本發(fā)明涉及在人工環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)方法及細(xì)胞培養(yǎng)裝置。

背景技術(shù)：

近年來，在藥品的生產(chǎn)、或基因治療、再生醫(yī)療、免疫療法等領(lǐng)域中，要求在人工環(huán)境下高效大量地培養(yǎng)細(xì)胞或組織、微生物、病毒等(將這些總稱為“細(xì)胞”)。在這樣的細(xì)胞培養(yǎng)中，隨著培養(yǎng)液(以下是指包含細(xì)胞及培養(yǎng)基的液體)內(nèi)的細(xì)胞密度變高，會引起增殖所必需的培養(yǎng)基成分的枯竭、細(xì)胞自身的代謝產(chǎn)物的蓄積，從而增殖速度降低，細(xì)胞密度達(dá)到飽和。因此，在以一定程度的規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的情況下，通常一邊重復(fù)繼代一邊進(jìn)行培養(yǎng)以適當(dāng)?shù)鼐S持細(xì)胞密度。

在該繼代時，有時要從孔板向燒瓶等轉(zhuǎn)移。例如，使用細(xì)胞培養(yǎng)孔板以達(dá)到適度的細(xì)胞密度的方式將細(xì)胞與培養(yǎng)基一起加入各個孔中而開始培養(yǎng)，在孔內(nèi)使細(xì)胞充分地增殖后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中，與細(xì)胞增殖匹配地追加培養(yǎng)基而進(jìn)行培養(yǎng)，同時進(jìn)行繼代，在增殖到一定量的時間點，轉(zhuǎn)移到容量更大的燒瓶或袋等中，再重復(fù)進(jìn)行培養(yǎng)和培養(yǎng)基的補(bǔ)給、繼代，進(jìn)行細(xì)胞的大量培養(yǎng)(例如參照專利文獻(xiàn)1[0027]段等)。

另外，在使用經(jīng)過冷凍保存的細(xì)胞時，也有如下的方法，即，在融化后，為了恢復(fù)細(xì)胞本來的功能而使用孔板在高密度狀態(tài)下進(jìn)行數(shù)日的培養(yǎng)(以下稱作“養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)”)，在使細(xì)胞的功能恢復(fù)為本來的狀態(tài)后轉(zhuǎn)移到燒瓶中進(jìn)行培養(yǎng)(以下稱作“擴(kuò)大培養(yǎng)”)，其后，進(jìn)行實施抗體刺激的活性化培養(yǎng)(例如參照專利文獻(xiàn)2[0057]段等)。

需要說明的是，在這樣的細(xì)胞培養(yǎng)時，以往使用的是孔板、燒瓶等器具，然而近年來，開始取代這些器具而使用將樹脂膜之類的撓性材料制袋而成的培養(yǎng)袋(參照專利文獻(xiàn)3、4)?？装?、燒瓶等器具不適于培養(yǎng)大量的細(xì)胞，與之不同，培養(yǎng)袋由于容易大容量化，因此不僅能夠進(jìn)行大量培養(yǎng)，而且能夠以封閉體系進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，還具有能夠減少培養(yǎng)期間中的菌、病毒的污染風(fēng)險的優(yōu)點。因此，在超過實驗室水平地以一定程度的規(guī)模大量培養(yǎng)細(xì)胞的情況下，傾向于使用培養(yǎng)袋。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開2011-241159號公報

專利文獻(xiàn)2：日本特開2013-215141號公報

專利文獻(xiàn)3：國際公開2012/032761號小冊子

專利文獻(xiàn)4：國際公開2008/136371號小冊子

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的問題

然而，在這樣的細(xì)胞培養(yǎng)中，在從孔板轉(zhuǎn)移到燒瓶時需要反復(fù)進(jìn)行數(shù)次移液操作，另外，在每次繼代時必須將細(xì)胞移動到新的燒瓶、袋等培養(yǎng)容器中，不僅操作變得煩雜，而且有可能對細(xì)胞造成損害。此外，還有污染(contamination)的風(fēng)險高的問題。

本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的，其目的在于，提供一種細(xì)胞培養(yǎng)方法及細(xì)胞培養(yǎng)裝置，能夠適度地維持培養(yǎng)時的細(xì)胞密度，而且在使細(xì)胞大量增殖時能夠取消培養(yǎng)容器的轉(zhuǎn)移操作，減少對細(xì)胞的損害、降低污染的風(fēng)險。

用于解決問題的方案

本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法將培養(yǎng)基與細(xì)胞一起向由撓性材料制成的容器供給而進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使所述容器的底面局部地隆起而隔開為多個分區(qū)，在每個所述分區(qū)中培養(yǎng)所述細(xì)胞，之后，消除所述分區(qū)，由此擴(kuò)大所述容器內(nèi)的培養(yǎng)面積。

另外，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)裝置將培養(yǎng)基與細(xì)胞一起向由撓性材料制成的容器供給而進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，具備保持所述容器的基臺，所述基臺具有平面狀的載置面，在所述基臺埋設(shè)有能夠從所述載置面以規(guī)定的高度突出的隔片，在將所述隔片收容于所述基臺內(nèi)時，所述隔片的上端面與所述載置面共面。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，在提高了細(xì)胞密度的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞，同時在增殖了的細(xì)胞的密度增大到一定值以上而超過適于培養(yǎng)的范圍時，擴(kuò)大容器內(nèi)的培養(yǎng)面積，由此能夠不用進(jìn)行繼代而適度地維持培養(yǎng)時的細(xì)胞密度，高效地增殖細(xì)胞。

