相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2014年11月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/082,047的優(yōu)先權(quán)，將其內(nèi)容在此通過引用方式完整并入本文用于全部目的。

發(fā)明背景

腸易激綜合征(ibs)是所有腸胃病的最常見的，影響10-20％的總?cè)巳翰⒄紦?jù)具有消化道疾患的全部患者的大于50％。但是，研究表明僅約10％至50％罹患ibs的那些患者實(shí)際上尋求就醫(yī)。ibs患者表現(xiàn)不同癥狀，例如主要與排便相關(guān)的腹痛、腹瀉、便秘或交替性腹瀉和便秘、腹部膨脹、氣體和糞便中有過多粘液。超過40％的ibs患者具有如此嚴(yán)重的癥狀，從而他們不得不請(qǐng)假休息、限制社交生活、避免性交、取消約會(huì)、終止旅行、服用藥物并且甚至因害怕尷尬而幽閉于其房間中。在美國(guó)，估計(jì)的ibs衛(wèi)生保健成本是每年80億美元(talley等人,gastroenterol.,109:1736-1741(1995))。

將ibs患者根據(jù)其主要腸癥狀劃分成三類：便秘為主的ibs(ibs-c)、腹瀉為主的ibs(ibs-d)、腹瀉和便秘癥狀交替的ibs(ibs-m)以及未分型的ibs(ibs-u)。在當(dāng)前臨床實(shí)踐中，ibs的診斷基于羅馬iii標(biāo)準(zhǔn)并根據(jù)患者呈現(xiàn)的癥狀進(jìn)行。不存在可以用來鑒定這種病癥的特異性生物學(xué)的、放射攝影的、內(nèi)窺鏡的或生理學(xué)的生物標(biāo)志物。

腸易激綜合征是一種多樣的胃腸道(gi)功能病癥。其發(fā)病機(jī)理中指向與應(yīng)激反應(yīng)和免疫系統(tǒng)有關(guān)的證據(jù)日益增加。應(yīng)激例如急性應(yīng)激或慢性應(yīng)激可影響腸道的幾乎所有方面包括胃腸活動(dòng)、內(nèi)臟感覺、胃腸道分泌、腸通透性和腸微生物群。經(jīng)常將ibs描述為“腦-腸軸病癥”。血清素(5-ht)是腦-腸軸的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)和腸道神經(jīng)系統(tǒng)(ens)的重要神經(jīng)遞質(zhì)和信號(hào)分子。經(jīng)必需氨基酸色氨酸轉(zhuǎn)化，血清素產(chǎn)生于cns和ens。大約95％的體內(nèi)總血清素發(fā)現(xiàn)于腸道(kesztheylyi等人，2015，neurogastroenterolmotil，27(8)：1127-1137)。色氨酸被色氨酸羥基化酶轉(zhuǎn)化為5-羥基色氨酸(5-htp)，并且5-htp被芳香氨基酸脫羧酶轉(zhuǎn)化為血清素。色氨酸還可以沿犬尿氨酸途徑代謝被免疫應(yīng)答酶或應(yīng)激應(yīng)答酶代謝而產(chǎn)生神經(jīng)毒性代謝產(chǎn)物和神經(jīng)保護(hù)性代謝產(chǎn)物(kennedy等人,worldjgastoenterol,20(39):14105-14125)。

精確的ibs病理生理學(xué)仍待闡明。已提出血清素代謝產(chǎn)物褪黑激素具有強(qiáng)的抗氧化和抗炎活性，并可調(diào)控腸運(yùn)動(dòng)(konturek等人，jphysiolpharmacol，2007，58：381-405；siah等人，worldjgastroenterol，2014，20(10)：2492-2498)。其還顯示對(duì)平滑肌運(yùn)動(dòng)活性具有抑制作用(bebeuik和pang，jpinealres，1994，16：91-99)。研究已表明在患ibs-c的絕經(jīng)后婦女中，腸道中褪黑激素水平降低(chojnacki等人，endokrynolpol，2013，64(2)：114-20)。

犬尿烯酸(kyna)是色氨酸、血清素和犬尿氨酸途徑的另一種代謝產(chǎn)物，其可促進(jìn)ibs。1％的攝入色氨酸轉(zhuǎn)化為血清素，而大多數(shù)通過犬尿氨酸途徑異化?；糹bs的患者可具有降低水平的粘膜kyna，這可促進(jìn)功能、神經(jīng)、代謝或炎癥的變化，這種變化有助于ibs的形成(keszthelyi等人，jpsychores，2013，74：5001-504)。腸道中，kyna具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化和抗炎性質(zhì)，并對(duì)腸運(yùn)動(dòng)和感覺功能有作用。

對(duì)于ibs治療，涉及血清素途徑的治療藥物正在研究。用褪黑激素治療可緩和與ibs-c相關(guān)的腸部疼痛(elsenbruch，gut，2005，54(10)：1353-1354)，并可改善具有睡眠障礙的ibs-d患者的腹部疼痛(song等人，gut，2005，54：1402-1407)。

鑒于前述情況，本領(lǐng)域需要測(cè)量或定量個(gè)體生物樣本中色氨酸、血清素和犬尿氨酸的代謝產(chǎn)物水平的方法。此外，需要通過監(jiān)測(cè)腦-腸道-微生物群軸診斷個(gè)體中ibs的方法。需要評(píng)估各種代謝途徑和異化途徑是否正常發(fā)揮作用的測(cè)定法。本發(fā)明滿足了這些需求和其他需求。

發(fā)明簡(jiǎn)述

一方面，本文提供了分離的抗體或其抗體片段，其特異性結(jié)合至5-羥基吲哚-3-乙酸(5-hiaa)，并具有低于1％的與一個(gè)或多個(gè)選自以下的成員的交叉反應(yīng)性：色氨酸(trp)、血清素(5-ht)、5-羥基色氨酸(5-htp)、犬尿氨酸(kyn)、犬尿烯酸(kyna)、3-羥基犬尿氨酸(3-hk)、3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-haa)、喹啉酸(quin)、鄰氨基苯甲酸(ana)、血清素-o-硫酸酯、血清素-o-磷酸酯和褪黑激素(mt)。分離的抗體或純化的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，分離的抗體或純化的抗體是嵌合抗體或人源化抗體。其分離的或純化的抗體片段可以是fab片段、fab’片段或f(ab)’2片段。

在一些實(shí)施方案中，抗5-hiaa抗體或其抗體片段是由2015年11月17日以atcc登錄號(hào)_保藏并指定為1204-10g6f11h3的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的。

在一實(shí)施方案中，抗體或其抗體片段如下生產(chǎn)：在動(dòng)物免疫細(xì)胞產(chǎn)生特異性地與5-hiaa結(jié)合的抗體或其抗體片段的條件下，用包括綴合至載體蛋白的5-hiaa衍生物的免疫原免疫動(dòng)物；并從動(dòng)物分離抗體或其抗體片段。動(dòng)物可以是山羊、兔子或小鼠。在一些實(shí)施方案中，5-hiaa衍生物包括5-hiaa的苯并唑衍生物。

另一方面，本文提供了分離的抗體或其抗體片段，其特異性地與褪黑激素(mt)結(jié)合，并具有低于1％的與一個(gè)或多個(gè)選自以下的成員的交叉反應(yīng)性：色氨酸(trp)、血清素(5-ht)、5-羥基色氨酸(5-htp)、5-羥基吲哚-3-乙酸(5-hiaa)、犬尿氨酸(kyn)、犬尿烯酸(kyna)、3-羥基犬尿氨酸(3-hk)、3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-haa)、喹啉酸(quin)、鄰氨基苯甲酸(ana)、血清素-o-硫酸酯和血清素-o-磷酸酯。分離的抗體或純化的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，分離的抗體或純化的抗體是嵌合抗體或人源化抗體。其分離的或純化的抗體片段可以是fab片段、fab’片段或f(ab)’2片段。

在一些實(shí)施方案中，抗褪黑激素抗體或其抗體片段是由2015年11月17日以atcc登錄號(hào)_保藏并指定為1212-6c1e2f7的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的。

