本專利涉及一種藻類混合培養(yǎng)方法，具體涉及一種絲狀綠藻和底棲硅藻混合培養(yǎng)方法，屬于藻類生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

硅藻種類繁多、分布廣泛，富含的多種營養(yǎng)物質(zhì)，包括高不飽和脂肪酸（EPA、DHA）、多糖、蛋白質(zhì)等，作為水域生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)經(jīng)濟動物幼體的培育餌料。

尤其是底棲型硅藻，在匍匐生長的鮑、海膽、海參等名貴海洋經(jīng)濟動物培育過程中，是其浮游幼體附著、變態(tài)過程必須的誘導(dǎo)物和重要餌料。

底棲硅藻的質(zhì)量和生物量是海產(chǎn)經(jīng)濟動物育苗成功的關(guān)鍵因素之一，影響苗種的生長速率和存活率。而且作為一種鮮活的餌料，硅藻在養(yǎng)殖水體中還具有調(diào)節(jié)水質(zhì)、控制水體富營養(yǎng)、減少養(yǎng)殖動物疾病的作用，應(yīng)用的潛力較大。

底棲硅藻油脂含量高，均能分泌胞外多聚物，如圖1所示，其主要成分是多糖。底棲硅藻在水體凈化、生物質(zhì)能源以及活性物質(zhì)開發(fā)等方面存在巨大的潛在價值。

絲狀綠藻，因藻體呈絲狀而得名，以綠藻種類居多，常見有硬毛藻和剛毛藻。藻細胞含有纖維束、木質(zhì)素、多糖、蛋白質(zhì)等成分，色素中以葉綠素A和B最多，還有葉黃素和胡蘿卜素，故呈綠色，并且細胞壁的成分主要是纖維素。

絲狀綠藻具有很高的經(jīng)濟社會和環(huán)保價值，可作食品、飼料或提取蛋白質(zhì)、脂肪、葉綠素和核黃素等多種產(chǎn)品，或可作為藥用，或用來處理生活污水和工業(yè)污水等用途。

現(xiàn)有技術(shù)中藻的培養(yǎng)主要是單一藻種類培養(yǎng)模式為主，通過尋找適合藻生長繁殖的最佳條件如溫度、光照、營養(yǎng)鹽和培養(yǎng)方式等因素進行藻類培養(yǎng)以最大限度提高其生物量，從而獲得預(yù)想的培養(yǎng)效果。

現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于底棲硅藻的培養(yǎng)一般置于培養(yǎng)容器中，如圖2所示，使底棲硅藻附著于培養(yǎng)容器內(nèi)壁進行培養(yǎng)，但該方法對于底棲硅藻的培養(yǎng)具有生長空間有限、生物量采收困難的缺陷，從而大大限制了其生物量的擴增及其應(yīng)用。

同時，項目組也檢索發(fā)現(xiàn)采用載體培養(yǎng)底棲硅藻的方法，使用的載體為多聚物或者藻粉，這些載體能夠增加底棲硅藻的附著面積，但附著底棲硅藻的載體仍然沉于培養(yǎng)容器底部，光照、培養(yǎng)空間和營養(yǎng)物質(zhì)仍難以充分利用，而且隨著培養(yǎng)時間的延長，載體存在分解或變質(zhì)的問題，從而影響培養(yǎng)水質(zhì)環(huán)境。

目前，項目組通過檢索未發(fā)現(xiàn)關(guān)于不同種類藻混合培養(yǎng)模式的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提出了一種藻類混合培養(yǎng)方法，尤其是一種絲狀綠藻和底棲硅藻混合培養(yǎng)方法，該方法根據(jù)兩種藻類自身的生物特性，充分利用了培養(yǎng)空間，培養(yǎng)方法更加生態(tài)環(huán)保，避免了上述載體培養(yǎng)底棲硅藻中存在的問題，并且進一步極大的提高了底棲硅藻的生物量，實現(xiàn)兩種藻類的高密度培養(yǎng)，兩種藻的混合培養(yǎng)使其生物量更便于在環(huán)境、餌料、飼料等方面實現(xiàn)綜合利用。同時，該方法也解決了現(xiàn)有技術(shù)中底棲硅藻不易采收的問題。

一種絲狀綠藻和底棲硅藻混合培養(yǎng)方法，具體技術(shù)方案如下，

步驟1，分別培養(yǎng)制備接種用底棲硅藻泥和絲狀綠藻；

步驟2，將步驟1制備的絲狀綠藻按照濕重質(zhì)量占整個培養(yǎng)體積的10%-50%置入培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)2~5天，然后按照接種的絲狀綠藻濕重的0.5%-5%的質(zhì)量接種步驟1制備的培養(yǎng)用底棲硅藻藻泥；