另外，不需要培養(yǎng)容器的轉(zhuǎn)移操作，培養(yǎng)液存留于同一培養(yǎng)容器中，由此能夠減少對細(xì)胞的損害、降低污染的風(fēng)險。

附圖說明

圖1是表示本發(fā)明的實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)方法中的養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序的概要的說明圖。

圖2是表示本發(fā)明的實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)方法中的擴(kuò)大培養(yǎng)工序的概要的說明圖。

圖3是表示本發(fā)明的實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的概要的立體圖。

圖4是圖3所示的細(xì)胞培養(yǎng)裝置所具備的基臺的分解立體圖。

圖5是表示將圖3所示的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的載置面開放后的狀態(tài)的立體圖。

圖6是用于說明圖3所示的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的動作的說明圖。

圖7是用于說明圖3所示的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的動作的說明圖。

圖8是用于說明圖3所示的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的動作的說明圖。

圖9是用于說明圖3所示的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的動作的說明圖。

圖10是表示使上推構(gòu)件上下移動的驅(qū)動機(jī)構(gòu)的一例的說明圖，所述上推構(gòu)件使圖3所示的細(xì)胞培養(yǎng)裝置所具備的基臺轉(zhuǎn)動。

圖11是表示使用圖3所示的細(xì)胞培養(yǎng)裝置進(jìn)行養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序的狀態(tài)的說明圖。

圖12是表示使用圖3所示的細(xì)胞培養(yǎng)裝置進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)工序的狀態(tài)的說明圖。

圖13是表示本發(fā)明的實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的變形例的概要的立體圖。

圖14是表示本發(fā)明的實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的變形例的概要的立體圖。

圖15是表示使設(shè)于容器中的孔與形成于固定件中的凹部卡合的一例的說明圖。

圖16是表示使設(shè)于容器中的孔與形成于固定件中的凹部卡合的另一例的說明圖。

圖17是表示使設(shè)于容器中的孔卡止于固定件的一例的說明圖。

具體實施方式

以下，參照附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行說明。

[細(xì)胞培養(yǎng)方法]

首先，對本實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行說明。

本實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)方法是將用于培養(yǎng)該細(xì)胞c的培養(yǎng)基m與成為培養(yǎng)的對象的細(xì)胞(培養(yǎng)細(xì)胞)c一起向由撓性材料制成的容器1供給而進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，尤其是適于在養(yǎng)護(hù)從患者采集的細(xì)胞或經(jīng)過冷凍的細(xì)胞等受到損害的細(xì)胞而恢復(fù)細(xì)胞本來的功能的同時進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法。

在本實施方式中，容器1利用撓性材料形成為袋狀(袋型)，其形狀通常多采用長方形狀，例如可以采用將四邊利用熱封加以密封的袋、或采用基于吹塑成形的一體成型袋。

需要說明的是，容器1的形狀有時也采用正方形狀、橢圓形狀、圓形狀等，可以根據(jù)需要采用各種形狀。

另外，容器1能夠以封閉體系(密閉體系)來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并且優(yōu)選具有在co2培養(yǎng)箱內(nèi)使用的情況下所必需的對氧及二氧化碳的透氣性，特別優(yōu)選適于在37℃、5％二氧化碳濃度的培養(yǎng)環(huán)境下使用。

此外，為了能夠確認(rèn)細(xì)胞培養(yǎng)的進(jìn)展?fàn)顩r、細(xì)胞的狀態(tài)等，容器1優(yōu)選一部分或全部具有透明性，為了能夠更加高效地增殖細(xì)胞，容器1優(yōu)選具有低細(xì)胞毒性、低溶出性及輻射滅菌適應(yīng)性。

作為滿足用作這樣的容器1的條件的撓性材料的具體例，可以舉出聚乙烯、乙烯與α-烯烴的共聚物、乙烯與乙酸乙烯酯的共聚物、使用了乙烯和丙烯酸或甲基丙烯酸共聚物和金屬離子的離聚物等聚乙烯系樹脂，然而也可以使用其他聚烯烴、苯乙烯系彈性體、聚酯系熱塑性彈性體、硅酮系熱塑性彈性體、硅酮樹脂等。

圖5所示的例子中，在長方形狀的容器1的短邊側(cè)的一邊連接有管12。經(jīng)由該管12，從外部向容器1供給細(xì)胞、培養(yǎng)基，并且在結(jié)束該容器1中的工序后，從容器1中回收細(xì)胞、培養(yǎng)基，然而也可以連接兩根管作為供給用和回收用。除此以外也可以連接樣品取出用的管等。

需要說明的是，雖然沒有特別地圖示，然而管12也可以與安裝于容器1的管狀的端口連接，為了能夠減少從容器1回收細(xì)胞、培養(yǎng)基時的殘液，也可以將容器1的收容部的形狀形成為朝向端口而逐漸變窄。

作為與容器1連接的管12的材質(zhì)，結(jié)合使用環(huán)境適當(dāng)?shù)剡x擇即可。在co2培養(yǎng)箱內(nèi)使用的情況下，優(yōu)選對氧及二氧化碳的透氣性優(yōu)異的材質(zhì)，在co2培養(yǎng)箱外使用的情況下，優(yōu)選阻氣性優(yōu)異的材質(zhì)。

具體而言，例如可以使用硅橡膠、軟質(zhì)氯乙烯樹脂、聚丁二烯樹脂、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、氯化聚乙烯樹脂、聚氨酯系熱塑性彈性體、聚酯系熱塑性彈性體、硅酮系熱塑性彈性體、苯乙烯系彈性體等。另外，作為苯乙烯系彈性體，例如可以使用sbs(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)、sis(苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯)、sebs(苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯)、seps(苯乙烯-乙烯-丙烯-苯乙烯)等。