在一實(shí)施方案中，抗體或其抗體片段如下生產(chǎn)：在動(dòng)物免疫細(xì)胞產(chǎn)生特異性地與褪黑激素結(jié)合的抗體或其抗體片段的條件下，用包括綴合至載體蛋白的褪黑激素的免疫原免疫動(dòng)物；并從動(dòng)物分離抗體或其抗體片段。動(dòng)物可以是山羊、兔子或小鼠。

還另一方面，本文提供了特異性地與犬尿烯酸(kyna)結(jié)合的分離的抗體或其抗體片段，其具有低于1％的與一個(gè)或多個(gè)選自以下的成員的交叉反應(yīng)性：色氨酸(trp)、血清素(5-ht)、5-羥基色氨酸(5-htp)、5-羥基吲哚-3-乙酸(5-hiaa)、犬尿氨酸(kyn)、3-羥基犬尿氨酸(3-hk)、3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-haa)、喹啉酸(quin)、鄰氨基苯甲酸(ana)、血清素-o-硫酸酯、血清素-o-磷酸酯和褪黑激素(mt)。分離的抗體或純化的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，分離的抗體或純化的抗體是嵌合抗體或人源化抗體。其分離的或純化的抗體片段可以是fab片段、fab’片段或f(ab)’2片段。

在一些實(shí)施方案中，抗犬尿烯酸抗體或其抗體片段是由2015年11月17日以atcc登錄號(hào)_保藏并指定為1194-6h5b11a7的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的。

在一實(shí)施方案中，抗體或其抗體片段如下生產(chǎn)：在動(dòng)物免疫細(xì)胞產(chǎn)生特異性地與kyna結(jié)合的抗體或其抗體片段的條件下，用包括綴合至載體蛋白的犬尿烯酸(kyna)的免疫原免疫動(dòng)物；并從動(dòng)物分離抗體或其抗體片段。動(dòng)物可以是山羊、兔子或小鼠。

在一些實(shí)施方案中，文中所述的分離的抗體或其抗體片段中的任何一個(gè)含有可檢測(cè)標(biāo)記。

在一些實(shí)施方案中，將文中所述的分離的抗體或其抗體片段中的任何一種固定于固體基質(zhì)上。

一方面，本文提供了產(chǎn)生和分泌選擇性與5-hiaa結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，并且其已在2015年11月17日以atcc登錄號(hào)_保藏并指定為1204-10g6f11h3。

一些方面，本文提供了產(chǎn)生和分泌選擇性與褪黑激素結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，并且其已在2015年11月17日以atcc登錄號(hào)_保藏并指定為1212-6c1e2f7。

一方面，本文提供了產(chǎn)生和分泌選擇性與犬尿烯酸結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，并且其已在2015年11月17日以atcc登錄號(hào)_保藏并指定為1194-6h5b11a7。

本文還提供利用免疫測(cè)定來檢測(cè)來自疑似患腸易激綜合征的患者的樣品中5-hiaa水平的方法。該方法包括：(a)在適當(dāng)條件下，使上述分離的抗體或其抗體片段、從患者獲得的樣品和固定化的5-hiaa接觸，以形成復(fù)合物，該復(fù)合物含有分離的抗體或其抗體片段和樣品中存在的5-hiaa或固定化的5-hiaa；(b)檢測(cè)結(jié)合至包含固定化的5-hiaa的復(fù)合物的抗體或其抗體片段的水平；和(c)基于步驟(b)中抗體或其抗體片段的水平，計(jì)算樣品中5-hiaa的水平。

在一些實(shí)施方案中，分離的抗體或其抗體片段、樣品和固定化的5-hiaa同時(shí)接觸。在其他實(shí)施方案中，分離的抗體或其抗體片段、樣品和固定化的5-hiaa依次接觸。免疫測(cè)定可以是elisa例如競(jìng)爭(zhēng)性elisa。

一方面，本文提供了利用免疫測(cè)定來檢測(cè)來自疑似患腸易激綜合征的患者的樣品中褪黑激素水平的方法。該方法包括：(a)在適當(dāng)條件下，使上述分離的抗體或其抗體片段、從患者獲得的樣品和固定化的褪黑激素接觸，以形成復(fù)合物，該復(fù)合物含有分離的抗體或其抗體片段和樣品中存在的褪黑激素或固定化的褪黑激素；(b)檢測(cè)結(jié)合至包含固定化的褪黑激素的復(fù)合物的抗體或其抗體片段的水平；和(c)基于步驟(b)中抗體或其抗體片段的水平，計(jì)算樣品中褪黑激素的水平。

在一些實(shí)施方案中，分離的抗體或其抗體片段、樣品和固定化的褪黑激素同時(shí)接觸。在其他實(shí)施方案中，分離的抗體或其抗體片段、樣品和固定化的褪黑激素依次接觸。免疫測(cè)定可以是競(jìng)爭(zhēng)性elisa。

一方面，本文提供了利用免疫測(cè)定來檢測(cè)來自疑似患腸易激綜合征的患者的樣品中犬尿烯酸(kyna)水平的方法。該方法包括：(a)在適當(dāng)條件下，使上述分離的抗體或其抗體片段、從患者獲得的樣品和固定化的kyna接觸，以形成復(fù)合物，該復(fù)合物含有分離的抗體或其抗體片段和樣品中存在的kyna或固定化的kyna；(b)檢測(cè)結(jié)合至包含固定化的kyna的復(fù)合物的抗體或其抗體片段的水平；和(c)基于步驟(b)中抗體或其抗體片段的水平，計(jì)算樣品中kyna的水平。

在一些實(shí)施方案中，分離的抗體或其抗體片段、樣品和固定化的犬尿烯酸同時(shí)接觸。在其他實(shí)施方案中，分離的抗體或其抗體片段、樣品和固定化的犬尿烯酸依次接觸。免疫測(cè)定可以是競(jìng)爭(zhēng)性elisa。

本申請(qǐng)以全部?jī)?nèi)容引入國(guó)際專利申請(qǐng)公開wo2014/188377和wo2014/188378作為參考，用于全部目的。

當(dāng)連同下述發(fā)明詳述和附圖閱讀時(shí)，這些和其他方面、優(yōu)點(diǎn)和實(shí)施方案將變得更顯而易見。

附圖簡(jiǎn)述

圖1圖示顯示血清素、色氨酸和犬尿氨酸途徑的代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物包括色氨酸(trp，122)、5-羥基色氨酸(5-htp，125)、血清素(5-ht，101)、褪黑激素(mt，120)、5-羥基吲哚乙酸(5-hiaa或5hiaa，115)、犬尿氨酸(kyn，131)、犬尿烯酸(kyna，135)、鄰氨基苯甲酸(ana，140)、3-羥基犬尿氨酸(3-hk，146)、3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-haa，149)、喹啉酸(quin；160)和黃尿酸(xa，148)。

圖2顯示文中所述競(jìng)爭(zhēng)性elisa的示例性實(shí)施方案。

圖3a-3d顯示用于產(chǎn)生文中所述抗體的免疫源性綴合物。免疫原包括5-hiaa的苯并唑衍生物(圖3a)、褪黑激素(圖3b)和犬尿烯酸(圖3c)半抗原。半抗原通過連接體例如peg連接體綴合至載體蛋白。圖3d提供顯示衍生化的代謝產(chǎn)物的分離的hplc色譜圖，所述衍生化的代謝產(chǎn)物包括衍生化的血清素(5ht-d)和衍生化的5-羥基吲哚乙酸(5-hiaa-d)。

圖4a和4b提供利用免疫源性綴合物的抗體產(chǎn)生示意圖。圖4a顯示免疫源性綴合物可用于單克隆抗體產(chǎn)生和多克隆抗體產(chǎn)生。圖4b顯示單克隆抗體產(chǎn)生的方法，其包括用指定抗原免疫小鼠，產(chǎn)生雜交瘤克隆，和分離指定抗原的特異性單克隆抗體。

圖5a和5b提供合成方式形成5-hiaa衍生物的化學(xué)流程圖。圖5a顯示綴合至peg連接體的5-hiaa的苯并唑衍生物。圖5b顯示經(jīng)peg連接體綴合至生物素的5-hiaa的苯并唑衍生物。