本發(fā)明中所用述語“濕重”是指接種微藻培養(yǎng)時，采用質(zhì)量占體積方法；

步驟3，將接種后的底棲硅藻和絲狀綠藻混合培養(yǎng)，混合培養(yǎng)過程中可根據(jù)藻類的不同調(diào)控利于底棲硅藻和絲狀綠藻生長的培養(yǎng)條件，促進藻類的生長，直至絲狀綠藻藻體表面呈現(xiàn)底棲硅藻的顏色時停止培養(yǎng)；

步驟4，將絲狀綠藻撈取并包裹于紗布中進行搓洗，將搓洗后的溶液自然沉降，然后過濾沉降物或離心處理可得底棲硅藻，紗布中得底棲硅藻和絲狀綠藻的混合物。

圖3為絲狀綠藻和底棲硅藻混合培養(yǎng)照片。如圖4所示，混合培養(yǎng)時絲狀綠藻的藻絲表面長滿底棲硅藻，圓圈部分所示為附著的較多底棲硅藻。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，該方法實現(xiàn)了混合培養(yǎng)，采用生態(tài)的方法擴大了培養(yǎng)數(shù)量級，尤其是經(jīng)濟價值較高的底棲硅藻的培養(yǎng)數(shù)量級，從而進一步提高了藻類的培養(yǎng)量，同時充分利用了培養(yǎng)空間和營養(yǎng)條件；其次，該方法采收方便、簡單，可實現(xiàn)單種分離，也可以混合使用，兩種藻類混合作為飼料使用時，可以實現(xiàn)增加飼料營養(yǎng)物質(zhì)多樣性的目的；最后，混合培養(yǎng)物藻體營養(yǎng)物質(zhì)具有更加多樣化的優(yōu)點。

并且，通過混合培養(yǎng)獲得兩種藻類混合生物量，共同吸收水體中過多營養(yǎng)鹽，凈化效率提高，同時，絲狀藻形成的藻網(wǎng)膜還可有效過濾吸附水體中懸浮雜物，實現(xiàn)更高效凈化廢水的作用。

底棲硅藻能夠分泌胞外多聚物，具有極強吸附生長的特性；絲狀綠藻，外形多半為線狀、刷狀或棉花狀，具有很強過濾吸附性，同時絲狀綠藻占據(jù)培養(yǎng)水體空間生長，藻體之間遮擋少，透光性好，能夠有效減少如像片狀藻體對光線的遮擋。

本方法的關(guān)鍵點在于利用底棲硅藻強吸附生長的特性和絲狀綠藻自身的過濾吸附性，將兩種藻類混合培養(yǎng)，底棲型硅藻附著于絲狀綠藻生長，同時利用了絲狀綠藻占據(jù)培養(yǎng)水體空間生長的特性，增大底棲硅藻的培養(yǎng)空間，充分利用營養(yǎng)物質(zhì)和光照，從而進一步提升了底棲硅藻的培養(yǎng)數(shù)量級，達到底棲硅藻高密度培養(yǎng)的目的。

另外，由于絲狀綠藻與底棲硅藻從形態(tài)、顏色等方面的不同，培養(yǎng)過程可以清楚的對藻類生長情況進行觀察。最后，培養(yǎng)結(jié)束后通過搓洗絲狀藻體分別采收底棲硅藻單種和混合培養(yǎng)物，從而解決了單種藻類尤其是經(jīng)濟價值更高的底棲硅藻的單種藻類采收問題。

附圖說明

圖1為菱板藻掃描電子顯微鏡照片。

其中，圖中箭頭所示為分泌的胞外多聚物。

圖2為底棲硅藻的單種培養(yǎng)照片。

圖3為絲狀綠藻和底棲硅藻混合培養(yǎng)照片。

圖4為圖3中底棲硅藻附著于絲狀綠藻的局部圖。

圖5為實施例1與對應(yīng)的單種藻類分別培養(yǎng)的對比圖。

具體實施方式

一種絲狀綠藻和底棲硅藻混合培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟1，底棲硅藻/絲狀綠藻的單種暫養(yǎng)