本實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)方法在使用這樣的容器1培養(yǎng)從患者采集的細(xì)胞、或冷凍保存后經(jīng)過解凍的細(xì)胞之類的受到損害而功能衰減的細(xì)胞時，包括：養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序，在細(xì)胞培養(yǎng)的初始的階段在養(yǎng)護(hù)該細(xì)胞的同時進(jìn)行培養(yǎng)，以使細(xì)胞本來的功能得以恢復(fù)；以及擴(kuò)大培養(yǎng)工序，在細(xì)胞的養(yǎng)護(hù)推進(jìn)到一定程度后擴(kuò)大容器內(nèi)的培養(yǎng)面積，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)直至達(dá)到規(guī)定的細(xì)胞密度。

本實施方式中，在養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序中，如圖1所示，將供給有細(xì)胞c和培養(yǎng)基m的容器1保持在具有平面狀的載置面20的基臺2上，利用從載置面20以規(guī)定的高度突出的隔片3使容器1的底面局部地隆起而隔開為多個分區(qū)10，在每個被隔開的分區(qū)10中培養(yǎng)細(xì)胞c。此時，對容器1的底面而言，由隔片3推起而撓曲的部分以從載置面20浮起的方式隆起，與載置面20抵接的剩余的平坦部分成為培養(yǎng)面。

由此，當(dāng)將細(xì)胞c以懸浮于培養(yǎng)基m中的狀態(tài)向容器1供給時，則其后無論是漂浮系細(xì)胞還是錨地依賴性細(xì)胞，細(xì)胞c都會沉降于容器1的底面，沉降了的細(xì)胞c集中于各分區(qū)10的培養(yǎng)面，由此能夠在提高了細(xì)胞密度的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞c。

這樣，在養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序時，細(xì)胞c被集中于各分區(qū)10的培養(yǎng)面而進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，通過對形成于容器1的底面的分區(qū)10的個數(shù)、間隔、大小等進(jìn)行調(diào)整，能夠?qū)⒓杏诟鞣謪^(qū)10的培養(yǎng)面的細(xì)胞c的密度調(diào)整為恰當(dāng)?shù)姆秶?/p>

需要說明的是，對于各分區(qū)10中的培養(yǎng)面的面積，優(yōu)選根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞c的種類、接種濃度等，使之為與以往用于繼代培養(yǎng)中的孔板(例如24孔板等)的各孔的底面積相同的程度。

在像這樣進(jìn)行養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序時，隔開容器1的底部的隔片3以規(guī)定的厚度形成為短條狀，以使培養(yǎng)中的細(xì)胞c不在分區(qū)間移動的方式來適當(dāng)?shù)卦O(shè)定其厚度、從載置面20突出的突出高度。例如，隔片3的厚度優(yōu)選設(shè)為0.5～2.0mm，從載置面20突出的突出高度優(yōu)選設(shè)為0.5～1.5mm。

接下來，在養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序中，在每個形成于容器1的底面的分區(qū)10中在提高了細(xì)胞密度的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞c，在由此增殖了的細(xì)胞c的密度(各分區(qū)10的培養(yǎng)面中的每單位面積的細(xì)胞數(shù))增大到一定值以上后，轉(zhuǎn)移到擴(kuò)大培養(yǎng)工序。

擴(kuò)大培養(yǎng)工序中，如圖2所示，將隔片3收容于基臺2內(nèi)，使隔片3的上端面與載置面20共面，由此消除分區(qū)10而將容器1內(nèi)作為一個分區(qū)使用來擴(kuò)大培養(yǎng)面積。

即，養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序中，容器1的底面由隔片3推起而撓曲的部分以從載置面20浮起的方式隆起而被隔開為多個分區(qū)10，該情況如前所述，而當(dāng)將隔片3收容于基臺2內(nèi)而使其上端面與載置面20共面而消除分區(qū)10時，則該部分能夠由于內(nèi)容液的重量而變得平坦從而作為培養(yǎng)面利用，容器內(nèi)的培養(yǎng)面積相應(yīng)地擴(kuò)大。

這樣，本實施方式中，在養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序中，在提高了細(xì)胞密度的狀態(tài)下一邊養(yǎng)護(hù)細(xì)胞c一邊進(jìn)行培養(yǎng)。此后，在增殖了的細(xì)胞c的密度增大到一定值以上而超過適于培養(yǎng)的范圍時，轉(zhuǎn)移到擴(kuò)大培養(yǎng)工序，擴(kuò)大容器內(nèi)的培養(yǎng)面積，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞c的培養(yǎng)直至達(dá)到規(guī)定的細(xì)胞密度。在擴(kuò)大容器內(nèi)的培養(yǎng)面積而繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時，根據(jù)需要向容器1中追加供給培養(yǎng)基m。

另外，在轉(zhuǎn)移到擴(kuò)大培養(yǎng)工序時，優(yōu)選攪拌容器1的內(nèi)容液。例如，在使容器1移動至比初始位置靠上方的位置后，使容器1返回至初始位置，并且對返回至初始位置的容器1施加振動，能夠通過反復(fù)進(jìn)行上述動作來攪拌容器1的內(nèi)容液。

