優(yōu)先權(quán)聲明

本pct國(guó)際申請(qǐng)要求2015年11月30日提交的美國(guó)系列號(hào)14/954335的優(yōu)先權(quán)，其本身要求2014年12月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)62/086,526的權(quán)益，所述申請(qǐng)通過引用結(jié)合到本文中。

本發(fā)明涉及含有表達(dá)含有富含亮氨酸重復(fù)序列的g-蛋白偶聯(lián)受體(lgr)的細(xì)胞的微聚集體多細(xì)胞移植物的構(gòu)建體，用于傷口治療應(yīng)用、組織工程學(xué)、細(xì)胞療法應(yīng)用、再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用、醫(yī)學(xué)/治療應(yīng)用、組織愈合應(yīng)用、免疫療法應(yīng)用和組織移植療法應(yīng)用。更具體而言，本發(fā)明提供用于直接施用的在遞送載體/基底/支持物/支架上的可遞送微聚集體多細(xì)胞lgr構(gòu)建體。

背景

多年以來，臨床醫(yī)生和研究人員在尋找這樣的抗微生物劑，其不僅減輕微生物傷口負(fù)荷，還具有更小的細(xì)胞毒性副作用。從燒傷到急性和慢性傷口二者，存在操作天然存在的源于自身的抗微生物肽的可能性，因?yàn)檫@些物質(zhì)通常通過膜透化作用起作用，其為較不可能導(dǎo)致微生物耐藥性的機(jī)制。隨著傷口中感染的持續(xù)風(fēng)險(xiǎn)以及對(duì)現(xiàn)有抗生素療法的細(xì)菌耐藥性的漸進(jìn)流行，對(duì)開發(fā)用于皮膚燒傷和創(chuàng)傷的新一類局部抗微生物劑存在真正需求。

基本上存在傷口愈合的四個(gè)階段，其在過去的一個(gè)世紀(jì)里進(jìn)行闡述：(1)止血階段，(2)炎癥階段，(3)增生階段和(4)重塑階段。這些連續(xù)階段首先通過遷移到傷口中的細(xì)胞類型來定義，并隨后通過在組織內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的類型來定義。

隨著在間充質(zhì)細(xì)胞和脂肪來源的干細(xì)胞分離和移植方面的最新進(jìn)展，研究人員已開始研究這些細(xì)胞如何在各階段改進(jìn)愈合并改變表達(dá)，特別是貫穿晚期炎癥階段至重塑階段。非常類似于較深層區(qū)室的間充質(zhì)細(xì)胞和脂肪來源的干細(xì)胞，上皮干細(xì)胞從原始外胚層形成，其隨后形成更表面的上皮區(qū)室，并因此在皮膚傷口愈合中亦具有潛在作用。目前對(duì)于移植和施用分離的表達(dá)lgr4、lgr5和lgr6的上皮干細(xì)胞如何改變傷口愈合基因表達(dá)，只有有限的研究。

已知的是，在對(duì)皮膚的嚴(yán)重全厚度損傷之后，表達(dá)lgr4、lgr5和lgr6的上皮干細(xì)胞群體常常被破壞，使組織不能產(chǎn)生可存活且自我維持的上皮區(qū)室。盡管有通過局部炎癥和后續(xù)的一系列細(xì)胞實(shí)體的趨化作用驅(qū)動(dòng)的肉芽組織形成(granulatory)和纖維變性作用的組合，在沒有上皮干細(xì)胞局灶龕(focalniche)的情況下，剩余組織不具有形成功能上皮、毛囊、汗腺等的再生潛能。

對(duì)人和哺乳動(dòng)物組織的復(fù)合性全厚度損傷和/或涉及多個(gè)組織成分(皮膚、肌肉、脂肪、血管、神經(jīng)和骨)的復(fù)合性損傷，本質(zhì)上難以愈合。通過當(dāng)前傷口護(hù)理方法、使有當(dāng)前獲準(zhǔn)技術(shù)的手術(shù)干預(yù)(利用細(xì)胞、組織、裝置、生物制品、藥物和/或生長(zhǎng)因子)，治療所述損傷和后續(xù)所致的傷口亦很困難。所述困難的一個(gè)常見原因?yàn)?，保留在受傷或受損組織床之中或周圍的組織通常缺乏相互依賴的必需組分：1)祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞群體；2)胞外基質(zhì)/支架成分和基底；和3)細(xì)胞實(shí)體和基底之間的相互作用的組合。細(xì)胞龕、ecm(胞外基質(zhì))支架和相關(guān)交互界面的這種缺乏，隨后導(dǎo)致不能再生或生成細(xì)胞遷移、分化和組織極性化所需的基本多維結(jié)構(gòu)。在沒有這些細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞與基質(zhì)相互作用的情況下，傷口床內(nèi)的剩余細(xì)胞實(shí)體(不論其增殖或譜系潛能)被迫主要提供屏障效用，而不是形成能夠進(jìn)行可識(shí)別“功能”的更復(fù)雜的多組織構(gòu)建體。因此，不論是否涉及皮膚、肌肉、脂肪、腱、骨，傷口均隨后變?yōu)橛旭：?、雜亂且機(jī)能失調(diào)的。

在培養(yǎng)皮膚、軟骨、骨、肌肉、血管、神經(jīng)、淋巴和相關(guān)替代物的組織工程學(xué)領(lǐng)域的當(dāng)前應(yīng)用，主要基于三部分策略：1)獲得組織來源并從所述組織收獲細(xì)胞懸液；2)將這些細(xì)胞施用至基質(zhì)或支架；和3)將構(gòu)建體移植到人或動(dòng)物的靶部位之上或之中。然而，在缺乏上文確定的相互依賴的必需組分的情況下，組織工程學(xué)應(yīng)用、細(xì)胞療法應(yīng)用、再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用、組織愈合應(yīng)用和組織移植療法應(yīng)用不具有有能力裝配功能極性化組織所需的天然細(xì)胞微聚集體結(jié)構(gòu)。因此，因缺乏適當(dāng)?shù)南嗷ヒ蕾嚒⒆婕?xì)胞群和適當(dāng)?shù)闹Ъ芩?，阻止了所述?gòu)建體用于諸如多區(qū)室組織再生和/或骨和肌肉重建等治療性應(yīng)用。

因此，部分因前述原因所致，產(chǎn)業(yè)界和學(xué)術(shù)界二者將大量努力和資源引導(dǎo)至開發(fā)合成組織替代物、自體移植構(gòu)建體以及患者來源的表皮擴(kuò)張自體移植物(即來自cambridgema的vericelcorporation的epicel?)。盡管這些產(chǎn)品有益，但常常很昂貴，且不能給患者提供真正的多區(qū)室組織構(gòu)建體。例如，培養(yǎng)的上皮自體移植物(cea)仍不能修復(fù)在天然皮膚中見到的上皮和真皮區(qū)室二者。但是鑒于缺少相互依賴的功能性區(qū)室，培養(yǎng)細(xì)胞不具有形成真正定義皮膚的體被(表皮、真皮、腺體和毛發(fā))所需的擴(kuò)展的局部干細(xì)胞群和逐漸發(fā)展的組織極性化。該缺乏繼而導(dǎo)致單細(xì)胞層脆性、上皮不穩(wěn)定性、屏障破壞和瘢痕。

備選地，諸如來自lifecellcorporation的alloderm?、來自integralifesciencescorporation的integra?和來自musculoskeletaltransplantfoundation的產(chǎn)品dermamatrix等更穩(wěn)健的非細(xì)胞基質(zhì)，盡管是優(yōu)秀的重建選項(xiàng)，但缺乏形成功能天然組織所必需的適當(dāng)安置的譜系特異性干細(xì)胞群。

本發(fā)明人已記述了關(guān)于lgr5和lgr6作為哺乳動(dòng)物中的腸和上皮干細(xì)胞兩者的標(biāo)志物的相對(duì)較新的認(rèn)識(shí)。在用腸來源的人α防御素5刺激毛囊隆突lgr5+和lgr6+干細(xì)胞導(dǎo)致減少的細(xì)菌存在，增強(qiáng)的傷口愈合以及從缺乏附屬結(jié)構(gòu)的組織中的毛發(fā)生長(zhǎng)(stimulationofthefollicularbulgelgr5+andlgr6+stemcellswiththegut-derivedhumanalphadefensin5resultsindecreasedbacterialpresence,enhancedwoundhealing,andhairgrowthfromtissuesdevoidofadnexalstructures)，plast.reconstr.surg.132:1159，2013中，含有富含亮氨酸重復(fù)序列的g-蛋白偶聯(lián)受體(lgr)為與促卵泡激素、促甲狀腺激素和促黃體生成素受體家族具有顯著序列和結(jié)構(gòu)同源性的七次跨膜蛋白受體。

在該研究中，認(rèn)識(shí)的是，與人β防御素1和磺胺嘧啶相比，人α防御素5肽顯著增強(qiáng)傷口愈合并減少基礎(chǔ)細(xì)菌負(fù)荷。人α防御素5為誘導(dǎo)lgr干細(xì)胞遷移到傷口床中的唯一療法。此外，基因熱圖顯示關(guān)鍵傷口愈合和wnt途徑轉(zhuǎn)錄物(例如wnt1和wisp1等)的顯著的mrna上調(diào)。因此推斷通過增加關(guān)鍵的wnt和傷口愈合轉(zhuǎn)錄物，人α防御素5可用于增進(jìn)傷口愈合，因?yàn)橛^察到增加的lgr干細(xì)胞遷移到傷口床中以及相關(guān)細(xì)菌減少和毛發(fā)產(chǎn)生。簡(jiǎn)單說來，該工作及其它工作使得認(rèn)識(shí)到在直接生物醫(yī)學(xué)工程軟組織構(gòu)建體中使用表達(dá)lgr4+、lgr5+和lgr6+的上皮干細(xì)胞的可能性。

發(fā)明概述

在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物，其包含分離的表達(dá)lgr的活細(xì)胞和選自支架、膠原、基質(zhì)、顆粒和纖維的多維支持物。

在前述實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物，其包含分離的表達(dá)lgr的活細(xì)胞和選自支架、膠原、基質(zhì)、顆粒和纖維的多維支持物，其中對(duì)表達(dá)lgr的細(xì)胞補(bǔ)充生長(zhǎng)因子，且其中表達(dá)lgr的細(xì)胞選自lgr4、lgr5和lgr6。

