4mgl^-1，因此對于藻類生長是過量的。第一個測量時期在指數(shù)期進行。第二個測量時期發(fā)生在向穩(wěn)定期轉變時，營養(yǎng)物限制開始時。對于該目的，將部分原始培養(yǎng)物在60μmolqm^-2s^-1培養(yǎng)直至no3耗盡(圖1)。

在實驗中，測量細胞的量(flowcam)、脂質累積(尼羅紅)和細胞的光生理學(aquapen)。光生理學測量包括光吸收、chl含量和光化學活性(使用可變熒光技術)。后者使用熒光-輻照度曲線技術(快速光曲線，suggett等人2003)測量。對于該分析，從每一培養(yǎng)物獲取子樣品，對于其它分析，熒光誘導曲線使用各種光水平測量。從熒光響應對光水平曲線中計算典型的生產(chǎn)-光合作用參數(shù)(macintyre等人2002)。

在指數(shù)期，光劑量影響生長速率，但顯然生長在200μmolqm^-2s^-1處已經(jīng)飽和(圖3&4)。在最低的光下細胞數(shù)目增加2.5倍，而在較高的輻照度下增加3倍。營養(yǎng)物分析顯示平均硝酸鹽和磷酸鹽濃度為7600和590μgl^-1。這些值是非常高的，而且在實驗期間幾乎沒有觀察到任何減少(圖3)?；诳勺儫晒鉁y量，在最高光水平下生長的細胞稍微被過量的光應激。在那種光水平下，fv/fm(或qy)值為大約0.50，而其它培養(yǎng)物顯示大約0.60的值，其對于非應激細胞是典型的(sepp?l?2009)。作為強光馴化，葉綠素濃度或熒光沒有像細胞數(shù)目一樣改變那么多(圖3&5)。雖然細胞在強光中比在弱光中分裂更快，但是它們在強光中不制造任何新的葉綠素。這在細胞葉綠素含量的結果中明顯可見，其顯示葉綠素含量在一天內減少50%(圖5)。葉綠素與干重比(圖5)沒有顯示葉綠素含量的相似減少，但是必須指出干重測量并不是非常可靠，特別對于在指數(shù)期第一個小時獲取的樣品。部分過量的光能量用于制造脂質，并且在較強光下細胞的脂質含量是60μmolqm^-2s^-1下的脂質含量的2倍(圖3)。當將此與葉綠素含量減少相結合時，脂質與葉綠素比率迅速增加，并且與輻照度在60μmolqm^-2s^-1的生長相比，在飽和輻照度水平下為2.5-3.5倍(圖3)。當著眼于脂質生產(chǎn)的速率時，培養(yǎng)物之間的許多差別看起來是由于在最弱光下降低的脂質生產(chǎn)速率所致(圖4)。在其它培養(yǎng)物中脂質生產(chǎn)速率比細胞生長速率略高，如同樣在大致20-40%的其脂質/細胞增加值中見到的。

穩(wěn)定期開始時，細胞生長在最低光水平下與在指數(shù)期相當相似。在較高光水平下生長甚至比第一部分實驗期間更高。營養(yǎng)物結果表明氮在第二部分實驗開始時消耗，因此并未在很大程度限制生長(圖3)。作為氮限制的第一個標志，葉綠素含量不以與細胞數(shù)目相同的速率增加，引起更迅速的細胞葉綠素含量減少，甚至在最低的光水平下?？勺儫晒馑綄τ诘谝粋€光照期相當高，除了最高的光處理，其指示比指數(shù)生長期期間更高的光應激。最高的值接近理論最大值0.65-0.70，其可在健康細胞中獲得(sepp?l?2009)。在那些樣品中葉綠素熒光也下降，表明熒光通過非光化學猝滅減少。在最強光下，與最低光水平相比，葉綠素濃度在24小時期間減少35%。因為在穩(wěn)定期實驗結束時細胞數(shù)目在最低和最高光水平下相當相似，由于強光處理細胞葉綠素份額也減少大致30%(圖3)。

脂質在氮耗盡后開始迅速增加。在11小時內尼羅紅熒光與時期開始時相比為4-7倍(圖3)，導致比細胞生長速率高得多的生產(chǎn)速率(圖4)。連同葉綠素含量的減少，脂質與葉綠素比率的改變甚至更顯著。該增加持續(xù)整個實驗過程，并且結束時觀察到多達17倍的比率增加(圖5和表1)。

在穩(wěn)定期，看起來營養(yǎng)物應激組合強光應激減少生長，引起chl熒光(非光化學猝滅或光損傷)的很大減少和光化學活性的減少。然而，脂質增加在所有強光物中相等。當在強光下生長時，細胞中葉綠素的相對減少沒有損害脂質生產(chǎn)。