通過如此操作，不僅利用容器1的上下移動進(jìn)行內(nèi)容液的攪拌，還利用施加于容器1的振動使細(xì)胞c以在內(nèi)容液中揚(yáng)起的方式擴(kuò)散。由此，容器1的內(nèi)容液在上下方向上也得到高效的攪拌，從而使容器1的內(nèi)容液中的細(xì)胞c的分布、培養(yǎng)基m的成分濃度均勻而維持良好的培養(yǎng)環(huán)境，并且抑制細(xì)胞c附著于容器內(nèi)壁、或過度地凝聚的情況，能夠促進(jìn)細(xì)胞c的增殖。此外，在所培養(yǎng)的細(xì)胞c為粘附性細(xì)胞的情況下，利用施加于容器1的振動，也能夠促進(jìn)細(xì)胞c從容器1的培養(yǎng)面的剝離。

根據(jù)這樣的本實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)方法，不僅無需繼代即能夠適度地維持培養(yǎng)時的細(xì)胞密度，從而高效地增殖細(xì)胞c，而且無需培養(yǎng)容器的轉(zhuǎn)移操作，使培養(yǎng)液存留于同一培養(yǎng)容器中，由此能夠減少對細(xì)胞c的損害、降低污染的風(fēng)險。

因而，在應(yīng)用本實施方式培養(yǎng)例如淋巴細(xì)胞等漂浮系細(xì)胞的情況下，通過將細(xì)胞c集中在形成于容器1的底面的每個分區(qū)10中，從而使細(xì)胞c所生成的細(xì)胞因子等活性化物質(zhì)的濃度局部地提高，另外，通過產(chǎn)生細(xì)胞間的相互作用，從而能夠在提高了細(xì)胞活性的狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)。此后，在細(xì)胞c的增殖推進(jìn)到一定程度后擴(kuò)大容器內(nèi)的培養(yǎng)面積，由此能夠在同一容器內(nèi)維持恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度的同時高效地培養(yǎng)細(xì)胞c。因此，本實施方式特別適用于養(yǎng)護(hù)剛從患者采集到的細(xì)胞、或冷凍保存后剛被解凍的細(xì)胞之類的受到損害而功能衰減的細(xì)胞，在恢復(fù)細(xì)胞本來的功能的同時高效地進(jìn)行培養(yǎng)。

另外，在應(yīng)用本實施方式培養(yǎng)例如皮膚細(xì)胞、ips細(xì)胞、間葉系干細(xì)胞等錨地依賴性細(xì)胞的情況下，細(xì)胞c貼附在形成于容器1的底面的各分區(qū)10的培養(yǎng)面而增殖，之后，消除該分區(qū)10而擴(kuò)大容器內(nèi)的培養(yǎng)面積，由此能夠以適度的配置來擴(kuò)大可供細(xì)胞c增殖的培養(yǎng)面。因此，無需像繼代培養(yǎng)那樣從培養(yǎng)面剝離并回收細(xì)胞、且向新的培養(yǎng)容器進(jìn)行細(xì)胞播種之類的煩雜且有可能導(dǎo)致增殖效率的降低的操作，而能夠在同一容器內(nèi)在與繼代培養(yǎng)同樣的培養(yǎng)環(huán)境下高效地進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

需要說明的是，本實施方式中所用的容器1由撓性材料制成，因此容易撓曲，形狀不穩(wěn)定。因而可以認(rèn)為，在一般需要數(shù)日的培養(yǎng)期間中，當(dāng)施加振動等而使容器1變形時，內(nèi)容液會過度地流動而對細(xì)胞造成損害，使培養(yǎng)效率降低。鑒于該情況，本實施方式中，在將培養(yǎng)基m與細(xì)胞c一起向由撓性材料制成的容器1供給而進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時，優(yōu)選在對容器內(nèi)加壓了的狀態(tài)下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以使得即使在長期的培養(yǎng)期間中施加振動等，該容器1也不會輕易地變形，能夠抑制對增殖中的細(xì)胞c造成損害的內(nèi)容液的流動，從而高效地增殖細(xì)胞c，對此將在后面進(jìn)行敘述。

[細(xì)胞培養(yǎng)裝置]

接下來，對適于在前述的細(xì)胞培養(yǎng)方法中使用的本實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置進(jìn)行說明。

需要說明的是，圖3是表示本實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的概要的立體圖。

本實施方式中，培養(yǎng)裝置100具備對如前所述的容器1進(jìn)行保持的基臺2，所述基臺2具有的平面狀的載置面20。該基臺2的短邊側(cè)的一端由支承框4軸支承，能夠繞著其軸轉(zhuǎn)動。

另外，基臺2具備形成載置面20的保持構(gòu)件21、以及在保持構(gòu)件21的下方配設(shè)的隔板30，在隔板30上，以一定的間隔平行地豎立設(shè)置有多個短條狀的隔片3。與此同時，在保持構(gòu)件21的載置面20上沿著長度方向平行地排列設(shè)置有多個狹縫22，能夠使豎立設(shè)置于隔板30的隔片3從該狹縫22中分別突出。通過如此設(shè)置，在基臺2埋設(shè)有能夠從載置面20以規(guī)定的高度突出的隔片3。

此處，圖4中示出圖3所示的培養(yǎng)裝置100所具備的基臺2的分解立體圖，在本實施方式中，在隔板30的長邊側(cè)的兩個側(cè)面形成有兩對切口部31，該兩對切口部31通過將該側(cè)面的相對的部位以一定的寬度切掉而成。此外，在使兩個導(dǎo)引構(gòu)件32分別以間隙嵌合狀嵌合于這些切口部31處的狀態(tài)下，將該導(dǎo)引構(gòu)件32安裝于保持構(gòu)件21，由此在保持構(gòu)件21的下方配設(shè)隔板30。此時，適當(dāng)?shù)卣{(diào)整各構(gòu)件的形狀、尺寸等，使得在使隔板30從導(dǎo)引構(gòu)件32翹起而處于向保持構(gòu)件21推壓的狀態(tài)時，隔片3以規(guī)定的高度從載置面20突出，在隔板30處于由導(dǎo)引構(gòu)件32支承的狀態(tài)時，隔片3的上端面與載置面20共面(參照圖6及圖9)。