底棲硅藻生物量的擴大培養(yǎng)，將底棲硅藻種中加入含10-30mg/L硅酸鈉的f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述f/2培養(yǎng)基中氮素也可用尿素替代，培養(yǎng)過程中溫度控制在15℃-25℃，持續(xù)光照控制在1000Lx-5000Lx，鹽度控制在30‰-35‰，pH控制在 7.5-8.5，培養(yǎng)期間可充氣；培養(yǎng)7-10天后，對培養(yǎng)的底棲型硅藻進行4000轉(zhuǎn)/min離心處理10min-20min，去上清并收集培養(yǎng)用底棲硅藻藻泥；

選取藻體鮮綠、生長狀態(tài)良好的絲狀綠藻進行暫養(yǎng)，暫養(yǎng)過程中，絲狀綠藻濕重控制在0.5kg/L-1kg/L，培養(yǎng)過程中溫度控制在5℃-23℃，鹽度控制在30‰-35‰，自然光照控制在1000Lx-10000Lx，每天換水1/3-1/2，自然海水培養(yǎng)2天后得培養(yǎng)用絲狀綠藻；

步驟2，接種

取步驟1的培養(yǎng)用絲狀綠藻置入培養(yǎng)容器，使得接種的絲狀綠藻的濕重質(zhì)量占整個培養(yǎng)體積的10%-50%，添加適當(dāng)營養(yǎng)鹽培養(yǎng)2-5天，然后按照接種的絲狀綠藻濕重的0.5%-5%的質(zhì)量接種步驟1制備的培養(yǎng)用底棲硅藻藻泥，所述底棲硅藻藻泥接種時將其用適當(dāng)海水懸浮后倒入進行混合培養(yǎng)，使得底棲硅藻附著至絲狀綠藻上；

步驟3，混合培養(yǎng)

混合培養(yǎng)過程中溫度控制在15℃-25℃，一天中光照時間控制在8h-12h，其它時間為黑暗，其中，持續(xù)同一強度光照時，光照強度保持在5000-10000Lx；非持續(xù)同一強度光照時，可逐漸改變光照強度，光照強度在開始的5h內(nèi)從1000Lx開始逐漸增強至15000Lx，然后保持最強光照1-2.5h后，剩余時間內(nèi)光照逐漸減弱至黑暗；該步驟中可適當(dāng)充氣，但充氣體量不宜過大；

按照上述條件培養(yǎng)7-15天，直至觀察到絲狀綠藻藻體表面呈現(xiàn)底棲硅藻的顏色時停止培養(yǎng)，進行分離；

步驟4，底棲硅藻/絲狀綠藻的采收

停止培養(yǎng)后，將絲狀綠藻撈取并包裹于紗布中進行搓洗，將搓洗后的溶液自然沉降，然后過濾沉降物或離心處理可得底棲硅藻，紗布中得底棲硅藻和絲狀綠藻的混合物。

采用該方法得到的底棲硅藻每毫升含硅藻細胞10⁸以上，均可在環(huán)境、養(yǎng)殖、化學(xué)等方面進行生物量的利用。

優(yōu)選，步驟2和步驟3中添加f/4-f/2培養(yǎng)基或硅酸鈉，或添加尿素、硝酸鈉、硝酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉中的任意一種或多種。

優(yōu)選，步驟3混合培養(yǎng)開始的1-3天內(nèi)不充氣、不攪動，利于底棲硅藻附著，增強附著效果。

若底棲硅藻和絲狀綠藻混合使用，優(yōu)選步驟3培養(yǎng)至硅藻有脫落現(xiàn)象時采收。

步驟4采收后的絲狀綠藻藻體上會存有少量的底棲硅藻，根據(jù)培養(yǎng)體系中營養(yǎng)物質(zhì)含量和底棲硅藻的密度，優(yōu)選，步驟4采收得的底棲硅藻和絲狀綠藻的混合物可添加營養(yǎng)鹽或硅藻種子液，可直接進行下一次混合培養(yǎng)。

為進一步對上述發(fā)明方法予以說明，列舉以下具體實施例。以下實施例有助于對本發(fā)明的進一步了解，但本發(fā)明并非限于這些內(nèi)容。

實施例1

強壯硬毛藻與菱形藻混合培養(yǎng)

1）強壯硬毛藻暫養(yǎng)和菱形藻擴大培養(yǎng)

強壯硬毛藻暫養(yǎng)，將生長健康、顏色鮮綠的強壯硬毛藻濕重5kg-5.5kg，放入裝有10L消毒海水的玻璃缸中，室溫15℃-20℃，鹽度31‰-33‰，自然光照5000Lx-7000Lx，充氣培養(yǎng)，每天吸底并換海水2L-3L，暫養(yǎng)2天后使用。