在任何前述實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物，其包含分離的表達(dá)lgr的活細(xì)胞和選自支架、膠原、基質(zhì)、顆粒和纖維的多維支持物，其中對(duì)表達(dá)lgr的細(xì)胞補(bǔ)充遷移/募集分析物，且表達(dá)lgr的細(xì)胞選自lgr4、lgr5和lgr6。

在任何前述實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物，其包含分離的表達(dá)lgr的活細(xì)胞和選自支架、膠原、基質(zhì)、顆粒和纖維的多維支持物，其中對(duì)表達(dá)lgr的細(xì)胞補(bǔ)充選自配體家族、r脊椎蛋白(r-spondin)、edgf、pdgf、wnt、vegf和抗微生物肽的lgr特異性結(jié)合成分，且其中表達(dá)lgr的細(xì)胞選自lgr4、lgr5和lgr6。

在任何前述實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物，其包含分離的表達(dá)lgr的活細(xì)胞和選自支架、膠原、基質(zhì)、顆粒和纖維的多維支持物，其中組合物用作治療性構(gòu)建體用于由組織區(qū)域、傷口、空隙、缺損組織或血液組成的所選靶標(biāo)，以改變?nèi)我环N周圍鄰近組織。

在任何前述實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物，其特征在于分離的表達(dá)lgr的活細(xì)胞被移植到受損組織以加速其愈合。

在任何前述實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于在身體各處的組織系統(tǒng)修復(fù)或恢復(fù)的最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物，其包含具有與之固定的分離的含lgr細(xì)胞的支持支架。

在任何前述實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于在哺乳動(dòng)物身體各處施用于外胚層、中胚層或內(nèi)胚層來源的組織系統(tǒng)的組織移植物。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案特征在于用于獲得最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物的方法，其特征在于生長(zhǎng)和分離表達(dá)lgr的活細(xì)胞以移植到所選哺乳動(dòng)物靶組織的步驟。

在前述方法的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于獲得最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物的方法，特征在于生長(zhǎng)和分離表達(dá)lgr的活細(xì)胞以移植到所選哺乳動(dòng)物靶組織的步驟，進(jìn)一步特征在于使分離的表達(dá)lgr的活細(xì)胞附著于選自支架、膠原、基質(zhì)、顆粒和纖維的多維支持物上的步驟。

在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明特征在于用于獲得最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物的方法，特征在于生長(zhǎng)和分離表達(dá)lgr的活細(xì)胞以移植到所選哺乳動(dòng)物靶組織的步驟，進(jìn)一步特征在于從lgr4、lgr5和lgr6中選擇表達(dá)lgr的細(xì)胞的步驟。

在任何前述方法實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供將最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物施用于上皮系統(tǒng)、腺體、毛發(fā)、神經(jīng)、骨、肌肉、脂肪、腱、血管、筋膜、眼組織和肽分泌性細(xì)胞成分之一的步驟，其采用通過選自以下的技術(shù)來遞送：施用、移植、植入、定向接種、定向遷移、定向追蹤、沉淀(insetting)、層壓(laminating)和/或注射細(xì)胞成分，用于產(chǎn)生、再生、增強(qiáng)和愈合。

在任何前述方法實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于獲得最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物的方法，特征在于生長(zhǎng)和分離表達(dá)lgr的活細(xì)胞以移植到所選哺乳動(dòng)物靶組織的步驟，進(jìn)一步特征在于將最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物直接施用于體內(nèi)組織以進(jìn)行組織修復(fù)的步驟。

在任何前述方法實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于獲得最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物的方法，特征在于生長(zhǎng)和分離表達(dá)lgr的活細(xì)胞以移植到所選哺乳動(dòng)物靶組織的步驟，進(jìn)一步特征在于將最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物經(jīng)由血流間接施用于身體以進(jìn)行組織修復(fù)的步驟。

在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明特征在于用于產(chǎn)生最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物的方法，其特征在于以下步驟：

a)獲得組織樣品；

b)從樣品中提取含表達(dá)lgr的細(xì)胞的最小極性化功能單元；

c)加工來自適當(dāng)來源的皮下組織和皮下脂肪細(xì)胞組分；

d)向提取的最小極性化功能單元中加入經(jīng)加工的皮下組織和皮下脂肪組分，以產(chǎn)生上皮干細(xì)胞單一(singularity)單元；

e)富集上皮干細(xì)胞單一單元；

f)向構(gòu)建體支架添加上皮干細(xì)胞單一單元；和

g)驗(yàn)證所得組合物的最小極性化的維持。

在任何前述實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于獲得最小極性化的微聚集體多細(xì)胞組合物的培養(yǎng)基配方，其使用細(xì)胞維持培養(yǎng)基組合物以在組織的運(yùn)輸和加工期間降低微生物的生存力，特征在于：a)上皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的混合物；b)至少一種選自青霉素、鏈霉素和兩性霉素b的藥劑；和c)纖維蛋白原。

在前述實(shí)施方案的進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于在組織的運(yùn)輸和加工期間降低微生物的生存力的細(xì)胞維持培養(yǎng)基組合物，其特征在于：a)上皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的混合物；b)至少一種選自青霉素、鏈霉素和兩性霉素b的藥劑；和c)纖維蛋白原，其中纖維蛋白原為人類的且其中藥劑包括用于穩(wěn)定人組織的抗生素和抗真菌藥二者。

在本發(fā)明的第一方面的情況下，其特征在于將表達(dá)lgr的細(xì)胞施用于支架、基質(zhì)和/或纖維，從而建立用于組織工程學(xué)應(yīng)用、細(xì)胞療法應(yīng)用、再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用、醫(yī)學(xué)/治療應(yīng)用的微聚集體多細(xì)胞移植物，將移植物直接施用于組織或血液以在身體各處改進(jìn)和/或改變上皮系統(tǒng)。

本發(fā)明的第二方面特征在于在施用于組織或血液以改進(jìn)和/或改變體內(nèi)上皮系統(tǒng)之前或之后，在含或不含另外的增強(qiáng)因子或分析物的情況下，將表達(dá)lgr的細(xì)胞施用于支架、基質(zhì)和/或纖維。

本發(fā)明的又一方面特征在于通過增強(qiáng)因子或分析物改變表達(dá)lgr的細(xì)胞，將其作為身體、組織或血液中的靶標(biāo)施用，用于通過在身體各處的局部或遠(yuǎn)端遷移來改進(jìn)和/或改變上皮系統(tǒng)和/或修復(fù)腺體和毛發(fā)生長(zhǎng)。

本發(fā)明的第四方面特征在于從組織、血液或培養(yǎng)物中移植表達(dá)lgr的細(xì)胞以改變周圍鄰近組織或遠(yuǎn)端組織，例如但不限于，在施用于組織或血液以在身體各處改進(jìn)和/或改變外胚層、中胚層或內(nèi)胚層來源的組織系統(tǒng)之前或之后，將表達(dá)lgr的細(xì)胞施用于支架、基質(zhì)和纖維。

本發(fā)明的第五方面特征在于在施用于組織或血液以在身體各處改進(jìn)和/或改變外胚層、中胚層或內(nèi)胚層來源的組織系統(tǒng)之前或之后，在含或不含另外的增強(qiáng)因子或分析物的情況下將表達(dá)lgr的細(xì)胞直接施用于選自支架、基質(zhì)和纖維的遞送基底載體。

本發(fā)明的又另一方面特征在于將通過增強(qiáng)因子或分析物改變的表達(dá)lgr的細(xì)胞與遞送支持基底組合，作為身體、組織或血液中的靶標(biāo)，用于在身體各處通過局部或遠(yuǎn)端遷移在身體各處改進(jìn)和/或改變外胚層、中胚層或內(nèi)胚層來源的組織系統(tǒng)。

本發(fā)明的又一個(gè)方面特征在于使表達(dá)lgr的細(xì)胞附著于支持基底，其用于遞送、施用、移植、植入、定向接種、定向遷移、定向追蹤、沉淀、層壓和/或注射細(xì)胞成分，用于產(chǎn)生、再生、增強(qiáng)和/或愈合上皮系統(tǒng)、腺體、毛發(fā)、神經(jīng)、骨、肌肉、脂肪、腱、血管、筋膜、眼組織和肽分泌性細(xì)胞成分。

本發(fā)明的最后說明方面為產(chǎn)生作為微聚集體多細(xì)胞功能單元的表達(dá)lgr的干細(xì)胞，其表現(xiàn)出最小極性化，用于移植和直接施用于哺乳動(dòng)物身體、組織或血液中的靶標(biāo)，以增強(qiáng)和加速組織產(chǎn)生、再生、增強(qiáng)和/或愈合。

概括地，本文的發(fā)明考慮移植和/或遞送分離的表達(dá)lgr的細(xì)胞(含有富含亮氨酸重復(fù)序列的g-蛋白偶聯(lián)受體)用于產(chǎn)生、再生、募集或增強(qiáng)上皮系統(tǒng)、毛發(fā)、腺體、骨。本發(fā)明亦考慮在補(bǔ)充或未補(bǔ)充生長(zhǎng)因子、遷移/募集分析物或lgr特異性結(jié)合成分(例如但不限于配體家族：r-脊椎蛋白、edgf、pdgf、wnt、vegf、抗微生物肽)的情況下，使用呈支架、基質(zhì)或纖維形式的遞送載體，施用于臨床醫(yī)學(xué)、生物工程和/或研究構(gòu)建體中的局部/近端和遠(yuǎn)端/遠(yuǎn)距離組織。

使用lgr上皮干細(xì)胞，特別是聯(lián)合成形的支架基底，給上皮系統(tǒng)中的全厚度傷口和/或空隙提供富含干細(xì)胞的組織替代物。此外，向上皮系統(tǒng)中添加該最小極性化的功能細(xì)胞單元(mpfu)增強(qiáng)/改進(jìn)該上皮的狀態(tài)，其包括維持和促進(jìn)上皮和局部周圍組織成分的健康和生存力通常所需的毛發(fā)、腺體、分泌性抗微生物肽、生長(zhǎng)因子和分析物的生長(zhǎng)、產(chǎn)生或再生。

認(rèn)識(shí)到lgr4+、lgr5+和lgr6+干細(xì)胞和祖細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)保持較高，特別是當(dāng)與基底支架接觸時(shí)，所以完全上皮更新(turnover)速率通常少于12天(1cm群體間距離間隔)。這種再生足夠的雙層組織及后續(xù)屏障功能的能力，表明這些細(xì)胞作為用于復(fù)合型全厚度和多組織創(chuàng)傷的一類逐漸發(fā)展的生物敷料的作用。