圖6a-6d顯示雜交瘤克隆10g6f11h3產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體的反應(yīng)性?？贵w特異性與5-hiaa結(jié)合(對(duì)5-hiaa是免疫反應(yīng)的)。圖6a顯示未稀釋抗體和1:200稀釋的單克隆抗體類似地結(jié)合5-hiaa。圖6b顯示游離5-hiaa和固定化的5-hiaa的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的數(shù)據(jù)。與當(dāng)100ng/ml游離5-hiaa存在時(shí)相比，當(dāng)未向孔中加入游離5-hiaa(0ng/ml)時(shí)，檢測(cè)到更高的od。高的od對(duì)應(yīng)于高水平的結(jié)合至固定化的5-hiaa的抗體。低的od對(duì)應(yīng)于低水平的結(jié)合至固定化的5-hiaa的抗體，以及在本次測(cè)試中高水平的結(jié)合至游離5-hiaa的抗體。圖6c顯示在不同游離5-hiaa濃度下，各種稀釋的單克隆抗體的滴度。圖6d顯示抗5-hiaa單克隆抗體與血清素?zé)o交叉反應(yīng)性，并且抗5ht單克隆抗體與5-hiaa無交叉反應(yīng)性。

圖7a和7b顯示源自雜交瘤克隆10g6f11h3的單克隆抗體對(duì)5-hiaa具有特異性，但是對(duì)色氨酸、血清素或犬尿氨酸代謝產(chǎn)物無特異性。圖7a顯示抗體與4-羥基喹啉、3-羥基-dl-犬尿氨酸和褪黑激素?zé)o交叉反應(yīng)性。圖7b顯示與血清素(5-ht)、5-羥基-l-色氨酸和n-乙?；?5-羥色胺無交叉反應(yīng)性。雜交瘤克隆10g6f11h3產(chǎn)生的單克隆抗體是抗-5hiaa，一種igg1κ抗體。

圖8顯示抗5-hiaa單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。濃度是0ng/ml～100ng/ml，稀釋因子是5。

圖9顯示在放血前和放血1-9(b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8和b9)時(shí)來自兔#16401、#16402和#16403的抗血清中抗褪黑激素多克隆抗體的存在。將兔子用文中所述的褪黑激素免疫原性綴合物免疫。兔子#16401顯示最高滴度的抗-褪黑激素抗體。

圖10a和10b顯示親和純化的兔多克隆抗-褪黑激素抗體在競(jìng)爭(zhēng)性elisa中的反應(yīng)性。在測(cè)定中，將褪黑激素(25μg/ml)固定化至孔的表面。將游離(未固定化或未結(jié)合的)褪黑激素和親和純化的兔多克隆抗-褪黑激素抗體加入到孔中。加入的游離褪黑激素的量是0.00mm(圖的右側(cè))至8.00mm(圖的左側(cè))。od測(cè)量值表示結(jié)合至固定化的褪黑激素的抗體量。在類似競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，將結(jié)構(gòu)上類似于褪黑激素的其他競(jìng)爭(zhēng)(游離，未固定化或未結(jié)合的)化合物用抗體和固定化的褪黑激素孵育。圖10b顯示親和純化的兔抗體與血清素(ser)、色氨酸(tryp)或5-hiaa無交叉反應(yīng)性。

圖11圖示抗褪黑激素單克隆抗體的特異性。該圖顯示來自4個(gè)雜交瘤克隆(6c1e2f7、6c2h4c8、7c7f1g2和7c8a1d2)的抗體特異性地與褪黑激素結(jié)合，并缺少與血清素、色氨酸和5-hiaa的交叉反應(yīng)性。產(chǎn)生自雜交瘤克隆6c1e2f7的單克隆抗體是抗-褪黑激素igg3κ抗體。

圖12提供來自雜交瘤克隆6c1e2f7的抗褪黑激素單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖13a和13b顯示抗犬尿烯酸(kyna)的兔多克隆抗體的反應(yīng)性。圖13a顯示用文中所述kyna免疫原性綴合物免疫的兔的抗血清含有特異性地與kyna結(jié)合的抗體。圖13a顯示競(jìng)爭(zhēng)性elisa測(cè)定結(jié)果，其中游離kyna與固定化的kyna就抗體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。在所述測(cè)定中，游離kyna的量是0μg/ml(右側(cè))至500μg/ml(左側(cè))。od測(cè)量值表示結(jié)合至固定化的kyna的抗體量。當(dāng)未加入游離kyna時(shí)(0.00μg/ml)，抗-kyna抗體結(jié)合至固定化的kyna抗原，如高的od值所示。當(dāng)加入游離kyna抗原時(shí)，較少的抗體結(jié)合至固定抗原，如較低的od值所示。圖13b顯示類似競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的結(jié)果。在本測(cè)試中，抗體的量還從1:250稀釋至1:2500稀釋變化。

圖14a和14b顯示鼠單克隆抗體與犬尿烯酸(kyna)的反應(yīng)性。圖14a顯示來自雜交瘤克隆4b11h9a2和6h5b11a7的抗體特異性地與kyna結(jié)合，并且與3-oh-dl-犬尿氨酸、血清素、色氨酸、n-乙酰基-5-羥基-色胺和5-oh-喹啉無交叉反應(yīng)性。在競(jìng)爭(zhēng)性elisa中，結(jié)構(gòu)式類似于kyna的化合物不干擾抗體與kyna的結(jié)合。圖14b顯示未稀釋和稀釋的小鼠單克隆抗kyna抗體與kyna結(jié)合。雜交瘤克隆6h5b11a7產(chǎn)生的單克隆抗體是抗-kyna，一種igg1κ抗體。

圖15a和15b顯示特異性地與犬尿烯酸結(jié)合的雜交瘤克隆6h5b11a7產(chǎn)生的鼠單克隆抗體。如圖15a中所示，在本文提供的競(jìng)爭(zhēng)性elisa中，游離kyna抗原與固定化的kyna抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗體。隨著游離kyna的量的增加，更少的抗體結(jié)合至固定化的抗原，并且od值降低。圖15b顯示小鼠單克隆抗-kyna抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖16a和16b顯示本文公開的競(jìng)爭(zhēng)性elisa的示例性實(shí)施方案。在圖16a中，將tmb底物用于比色反應(yīng)。在圖16b中，將發(fā)光底物用于檢測(cè)反應(yīng)。利用發(fā)光底物的測(cè)定提供比tmb底物測(cè)定更高的靈敏度。

發(fā)明詳述

i.定義

如本文所用的術(shù)語“a、an”或“該(the)”不僅包括具有一個(gè)成員的方面，還包括具有多于一個(gè)成員的方面。例如，包含“多胺化合物(apolyaminecompound)和賦形劑(anexcipient)”的實(shí)施方案應(yīng)當(dāng)理解為存在具有至少第二種多胺化合物、至少第二種賦形劑或這兩者的某些方面。

術(shù)語“抗原”指能特異性地與抗體結(jié)合的任何分子、化合物、組合物或顆粒物。抗原具有一個(gè)或多個(gè)與抗體相互作用的表位，盡管其不一定誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生。

術(shù)語“抗體”指與特定抗原免疫性反應(yīng)的免疫球蛋白分子，并包括多克隆和單克隆抗體。該術(shù)語還包括基因工程形式例如嵌合抗體(例如人源化鼠抗體)和雜綴合物抗體(例如雙特異性抗體)。術(shù)語“抗體”還包括抗體的抗原結(jié)合形式，其包括具有抗原結(jié)合能力的片段例如fab'、f(ab')2、fab、fv、scfv和di-scfv(參見，例如kuby，immunology，第三版，w.h.freeman&co.，紐約1998)。該術(shù)語還包括二價(jià)或雙特異性分子、雙抗體、三抗體和四抗體。二價(jià)和雙特異性分子描述在例如zhu等人(proteinsci.1997；6：781-9和hu等人(cancerres.1996；56：3055-61)中。雖然根據(jù)完整抗體的消化定義各種抗體片段，但是技術(shù)人員應(yīng)該理解可以用化學(xué)方法或者利用重組dna方法，從頭合成片段。因此，文中所用的術(shù)語抗體還包括通過完整抗體的修飾產(chǎn)生的或者利用重組dna方法合成的抗體片段。