菱形藻的擴大培養(yǎng)，將藻種按10%接種含25-30mg/L硅酸鈉的f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中室溫15℃-20℃，光照4000Lx-5000Lx，鹽度31‰-33‰，pH 7.5-8.5，充氣培養(yǎng)10天密度達到10⁵cell/mL，離心收集藻泥。

2）接種

將步驟1）暫養(yǎng)的強壯硬毛藻0.5kg（濕重）投入裝有4L消毒海水培養(yǎng)缸，添加35-40mg/L硝酸鈉、2-3mg/L磷酸二氫鈉，充氣培養(yǎng)2-3天后，接種步驟1）獲得的5g菱形藻藻泥，將藻泥用適當(dāng)消毒海水懸浮后倒入進行混合培養(yǎng)。同時進行兩種藻單種培養(yǎng)作為對照。

3）混合培養(yǎng)

培養(yǎng)溫度20℃，光照強度2000-5000Lx，光照周期日照：黑暗為8h：16h，培養(yǎng)2天后開始適當(dāng)充氣，氣體量不宜過大。每天輕微攪動1次。培養(yǎng)5-8天追加少量硝酸鈉、磷酸二氫鈉和硅酸鈉。強壯硬毛藻藻體表面出色褐色斑點，增強光照使培養(yǎng)體系中心達到3000-5000Lx，培養(yǎng)15-20天，觀察到強壯硬毛藻體表面呈現(xiàn)深褐色菱形藻的顏色時進行分離、采收。

4）采收

將混合藻體在培養(yǎng)液中進行輕輕搓洗，獲得菱形藻4.19×10⁸ cell/mL作為鮮活餌料直接利用。撈取出剩余藻體可用作凈化氮磷，或繼續(xù)培養(yǎng)。

如圖5所示，強壯硬毛藻與菱形藻混合培養(yǎng)比單種培養(yǎng)21天的菱形藻生物量提高了3倍多。

實施例2

剛毛藻與舟形藻混合培養(yǎng)

1）剛毛藻暫養(yǎng)和舟形藻擴大培養(yǎng)

剛毛藻暫養(yǎng)，裝有1L消毒海水的燒杯中暫養(yǎng)生長健康、顏色鮮綠的剛毛藻0.5kg-1kg（濕重），室溫15℃-18℃，鹽度30‰，LED白燈光強4000Lx-6000Lx，每天換消毒海水0.5L，充氣暫養(yǎng)2-3天。

舟形藻的擴大培養(yǎng)，將藻種按10%接種含23-25mg/L硅酸鈉的f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中室溫15℃-18℃，LED白燈光強2000Lx-3000Lx，鹽度30‰，pH 7.5-8.0，充氣培養(yǎng)密度達到10⁵cell/mL以上，離心收集藻泥。

2）接種

將步驟1）暫養(yǎng)的剛毛藻500g（濕重）投入裝有4L消毒海水培養(yǎng)缸，添加20-25mg/L硝酸鈉、2-3mg/L磷酸二氫鈉，充氣培養(yǎng)1-2天后，接種步驟1）獲得的10g舟形藻藻泥，將藻泥用適當(dāng)消毒海水懸浮后倒入進行混合培養(yǎng)。

3）混合培養(yǎng)

培養(yǎng)溫度15-18℃，光照強度3000左右，光照周期日照：黑暗為12h：12h，培養(yǎng)1天后，開始充弱氣流，添加10mg/L硅酸鈉。每天溫度升高1℃達到20-23℃為止，光照強度逐漸升到6000-7000Lx。每天輕微攪動1次。培養(yǎng)8-10天追加少量硝酸鈉、磷酸二氫鈉和硅酸鈉。培養(yǎng)15-20天，觀察到剛毛藻分支藻體表面呈現(xiàn)深褐色舟形藻的顏色，增大通氣量，褐色舟形藻有輕微脫落現(xiàn)象時開始采收。

4）采收

輕柔搓洗，獲得至少舟形藻密度10⁸cell/mL藻液，剛毛藻濕重達到900g，混合培養(yǎng)的水體中營養(yǎng)鹽去除率達到90%以上，而單種培養(yǎng)營養(yǎng)鹽去除率不到50%?；蛘咧苯訐迫?0%混合藻晾干、粉碎，作為飼料添加。剩余20%混合藻，同時添加營養(yǎng)鹽、剛毛藻和舟形藻種子液，繼續(xù)進行培養(yǎng)。

實施例3

水棉（Spirogyra）與雙眉藻混合培養(yǎng)

1）水綿暫養(yǎng)和雙眉藻擴大培養(yǎng)