除快速再生皮膚、肌肉和骨的能力之外，lgr4、lgr5和lgr6干細(xì)胞的祖細(xì)胞亦具有產(chǎn)生天然抗微生物肽的能力，其不僅降低傷口床中微生物的基礎(chǔ)水平，還增進(jìn)祖細(xì)胞擴(kuò)增和分化，導(dǎo)致減少傷口和傷口周邊感染，加速傷口閉合和毛囊形成。

本文的發(fā)明描述了表達(dá)lgr的上皮干細(xì)胞接種的支架在提供即用的可遞送和活組織屏障中的轉(zhuǎn)化(translational)適用性，所述屏障能夠維持具有伴隨的活性子代的干細(xì)胞集落灶。從這些干細(xì)胞灶中，子代可經(jīng)歷遷移增殖-分化，以刺激上皮組織成分、愈合和移植物整合。已發(fā)現(xiàn)的是，lgr上皮干細(xì)胞可單獨(dú)施用、與促進(jìn)支架結(jié)合群體的極性化的支架、可溶性生長(zhǎng)因子和/或另外的細(xì)胞系以及在上皮愈合和細(xì)胞再生作用中所需的內(nèi)在組織結(jié)構(gòu)一起施用。

廣泛定義的是，本發(fā)明的方案包括：a)收獲活的人/哺乳動(dòng)物組織；b)加工組織成分以生成含表達(dá)lgr的細(xì)胞的微聚集體多細(xì)胞功能單元；c)將表達(dá)lgr的細(xì)胞微聚集體多細(xì)胞功能單元施用于選自支架、基質(zhì)、顆粒、細(xì)胞和纖維的遞送載體基底以產(chǎn)生構(gòu)建體；d)任選包含所選的額外的增強(qiáng)因子；和e)將構(gòu)建體施用于組織以產(chǎn)生、再生、增強(qiáng)和/或愈合組織系統(tǒng)，包括涉及外胚層、中胚層和/或內(nèi)胚層原始組織的組織系統(tǒng)，包括但不限于皮膚、腺體、毛發(fā)、神經(jīng)、骨、肌肉、脂肪、腱、血管、筋膜、眼組織、骨髓、肺、心、指(趾)甲、胃腸組織、口腔組織、牙、味蕾、泌尿生殖組織、腎組織、生殖組織、淋巴組織、免疫系統(tǒng)組織/成分和這類相關(guān)的附屬物和蛋白質(zhì)細(xì)胞成分。

本發(fā)明考慮通過施用、移植、植入、定向接種、定向遷移、定向追蹤、沉淀、層壓和/或注射細(xì)胞成分來直接遞送經(jīng)支持的表達(dá)lgr的上皮干細(xì)胞，以在療法、裝置、生物制品、藥物和生物工程中改變哺乳動(dòng)物組織。

定義

在此詳述中，提及“一個(gè)實(shí)施方案”、“實(shí)施方案”或“在實(shí)施方案中”，意指所提及的特征包含在本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案中。此外，分開提及“一個(gè)實(shí)施方案”、“實(shí)施方案”或“多個(gè)實(shí)施方案”，不一定是指相同的實(shí)施方案；然而，除非這樣規(guī)定，且除對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是容易顯而易見的，否則二者并非互相排斥的實(shí)施方案。因此，本發(fā)明可包括本文所述實(shí)施方案的任意多種組合和/或整合。本文使用的術(shù)語僅以描述具體實(shí)施方案為目的，且不旨在限制本發(fā)明。

除非上下文另外明確指出，否則本文使用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”，亦旨在包括復(fù)數(shù)形式。要進(jìn)一步理解的是，詞根術(shù)語“包括”和/或“具有”，當(dāng)用于本說明書時(shí)，規(guī)定所述特征、步驟、操作、成分和/或組分的存在，但不排除存在或添加至少一個(gè)其它特征、步驟、操作、成分、組分和/或其群組。

本文使用的骨，意指由嵌入礦化基質(zhì)(groundsubstance)和膠原纖維的基質(zhì)(matrix)中的細(xì)胞組成的硬結(jié)締組織。纖維浸漬有無機(jī)組分，包括磷酸鈣的晶體，由此使用x-射線衍射，其顯示為以羥磷灰石形式(磷酸鈣為85%重量)以及碳酸鈣(10%)和鎂構(gòu)成；按重量，骨由65-75%無機(jī)物和25-35%有機(jī)物構(gòu)成；一部分確定形狀和大小的骨組織，形成動(dòng)物骨骼的一部分；在人類中，在骨骼中存在約200塊不同的骨，不包括鼓室中的聽小骨或者除兩塊膝蓋骨之外的籽骨。骨被纖維膜(骨膜)包被，除關(guān)節(jié)軟骨之外，其覆蓋骨的整個(gè)表面。在骨膜之下為致密層(骨密質(zhì))，且在其之下為海綿狀層(骨松質(zhì))。長(zhǎng)骨的核心充滿骨髓。

本文使用的術(shù)語“包含(comprises)”、“含有(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“有”、“具有”或其任何其它變化，意圖涵蓋非排他性包含物。例如，包含一系列特征的過程、方法、制品或設(shè)備，不一定僅限于所述特征，還可包含未在所述過程、方法、制品或設(shè)備中明確列出或并非其固有的其它特征。

用于定義目的且如在本文中使用的“連接的”，包括物理附著或可調(diào)節(jié)安裝的，不論直接或間接，例如，將通信單元直接與pid控制器連接或當(dāng)間隔分開時(shí)通過常規(guī)無線連接與之相連。因此，除非有規(guī)定，否則“連接的”旨在包括任何操作上的功能連接。

如在本文中使用的上皮，意指覆蓋所有游離表面、皮膚、粘液和漿液的細(xì)胞層，包括來源于其中的腺體及其它結(jié)構(gòu)。

如在本文中使用的gmp，意指藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(goodmanufacturingpractices)。

如在本文中使用的體被，意指身體的包被膜；除表皮和真皮之外，包括表皮、毛發(fā)、指(趾)甲、汗腺和皮脂腺及乳腺的所有衍生物，以及皮下組織。

如在本文中使用的lgr4，意指含有富含亮氨酸重復(fù)序列的g蛋白偶聯(lián)受體4，為在多種生理功能中起重要作用的g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)。富含亮氨酸gpcr(lgr)家族的成員，例如gpr48，具有多個(gè)n-端富含亮氨酸重復(fù)序列(lrr)和7-跨膜結(jié)構(gòu)域。lgr4(含有富含亮氨酸重復(fù)序列的g蛋白偶聯(lián)受體4)為蛋白質(zhì)編碼基因。與lgr4相關(guān)的疾病包括低骨礦物質(zhì)密度。其相關(guān)的途徑包括wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑(kegg)。涉及該基因的go注釋包括g-蛋白偶聯(lián)受體活性和跨膜信號(hào)傳導(dǎo)受體活性。該基因的一個(gè)重要旁系同源物(paralog)為lgr6。用于r-脊椎蛋白的受體增強(qiáng)典型wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑并涉及多種器官的形成。在與r-脊椎蛋白(rspo1、rspo2、rspo3或rspo4)結(jié)合之后，與通過胞外wnt受體激活的磷酸化lrp6和frizzled受體結(jié)合，觸發(fā)典型wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑以增加靶基因的表達(dá)。

與經(jīng)典的g-蛋白偶聯(lián)受體相比，lgr4不激活異源三聚體g-蛋白以轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。其作為wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活物的功能，為多種器官的發(fā)育所必需的，所述器官包括肝、腎、腸、骨、生殖道和眼。lgr4亦可充當(dāng)norrin(ndp)的受體，且在精子發(fā)生期間為必需的，以在小管周肌樣細(xì)胞中激活wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑。同樣，需要lgr4來維持出生后腸隱窩中的腸干細(xì)胞和帕內(nèi)特細(xì)胞分化。除涉及腎發(fā)育之外，lgr4亦充當(dāng)骨形成和重塑的調(diào)節(jié)物；為將輸尿管芽維持在未分化狀態(tài)所必需。lgr4涉及眼前段的發(fā)育，在紅細(xì)胞生成期間為必需的，且通過抑制tlr2/tlr4相關(guān)的模式識(shí)別和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生來充當(dāng)先天免疫的負(fù)調(diào)節(jié)物。lgr在調(diào)節(jié)血漿脂質(zhì)的晝夜節(jié)律中起重要作用，部分地通過調(diào)節(jié)mttp的節(jié)律性表達(dá)進(jìn)行(通過類似方式)。用于lgr4的通常已知的別名包括：gpr48；g蛋白偶聯(lián)受體48；bnmd17；含有富含亮氨酸重復(fù)序列的g蛋白偶聯(lián)受體4；含有富含亮氨酸重復(fù)序列的g-蛋白偶聯(lián)受體4；和g-蛋白偶聯(lián)受體48。用于lgr4的外部數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符包括：hgnc:13299、entrezgene:55366、ensembl:ensg00000205213、omim:606666和uniprotkb:q9bxb。

如在本文中使用的lgr5，意指含有富含亮氨酸重復(fù)序列的g蛋白偶聯(lián)受體5，為蛋白質(zhì)編碼基因。其相關(guān)的途徑包括wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑(kegg)。涉及該基因的go注釋包括g-蛋白偶聯(lián)受體活性和跨膜信號(hào)傳導(dǎo)受體活性。該基因的一個(gè)重要旁系同源物為lgr6。lgr5受體用于r-脊椎蛋白，其增強(qiáng)典型wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑并充當(dāng)腸上皮和毛囊的干細(xì)胞標(biāo)志物。在與r-脊椎蛋白(rspo1、rspo2、rspo3或rspo4)結(jié)合之后，與通過胞外wnt受體激活的磷酸化lrp6和frizzled受體結(jié)合，觸發(fā)典型wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑以增加靶基因的表達(dá)。與經(jīng)典的g-蛋白偶聯(lián)受體相比，lgr5不激活異源三聚體g-蛋白以轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。其在胚后發(fā)育期間涉及成體腸干細(xì)胞的發(fā)育和/或維持。用于lgr5的通常已知的別名包括：g-蛋白偶聯(lián)受體hg38；g-蛋白偶聯(lián)受體49；g-蛋白偶聯(lián)受體67；gpr67；gpr49和含有富含亮氨酸重復(fù)序列的g-蛋白偶聯(lián)受體5。用于lgr5的外部數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符包括hgnc:4504、entrezgene:8549、ensembl:ensg00000139292、omim:606667和uniprotkb:o75473。