另一方面，在對這樣的基臺2進(jìn)行軸支承的支承框4中，以長邊側(cè)的基端側(cè)被軸支承而能夠轉(zhuǎn)動的方式安裝有截面l字狀的兩個支承構(gòu)件40。該支承構(gòu)件40在長邊側(cè)與鉛垂方向平行時，長邊側(cè)的前端與隔板30的下表面抵接，由此將隔板30抬起，以向保持構(gòu)件21推壓的方式支承隔板30(參照圖6)。此后，支承構(gòu)件40在與隔板30的抵接被解除時，由于短邊側(cè)的重量而使長邊側(cè)以相對于鉛垂方向傾斜的方式轉(zhuǎn)動(參照圖7)，失去了支承構(gòu)件40的支承的隔板30下降到由導(dǎo)引構(gòu)件32支承的位置。由此，隔片3被收容于基臺2內(nèi)，隔片3的上端面與載置面20共面。

另外，在基臺2安裝有用于對保持于載置面20上的容器1的上表面?zhèn)冗M(jìn)行按壓而對容器內(nèi)進(jìn)行加壓的推壓板23。推壓板23為了能夠根據(jù)容器1的內(nèi)容量而上下移動(參照圖11及圖12)，例如能夠如圖示那樣，在基臺2的四角豎立設(shè)置形成長孔狀的導(dǎo)孔24的環(huán)狀豎立片25，通過使水平地突出設(shè)置于推壓板23的四角的銷釘26穿過該導(dǎo)孔24來安裝。

此外，在圖示的例子中，在設(shè)于基臺2的四個環(huán)狀豎立片25中的位于基臺2的一方的長邊的兩端的兩個環(huán)狀豎立片25的上端側(cè)，形成切口為槽狀的薄壁部27。由此，如果在穿過該環(huán)狀豎立片25的導(dǎo)孔24的銷釘26在抬起推壓板23時與導(dǎo)孔24的上緣抵接的狀態(tài)下施加力，則銷釘26通過該薄壁部27而從導(dǎo)孔24中脫出。

通過如此設(shè)置，如圖5所示，能夠傾斜地抬起推壓板23而將載置面20開放。在該狀態(tài)下，通過使穿設(shè)于容器1的四角的孔11卡止在設(shè)于基臺2的四角的固定件28處，并且將與容器1連接的管12固定在管固定構(gòu)件29處，能夠?qū)⑷萜?安裝于培養(yǎng)裝置100。

另外，在將容器1安裝于培養(yǎng)裝置100時，將培養(yǎng)基m與細(xì)胞c一起向容器1供給，使容器內(nèi)存留規(guī)定量的內(nèi)容液。此后，在將容器1安裝于培養(yǎng)裝置100后，使推壓板23返回至原處而壓接于容器1，并且使鉤41、42卡止于推壓板23的短邊側(cè)的兩邊，從而能夠?qū)⑼茐喊?3固定于下方位置，由此，保持于載置面20上的容器1的上表面?zhèn)缺煌茐喊?3推壓，形成容器內(nèi)被加壓了的狀態(tài)。

卡止于推壓板23的鉤41、42分別由支承框4軸支承為能夠轉(zhuǎn)動，通過使鉤41、42轉(zhuǎn)動，來進(jìn)行對推壓板23的卡止和解除。鉤41、42的卡止被解除后的推壓板23能夠向上移動至銷釘26與導(dǎo)孔24的上緣抵接的上方位置。

接下來，對這樣的培養(yǎng)裝置100的動作進(jìn)行說明。

需要說明的是，圖6～圖9是用于說明本實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的動作的說明圖，這些圖中所示的剖面相當(dāng)于圖3的a-a剖面。

圖6表示培養(yǎng)裝置100的初始狀態(tài)。在該狀態(tài)下，當(dāng)安裝供給有細(xì)胞c和培養(yǎng)基m的容器1時，利用從載置面20以規(guī)定的高度突出的隔片3將容器1的底面隔開為多個分區(qū)10(參照圖1)。

由此，完成了進(jìn)行前述的細(xì)胞培養(yǎng)方法的養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序的準(zhǔn)備。

圖6～圖9中省略了容器1的圖示，然而在養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序中，如圖11所示，利用固定于下方位置的推壓板23推壓容器1的上表面?zhèn)龋允谷萜鲀?nèi)成為被加壓的程度的內(nèi)容量的方式，調(diào)整向容器1供給的培養(yǎng)基m的量。

通過如此設(shè)置，在將容器1安裝于培養(yǎng)裝置100后，使推壓板23從圖5所示的狀態(tài)返回至原處而壓接于容器1，并且使鉤41、42卡止于推壓板23的短邊側(cè)的兩邊，由此能夠利用推壓板23對保持于載置面20上的容器1的上表面?zhèn)冗M(jìn)行推壓，從而對容器內(nèi)進(jìn)行加壓。