抗體可以由主要被免疫球蛋白基因或者免疫球蛋白基因片段編碼的一種或多種多肽構(gòu)成。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。將輕鏈分類為κ或λ。將重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，所述依次分別定義免疫球蛋白類別igg、igm、iga、igd和ige?！翱贵w”起結(jié)合蛋白的功能，并且結(jié)構(gòu)上定義為包含來自或衍生自產(chǎn)生抗體的動(dòng)物的免疫球蛋白編碼基因的框架區(qū)的氨基酸序列。

典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元已知包含四聚體。每個(gè)四聚體由兩對(duì)相同的多肽鏈構(gòu)成，每對(duì)有一個(gè)“輕鏈”(大約25kd)和一個(gè)“重鏈”(大約50-70kd)。每條鏈的n-末端定義主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100～110或者更多氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語可變輕鏈(vl)和可變重鏈(vh)分別指這些輕鏈和重鏈。

抗體可包括vh-vl二聚體，其包括單鏈抗體(作為單一多肽鏈存在的抗體)，例如單鏈fv抗體(sfv或scfv)，其中可變重區(qū)和可變輕區(qū)連接在一起(直接或通過肽連接體)，形成連續(xù)多肽。單鏈fv抗體是共價(jià)連接的vh-vl，其可從包括vh-和vl-編碼序列的核酸表達(dá)，該序列直接連接或者通過肽-編碼連接體連接(例如huston等人，proc.nat.acad.sci.usa，85：5879-5883，1988)。盡管vh和vl作為單一多肽鏈互相連接，而vh和vl域非共價(jià)地聯(lián)合?；蛘?，抗體可以是另一個(gè)片段。例如利用重組技術(shù)，其他片段還可以作為可溶蛋白或者作為從顯示方法(displaymethods)得到的片段產(chǎn)生?？贵w還可以包括雙抗體和微型抗體。本發(fā)明抗體還包括重鏈二聚體例如來自駱駝科動(dòng)物的抗體。因此，在一些實(shí)施方案中，抗體是二聚的。在另一實(shí)施方案中，抗體可以是具有活性同種型的單體形式。在一些實(shí)施方案中，抗體是多價(jià)形式例如三價(jià)或四價(jià)形式，其可交聯(lián)抗原。

術(shù)語“抗體片段”或“抗原結(jié)合片段”指免疫球蛋白分子的至少一部分可變區(qū)，其結(jié)合其靶標(biāo)，即抗原識(shí)別區(qū)或抗原結(jié)合區(qū)?？砂ㄒ恍┟庖咔虻鞍椎暮愣▍^(qū)?？贵w片段的示例包括但是不限于線性抗體、單鏈抗體分子(scfv)、fv片段、高變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(cdrs)、vl(輕鏈可變區(qū))、vh(重鏈可變區(qū))、fab片段、f(ab)'2片段、從抗體片段形成的多特異性抗體，及其任何組合或者能結(jié)合目標(biāo)抗原的免疫球蛋白肽的任何其他部分。如同本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，可利用各種方法例如用酶如胃蛋白酶消化完整的抗體；或者從頭合成，得到各種抗體片段。通常用化學(xué)方法或者利用重組dna方法，從頭合成抗體片段。

術(shù)語“多克隆抗體”指由識(shí)別相同抗原上的多個(gè)表位的不同b細(xì)胞譜系分泌的抗體集合內(nèi)的抗體。

術(shù)語“單克隆抗體”指從基本同源的抗體群得到的抗體，即除了可能微量存在的可能天然發(fā)生的突變外，所述群包含的個(gè)體抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，靶向單一抗原位點(diǎn)或表位。此外，與通常包括靶向不同決定簇或表位的不同抗體的多克隆抗體制品相比，每個(gè)單克隆抗體靶向抗原上的單一決定簇。根據(jù)本發(fā)明的待使用的單克隆抗體可以通過雜交瘤方法制備，該方法首先由kohler和milstein，nature，256：495(1975)描述，或者可以通過例如u.s.pat.no.4,816,567中描述的重組dna方法制備。在一些情況下，可以從利用mccafferty等人，nature，348：552-554(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的噬菌體庫(kù)，分離單克隆抗體。

術(shù)語“嵌合抗體”指免疫球蛋白分子，其中(a)恒定區(qū)或其一部分被改變、置換或交換，從而抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))連接至不同或改變的種類、效應(yīng)子功能和/或物種的恒定區(qū)或者為嵌合抗體提供新的性質(zhì)的完全不同分子例如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物等；或(b)可變區(qū)或其一部分被具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)或其一部分改變、置換或交換；或者被來自另一物種或來自另一抗體種類或亞類的相應(yīng)序列改變、置換或交換。

術(shù)語“人源化抗體”指其中vh和vl區(qū)所含的抗原結(jié)合環(huán)即互補(bǔ)決定區(qū)(cdrs)被移植到人框架序列的抗體。通常，人源化抗體具有與文中所述的非人源化抗體相同的結(jié)合特異性。用于人源化抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并描述于例如verhoyen等人，science，239：1534(1988)與winter和milstein，nature，349：293(1991)中。

當(dāng)涉及抗原或半抗原時(shí)，短語與抗體“特異性(或選擇性)結(jié)合”或者“與…特異性(或選擇性)免疫反應(yīng)”是指，通常在異源抗原或半抗原群中或其他生物制品例如細(xì)胞混合物、細(xì)胞裂解物或者生物樣品諸如血液、血漿或血清中，確定抗原或半抗原存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫測(cè)定條件下，指定的抗體與特定的抗原或半抗原結(jié)合(至少是背景的兩倍，且更通常是高于背景的10～100倍)。在此條件下，與抗體的特異性結(jié)合需要就其特異性對(duì)特定抗原或半抗原進(jìn)行選擇的抗體。例如，多克隆抗體可被選擇，以僅獲得與選擇的抗原特異性免疫反應(yīng)且不與其他蛋白免疫反應(yīng)的那些多克隆抗體?？赏ㄟ^減去與其他分子交叉反應(yīng)的抗體，實(shí)現(xiàn)所述選擇?？墒褂酶鞣N免疫測(cè)定形式，以選擇與特定蛋白特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，常規(guī)使用elisa免疫測(cè)定，以選擇與蛋白質(zhì)特異性免疫反應(yīng)的抗體(參見，例如harlow&lane，描述可用于測(cè)定特異性免疫反應(yīng)的免疫測(cè)定方式和條件的usingantibodies,alaboratorymanual(1998))。

可以例如利用本領(lǐng)域已知的方法諸如利用與靶標(biāo)類似的對(duì)照分子如過量非標(biāo)記靶標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，測(cè)量特異性結(jié)合。特異性結(jié)合靶標(biāo)抗原的抗體可以具有對(duì)于抗原的至少大約10^-4m的kd，或者至少大約10^-5m的kd，或者至少大約10^-6m的kd，或者至少大約10^-7m的kd，或者至少大約10^-8m的kd，或者至少大約10^-9m的kd，或者至少大約10^-10m的kd，或者至少大約10^-11m的kd，或者至少大約10^-12m或更大的kd。在一實(shí)施方案中，術(shù)語“特異性結(jié)合”指如下結(jié)合：在基本不與任何其他結(jié)構(gòu)類似的半抗原或化合物結(jié)合的條件下，抗體與其特定半抗原結(jié)合。在此類實(shí)施方案中，非特異性結(jié)合的程度是例如通過熒光活化細(xì)胞分選(facs)分析、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)或放射免疫沉淀(ria)，以背景或低于背景的結(jié)合量，并將通常是低于大約10％，優(yōu)選低于大約5％，并更優(yōu)選低于大約1％。