如在本文中使用的lgr6，意指含有富含亮氨酸重復(fù)序列的g蛋白偶聯(lián)受體6，其為蛋白質(zhì)編碼基因，該基因編碼g蛋白偶聯(lián)的7-跨膜蛋白超家族的含有富含亮氨酸重復(fù)序列的亞族的成員。編碼的蛋白質(zhì)為具有大型n-端胞外結(jié)構(gòu)域的糖蛋白激素受體，其含有對(duì)形成用于配體結(jié)合的馬蹄形相互作用基序而言重要的富含亮氨酸的重復(fù)序列。該基因的選擇剪接得到多種轉(zhuǎn)錄物變體。與lgr6相關(guān)的疾病包括粘液水腫和卵巢囊腺瘤。其相關(guān)的途徑包括wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑(kegg)和gpcr。涉及該基因的其它注釋包括g-蛋白偶聯(lián)受體活性和跨膜信號(hào)傳導(dǎo)受體活性。該基因的一個(gè)重要旁系同源物為tshr。用于r-脊椎蛋白的受體增強(qiáng)典型wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑并充當(dāng)表皮中的多能干細(xì)胞的標(biāo)志物。在與r-脊椎蛋白(rspo1、rspo2、rspo3或rspo4)結(jié)合之后，與通過胞外wnt受體激活的磷酸化lrp6和frizzled受體結(jié)合，觸發(fā)典型wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑以增加靶基因的表達(dá)。與經(jīng)典的g-蛋白偶聯(lián)受體相比，lgr6不激活異源三聚體g-蛋白以轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)且可充當(dāng)腫瘤抑制物。用于lgr6的常見別名包括：促性腺激素受體；vts20631和gpcr。用于lgr6的外部數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符包括hgnc:19719、entrezgene:59352、ensembl:ensg00000133067、omim:606653和uniprotkb:q9hbx8。

如在本文中使用的間充質(zhì)，意指間充質(zhì)細(xì)胞的聚集物。由間充質(zhì)細(xì)胞組成的原始胚胎結(jié)締組織，通常呈星狀形式，在層間膠狀物中得到支持。

如在本文中使用的肌肉，意指主要由高度特化的收縮細(xì)胞組成的基本組織，其可分為骨骼肌、心肌或平滑?。辉陲@微鏡下，后者缺乏其它兩種類型的橫紋特征；其為通過其實(shí)現(xiàn)多個(gè)器官和部件的運(yùn)動(dòng)的身體的收縮性器官之一；典型的肌肉為通過腱在各末端附著于骨或其它結(jié)構(gòu)的一群肌纖維(突起或肌腹)；更近端或更固定的附著稱為起點(diǎn)(q.v.)，更遠(yuǎn)端或更加可活動(dòng)的附著為止點(diǎn)(q.v.)；附著于起點(diǎn)的腱的肌腹的變窄部分稱為頭或頭部。

如在本文中使用的神經(jīng)的(neural)，意指包括由神經(jīng)細(xì)胞或其突起構(gòu)成的任何結(jié)構(gòu)，或者在進(jìn)一步發(fā)育后將進(jìn)化成神經(jīng)細(xì)胞的任何結(jié)構(gòu)。涉及椎體或其前體的背側(cè)，其中具有脊髓，與血管相反。

如在本文中使用且除非明確相反說明，否則“或”是指可兼或且不是指異或。例如，下列的任一項(xiàng)均滿足條件a或b：a為真(或存在)且b為假(或不存在)，a為假(或不存在)和b為真(或存在)，以及a和b二者均為真(或存在)。

顆粒的含義在本文中意味著十微米或更小的最大域，且包括但不限于納米粒子、大分子締合物、膠束、血影細(xì)胞(cellghost)、樹枝狀聚合物等等，其可充當(dāng)用于細(xì)胞微聚集體的合適的錨。

如在本文中使用的極性，意指細(xì)胞、組織和/或生物體沿軸差異發(fā)育的趨勢(shì)。

如在本文中使用的脈沖復(fù)蘇培養(yǎng)基(prm)，為細(xì)胞維持培養(yǎng)基混合物的配方，包含角質(zhì)形成細(xì)胞-sfm(1x)、選自青霉素、鏈霉素和兩性霉素b的抗生素-抗真菌藥和纖維蛋白原，其中角質(zhì)形成細(xì)胞-sfm由上皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的混合物構(gòu)成。使用所述試劑以穩(wěn)定原代組織并降低微生物在運(yùn)輸和加工期間的生存力。

如在本文中使用的皮膚，意指身體的膜狀保護(hù)性覆蓋物，由表皮和真皮(dermis(corium))組成。

如在本文中使用的干細(xì)胞，意指任何前體細(xì)胞；具有可分化成其它細(xì)胞類型的子細(xì)胞的細(xì)胞；能夠在給一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞系輸出子代的同時(shí)維持其自身數(shù)量的細(xì)胞。

如在本文中使用的“基本上”、“一般”和其它程度詞，均為相對(duì)修飾詞，旨在指示與如此修飾的特征的允許偏差。不旨在限于其修飾的絕對(duì)值或特征，而是與其對(duì)立面相比具有更多物理或功能特征，以及優(yōu)選靠近或接近這樣的物理或功能特征。

如在本文中使用的組織，意指相似細(xì)胞及圍繞其的細(xì)胞間物質(zhì)的集合。身體中存在四種基本類型的組織：上皮組織；結(jié)締組織，包括脂肪組織、血、骨和軟骨；肌肉組織；和神經(jīng)組織。任何身體或部位的外皮、被膜或覆蓋物。

在下列描述中，參考這樣的附圖，提供其用于說明目的，作為其中可實(shí)施本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的代表。以足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的詳細(xì)程度來闡述下文圖解的實(shí)施方案。要理解的是，可采用其它實(shí)施方案，且可在不背離本發(fā)明范圍的情況下進(jìn)行基于目前已知結(jié)構(gòu)和/或功能等同物的結(jié)構(gòu)改變。

附圖簡(jiǎn)述

圖1a描述所述皮膚來源的表達(dá)lgr的細(xì)胞的位置的實(shí)例。

圖1b為熒光激活的細(xì)胞分選圖表。

圖1c為考慮聯(lián)合本發(fā)明使用的一系列不同的非細(xì)胞支持物的照片。

圖2a為可用于接種的整體細(xì)胞構(gòu)建體/去細(xì)胞化膠原支架的照片。

圖2b為在接種根據(jù)本發(fā)明的微聚集體多細(xì)胞功能單元之后的膠原構(gòu)建體的免疫熒光顯微照片。

圖3a-3f通過不同的技術(shù)顯示根據(jù)本發(fā)明的一系列不同接種基底的多個(gè)圖像。

圖4a描述對(duì)照和根據(jù)本發(fā)明的含lgr構(gòu)建體的實(shí)例的體內(nèi)愈合進(jìn)展的延時(shí)攝影。圖4b為第十天的細(xì)胞角蛋白-17轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的圖示表達(dá)。圖4c-e描述通過生物發(fā)光成像掃描電子顯微鏡術(shù)，對(duì)照和根據(jù)本發(fā)明的基于表達(dá)lgr的微聚集體多細(xì)胞功能單元的基質(zhì)，以及具有硅酮保護(hù)覆蓋物的備選基質(zhì)。

圖5a-e描述在最初極性化形式之后具有l(wèi)gr和支持性細(xì)胞實(shí)體的所述構(gòu)建體的實(shí)例，隨附圖表比較。

圖6a-b描述含和不含支持性細(xì)胞實(shí)體的含lgr細(xì)胞的構(gòu)建體的實(shí)例，以及生長(zhǎng)因子的相對(duì)產(chǎn)生量。

圖7a-h闡述接受增加進(jìn)入三度傷口床的lgr細(xì)胞遷移、增殖和生存力的治療實(shí)例的傷口/損傷/空隙。

圖8a-q描述具有l(wèi)gr的傷口/損傷/空隙涉及抗微生物性能的時(shí)間進(jìn)展。

圖9a和b為傷口床內(nèi)的表達(dá)lgr的細(xì)胞實(shí)體的對(duì)比照片，其涉及在缺乏附屬結(jié)構(gòu)的情況下在治療的燒傷傷口中增強(qiáng)愈合、組織和附屬物再生及后續(xù)毛發(fā)生長(zhǎng)。

圖10a-l包括涉及增強(qiáng)所述實(shí)體的愈合、增殖的傷口/損傷/組織空隙中的所述表達(dá)lgr的細(xì)胞實(shí)體的實(shí)例。

圖11a和b闡述涉及增強(qiáng)促愈合途徑的具有放入傷口中的所述表達(dá)lgr的細(xì)胞實(shí)體的傷口/損傷/組織空隙。

圖12a-1表示涉及位置、群體身份和傷口愈合能力的含表達(dá)lgr的干細(xì)胞灶的微聚集體多細(xì)胞單元的實(shí)例。

圖13a-d為在初始接種和1天之后的時(shí)間，通過共聚焦顯微鏡和生物發(fā)光的功能單一單元(afsu)的顯微照片。

圖13e為膠原支架的顯微照片。

圖14a-e描述lgr細(xì)胞位置多樣性的實(shí)例，其涉及皮膚組織內(nèi)的位置、表型、界面和極性。從毛囊隆突處分離和培養(yǎng)lgr6+esc。

圖15a-e提供表達(dá)lgr的細(xì)胞灶的實(shí)例，其涉及通過放置在傷口/損傷/組織空隙周圍和/或之中來遞送的方法。

圖16a-d描述含lgr的干細(xì)胞灶的實(shí)例，其涉及經(jīng)由可遞送載體遞送到傷口之中和周圍以及組織和支持結(jié)構(gòu)的后續(xù)治愈、再生。

圖17a-d顯示移植之后10天在全厚度傷口床中的lgr6+上皮干細(xì)胞遷移和分化。

圖18提供具有表達(dá)lgr的細(xì)胞灶的傷口/損傷/組織空隙的rt-pcr定量和插入的基因熱圖比較。

圖19描述涉及遞送到傷口/損傷/組織空隙之中和/或周圍并增強(qiáng)傷口愈合因子的所述表達(dá)lgr的細(xì)胞灶的實(shí)例。

圖20a-f闡述涉及骨組織的再生的表達(dá)lgr的細(xì)胞灶的實(shí)例。分離的lgr灶可接種至骨并保持活性。

發(fā)明詳述

圖1a-c為存在于毛囊周圍的細(xì)胞群體的流式細(xì)胞術(shù)和在接種時(shí)所述細(xì)胞容易附著的支架的實(shí)例。更具體而言，圖1a描述皮膚來源的所述表達(dá)lgr的細(xì)胞的位置的實(shí)例。40x放大倍數(shù)下的免疫熒光共聚焦顯微鏡描述毛囊隆突(白色箭頭)、lgr6+(綠色)、dna(藍(lán)色)。圖1b為熒光激活的細(xì)胞分選圖表，門分析指出示例性細(xì)胞標(biāo)志物。圖1c描述可用于接種根據(jù)本發(fā)明的一系列非細(xì)胞基質(zhì)/基底/支架/材料的一組細(xì)胞類型。