通過將容器內(nèi)設(shè)為加壓了的狀態(tài)，能夠抑制容器內(nèi)的內(nèi)容液的過度的流動，從而不對培養(yǎng)中的細(xì)胞c造成損害。此外，如果溶解于培養(yǎng)基m中的氣體發(fā)生氣化而在容器內(nèi)滯留氣泡，在觀察容器內(nèi)時可能會產(chǎn)生細(xì)微的氣泡使照明的光路折曲而無法進(jìn)行清晰的觀察的不良狀況，或者在氧氣等氣體從容器外向容器內(nèi)的培養(yǎng)液中擴(kuò)散時，原為氣體與膜、膜與培養(yǎng)液這兩處的邊界膜氣體移動的移動因氣泡滯留于容器內(nèi)，而成為氣體與膜、膜與氣泡、氣泡與培養(yǎng)液這三處的邊界膜氣體移動，可能會產(chǎn)生氣體向容器內(nèi)的培養(yǎng)液中的擴(kuò)散降低的不良狀況。通過對容器內(nèi)進(jìn)行加壓，也能夠抑制溶解于培養(yǎng)基m中的氣體的氣化，由此，能夠使得如上所述的不良狀況不產(chǎn)生。

在前述的細(xì)胞培養(yǎng)方法中，這樣進(jìn)行養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序，在養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序推進(jìn)到增殖了的細(xì)胞c的密度增大到一定值以上而超過適于培養(yǎng)的范圍后，轉(zhuǎn)移到擴(kuò)大培養(yǎng)工序。

本實施方式中，在轉(zhuǎn)移到擴(kuò)大培養(yǎng)工序時，使上推構(gòu)件5向上移動，從而使由支承框4軸支承的基臺2繞其軸而向上方轉(zhuǎn)動。由此，如圖7所示，支承隔板30的截面l字狀的支承構(gòu)件40與隔板30的抵接被解除，利用短邊側(cè)的重量使長邊側(cè)相對于垂直方向傾斜地轉(zhuǎn)動。此后，失去了支承構(gòu)件40的支承的隔板30下降到由導(dǎo)引構(gòu)件32支承的位置，與之相伴，隔片3被收容于基臺2內(nèi)，隔片3的上端面與載置面20共面。其結(jié)果是，由隔片3隔開的分區(qū)10被消除，容器內(nèi)變成一個分區(qū)而使培養(yǎng)面積擴(kuò)大(參照圖2)。

另外，在初始狀態(tài)下，使鉤41、42卡止于推壓板23的短邊側(cè)的兩邊，通過使基臺2向上方轉(zhuǎn)動，該鉤41、42的卡止被解除。

即，本實施方式中，通過使向上移動的上推構(gòu)件5抵接于基臺2的與設(shè)有轉(zhuǎn)動軸的一側(cè)相反一側(cè)的短邊側(cè)的抵接構(gòu)件50，而使基臺2向上方轉(zhuǎn)動時，梁狀的抵接片51架設(shè)于抵接構(gòu)件50。此后，當(dāng)上推構(gòu)件5抵接于抵接構(gòu)件50而使基臺2向上方轉(zhuǎn)動時，即如圖7所示，該抵接片51抵接于一方的鉤41的下側(cè)舌片41a而使該鉤41轉(zhuǎn)動，由此解除卡止。此后，當(dāng)使基臺2進(jìn)一步向上方轉(zhuǎn)動時，即如圖8所示，另一方的鉤42以被基臺2推壓的方式轉(zhuǎn)動，該鉤42的卡止也得到解除。

在使基臺2轉(zhuǎn)動到規(guī)定的角度后，使上推構(gòu)件5向下移動。由此，即如圖9所示，基臺2向下方轉(zhuǎn)動而返回至初始狀態(tài)的位置。此時，支承框4由于承接基臺2所致的沖擊而向保持在基臺2的載置面20上的容器1傳遞振動。這樣一來，通過使上推構(gòu)件5上下移動而反復(fù)進(jìn)行基臺2的轉(zhuǎn)動動作，從而反復(fù)進(jìn)行在使容器1移動至比初始位置靠上方的位置后，使容器1返回至初始位置，并且對返回至初始位置的容器1施加振動的動作，由此，能夠攪拌容器1的內(nèi)容液。

使上推構(gòu)件5上下移動的驅(qū)動機(jī)構(gòu)例如如圖10所示，可以作為如下的凸輪機(jī)構(gòu)來構(gòu)成，即，具備具有輪廓為圓弧狀的第一凸輪面5c、以及輪廓為直線狀的第二凸輪面5d的平板凸輪5b，以水平地設(shè)于上推構(gòu)件5的基端的托板5a作為隨動件，然而并不限定于此。

圖10所示的例子中，適當(dāng)?shù)卦O(shè)定凸輪面5c、5d的曲率、使平板凸輪5b旋轉(zhuǎn)的驅(qū)動軸5e的位置及驅(qū)動軸5e的轉(zhuǎn)速，第一凸輪面5c將托板5a推起，由此使上推構(gòu)件5向上移動(參照圖10(a)～(e))，在切換為第二凸輪面5d時平板凸輪5b離開托板5a，上推構(gòu)件5落下(參照圖10(f)～(h))，通過使平板凸輪5b沿一定方向旋轉(zhuǎn)，反復(fù)進(jìn)行上推構(gòu)件5的上下移動。若如此構(gòu)成該驅(qū)動機(jī)構(gòu)，則在基臺2向下方轉(zhuǎn)動而返回至初始狀態(tài)的位置時，基臺2以落下的方式轉(zhuǎn)動，在支承框4承接基臺2時產(chǎn)生沖擊。