表1.光實驗1期間尼羅紅熒光和尼羅紅熒光與葉綠素濃度之間比率的相對增加

實施例2

第二個實驗部分重復第一個實驗，但是僅使用光水平60和200μmolqm^-2s^-1并且測量期僅在向穩(wěn)定期轉變時。另外我們檢驗了以不同脈沖供給光的模式是否對脂質累積和光生理學有作用。這通過在測量期間應用脈沖光進行。脈沖以秒-分鐘標度(45秒弱光，15秒強光)或分鐘-小時標度(45min弱光，15min強光)進行。光水平為弱光=60μmolqm^-2s^-1并且強光=600μmolqm^-2s^-1。對于兩種脈沖光處理，累積的光劑量等于200μmolqm^-2s^-1連續(xù)水平的累積光劑量。

細胞生長在200μmolqm^-2s^-1恒定光時最高(圖6)。相似地，最高的脂質產(chǎn)量(絕對的，每細胞或每葉綠素)使用這種處理獲得。根據(jù)生長曲線看起來很明顯，細胞不能使用由光脈沖提供的額外能量。細胞數(shù)目在脈沖光下甚至比弱光下略低。在實驗期間脈沖或特別是較高的光水平降低光合效率。

細胞的葉綠素含量(圖7)如第一個實驗中減少，但是再次，脈沖處理看起來不影響細胞葉綠素含量。光處理對光譜吸收的作用低于第一個實驗。同樣的，在光-熒光關系中，參數(shù)在弱和強光中和在脈沖光條件下具有十分相似的范圍。這表明在該實驗期間細胞非常低的動態(tài)光馴化能力，正如第一個實驗的后半部分。色素沉著和脂質含量在第一個和第二個實驗之間的輕微差異可通過細胞營養(yǎng)物狀態(tài)的輕微偏移解釋。當著眼于氮濃度時，在第二個實驗的起始階段所觀察到的相似值(大約30μgno3-nl^-1)在第一個實驗的2-3小時發(fā)現(xiàn)。因為no3吸收在黑暗期可較低，氮限制進展之間的實際差異可比該時間差異稍微長些。結果表明第二個實驗開始的值與第一個實驗的4-11小時(穩(wěn)定期)的值十分相似。因此我們可認為第二個實驗顯示其中營養(yǎng)物限制已比第一個實驗中稍微進一步進展的情況。這可部分解釋為什么在第二個實驗中響應比在第一個實驗中弱；在第二個實驗中細胞已受到更多的氮限制。

根據(jù)此處收集的實驗數(shù)據(jù)，很可能用于色素和脂質累積改變的時間標度為從數(shù)小時到數(shù)天，因為較短的分鐘或秒標度光脈沖不引起這種強馴化。

實施例3

實驗使用綠色藻類普通小球藻(chlorellavulgaris)進行?；谙惹暗膶嶒灒覀儍H使用兩種光處理，并且樣品在光照期開始和結束時采集，持續(xù)兩天。在實驗的11至24小時之間，細胞處于黑暗中，而在其它時間在給定輻照度下。如同對于先前的實驗，首先將細胞在最低輻照度(此處，80μmolqm^-2s^-1)下培養(yǎng)。在由于氮耗盡從指數(shù)期到穩(wěn)定期的開始時，將培養(yǎng)物分成四瓶。

普通小球藻在強光時在細胞數(shù)目和脂質兩方面顯示高生長(圖8)。脂質增加的時間發(fā)生在細胞生長已停止之后，在氮限制條件期間第一個光照期之后。細胞生長的停止非常迅速并且細胞脂質的增加為2倍。較高的光劑量導致稍微高的脂質與葉綠素比率。雖然強光下在最后的樣品中注意到藍與紅吸收比的輕微增加，但是色素沉著不響應于光水平的增加。

前述說明通過本發(fā)明具體實施方式和實施方案的非限制性實施例，提供了發(fā)明人目前考慮的用于實施本發(fā)明的最佳方式的完整和提供信息的描述。然而對于本領域技術人員清楚的是，本發(fā)明不受前文呈現(xiàn)的實施方案的細節(jié)限制，而是其可在其它實施方案中使用等同方法或以實施方案的不同組合實現(xiàn)，而不偏離本發(fā)明的特征。

此外，本發(fā)明前面公開的實施方案的一些特征可用于無其它特征的相應使用而獲益。正因如此，前述說明應該被認為僅僅是本發(fā)明原理的說明，而非其限制。因此，本發(fā)明的范圍僅受所附的專利權利要求書限制。