圖2a為不含根據(jù)本發(fā)明的含表達(dá)lgr的干細(xì)胞灶的微聚集體多細(xì)胞功能單元的整體構(gòu)建體的實(shí)例的攝像顯示。圖2b描述在用根據(jù)本發(fā)明的含表達(dá)lgr的干細(xì)胞灶的微聚集體多細(xì)胞功能單元接種基底之后的構(gòu)建體。

圖3a為分列格式的通過微分干涉差(dic)共聚焦顯微鏡的lgr接種的來自不同來源的基底的圖像系列。圖3b為通過20x放大倍數(shù)下的免疫熒光共聚焦顯微鏡的lgr6+esc接種的含表達(dá)lgr的細(xì)胞的各構(gòu)建體的基質(zhì)的對(duì)應(yīng)列。插入的白框表示在圖3d列中顯示的局部放大區(qū)，而圖3c為描述圖3a的各圖像(dic)和圖3b的免疫熒光的數(shù)字合并的列，指出基質(zhì)輪廓和邊界。圖3e和3f的列分別表示以非細(xì)胞基質(zhì)對(duì)照和接種后72小時(shí)的相應(yīng)的lgr6+esc接種的基質(zhì)的輻射效率測(cè)得的生物發(fā)光。

圖4a-e描述放入活的哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的所述含lgr構(gòu)建體的實(shí)例。放置lgr6+gfpesc接種的基質(zhì)增強(qiáng)治愈毛囊生長(zhǎng)。圖4a為不含基質(zhì)(燒傷對(duì)照)、含基質(zhì)(基質(zhì)對(duì)照)和根據(jù)本發(fā)明的lgr6+gfpesc的3mm人去細(xì)胞化真皮全厚度燒傷傷口床在第5天、第8天和第10天的3x3顯微照片矩陣。圖4b圖示描述圖4a中所述的傷口床在第10天的細(xì)胞角蛋白-17轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的相對(duì)表達(dá)。使用作為imagejncbi應(yīng)用中的百分面積函數(shù)的傷口床愈合率的定量分析來確定愈合的傷口床百分?jǐn)?shù)。傷口對(duì)照僅包含燒傷傷口床?；|(zhì)對(duì)照僅包含基質(zhì)，而lgr6+gfp包含用lgr6+gfpesc接種的adm。圖4c為第5天在鼠全厚度燒傷傷口床中的體內(nèi)生物發(fā)光成像的顯微照片。圖4d為對(duì)照以及在接種esc之后的12小時(shí)和72小時(shí)的含lgr6+gfp的真皮在100x下的人真皮的顯微照片。白色箭頭指示皮膚小孔的存在。圖4e提供對(duì)照和含有具有防止干燥的硅酮保護(hù)覆蓋物的用esc接種的人真皮的本發(fā)明的構(gòu)建體的圖像。lgr6+gfp基質(zhì)圖像包括一對(duì)小黑箭頭，指出來自全厚度nu/nu鼠傷口床的新生毛發(fā)塊(hairpatch)。

圖5a-e描述在初始極性化形式之后的具有l(wèi)gr和支持性細(xì)胞實(shí)體的所述構(gòu)建體的實(shí)例，以及向lgr6+esc接種的基質(zhì)添加基質(zhì)血管部分(svf)在促進(jìn)組織極性化和雙區(qū)室皮膚樣系統(tǒng)中的作用。圖5a為在接種至代表性腎上腺髓質(zhì)素(adm)(例如可以名稱integra?獲自integralifesciencescorporation)之后24小時(shí)的5x10⁵個(gè)表達(dá)rfp的基質(zhì)血管部分細(xì)胞的分離群的20x共聚焦成像。圖5b為在接種至代表性adm(integra?)之后24小時(shí)的5x10⁵個(gè)表達(dá)gfp的lgr6+的細(xì)胞分離群的20x共聚焦圖像。圖5c描述在培養(yǎng)中共同接種之后24小時(shí)的用5x10⁵個(gè)表達(dá)rfp的svf和5x10⁵個(gè)表達(dá)gfp的lgr6+分離群雙重接種的代表性adm(integra?)的20x共聚焦成像。圖5d為在培養(yǎng)中生長(zhǎng)5天之后的含5x10⁵個(gè)表達(dá)rfp的svf^rfp和5x10⁵個(gè)表達(dá)gfp的lgr6+的共同接種的基質(zhì)。平行虛線指出蓄積在adm基底邊緣的上皮lgr6^+gfp譜系。小括弧和大括弧指出與lgr6^+gfp和svf^rfp豐度相關(guān)的兩個(gè)區(qū)室的相對(duì)位置。標(biāo)有箭頭的“u”形實(shí)線指出含有通過32號(hào)無菌針頭誘導(dǎo)的預(yù)接種孔的區(qū)域。圖5e為使用綠色表達(dá)lgr的細(xì)胞和紅色表達(dá)svf的細(xì)胞共同接種的膠原基底的增殖動(dòng)力學(xué)的圖示。

圖6a和6b描述含或不含支持性細(xì)胞實(shí)體的含lgr細(xì)胞的構(gòu)建體的實(shí)例，以及生長(zhǎng)因子的相對(duì)產(chǎn)生量。來自富含lgr6^+gfpesc和svf^rfp的支架培養(yǎng)構(gòu)建體的促血管發(fā)生轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)分析物的相關(guān)表達(dá)譜。圖6a圖示了來自總rna的指定基因成分的轉(zhuǎn)錄物相對(duì)倍數(shù)表達(dá)(??ct)：在各支架基底上的lgr6^+gfpesc(黑色條)、svf^rfp(灰色條)和共培養(yǎng)lgr6^+gfpesc+svf^rfp(白框)。x軸上方的顯著性(lgr6+svf)表示所指示支架上的共培養(yǎng)lgr6^+gfpesc+svf^rfp表達(dá)與單一lgr6^+gfpesc和svf^rfp表達(dá)的相互比較。例如，除共培養(yǎng)integra?(integra+lgr6+svf)之外，共培養(yǎng)基質(zhì)的平均fgf-2基因表達(dá)均高于兩種單一系統(tǒng)(支架+lgr6或支架?+svf)的平均表達(dá)。x軸下方的顯著性(lgr6)或(svf)指示在細(xì)胞實(shí)體保持不變時(shí)基底的內(nèi)部比較。例如，單獨(dú)的integra?+lgr6^+gfpesc與單獨(dú)的dermamatrix?+lgr6^+gfpesc的vegf-a基因表達(dá)無顯著性(ns)。圖6b圖示來自總蛋白質(zhì)分離物的所指示蛋白質(zhì)分析物的相對(duì)密度單位(rdu)：各支架基底上的lgr6^+gfpesc(黑色條)、svf^rfp(灰色條)和共培養(yǎng)lgr6^+gfpesc+svf^rfp(白框)。(*)表示(p值<0.05)，一式三份完成測(cè)定，gapdh看家基因?qū)φ铡?/p>

圖7a-h闡述接受增加進(jìn)入傷口(稱為三度傷口床)中的lgr細(xì)胞遷移、增殖和生存力的治療實(shí)例的傷口/損傷/空隙，誘導(dǎo)并驗(yàn)證lgr干細(xì)胞毛囊隆突和附屬結(jié)構(gòu)的去除。圖7a描述3mm直徑的傷口床模板標(biāo)記。圖7b描述第0天的傷口床結(jié)構(gòu)(白色比例尺為1mm)。圖7c圖示2x33mm傷口床網(wǎng)格的實(shí)例。圖7d顯示在傷口部位局部施用重懸浮的肽。圖7e為具有毛囊和附屬結(jié)構(gòu)的未燒傷完整體被/皮膚的h&e染色的顯微照片。箭頭指示放大的毛囊的位置(插圖)，其中白色比例尺為500μm。圖7f為在高溫?zé)浦蟮氖蟊巢科つw的h&e染色，其顯示去除了包括毛囊隆突在內(nèi)的表皮、真皮和皮下組織。圖7g為具有毛囊和附屬結(jié)構(gòu)的未燒傷完整皮膚的dapi/dna染色(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)。箭頭指示免疫熒光lgr5和lgr6抗體(分別為綠色和紅色)共同標(biāo)記的放大的毛囊(插圖)。圖7h為在高溫?zé)浦蟮氖蟊巢科つw的dapi/dna染色，其顯示去除了包括毛囊隆突在內(nèi)的表皮、真皮和皮下組織，其中白色比例尺為100μm。

圖8a-q描述涉及五天和十天時(shí)間內(nèi)的抗微生物性能的具有l(wèi)gr的傷口/損傷/空隙。使用16srrna熒光寡核苷酸探針，原位雜交指出三度燒傷傷口床處細(xì)菌粘附的存在。圖8a顯示每天用sdz處理的在燒傷誘導(dǎo)之后第五天的3度燒傷傷口床的dna/dapi標(biāo)記。在圖8b中，描述了每天用sdz處理的在燒傷誘導(dǎo)之后第五天的3度燒傷傷口床細(xì)菌生物(黃色顆粒)的經(jīng)5’-cy3-eub338標(biāo)記的16srrna。圖8c為圖8a和8b的數(shù)字合并圖像。圖8d對(duì)應(yīng)于圖8a，除了在第十天用dna/dapi標(biāo)記每天用sdz處理的3度燒傷傷口床。相應(yīng)地，圖8e為每天用sdz處理的在燒傷誘導(dǎo)之后第十天的3度燒傷傷口床細(xì)菌生物(黃色顆粒)的經(jīng)5’-cy3-eub338標(biāo)記的16srrna的顯微照片。圖8f為圖8d和e的合并圖像。圖8g-8l為分別對(duì)應(yīng)于圖8a-f的五天和十天燒傷后時(shí)期的圖像，但經(jīng)歷使用防御素、α5(defa5)而不是sdz進(jìn)行每天處理。h中的箭頭表示具有覆蓋的含纖維物質(zhì)的組織的界面，其中在defa5處理的情況下觀察到更少細(xì)菌。帶有插圖8n的圖8m顯示用sdz處理且每單位面積含更多16srrna標(biāo)記的傷口床的cy3熒光灰度轉(zhuǎn)換圖像的白像素強(qiáng)度的定量。圖8o和插圖8p相應(yīng)地顯示用defa5處理且每單位面積含減少的16srrna標(biāo)記的傷口床的cy3熒光灰度轉(zhuǎn)換圖像(插圖p)的白像素強(qiáng)度的定量。使用灰度成像軟件，該插圖描述第五天在sdz和defa5處理的燒傷傷口床二者中表達(dá)的16srrna的平均白像素強(qiáng)度。最后，圖8q為說明第五天在sdz和defa5處理的燒傷傷口床二者中表達(dá)的16srrna的平均紅色通道熒光的圖表。圖8h中的白色箭頭指示defa5處理的傷口床中的潛在的膜，和圖8m中的黑色箭頭指示白像素強(qiáng)度。比例尺100μm。(*)表示p值<0.05。