術(shù)語“交叉反應(yīng)性”是指指定的(一級(jí))抗原和次級(jí)抗原與所關(guān)注的純化的抗體的相對(duì)結(jié)合，其中指定的或一級(jí)抗原用于產(chǎn)生關(guān)注的抗體。c50次級(jí)是引起一級(jí)抗原和關(guān)注抗體之間的反應(yīng)的50％抑制所需要的次級(jí)抗原的濃度。類似地，c50一級(jí)是引起一級(jí)抗原和抗體之間的反應(yīng)的50％抑制(自我抑制)所需要的一級(jí)抗原的濃度。然后，變體抗原的相對(duì)平衡結(jié)合常數(shù)c50一級(jí)/c50次級(jí)測(cè)量交叉反應(yīng)性(benjamin和perdue，methods，1996，9(3)：508-515)。換言之，相對(duì)于具體化合物x，針對(duì)化合物x產(chǎn)生的抗體的交叉反應(yīng)百分比等于[(a/b)x100]，其中a是置換50％的抗體結(jié)合的化合物y需要的化合物x的量；b是置換50％的結(jié)合至抗體的化合物x需要的化合物y的量。術(shù)語抗體的“交叉反應(yīng)性”還可以指抗體與不同抗原上相似或不相似表位的相互作用?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定例如競(jìng)爭(zhēng)性elisa諸如直接競(jìng)爭(zhēng)性elisa或間接競(jìng)爭(zhēng)性elisa，測(cè)量“交叉反應(yīng)性”。

如文中所用，術(shù)語“分離的”或“純化的”抗體指如下抗體，其實(shí)質(zhì)上或基本上不含正?；蛱烊话殡S它的成分。通常利用分析化學(xué)技術(shù)例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜，測(cè)定純度和同質(zhì)性。其環(huán)境的污染物成分是將干擾抗體或其片段應(yīng)用的物質(zhì)，并可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性的溶解物。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)lowry方法測(cè)定，分離的抗體被純化至大于95％重量多肽，并優(yōu)選地多于99％重量，或者在還原或非還原條件下，利用考馬斯藍(lán)或銀染色通過sds-page純化至同質(zhì)。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。在一些情況下，通過至少一步純化步驟，制備分離的抗體。

術(shù)語“雜交瘤細(xì)胞系”或“雜交瘤克隆”指用于產(chǎn)生單克隆抗體的雜交細(xì)胞系。在一些情況下，雜交瘤細(xì)胞是與骨髓瘤細(xì)胞融合的來自鼠脾臟的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，其中已將鼠注射特異性抗原。

術(shù)語“半抗原”指當(dāng)半抗原連接或綴合至載體分子例如載體蛋白，形成免疫原或免疫原性綴合物時(shí)，可引發(fā)動(dòng)物體內(nèi)免疫應(yīng)答的小分子。半抗原-載體蛋白復(fù)合物是免疫原性的(可引發(fā)免疫應(yīng)答)，并且半抗原單獨(dú)(未結(jié)合的半抗原)不是免疫原性的。載體蛋白的非限制性示例包括牛血清白蛋白(bsa)、鼠血清白蛋白(msa)、兔血清白蛋白(rsa)、卵白蛋白(ova)、釘形貝血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin，klh)、牛或豬甲狀腺球蛋白、破傷風(fēng)類毒素、明膠或大豆胰蛋白酶抑制劑等。

術(shù)語“免疫原”指刺激動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)、化合物、肽或組合物。

如文中所用，“連接體”或“間隔體”是將文中公開的半抗原與另一分子或部分結(jié)合(例如共價(jià)地)在一起的任何分子。連接體包括但不限于直鏈或支鏈碳連接體、雜環(huán)碳連接體、肽連接體、聚醚連接體和短的親水分子。示例性連接體可包括但不限于nh-ch2-ch2-o-ch2-co-和5-氨基-3-氧代戊?；＠?，聚(乙二醇)連接體可從quantabiodesign,powell,oh獲得。所述連接體任選地具有酰胺鏈接(linkage)、巰基鏈接或雜官能鏈接。

術(shù)語“標(biāo)記”或“可檢測(cè)標(biāo)記”是通過波譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其他物理手段可檢測(cè)的組合物。例如，可用的標(biāo)記包括³²p、熒光染料、高電子密度試劑、酶(例如，通常在elisa中所用的)、生物素、洋地黃毒苷(digoxigenin)或肽和蛋白質(zhì)，其可例如通過向肽中引入放射性標(biāo)記可被檢測(cè)?？蓹z測(cè)標(biāo)記可以是而不限于熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記。

術(shù)語“固體基質(zhì)”或“固體支持物”指固體材料、膜、陣列、片、珠等。固體基質(zhì)的表面可由與基質(zhì)相同的材料構(gòu)成。表面可以由多種材料例如聚合物、塑料、樹脂、聚糖、硅石或基于硅石的材料、碳、金屬、無機(jī)玻璃、膜或上文所列基質(zhì)材料中的任何材料構(gòu)成。

術(shù)語“免疫測(cè)定”指利用抗體、免疫球蛋白或其片段，檢測(cè)或測(cè)量分析物(小分子、化學(xué)化合物、肽、多肽、生物分子、抗原、代謝產(chǎn)物等)的存在或濃度(水平或量)的測(cè)定。

術(shù)語“受試者”、“患者”和“個(gè)體”可交換使用，并且除特別說明之外，指哺乳動(dòng)物例如人和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、豬和其他哺乳動(dòng)物種類。

術(shù)語“樣品”包括自個(gè)體獲得的任何生物標(biāo)本。所用的適當(dāng)樣品包括但不限于全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便、眼淚、任何其他體液、組織樣品(例如活組織檢查)及其細(xì)胞提取物(例如紅細(xì)胞提取物)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品是血清或血漿樣品。樣品例如血清、唾液和尿液的用途是本領(lǐng)域眾所周知的(參見，例如hashida等人，j.clin.lab.anal.，11：267-86(1997))。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解：完成文中公開的方法之前，可將樣品例如血清樣品稀釋。

如本文所用的“?；卑ㄈ绫疚亩x的烷酰基、芳酰基、雜環(huán)?；螂s芳?；４硇怎；ㄒ阴；⒈郊柞；燉；?。

如本文所用的“烷?；卑ㄍ榛?c(o)-基團(tuán)，其中烷基如本文定義。代表性烷?；阴；⒁阴?ethanoyl)等。

如本文所用的“烯基”包括含有至少一個(gè)碳-碳雙鍵或叁鍵的2個(gè)至約15個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的脂族烴基團(tuán)。優(yōu)選的烯基具有2個(gè)至約12個(gè)碳原子。更優(yōu)選的烯基含有2個(gè)至約6個(gè)碳原子。在一個(gè)方面，優(yōu)選含有碳-碳雙鍵的烴基。在第二方面，優(yōu)選含有碳-碳叁鍵的烴基(即，炔基)。如本文所用的“低級(jí)烯基”包括2個(gè)至約6個(gè)碳原子的烯基。代表性烯基包含乙烯基、烯丙基、正丁烯基、2-丁烯基、3-甲基丁烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、癸烯基、丙炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔基、庚炔基等。

烯基可以是未取代或任選地取代的。當(dāng)任選地取代時(shí)，烯基的一個(gè)或多個(gè)氫原子(例如，1至4個(gè)、1至2個(gè)、或1個(gè))可以替換為獨(dú)立選自氟、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、酰氨基、硫基(thio)和烷硫基的基團(tuán)。

如本文所用的“亞烯基”包括含有至少一個(gè)碳-碳雙鍵或叁鍵的直鏈或支鏈的雙價(jià)烴鏈。優(yōu)選的亞烯基在鏈中包括2個(gè)至約12個(gè)碳，并且更優(yōu)選的亞烯基在鏈中包括2個(gè)至約6個(gè)碳。在一個(gè)方面，優(yōu)選含有碳-碳雙鍵的烴基。在第二方面，優(yōu)選含有碳-碳叁鍵的烴基。代表性亞烯基包括-ch＝ch-、-ch2-ch＝ch-、-c(ch3)＝ch-、-ch2ch＝chch2-、亞乙炔基、亞丙炔基、正-亞丁炔基等。

如本文所用的“烷氧基”包括烷基-o-基團(tuán)，其中烷基如本文定義。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、庚氧基等。