反復(fù)進(jìn)行數(shù)次基臺2的轉(zhuǎn)動動作，充分地進(jìn)行容器1的內(nèi)容液的攪拌后，向容器1中追加供給培養(yǎng)基m。此時，由于推壓板23被解除了鉤41、42的卡止，因此由內(nèi)容量增加而厚度增大的容器1推起，當(dāng)突出設(shè)置于推壓板23的銷釘26到達(dá)導(dǎo)孔24的上緣時，推壓板23無法進(jìn)一步向上移動而被固定在上方位置(參照圖12)。由此，能夠提高因追加供給培養(yǎng)基m而增加了內(nèi)容量的容器1的容器內(nèi)的壓力，即使在擴(kuò)大培養(yǎng)工序中，因?qū)⑷萜鲀?nèi)設(shè)為加壓了的狀態(tài)，也能夠抑制容器內(nèi)的內(nèi)容液的過度的流動，從而不會對細(xì)胞c造成損害，并且能夠有效地避免溶解于培養(yǎng)基m中的氣體成為氣泡而滯留于容器內(nèi)的情況。

通過使培養(yǎng)裝置100如上述那樣動作而完成向擴(kuò)大培養(yǎng)工序的轉(zhuǎn)移，其后，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞c的培養(yǎng)直至達(dá)到規(guī)定的細(xì)胞密度。

這樣，培養(yǎng)裝置100能夠利用基臺2的轉(zhuǎn)動動作而從養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序向擴(kuò)大培養(yǎng)工序轉(zhuǎn)移。此后，在擴(kuò)大培養(yǎng)工序中，由于內(nèi)容液的重量而變得平坦的容器1的底面被用作培養(yǎng)面，然而當(dāng)容器1的底面并非充分地平坦而在培養(yǎng)面產(chǎn)生褶皺或松弛時，就會在該部分積存細(xì)胞而產(chǎn)生過大的密度，另外細(xì)胞的移動受到限制，因此細(xì)胞的增殖效率有可能降低。

另外，這樣的存留有細(xì)胞的場所在培養(yǎng)細(xì)胞的回收時，也很有可能成為在容器內(nèi)殘存細(xì)胞的原因。

專利文獻(xiàn)4中采用了如下的方法，即，在培養(yǎng)容器的四角設(shè)置孔，并且在容器載置臺的四角豎立設(shè)置固定件，通過使培養(yǎng)容器的孔卡止于容器載置臺的固定件并牽拉培養(yǎng)容器，從而使培養(yǎng)面平坦。

然而，即使利用該方法，在培養(yǎng)液進(jìn)入培養(yǎng)容器的狀態(tài)下，也會在培養(yǎng)容器的培養(yǎng)面產(chǎn)生褶皺、松弛，在該部分產(chǎn)生存留有細(xì)胞的場所，由此不足以消除細(xì)胞的增殖效率降低的不良狀況。

具體而言，圖17中示出使設(shè)于容器1中的孔11卡止于固定件28并對容器1進(jìn)行牽拉的例子，然而即使如此操作，也不足以使得容器1的底面不產(chǎn)生褶皺、松弛。

本實施方式中，在將容器1安裝于培養(yǎng)裝置100中時，使穿設(shè)于容器1的四角的孔11卡止在設(shè)于基臺2的四角的固定件28，這一點如前所述，然而此時優(yōu)選在固定件28中設(shè)置凹部28a，使設(shè)于容器1中的孔11卡合于該凹部28a，在凹部28a的高度保持容器1的端部。這樣一來，在轉(zhuǎn)移到擴(kuò)大培養(yǎng)工序時，容易利用內(nèi)容液的重量使容器1的底面平坦，能夠使容器1的底面足夠平坦。

這樣的方式中，固定件28的配置及個數(shù)沒有特別限定，只要在基臺2的周緣部對置地配置兩個以上的固定件28即可。在使用一般的容器1的情況下，優(yōu)選將固定件28豎立設(shè)置于基臺2的四角，在使用尺寸比較大的容器1的情況下，也優(yōu)選豎立設(shè)置更多的固定件28。另外，也可以在基臺2的短邊的端部中央分別各配置一個固定件28，也可以在一個短邊的端部中央配置一個固定件28，在對置的端部配置兩個以上固定件28。

另一方面，穿設(shè)于容器1中的孔11以與設(shè)于基臺2的固定件28的配置及個數(shù)對應(yīng)的方式設(shè)置，能夠設(shè)于被熱封了的端部區(qū)域等，以使得能夠?qū)⒐潭?8插入孔11而使孔11的周緣部卡合于凹部28a。即，以與設(shè)于基臺2的周緣部的兩個以上的固定件28對應(yīng)的方式在容器1的端部設(shè)置有兩個以上的孔11即可。此時，當(dāng)然不會因在容器1中設(shè)置孔11而損害容器1的密封性。

固定件28的形狀沒有特別限定。例如可以設(shè)為大致圓柱狀，也可以設(shè)為大致長方體等其他形狀。另外，也可以將凹部28a的上方設(shè)為圓頂狀，將凹部28a的下方設(shè)為圓柱狀或棱柱狀。

另外，凹部28a優(yōu)選在固定件28中相對于水平面形成為圓周狀，然而并不限定于此，也可以在基臺2的外側(cè)方向，相對于水平面以半圓周狀、弧狀等形成。另外，凹部28a的水平截面并不限定為圓形，也可以是多邊形、星形等。

另外，對于在固定件28形成凹部28a的位置，以容器1的滿裝容量填充培養(yǎng)液，設(shè)想達(dá)到容器1充滿的厚度，以容器1充滿時的厚度為基準(zhǔn)來確定。

圖15表示在固定件28中比基臺2的表面的位置靠上方且容器1充滿時的厚度的1/2(大約液深d的1/2)的位置形成凹部28a，并在該凹部28a卡合了容器1的孔11的周緣部的例子。