圖9a和b為表示傷口內(nèi)的表達(dá)lgr的細(xì)胞實(shí)體的實(shí)例的一系列時(shí)間進(jìn)展照片，其涉及在缺乏附屬結(jié)構(gòu)的情況下在治療的燒傷傷口中增強(qiáng)愈合、組織和附屬物再生以及后續(xù)毛發(fā)生長(zhǎng)、傷口愈合動(dòng)力學(xué)和新生毛發(fā)生長(zhǎng)。使用leicawildm680外科顯微鏡對(duì)包括圖9a在內(nèi)的照片系列進(jìn)行整體成像，以將在用指定藥劑mqh2o、defa5、defb1、sdz處理時(shí)在10天內(nèi)的3度燒傷傷口床的愈合成像。白色比例尺代表1mm。圖9b的第二照片系列同樣包括使用leicawildm680進(jìn)行整體成像，以并排比較defa5與對(duì)照處理的傷口床來追蹤在16天內(nèi)的3度燒傷傷口床的新生毛發(fā)生長(zhǎng)。白色箭頭指示新毛發(fā)的生長(zhǎng)。同樣，比例尺為1mm。

圖10a-l包括涉及增強(qiáng)所述實(shí)體的愈合、增殖的傷口/損傷/組織空隙中的所述表達(dá)lgr的細(xì)胞實(shí)體的實(shí)例。包括圖10k和10l在內(nèi)的圖表提供在用局灶劑處理之后的傷口床愈合動(dòng)力學(xué)以及進(jìn)入燒傷組織的lgr5和lgr6干細(xì)胞遷移的定量的證據(jù)。簡(jiǎn)單說來，這些測(cè)試用于確認(rèn)來自對(duì)lgr5和lgr6成像的定量共聚焦顯微強(qiáng)度模式，且是基于對(duì)燒傷傷口組織的反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)。如在圖表中所示，與第5天在磺胺嘧啶處理傷口中的lgr5和lgr6的未檢出水平相比，發(fā)現(xiàn)在人α防御素5中的平均lgr5和lgr6mrna表達(dá)分別為95.8±10.6和259.2±20.2(圖4，右)。在人α防御素5處理的組織和用磺胺嘧啶處理的樣品中的這些倍數(shù)水平比較的數(shù)量級(jí)，表明遷移到傷口中的表達(dá)lgr5和lgr6的細(xì)胞的絕對(duì)存在或者絕對(duì)缺乏定義倍數(shù)值。

轉(zhuǎn)向具體附圖，圖10a顯示具有代表1mm的白色比例尺的傷口區(qū)域的照片，且以黑色顯示傷口面積計(jì)算。圖10b以圖表顯示在指定局灶劑施用的10天時(shí)間內(nèi)表達(dá)為剩余傷口面積的百分?jǐn)?shù)%的平均傷口愈合率。星號(hào)(*)代表p值<0.05。圖10c-j為在第5天的defa5處理傷口床的lgr5和lgr6免疫熒光抗體標(biāo)記，其中圖10c為dna/dapi/藍(lán)，圖10d為lgr5/fitc/綠，圖10e為lgr6/tritc/紅，和圖10f為10c-10e的合并。圖10g-i為在第5天的sdz(磺胺嘧啶)處理傷口床的對(duì)應(yīng)的lgr5和lgr6免疫熒光抗體標(biāo)記(dna/dapi/藍(lán)、lgr5/fitc/綠和lgr6/tritc/紅)。圖10j為10g-10i的合并圖像且包含使用在第5天的每個(gè)傷口床的綠色和紅色熒光強(qiáng)度顯示平均lgr5和lgr6表達(dá)的插圖。顯示從反轉(zhuǎn)錄酶pcr定量rna的倍數(shù)增加獲得的比較值，所述rna提取自用defa5和sdz處理的傷口床重復(fù)。白色比例尺50μm且同樣地，星號(hào)(*)代表p值<0.05。

圖11a和b闡述涉及增強(qiáng)促愈合途徑的具有放入傷口中的表達(dá)lgr的細(xì)胞實(shí)體的傷口/損傷/組織空隙。所述附圖分別代表與sdz相比的用defa5處理的傷口床的rt-pcr定量和基因熱圖比較。這些附圖顯示人α防御素5相對(duì)于磺胺嘧啶在增強(qiáng)傷口中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的作用。結(jié)果顯示在與磺胺嘧啶療法進(jìn)行比較時(shí)，在接受人α防御素5的傷口床內(nèi)，數(shù)個(gè)基因亞組顯著上調(diào)，且在lgr干細(xì)胞系統(tǒng)響應(yīng)腸道和皮膚二者中的wnt配體中，某些wnt途徑基因亞組顯著上調(diào)。

圖11a顯示對(duì)于將defa5與sdz處理系統(tǒng)進(jìn)行比較的傷口床，具有倍數(shù)調(diào)節(jié)的平均傷口愈合rt2-pcr陣列途徑熱圖和相應(yīng)的基因圖。圖11b顯示對(duì)于將defa5與sdz處理系統(tǒng)進(jìn)行比較的傷口床，具有倍數(shù)調(diào)節(jié)的平均wntrt2-pcr陣列愈合途徑熱圖和相應(yīng)的基因圖。熱圖的顏色顯示為紅色：在defa5處理的燒傷中更多表達(dá)，綠色：在sdz處理的燒傷中更多表達(dá)。

圖12a-i表示涉及位置、群體身份和傷口愈合能力的含表達(dá)lgr的干細(xì)胞灶的微聚集體多細(xì)胞單元的實(shí)例。使用簡(jiǎn)單的離體傷口愈合試驗(yàn)和熒光激活的細(xì)胞分選術(shù)，分離lgr6+、cd34+和cd73+c57bl/6(ubc-gfp)鼠細(xì)胞用于細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)大。圖12a描述在10個(gè)單位/μl分散酶部分消化表皮之后毛囊上細(xì)胞的lgr6熒光抗體(綠色)表達(dá)。(worthingtonbiochemicalcorp.，lakewood,n.j.)于37℃在慢速搖床上消化30分鐘。圖12b為表達(dá)額外的cd34和cd73標(biāo)志物的lgr6+細(xì)胞(箭頭指示包含全部細(xì)胞的約1-3%的分離群)。圖12c-h為體外傷口試驗(yàn)的efluor450表達(dá)直方圖，分別顯示周期性內(nèi)在的來自c57bl/6(ubc-gfp)鼠細(xì)胞的gfp表達(dá)、cd34+pe/cy7表達(dá)、lgr6+apc表達(dá)和cd73+。虛線指示在破壞細(xì)胞層之后在0、6和12小時(shí)的分離距離，且比例尺=50μm。圖12i的圖表顯示隨時(shí)間在距離線上的平均減小，表示為熒光分選之后的初始距離的百分?jǐn)?shù)，其中星號(hào)(*)代表p值<0.05。

圖13a-d為在初始接種和1天之后的時(shí)間，通過共聚焦顯微鏡和生物發(fā)光的激活的功能單一單元(afsu)的顯微照片，其顯示正在膠原基質(zhì)(圖13e)上經(jīng)歷初始增殖的含表達(dá)lgr的干細(xì)胞灶的微聚集體多細(xì)胞單元的實(shí)例。

圖14a-e描述lgr細(xì)胞位置多樣性的實(shí)例，其涉及皮膚組織內(nèi)的位置、表型、界面和極性。圖14a通過免疫熒光染色顯示lgr6(綠色/異硫氰酸熒光素(fitc))和lgr5(紅色/異硫氰酸四甲基羅丹明(tritc))表達(dá)的局部區(qū)域。比例尺為20μm。圖14b顯示來自c57bl/6(ubcgfp)鼠皮膚的lgr6+^gfp上皮干細(xì)胞的熒光激活的細(xì)胞分選分離，左側(cè)為使用lgr6+、cd34和cd73的最終分選門，且右側(cè)為描述細(xì)胞gfp表達(dá)和相關(guān)抗體-綴合標(biāo)記的各個(gè)直方圖：cd73/pe-7、lgr6/cy5、cd34/eflour450。圖14c顯示在熒光激活的細(xì)胞分選分離之后涂布的lgr6^+gfp上皮干細(xì)胞的微分干涉差圖像。圖14d描述lgr6^+gfp上皮干細(xì)胞的內(nèi)在gfp表達(dá)，且圖14e為圖14c和14d的合并圖像。比例尺代表20μm。

圖15a-e提供表達(dá)lgr的細(xì)胞灶的實(shí)例，其涉及通過放置在傷口/損傷/組織空隙周圍和/或之中來遞送的方法。圖15a的三個(gè)圖像分別描述初始燒傷模板；nu/nu小鼠背部的全厚度燒傷；和在傷口床的基部遞送含10⁵個(gè)lgr6^+gfp上皮干細(xì)胞的hydrogel?。用于圖15a的比例尺為1mm。圖15b為第0天注射袋(pocket)dna/dapi-藍(lán)的免疫熒光圖像。圖15b為抗lgr6/tritc抗體標(biāo)記的免疫熒光圖像，和圖15c為lgr6^+gfp上皮干細(xì)胞的相同圖像。圖15e為圖15b-d的合并圖像，且具有20μm的比例尺。圖15a-e顯示全厚度燒傷傷口床誘導(dǎo)并驗(yàn)證lgr6+干細(xì)胞植入后續(xù)軟組織缺損中。