烷氧基可以是未取代或任選地取代的。當(dāng)任選地取代時(shí)，烷氧基的一個(gè)或多個(gè)氫原子(例如，1至4個(gè)、1至2個(gè)、或1個(gè))可以替換為獨(dú)立選自氟、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、酰氨基、硫基和烷硫基的基團(tuán)。

如本文所用的“烷氧基烷基”包括烷基-o-亞烷基-，其中烷基和亞烷基如本文定義。代表性烷氧基烷基包括甲氧基乙基、乙氧基甲基、正丁氧基甲基和環(huán)戊基甲氧基乙基。

如本文所用的“烷氧羰基”包括酯基；即，烷基-o-co-基團(tuán)，其中烷基如本文定義。代表性烷氧羰基包括甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基等。

如本文所用的“烷氧羰基烷基”包括烷基-o-co-亞烷基-，其中烷基和亞烷基如本文定義。代表性烷氧羰基烷基包括甲氧羰基甲基、乙氧羰基甲基、甲氧羰基乙基等。

如本文所用的“烷基”包括脂族烴基團(tuán)，其可以是在鏈中具有約1個(gè)至約20個(gè)碳原子的直鏈或支鏈。優(yōu)選的烷基在鏈中具有1個(gè)至約12個(gè)碳原子。更優(yōu)選的烷基在鏈中具有1個(gè)至6個(gè)碳原子。如本文所用的“支鏈”包括連接至直鏈烷基鏈的一個(gè)或多個(gè)低級(jí)烷基如甲基、乙基或丙基。如本文所用的“低級(jí)烷基”在鏈中包括1個(gè)至約6個(gè)碳原子、優(yōu)選地5個(gè)或6個(gè)碳原子，所述鏈可以是直鏈或支鏈的。代表性烷基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、正戊基和3-戊基。

烷基可以是未取代或任選地取代的。當(dāng)任選地取代時(shí)，烷基的一個(gè)或多個(gè)氫原子(例如，1至4個(gè)、1至2個(gè)、或1個(gè))可以替換為獨(dú)立選自氟、羥基、烷氧基、氨基、烷基氨基、酰氨基、硫基和烷硫基的基團(tuán)。

如本文所用的“亞烷基”包括1個(gè)至約6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的二價(jià)烴鏈。優(yōu)選的亞烷基是具有1個(gè)至約4個(gè)碳原子的低級(jí)亞烷基。代表性亞烷基包括亞甲基、亞乙基等。

如本文所用的“烷硫基”包括烷基-s-基團(tuán)，其中烷基如本文定義。優(yōu)選的烷硫基是其中烷基是低級(jí)烷基的那些。代表性烷硫基包括甲硫基、乙硫基、異丙硫基、庚硫基等。

如本文所用的“烷硫基烷基”包括烷硫基-亞烷基-，其中在本文定義了烷硫基和亞烷基。代表性烷硫基烷基包括甲硫基甲基、乙硫基丙基、異丙硫基乙基等。

如本文所用的“酰氨基”包括式y(tǒng)1y2n-c(o)-的基團(tuán)，其中y1和y2獨(dú)立地是氫、烷基或烯基；或y1和y2連同經(jīng)其連接y1和y2的氮接合以形成4元至7元氮雜環(huán)基(例如，哌啶基)。代表性酰氨基包括伯酰氨基(h2n-c(o)-)、甲基酰氨基、二甲基酰氨基、二乙基酰氨基等。優(yōu)選地，“酰氨基”是-c(o)nrr’基團(tuán)，其中r和r’是獨(dú)立選自h和烷基的成員。更優(yōu)選地，r和r’中至少之一是h。

如本文所用的“酰氨基烷基”包括酰氨基-亞烷基-，其中酰氨基和亞烷基如本文所定義。代表性酰氨基烷基包括酰氨基甲基、酰氨基亞乙基、二甲基酰氨基乙基等。

如本文所用的“氨基”包括式y(tǒng)1y2n-的基團(tuán)，其中y1和y2獨(dú)立地是氫、?；蛲榛?；或y1和y2連同經(jīng)其連接y1和y2的氮接合以形成4元至7元氮雜環(huán)基(例如，哌啶基)。任選地，當(dāng)y1和y2獨(dú)立地是氫或烷基時(shí)，可以添加額外的取代基至氮，產(chǎn)生季銨離子。代表性氨基包括伯氨基(h2n-)、甲基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基等。優(yōu)選地，“氨基”是-nrr’基團(tuán)，其中r和r’是獨(dú)立選自h和烷基的成員。優(yōu)選地，r和r’中至少之一是h。

如本文所用的“氨基烷基”包括氨基-亞烷基-基團(tuán)，其中氨基和亞烷基如本文所定義。代表性氨基烷基包括氨基甲基、氨基乙基、二甲基氨基甲基等。

如本文所用的“芳酰基”包括芳基-co-基團(tuán)，其中芳基如本文所定義。代表性芳?；ū郊柞；?、萘-1-酰基和萘-2-?；?。

如本文所用的“芳基”包括6個(gè)至約14個(gè)碳原子、優(yōu)選地6個(gè)至約10個(gè)碳原子的芳族單環(huán)或多環(huán)環(huán)系統(tǒng)。代表性芳基包括苯基和萘基。

如本文所用的“芳環(huán)”包括可以包括零個(gè)至4個(gè)選自氧、硫、硒和氮的雜原子的5-12元的芳族單環(huán)部分或稠合多環(huán)部分。示例性芳環(huán)包括苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪、嘧啶、萘、苯并噻唑啉、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、苯并吲哚、喹啉等。芳環(huán)基團(tuán)可以在一個(gè)或多個(gè)位置被鹵素、烷基、烷氧基、烷氧基羰基、鹵代烷基、氰基、磺酸根合(sulfonato)、氨基磺?；?、芳基、磺酰基、氨基羰基、羧基、酰氨基、烷基磺?；?、氨基和取代或未取代的取代基取代。

如本文所用的“生物分子”包括生物系統(tǒng)中使用的天然分子或合成分子。優(yōu)選的生物分子包括蛋白質(zhì)、肽、酶底物、激素、抗體、抗原、半抗原、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、碳水化合物、碳水化合物衍生物、寡糖、多糖和核酸。更優(yōu)選的生物分子包括蛋白質(zhì)、肽、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素或生物素。

如本文所用的“羧基”包括hoc(o)-基團(tuán)(即，羧酸)或其鹽。

如本文所用的“羧烷基”包括hoc(o)-亞烷基-基團(tuán)，其中亞烷基如本文所定義。代表性羧烷基包括羧甲基(即，hoc(o)ch2-)和羧乙基(即，hoc(o)ch2ch2-)。

如本文所用的“環(huán)烷基”包括約3個(gè)至約10個(gè)碳原子、優(yōu)選地約5個(gè)至約10個(gè)碳原子的非芳族單環(huán)或多環(huán)環(huán)系統(tǒng)。更優(yōu)選的環(huán)烷基環(huán)含有5個(gè)或6個(gè)環(huán)原子。環(huán)烷基任選地包含至少一個(gè)sp²-雜化的碳(例如，引入環(huán)內(nèi)或環(huán)外烯烴的環(huán))。代表性單環(huán)環(huán)烷基包括環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。代表性多環(huán)狀環(huán)烷基包括1-萘烷、降冰片基、金剛烷基等。

如本文所用的“亞環(huán)烷基”包括具有約4個(gè)至約8個(gè)碳原子的二價(jià)環(huán)烷基。優(yōu)選的環(huán)烯基包括1,2-、1,3-或1,4-順-或反-環(huán)己烯。

如本文所用的“鹵代”或“鹵素”包括氟、氯、溴或碘。

如本文所用的“雜原子”包括除碳或氫之外的原子。代表性雜原子包括o、s和n。雜原子氮或硫原子任選地氧化成相應(yīng)的n-氧化物、s-氧化物(亞砜)或s,s-二氧化物(砜)。在優(yōu)選的方面，雜原子具有至少兩個(gè)至亞烷基碳原子的鍵(例如，-c1-c9亞烷基-o-c1-c9亞烷基-)。在一些實(shí)施方案中，雜原子進(jìn)一步被?；?、烷基、芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)基或雜芳基取代(例如，-n(me)-；-n(ac)-)。