水綿暫養(yǎng)，裝有5L消毒淡水的玻璃缸中暫養(yǎng)水綿2kg-3kg（濕重），室溫25℃，日光燈光強8000Lx-10000Lx，每天換消毒培養(yǎng)水體1/4-1/3，充氣暫養(yǎng)1-2天。

雙眉藻的擴大培養(yǎng)，將藻種按10%接種含10mg/L硅酸鈉的f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20℃-25℃，LED燈光強5000Lx-8000Lx，充氣培養(yǎng)密度達到10⁴cell/mL，離心收集藻泥。

2）接種

將步驟1）暫養(yǎng)的水綿1kg（濕重）投入裝有5L消毒淡水培養(yǎng)缸，添加10-20mg/L尿素，4-5mg/L磷酸氫二鈉和30-35mg/L碳酸氫鈉，培養(yǎng)1-2天后，接種步驟1）獲得的10g雙眉藻藻泥，將藻泥用適當(dāng)消毒淡水懸浮后倒入進行混合培養(yǎng)。

3）混合培養(yǎng)

培養(yǎng)溫度25℃，光照強度5000左右，日光燈管光照12h：12h，培養(yǎng)1天后添加5mg/L硅酸鈉。光照強度逐漸升到8000-10000Lx。每天輕微攪動1次。培養(yǎng)8-10天追加少量尿素、磷酸氫二鈉和碳酸氫鈉。培養(yǎng)15-20天，觀察到水綿藻絲表面呈現(xiàn)淺褐色雙眉藻的顏色，開始采收。

4）采收

采收混合藻放入10L養(yǎng)魚廢水中，自然條件凈化7-10天，廢水懸浮物減少90%以上，營養(yǎng)鹽去除率達到80%以上，揉搓獲得至少雙眉藻密度10⁸cell/mL藻液，水棉濕重至少達到2kg。

撈取藻晾干、粉碎，作為飼料添加。

實施例4

絲藻（Ulothrix）和菱板硅藻混合培養(yǎng)

1）絲藻暫養(yǎng)和菱板硅藻擴大培養(yǎng)

絲狀藻暫養(yǎng)，裝有500mL消毒淡水的三角瓶中暫養(yǎng)絲藻500g（濕重），室溫25℃-28℃，日光燈光強8000Lx-10000Lx，暫養(yǎng)1天。

菱板藻的擴大培養(yǎng)，將藻種按10%接種含25mg/L硅酸鈉的f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中室溫25℃-28℃，日光燈照射，光強5000Lx-6000Lx，充氣培養(yǎng)密度達到10⁴cell/mL以上，離心收集藻泥。

2）接種

將步驟1）暫養(yǎng)的絲藻換一半水，添加15-20mg/L硝酸鈉和2-3mg/L磷酸二氫鈉，接種步驟1）獲得的4-5g菱板藻藻泥，將藻泥用適當(dāng)消毒淡水懸浮后倒入進行混合培養(yǎng)。同時進行單種培養(yǎng)作為對照。

3）混合培養(yǎng)

培養(yǎng)溫度25-28℃，自然光照條件培養(yǎng)1天后，觀察菱板藻附著絲藻藻體上后，開始充弱氣流，添加10mg/L硅酸鈉。光照周期日照：黑暗為12h：12h，光照初始1000Lx，每小時增加1000-2000Lx，直到10000Lx為止，持續(xù)2-3h后，逐漸減弱光照至黑暗。每天輕微攪動1次。培養(yǎng)8-10天追加少量硝酸鈉、磷酸二氫鈉和硅酸鈉。培養(yǎng)15-20天，絲藻藻體表面呈現(xiàn)菱板藻的深褐色，增大通氣量，褐色菱板藻有輕微脫落現(xiàn)象時開始采收。

4）采收

將混合藻體撈取并包裹于紗布在培養(yǎng)液中進行輕輕搓洗，獲得10⁸cell/mL藻液直接利用作為餌料，比單種培養(yǎng)數(shù)量增加1-2個數(shù)量級，絲藻質(zhì)量比單種培養(yǎng)增加了50%（濕重）。

揉搓后的絲藻藻體上殘留有菱板藻可作為種子，添加營養(yǎng)鹽繼續(xù)進行連續(xù)培養(yǎng)。

通過控制培養(yǎng)條件和工藝，本發(fā)明的方法可適用于不同硅藻和絲狀藻的任意搭配培養(yǎng)。

以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。

但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行多種等同變換，這些等同變換均屬于本發(fā)明的保護范圍。