圖16a-d描述含lgr的干細(xì)胞灶的實(shí)例，其涉及經(jīng)由可遞送載體遞送到傷口之中和周圍以及組織和支持結(jié)構(gòu)的后續(xù)治愈、再生，包括但不限于血管發(fā)生(angiogenesis)和/或血管生成(angiogenesis)。在lgr6+上皮干細(xì)胞移植到全厚度傷口中之后的傷口愈合進(jìn)展。與圖16b在15天內(nèi)的lgr6^+gfp上皮干細(xì)胞接種的水凝膠進(jìn)行比較，在圖16a中描述在注射來自bdbiosciences，sanjose，calif.的水凝膠(對(duì)照)之后的傷口愈合進(jìn)展。比例尺為1mm。在圖16c中，顯示第15天之后的植入袋，白色箭頭指示位于愈合傷口床內(nèi)的剩余l(xiāng)gr6^+gfp上皮干細(xì)胞群體的存在。在圖16d中，黑色箭頭指示不含lgr6^+gfp上皮干細(xì)胞的燒傷傷口基部的位置。

圖17a-d描述在遞送到傷口之中和/或周圍之后的含lgr干細(xì)胞灶的實(shí)例，其隨后治愈并再生組織和相關(guān)附屬物，例如但不限于毛囊及相關(guān)支持結(jié)構(gòu)。圖17a為將lgr6+上皮干細(xì)胞移入傷口床的移植10天之后，在第10天的免疫熒光標(biāo)記的組織樣品的共聚焦圖像的四圖矩陣(fourpanelmatrix)。包括圖17a在內(nèi)的圖像包括dna/dapi-藍(lán)；抗lgr6/tritc；lgr6^+gfpesc的gfp表達(dá)。

圖17b為所有通道的微分干涉差圖像合并。紅色箭頭指示新生毛囊形成的區(qū)域。(亦參見上方插圖)。虛線顯示覆蓋新生毛囊的上皮極性化，而白色箭頭指示移植物注射袋的位置(對(duì)于初始注射袋細(xì)胞群體的圖像，亦參見其在下方插圖中的放大)。圖17b的插圖表示在對(duì)照和lgr6+^+gfp處理的指定燒傷床中的相當(dāng)?shù)膋rt17/細(xì)胞角蛋白17基因表達(dá)。

參考圖17c，三個(gè)圖像為用于覆蓋毛囊研究群體燒傷傷口床的移植圓頂(transplantdome)、具有新生毛囊(空心箭頭)毛囊囊腫形成(folliclecystformation)的第10天的lgr6+^+gfpesc處理的傷口床(實(shí)心箭頭)和第10天的對(duì)照傷口床。包括圖17d在內(nèi)的圖表定量第10天傷口床，其得自rt-pcr，指出wnt配體的相對(duì)倍數(shù)基因表達(dá)。正數(shù)表示在lgr6^+gfp上皮干細(xì)胞傷口床中更高表達(dá)，而負(fù)數(shù)表示在對(duì)照傷口床中更高表達(dá)。

圖18提供具有表達(dá)lgr的細(xì)胞灶的傷口/損傷/組織空隙的rt-pcr定量和插入的基因熱圖比較，其涉及遞送到傷口/損傷/組織空隙之中和/或周圍，涉及與對(duì)照相比增強(qiáng)接受lgr6+上皮干細(xì)胞的傷口的促愈合途徑和相當(dāng)?shù)幕虮磉_(dá)。所述圖表闡述用于血管發(fā)生、傷口愈合和表皮生長(zhǎng)因子的基因的相對(duì)倍數(shù)表達(dá)。比較接受lgr6+上皮干細(xì)胞和對(duì)照治療的傷口床的數(shù)據(jù)的相關(guān)圖示。對(duì)于插入的熱圖，紅色表示在lgr6+上皮干細(xì)胞傷口床中更高表達(dá)，而綠色表示在對(duì)照傷口床中更高表達(dá)。在條形圖中，正數(shù)表示在lgr6^+gfp上皮干細(xì)胞傷口床中更高表達(dá)，而負(fù)數(shù)表示在對(duì)照傷口床中更高表達(dá)。在各定量柱上方顯示ncbiunigene術(shù)語，星號(hào)(*)p值表示<0.05顯著性。

圖19以圖表顯示涉及遞送到傷口/損傷/組織空隙之中和/或周圍并增強(qiáng)傷口愈合因子的表達(dá)lgr的細(xì)胞灶的實(shí)例的相對(duì)蛋白密度測(cè)定。與調(diào)節(jié)和增強(qiáng)血管發(fā)生的常見蛋白質(zhì)相比，接受lgr6+esc蛋白質(zhì)組陣列的傷口有相當(dāng)?shù)难馨l(fā)生分析物表達(dá)?；疑硎緦?duì)照傷口，而黑色柱表示接受lgr6^+gfpesc的傷口。插圖顯示在用hrp化學(xué)發(fā)光顯影之后的蛋白質(zhì)組陣列膜實(shí)例。顏色越亮表示蛋白質(zhì)表達(dá)水平越高。

圖20a-f闡述涉及骨組織的再生的表達(dá)lgr的細(xì)胞灶的實(shí)例。分離的lgr灶可接種至骨并保持活性。圖20a為采集用于培養(yǎng)的骨的整體骨圖像。圖20b為接種之后7天的含lgrgfp的骨的dic圖像。圖20c為接種之后7天的含lgr6^+gfp的骨的488nm綠激光共聚焦圖像。注意的是，lgr灶可經(jīng)歷體外骨誘導(dǎo)。圖20d描述使用補(bǔ)充培養(yǎng)基骨誘導(dǎo)1周之后的lgr灶。圖20e為骨誘導(dǎo)之后的lgr灶的茜素紅染色，其可經(jīng)歷體外骨誘導(dǎo)并上調(diào)關(guān)鍵成骨基因。最后，圖20f為顯示相對(duì)倍數(shù)基因表達(dá)的rt-pcr數(shù)據(jù)，其中灰色柱表示(對(duì)照)非骨誘導(dǎo)的lgr，和黑色柱表示在培養(yǎng)7天之后接受骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的lgr。gapdh用作參照標(biāo)準(zhǔn)看家基因。

示例性方案

以下為提供用于實(shí)施本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的說明性方案順序的一系列實(shí)施例。

在生成根據(jù)本發(fā)明的最小極性化功能單元之前，可通過如下眾所周知的程序生成諸如示例性三維膠原支架等的凝膠狀支持物：

i.在溫和渦旋下，向8份冷凍的基于膠原的溶液中緩慢加入1份冷凍的10x培養(yǎng)基的10xpbs。向混懸液中加入ecm和活性蛋白；

ii.使用無菌的0.1mnaoh將混合物的ph調(diào)至7.2-7.6，并小心監(jiān)測(cè)ph調(diào)節(jié)；

iii.使用無菌的分子級(jí)水將終體積調(diào)至總計(jì)10份；

iv.將混合物的溫度維持在2-10℃以防止膠凝作用，

v.通過加溫至37℃達(dá)約90-120分鐘來形成凝膠；

vi.使用無菌微針壓力機(jī)(micro-needlepress)將支架穿孔(如有需要，支架可經(jīng)歷冷凍干燥過程用于儲(chǔ)存)。

亦推薦的是，在開始lgr聚集體提取程序之前，制備并獲得稱為脈沖資源培養(yǎng)基(pulseresourcemedia,prm)的額外材料。

在此實(shí)施方案中，針對(duì)人類的prm為含l-谷氨酰胺的細(xì)胞維持無血清培養(yǎng)基混合物keratinocyte-sfm，其以獨(dú)立包裝的預(yù)先證明合格的人重組表皮生長(zhǎng)因子1-53(egf1-53)和牛垂體提取物(bpe)提供，作為keratinocyte-sfm(1x)由thermofisherscientific銷售，連同gmp-纖維蛋白原(人)一起向其中加入抗生素-抗真菌藥青霉素、鏈霉素和兩性霉素b。用于一個(gè)實(shí)施方案的藥劑為來自thermofisherscientific的gibco?抗生素-抗真菌藥，其為含10,000單位/ml青霉素、10,000μg/ml鏈霉素和25μg/mlfungizone?抗真菌藥的溶液。因?yàn)閷rm用于運(yùn)輸人組織，所以利用補(bǔ)充試劑來穩(wěn)定原代組織并降低微生物在運(yùn)輸和加工期間的生存力。

以下具體涉及根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的含表達(dá)lgr的上皮的干細(xì)胞微聚集體功能單元的產(chǎn)生和保存。

實(shí)施例1

實(shí)施例1涉及用于提取根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的最小極性化功能單元的方法。在獲得樣品之后，將其從伴隨的運(yùn)輸容器中取出，接著：

i.將樣品放入含脈沖復(fù)蘇培養(yǎng)基的無菌的50ml錐形管中并放在搖床上達(dá)5分鐘，使用新鮮培養(yǎng)基和容器重復(fù)達(dá)總計(jì)三次；

ii.取出樣品并放入含脈沖培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，并小心地從真皮和表皮區(qū)室中切下脂肪和皮下成分。將毛囊單元留在原地且不要過度切割；

iii.將切下的皮下脂肪組分放入含prm的單獨(dú)的50ml錐形管中，并放在+4℃慢速搖床上。

iv.使用超細(xì)wecprep刀片或者某種形狀的微型16號(hào)柳葉刀將含上皮、毛囊和真皮區(qū)室的剩余皮膚成分分割成最小極性化功能單元(mpfu)。

v.將mpfu組分放入含脈沖培養(yǎng)基的單獨(dú)的50ml錐形管中并置于+4℃。

下文涉及二次加工，其中利用酶促制備，使用符合fda和/或gmp認(rèn)證的常規(guī)clia設(shè)備和試劑，建立原代培養(yǎng)物并制備功能組織成分：