如本文所用的“羥基烷基”包括被一個(gè)或多個(gè)羥基取代的如本文定義的烷基。優(yōu)選的羥基烷基含有低級(jí)烷基。代表性羥基烷基包括羥基甲基和2-羥基乙基。

“連接基團(tuán)”即，l，包含使代謝產(chǎn)物衍生物與生物分子如載體蛋白、生物素或抗生蛋白鏈菌素連接的原子。還參見r.haugland,molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.(1992)。在一個(gè)實(shí)施方案中，l表示與蛋白質(zhì)發(fā)生連接反應(yīng)前的連接基團(tuán)前體，并且r¹¹表示本發(fā)明化合物和蛋白質(zhì)或生物素之間的得到的連接(attachment)(即，r¹¹是與生物分子連接的連接基之間的得到的連接)。優(yōu)選的反應(yīng)性官能團(tuán)包括亞磷酰胺(phosphoramidite)基團(tuán)、活化酯(例如，nhs酯)、硫氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺和碘乙酰胺。l可以包含與環(huán)共價(jià)連接的末端氨基、羧酸或巰基。在某些情況下，顯示末端氨基、羧酸或巰基并表示為-l-nh2或-l-c(o)oh或-l-sh。

如本文所用的“氧代”包括式>c＝o基團(tuán)(即，羰基-c(o)-)。

如本文所用的“磺酸根合(sulfonato)”包括-so3^-基團(tuán)，優(yōu)選地被陽(yáng)離子如h⁺、na⁺、k⁺等平衡。

如本文所用的“磺酸根合烷基(sulfonatoalkyl)”包括磺酸根合-亞烷基-，其中磺酸根合和亞烷基如本文定義。更優(yōu)選的實(shí)施方案包括具有2個(gè)至6個(gè)碳原子的亞烷基，并且最優(yōu)選的實(shí)施方案包括具有2、3或4個(gè)碳的亞烷基。代表性磺酸根合烷基包括磺酸根合甲基、3-磺酸根合丙基、4-磺酸根合丁基、5-磺酸根合戊基、6-磺酸根合己基等。

i.實(shí)施方案詳述

在某些方面，本發(fā)明提供用于測(cè)量從受試者例如人受試者得到的樣品中色氨酸、血清素和犬尿氨酸途徑中代謝產(chǎn)物的水平、量或濃度的測(cè)定例如免疫測(cè)定。例如，參考圖1，文中提供了用于測(cè)量或定量從疑似患有或患有腸易激綜合征(ibs)的受試者得到的生物樣品例如血液、血漿或血清中5-hiaa(5-羥基吲哚-3-乙酸)115、褪黑激素和犬尿烯酸的量的組合物和方法。文中提供了抗體例如多克隆和單克隆抗體，其對(duì)特定色氨酸、血清素和犬尿氨酸途徑的代謝產(chǎn)物是免疫反應(yīng)的。如此，可使用所述組合物和方法，以助于ibs或者與色氨酸、血清素和犬尿氨酸途徑相關(guān)的其他病理學(xué)情況例如類癌綜合征、抑郁、高血壓、孤獨(dú)癥、阿爾茨海默氏病和偏頭痛的診斷或預(yù)后。

檢測(cè)或測(cè)量結(jié)構(gòu)類似的代謝產(chǎn)物的現(xiàn)有技術(shù)方法不存在或缺少靈敏度、特異性和重現(xiàn)性。一般來講，這些方法不能區(qū)別結(jié)構(gòu)類似的化合物。對(duì)于一些方法，需要大約500μl的樣品體積，以測(cè)量特定代謝產(chǎn)物的水平。并且，在一些情況下，進(jìn)行方法前，樣品必需進(jìn)行處理例如提取、冷凍干燥和/或重構(gòu)。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公認(rèn)血清素和5-hiaa對(duì)氧敏感，且非常不穩(wěn)定。在4℃，從解凍大約7小時(shí)，所述化合物的降解發(fā)生。5-羥基吲哚不穩(wěn)定的性質(zhì)會(huì)產(chǎn)生不可靠的含量測(cè)定結(jié)果，即使當(dāng)使用添加劑用于預(yù)防氧化破壞時(shí)。

a.色氨酸和血清素途徑代謝產(chǎn)物-5-hiaa半抗原

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供代謝產(chǎn)物衍生物和其綴合物、用于產(chǎn)生抗體的方法和血清素代謝產(chǎn)物的抗體。在某些方面，衍生化是優(yōu)選的，因?yàn)榇x產(chǎn)物如5-ht和5-hiaa對(duì)氧敏感并且因此不穩(wěn)定。血漿中血清素水平為從約0.6nmol/l至179nmol/l。在溫和條件下5-ht和5-hiaa的化學(xué)衍生化穩(wěn)定這些化合物。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供血清素代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定的苯并唑衍生物?？梢酝ㄟ^hplc以高靈敏度檢測(cè)穩(wěn)定的苯并唑衍生物，原因在于它們的熒光(圖3d)。衍生化可以是綴合至生物分子例如載體蛋白，并與佐劑結(jié)合，以刺激免疫應(yīng)答。衍生化還可以是綴合至其他生物分子包括肽。

本發(fā)明提供血清素(5-ht)和5-羥基吲哚乙酸(5-hiaa)的穩(wěn)定衍生物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供式i化合物：

其中r是選自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、氨基烷基、酰氨基烷基、羧基烷基、取代的羧基烷基的成員；并且

r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁶、r⁷和r⁸各自是獨(dú)立選自氫、烷基、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、芳?；⑼轷；?、酰氨基、取代的酰氨基、氰基、羧基、烷氧羰基、磺酸根合(sulfonato)、烷氧基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧羰基烷基、磺酸根合烷基(sulfonatoalkyl)、l和r¹¹b的成員；

l是連接體；

r¹¹是在化合物和生物分子之間的所得到的連接；并且

b是生物分子。

在一個(gè)方面，r是選自氨基烷基、羧基烷基和取代的羧基烷基的成員。在另一個(gè)方面，r是選自-ch2ch2nh2、-ch2ch2co2h和-ch2ch(nh2)co2h的成員。

l表示用于連接至生物分子如載體蛋白或生物素的連接基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，l包含聚乙二醇或peg。例如，l可以包含與環(huán)共價(jià)連接的末端氨基、羧酸或巰基。在某些情況下，末端氨基、羧酸或巰基被顯示并表示為-l-nh2或-l-c(o)oh或-l-sh。

r¹¹表示本發(fā)明化合物和生物分子如載體蛋白、肽或生物素之間的得到的連接(attachment)(即，r¹¹包含與生物分子連接的連接基團(tuán))。

l是選自直接連接(link)或共價(jià)聯(lián)接(linkage)的成員，其中共價(jià)聯(lián)接是直鏈或支鏈的、環(huán)狀或雜環(huán)的、飽和的或不飽和的、具有1-60個(gè)選自c、n、p、o和s的原子，其中l(wèi)可以具有額外的氫原子以填充化合價(jià)，其中聯(lián)接(linkage)含有以下的任何組合：醚、硫醚、胺、酯、氨基甲酸酯、脲、硫脲、氧基或酰胺鍵；或單鍵、雙鍵、叁鍵或芳族碳-碳鍵；或磷-氧、磷-硫、氮-氮、氮-氧或氮-鉑鍵；或芳族鍵或雜芳族鍵。在某些方面，l包含末端氨基、羧酸或巰基。

在某些方面，l具有下式：

-x¹-y¹-x²-

其中：x¹是選自二價(jià)基團(tuán)、直接連接、氧、任選取代的氮和硫的成員；y¹是選自直接連接和任選地被雜原子間斷的c1-c10亞烷基的成員；并且x²是選自二價(jià)基團(tuán)、直接連接、氧、任選取代的氮和硫的成員。

優(yōu)選地，x¹和x²的二價(jià)基團(tuán)各自獨(dú)立地選自直接連接、任選取代的亞烷基、任選取代的亞烷基氧基羰基、任選取代的亞烷基氨甲?；?、任選取代的亞烷基磺酰基、亞芳基磺?；⑷芜x地取代的亞芳基氧基羰基、任選地取代的亞芳基氨甲?；?、任選地取代的硫羰基、任選地取代的磺?；腿芜x地取代的亞磺?；?。