通過如此設(shè)置，容器1的端部被保持在凹部28a的高度，能夠使容器1的底面成為平坦的狀態(tài)而將容器1固定于基臺2。

另外，圖16表示在固定件28中比基臺2的表面的位置靠上方且容器1充滿時的厚度的3/4(大約液深d的3/4)的位置形成凹部28a，并在該凹部28a卡合了容器1的孔11的周緣部的例子。

通過如此設(shè)置，將容器1的對置的端部拉起到凹部28a的高度，由此能夠使容器1的底面為平坦的狀態(tài)。即使在凹部28a的位置位于比基臺2的表面的位置靠上方且比容器1充滿的厚度還略靠上方的位置，也能夠同樣地獲得這樣的效果。

基于這樣的觀點，優(yōu)選將在固定件28形成凹部28a的位置設(shè)為比基臺2的表面的位置靠上方且容器1充滿時的厚度的1/2～3/2的范圍，更優(yōu)選設(shè)為1/2～1的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選設(shè)為1/2～3/4的范圍。

通過將在固定件28形成凹部28a的位置設(shè)為上述范圍，能夠?qū)⑥D(zhuǎn)移到擴(kuò)大培養(yǎng)工序后的容器1的底面更加可靠地維持為平坦的狀態(tài)，可以使培養(yǎng)面為沒有褶皺、松弛的狀態(tài)。由此，能夠使容器1的培養(yǎng)面積最大。

另外，通過使容器1的底面更加可靠地成為平坦的狀態(tài)，就能夠使細(xì)胞均勻地分布(分散)在容器1內(nèi)。由此，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的培養(yǎng)時的培養(yǎng)條件的最佳化，能夠進(jìn)一步提高細(xì)胞的增殖效率。

以上，示出優(yōu)選的實施方式對本發(fā)明進(jìn)行了說明，然而本發(fā)明并不限定于前述的實施方式，當(dāng)然也可以在本發(fā)明的范圍中實施各種變更。

例如，在前述的實施方式中，在埋設(shè)有能夠從載置面20以規(guī)定的高度突出的隔片3的基臺2中，以使該隔片3突出的狀態(tài)保持容器1，由此使容器1的底面局部地隆起而隔開為多個分區(qū)10，然而本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法可以不受此限定地實施。

只要能夠利用由撓性材料制成的容器1的撓曲變形使容器1的底面局部地隆起而隔開為多個分區(qū)10，例如也可以將多個棒狀的構(gòu)件并排配置于載置面20，在其上保持容器1。

即使如此設(shè)置，容器1的底面也會由棒狀的構(gòu)件推起而局部地隆起，由此被隔開為多個分區(qū)10。此外，若拔出該棒狀的構(gòu)件，則利用內(nèi)容液的重量使容器1的底面平坦，從而容器內(nèi)的培養(yǎng)面積擴(kuò)大。

另外，在前述的實施方式中，通過在基臺2的四角豎立設(shè)置形成長孔狀的導(dǎo)孔24的環(huán)狀豎立片25，水平地突出設(shè)置在推壓板23的四角的銷釘26穿過該導(dǎo)孔24而安裝推壓板23，然而并不限定于此。推壓板23只要以能夠根據(jù)容器1的內(nèi)容量而上下移動的方式安裝即可，例如也可以如圖13及圖14所示那樣地安裝。

圖13及圖14中，將形成有長孔狀的導(dǎo)孔24a的兩對豎立片25a以在基臺2的長邊的相對的位置成對的方式豎立設(shè)置，借助分別架設(shè)于成對的豎立片25a中的支承棒26a將推壓板23安裝為能夠上下移動。此外，在養(yǎng)護(hù)培養(yǎng)工序中，通過使鉤f卡止于穿過導(dǎo)孔24a的支承棒26a來抑制推壓板23的向上移動，由此利用固定于下方位置的推壓板23對設(shè)為規(guī)定的內(nèi)容量的容器1的上表面?zhèn)冗M(jìn)行推壓，從而能夠?qū)θ萜鲀?nèi)進(jìn)行加壓(參照圖13)

另外，在擴(kuò)大培養(yǎng)工序中，通過解除鉤f的卡止，推壓板23能夠向上移動。然后，當(dāng)支承棒26a到達(dá)導(dǎo)孔24a的上緣時，推壓板23無法進(jìn)一步向上移動而被固定于上方位置。由此，利用推壓板23對被追加供給了培養(yǎng)基m、內(nèi)容量增加而厚度增大了的容器1的上表面?zhèn)冗M(jìn)行推壓，能夠?qū)θ萜鲀?nèi)進(jìn)行加壓(參照圖14)。

需要說明的是，要解除鉤f的卡止，只要在與前述的實施方式同樣地進(jìn)行基臺2的轉(zhuǎn)動動作時，利用基臺2的傾斜使鉤f因其重量而轉(zhuǎn)動即可。

將本說明書中記載的文獻(xiàn)及作為本申請的巴黎優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本申請說明書的內(nèi)容全部援引于此。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

本發(fā)明可以適用于使用細(xì)胞培養(yǎng)容器無菌并且簡便地在封閉體系中培養(yǎng)細(xì)胞的基因治療、免疫療法、再生醫(yī)療、抗體醫(yī)藥生產(chǎn)等。

附圖標(biāo)記說明

1容器，10分區(qū)，11孔，2基臺，20載置面，23推壓板，24導(dǎo)孔，25環(huán)狀豎立片，26銷釘，28固定件，28a凹部，3隔片，4支承框，41、42鉤，c細(xì)胞，m培養(yǎng)基。