實(shí)施例2

實(shí)施例2涉及皮下組織和皮下脂肪細(xì)胞組分的加工。實(shí)施例2敘述了下列步驟：

i.在組織容器的外側(cè)噴灑70%乙醇(etoh)并將組織容器放入層流空氣柜中；

ii.送出組織的樣品或轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基進(jìn)行微生物檢驗(yàn)；

iii.將先前洗滌的脂肪組織和皮下組織放入150mm無菌培養(yǎng)皿中；

iv.用prm將組織洗滌兩次；

v.使用無菌外科器械將組織修剪成小塊(3mm)并放入含脈沖培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)支持平皿中，同時(shí)完成切割；

vi.從支持平皿中吸出培養(yǎng)基并用無菌鏟或鑷子取出樣品，接著將樣品放入含msc酶促消化培養(yǎng)基的50ml錐形管中，所述培養(yǎng)基為預(yù)混合的消化酶溶液(基于膠原酶和分散酶)，將錐形管放入37℃水浴或干熱慢速振蕩器中并振蕩30分鐘或者直至剩余少量微粒物質(zhì)；

vii.加入37℃磷酸緩沖鹽水(pbs)乙二胺四乙酸(edta)(等體積pbs-edta)以終止消化；

viii.將混懸液離心10分鐘以生成“軟”沉淀；

ix.棄去上面液體部分并使用無菌移液器從保留團(tuán)塊中的基質(zhì)血管部分(svf)中分離脂肪群體；

x.在兩個(gè)單獨(dú)的錐形管中，用磷酸緩沖鹽水/edta(pbs-edta，1mm的edta)重懸浮svf，并用prm重懸浮脂肪細(xì)胞群體；

xi.使用100μm無菌過濾器，將混懸液過濾到新的無菌錐形管中；

xii.用pbs-edta洗滌過濾器；

xiii.于室溫將混懸液旋轉(zhuǎn)過濾10分鐘，接著吸出培養(yǎng)基并用已知體積的新鮮培養(yǎng)基替換吸出的培養(yǎng)基；

xiv.使用countess^tm自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器(thermofisherscientific)，計(jì)數(shù)細(xì)胞群體以確定生存力；

xv.移出20%的所得細(xì)胞群體用于使用來自thermofisherscientific的syntha-freezects^tm(celltherapysystems)深低溫保藏并隨后適當(dāng)分類，同時(shí)使用剩下的80%群體進(jìn)行構(gòu)建體裝配。

實(shí)施例3

實(shí)施例3涉及向根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的構(gòu)建體的實(shí)例添加皮下組織和皮下脂肪組分。說明性的組分添加實(shí)例包括：

i.將已含有經(jīng)裝配和洗滌的支架的無菌nunc皮膚移植物細(xì)胞培養(yǎng)皿或自動(dòng)培養(yǎng)皿放入層流通風(fēng)櫥中，并在添加細(xì)胞之前用脈沖培養(yǎng)基將支架再洗滌兩次；

ii.在各培養(yǎng)皿上插入帶有追蹤號(hào)的標(biāo)簽；

iii.每個(gè)平皿系統(tǒng)轉(zhuǎn)移約5x10⁵-1x10⁶個(gè)混合的svf細(xì)胞以及每個(gè)平皿1x10⁵個(gè)脂肪細(xì)胞；

iv.如根據(jù)情況的具體要求而定，向裝載儲(chǔ)存器中加入含或不含自體prp的完全培養(yǎng)基；

v.將平皿轉(zhuǎn)移到慢速搖床上的培養(yǎng)箱中達(dá)1小時(shí)，接著從其中取出平皿并在單獨(dú)的標(biāo)記(sentinel)培養(yǎng)箱中靜置平放48小時(shí)；

vi.在48小時(shí)之后洗滌培養(yǎng)基，棄去未粘附的細(xì)胞，并更新完全培養(yǎng)基。使用諸如evos(thermofisherscientific)等細(xì)胞成像裝置成像并用指定的追蹤號(hào)儲(chǔ)存。

vii.每72小時(shí)替換培養(yǎng)基；

viii.在匯合時(shí)，用dulbecco's磷酸緩沖鹽水(dpbs)洗滌培養(yǎng)物并用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。

ix.將上皮干細(xì)胞功能單一構(gòu)建體(escfsu)直接置于間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)構(gòu)建體的表面上，添加esc培養(yǎng)基以覆蓋兩個(gè)構(gòu)建體，以相同方式成像并將構(gòu)建體放回培養(yǎng)箱中。

x.每48小時(shí)更換/替換構(gòu)建體培養(yǎng)基。

實(shí)施例4

實(shí)施例4涉及最小極性化的上皮干細(xì)胞單一單元的富集。遵循實(shí)施例1，將mpfu放入含脈沖復(fù)蘇培養(yǎng)基的15ml錐形管中并旋轉(zhuǎn)/離心成軟沉淀。然后使該物質(zhì)經(jīng)歷下列部分消化過程：

i.獲得先前等分的冷凍的10ml消化緩沖液(基于膠原酶和分散酶)，在添加至mpfu之前使之達(dá)到室溫；

ii.向mpfu的軟沉淀中加入消化液并通過吹打溫和混合管，以使mpfu分布在溶液各處；

iii.將管置于37℃水浴或干培養(yǎng)箱中達(dá)10分鐘；

iv.從水浴/培養(yǎng)箱中取出管，溫和吹打管并對(duì)內(nèi)容物檢測(cè)線狀物(string)；

v.觀察到線狀物，將內(nèi)容物離心成軟沉淀；

vi.用5-10ml完全確定成分的角質(zhì)形成細(xì)胞sfm培養(yǎng)基(來自thermofisherscientific的keratinocyte-sfm(1x))洗滌細(xì)胞沉淀并再次離心成軟沉淀；

vii.用5ml的完全的keratinocyte-sfm培養(yǎng)基重懸浮激活的功能單一單元的沉淀；和

viii.使用countess?自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器(thermofisherscientific)確定單元的細(xì)胞密度。

實(shí)施例5

實(shí)施例5包括向構(gòu)建體/支架添加從實(shí)施例4獲得的上皮干細(xì)胞功能單一單元(escafsu)。程序必須包括：

i.放置已含有經(jīng)裝配和洗滌的支架的upcell表面皮膚移植物細(xì)胞培養(yǎng)皿，并保證生理ph，在添加細(xì)胞之前用脈沖培養(yǎng)基將支架再次洗滌兩次；

ii.用獨(dú)特的追蹤號(hào)標(biāo)記各培養(yǎng)皿；

iii.使用完全確定成分的角質(zhì)形成細(xì)胞sfm培養(yǎng)基(任選額外的自體prp)經(jīng)由一次性轉(zhuǎn)移移液管向構(gòu)建體轉(zhuǎn)移escafsu；

iv.向所選裝載儲(chǔ)存器中加入完全培養(yǎng)基并確保完全覆蓋構(gòu)建體；

v.將平皿轉(zhuǎn)移到慢速搖床上的培養(yǎng)箱中達(dá)1小時(shí)。然后從搖床中取出平皿并使之在單獨(dú)的標(biāo)記培養(yǎng)箱中保持平放48小時(shí)；

vi.在48小時(shí)時(shí)，吸出培養(yǎng)基并添加新鮮角質(zhì)形成細(xì)胞sfm培養(yǎng)基。用evos將培養(yǎng)物成像并用分配的追蹤號(hào)儲(chǔ)存培養(yǎng)物。如果此時(shí)發(fā)現(xiàn)有需要，則增加牙齦成纖維細(xì)胞(gf)群體和活性蛋白和/或補(bǔ)充prp。

vii.每48-72小時(shí)替換培養(yǎng)基；

viii.在完成匯合之后，用dpbs洗滌培養(yǎng)物并替換培養(yǎng)基。使用基于溫度的系統(tǒng)降低esc構(gòu)建體支架的溫度以利于從平皿的釋放；

ix.將esc直接置于msc構(gòu)建體的表面上，并添加組合培養(yǎng)基以覆蓋兩個(gè)構(gòu)建體。將構(gòu)建體成像，放回培養(yǎng)箱中并每48小時(shí)更換構(gòu)建體培養(yǎng)基。

x.為了確認(rèn)極性化保持，每天將構(gòu)建體成像，并在確認(rèn)極性化已維持48小時(shí)之后添加適當(dāng)?shù)慕腔?外皮形成)培養(yǎng)基；

xi.在收獲時(shí)用脈沖培養(yǎng)基洗滌構(gòu)建體兩次并使用ctstmstempro?mscsfm基料，用確定的運(yùn)輸培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。

實(shí)施例6

實(shí)施例6顯示用于質(zhì)量保證和包括深低溫保藏在內(nèi)的構(gòu)建體定型的說明性方案，其必須包含遵循限定的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(gmp)制備用于運(yùn)輸?shù)臉?gòu)建體，以用于細(xì)胞療法且包括：

i.獲得適當(dāng)體積的synth-a-freeze?深低溫保藏培養(yǎng)基(thermofisherscientific)并將培養(yǎng)基儲(chǔ)存于2℃-8℃直至使用；

ii.在離心分離所需數(shù)量的細(xì)胞之前，制備、收獲并使用countess?自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞密度，其中用于使用synth-afreeze?培養(yǎng)基深低溫保藏的典型細(xì)胞密度為5x10⁵-3x10⁶；

iii.用預(yù)定體積的2℃-8℃的synth-afreeze?培養(yǎng)基重懸浮細(xì)胞沉淀；

iv.根據(jù)制造商說明書，立即將獲得的混懸液的等份分配到冷凍小瓶中；

v.將冷凍小瓶放入適當(dāng)?shù)牡蜏叵到y(tǒng)中，例如可獲自thermofisherscientificinc.的mr.frosty^tm系統(tǒng)，其將冰箱溫度維持在-80℃；

vi.將小瓶轉(zhuǎn)移至-200℃至-125℃下液氮長(zhǎng)期氣相儲(chǔ)存。

在前述說明書中已提供本發(fā)明的所述實(shí)施方案。本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的是，將想到本發(fā)明的許多修改和實(shí)施方案，其得益于前文描述和相關(guān)附圖中所示的教導(dǎo)。因此，亦應(yīng)理解的是，本發(fā)明不限于本文所公開的具體實(shí)施方案，且意圖本發(fā)明的許多修改和其它實(shí)施方案亦包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。此外，盡管在本文中使用了具體的術(shù)語，其僅以通用和描述性意義使用，且不以限制本發(fā)明描述為目的。

工業(yè)適用性

本發(fā)明涉及用于制備含有分離的表達(dá)含有富含亮氨酸重復(fù)序列的g-蛋白偶聯(lián)受體(lgr)的細(xì)胞的微聚集體多細(xì)胞移植物的構(gòu)建體的方法，以及使用所述構(gòu)建體的方法，用于遞送、施用、移植、植入、定向接種、定向遷移、定向追蹤、沉淀、層壓和/或注射細(xì)胞成分，用于產(chǎn)生、再生、增強(qiáng)和/或愈合上皮系統(tǒng)、腺體、毛發(fā)、神經(jīng)、骨、肌肉、脂肪、腱、血管、筋膜、眼組織和肽分泌性細(xì)胞成分，以用于傷口治療應(yīng)用、組織工程學(xué)、細(xì)胞療法應(yīng)用、再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用、醫(yī)學(xué)/治療應(yīng)用、組織愈合應(yīng)用、免疫療法應(yīng)用和組織移植療法應(yīng)用。