在某些優(yōu)選的方面，l是-(ch2)n-，其中r是1至10的整數(shù)，優(yōu)選地n是1至5的整數(shù)，如1至4，或1、2、3、4或5。

此外，苯并唑衍生物可以用來產(chǎn)生免疫原性綴合物。例如，在一個(gè)方面，本發(fā)明的綴合物用來提高對(duì)于關(guān)注的代謝產(chǎn)物特異性的免疫原性反應(yīng)。在某些情況下，苯并唑衍生物和連接臂(其中n是約1-20)可以用來附著載體蛋白至氨基(或巰基)末端。在一些實(shí)施方案中，連接臂是peg。連接臂可包括peg1、peg2、peg3、peg4、peg5、peg6、peg7、peg8、peg9、peg10、peg11、peg12、peg13、peg14、peg15、peg16、peg17、peg18、peg19或peg20連接體。在一些實(shí)施方案中，5-hiaa衍生物半抗原是文中所述的。

為了測(cè)試如此產(chǎn)生的抗體的親和力和特異性，可以制備生物素化的半抗原。在一些情況下，苯并唑衍生物和連接臂(其中n是大約1-20)可用于將生物素分子附加至氨基(或巰基)末端。在一些實(shí)施方案中，連接臂是peg。連接臂可包括peg1、peg2、peg3、peg4、peg5、peg6、peg7、peg8、peg9、peg10、peg11、peg12、peg13、peg14、peg15、peg16、peg17、peg18、peg19或peg20連接體。在一些實(shí)施方案中，將生物素分子替換為可用于將半抗原固定至固體基質(zhì)或支持物的不同分子。

在一些實(shí)施方案中，苯并唑衍生物是唑并-吲哚-peg-生物素-酯或唑并-吲哚-peg-生物素-酸。

在一些方面，如圖1中所示的血清素途徑的化合物或式i化合物可以利用本領(lǐng)域眾所周知的綴合化學(xué)，與載體分子反應(yīng)。例如，活化酯(nhs酯)可以與伯胺反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。馬來酰亞胺和硫醇可一起反應(yīng)，并制備硫醚。烷基鹵化物與胺和硫醇反應(yīng)，以分別制備烷基胺和硫醚。本文中可使用提供能夠綴合至蛋白質(zhì)的反應(yīng)基團(tuán)的任何衍生物。如本領(lǐng)域已知的，含有游離氨基基團(tuán)、游離羧酸基團(tuán)或游離巰基基團(tuán)的部分(moieties)提供用于蛋白綴合的反應(yīng)基團(tuán)。例如，通過戊二醛交聯(lián)或者通過碳二亞胺交聯(lián)至蛋白質(zhì)上能用的羧酸基團(tuán)，可以將游離氨基基團(tuán)綴合至蛋白質(zhì)。并且，通過例如利用磺基琥珀酰亞氨基-4-(n-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-甲酸酯(sulfo-smcc)的蛋白質(zhì)的馬來酰亞胺活化，然后連接至巰基基團(tuán)，可將含游離巰基基團(tuán)的半抗原綴合至蛋白質(zhì)。

當(dāng)將含有用于連接的羧酸基團(tuán)的載體蛋白連接至含有胺的代謝產(chǎn)物時(shí)，可以首先使用活化試劑，將羧酸轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性更強(qiáng)的形式，形成例如n-羥琥珀酰亞胺(nhs)酯或混合酐。將含胺代謝產(chǎn)物用所產(chǎn)生的活化的酸處理以形成酰胺鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，備選地，nhs酯可以在代謝產(chǎn)物上并且胺可以在載體蛋白上。

通過衍生化使代謝產(chǎn)物穩(wěn)定的方法使得能夠產(chǎn)生針對(duì)免疫原性綴合物的抗體。采用這些抗體時(shí)，可以使用免疫測(cè)定如elisa，其中抗體對(duì)關(guān)注的代謝產(chǎn)物是高度特異性的。

如圖1中所示，血清素途徑中的關(guān)注的代謝產(chǎn)物例如是血清素(5-ht)101、5-羥基吲哚乙醛105和5-羥基吲哚乙酸(5-hiaa)115。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供與5-羥基吲哚乙酸(5-hiaa)115特異性結(jié)合的分離或純化的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體對(duì)選自圖1的色氨酸122，5-羥基色氨酸125、血清素101、褪黑激素120、犬尿氨酸131、犬尿烯酸135、鄰氨基苯甲酸140、3-羥基犬尿氨酸146、3-羥基鄰氨基苯甲酸149、喹啉酸160和黃尿酸148的一種或多種代謝產(chǎn)物具有小于1％交叉反應(yīng)性例如0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0％交叉反應(yīng)性。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供針對(duì)代謝產(chǎn)物綴合物的分離的或純化的抗體。首先，可以制備代謝產(chǎn)物或其穩(wěn)定的衍生物。下一步，使載體蛋白如bsa與衍生物綴合。通過將綴合物注射至哺乳動(dòng)物如兔、小鼠、綿羊、雞、山羊等，制備抗代謝產(chǎn)物或其穩(wěn)定衍生物的抗體。此后，生物素化的半抗原可以用來測(cè)試如此產(chǎn)生的抗體的反應(yīng)性、結(jié)合活性、特異性和/或敏感性。

在其他方面，本發(fā)明提供用于制備特異性地與血清素代謝產(chǎn)物結(jié)合的抗體例如多克隆抗體或單克隆抗體的方法。該方法包括：(a)提供免疫原，所述免疫原包含選自血清素(5-ht)、5-羥基吲哚乙酸(5-hiaa)和5-羥基色氨酸(5-htp)的衍生物，所述衍生物各自與載體蛋白綴合；(b)在使得動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的條件下用免疫原免疫動(dòng)物；和(c)從動(dòng)物中移出抗體。

在一個(gè)方面，可以使用本發(fā)明的綴合物，從血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中移出或分離根據(jù)文中提供的方法生成的抗體。例如，在一個(gè)方面，5-hiaa化合物、其綴合物或其衍生物可以用來從被免疫的動(dòng)物例如被免疫的山羊、兔或小鼠的血清移出抗體。可以通過從血清、腹水、細(xì)胞培養(yǎng)上清液或培養(yǎng)基等中選擇性富集或特異性分離關(guān)注的抗體，來將抗體純化。例如，可將親和方法如抗原特異性親和方法或免疫球蛋白類特異性親和方法，用于分離關(guān)注的抗體?？蓪⑸锼鼗?-hiaa化合物用于從哺乳動(dòng)物(例如兔、小鼠或山羊)移出其相應(yīng)抗體。

在一些方面，本發(fā)明提供分離的或純化的單克隆抗體，其是對(duì)5-hiaa免疫反應(yīng)的，并由2015年11月17日以atcc登錄號(hào)_在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏并指定為1204-10g6f11h3的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。所述抗體與其他結(jié)構(gòu)類似的代謝產(chǎn)物或色氨酸、血清素和犬尿氨酸途徑的化合物(包括圖1的色氨酸122、5-羥色氨酸125、血清素101、褪黑激素120、犬尿氨酸131、犬尿烯酸135、鄰氨基苯甲酸140、3-羥基犬尿氨酸146、3-羥基鄰氨基苯甲酸149、喹啉酸160和黃尿酸148)基本無交叉反應(yīng)性。

b.色氨酸和血清素途徑代謝產(chǎn)物-褪黑激素半抗原

本文提供了穩(wěn)定的褪黑激素半抗原、其變體或其衍生物，它們可以綴合至生物分子例如載體蛋白并與佐劑組合以刺激免疫應(yīng)答。

另一方面，本發(fā)明提供用于色氨酸途徑的代謝產(chǎn)物的抗體產(chǎn)生的抗原。在某一情況下，腸易激綜合征(ibs)中血清素功能的失調(diào)是由血清素代謝產(chǎn)物即褪黑激素120(圖1)的代謝變化引起的。

本發(fā)明提供抗體和制備褪黑激素(mt)的抗體的方法。

一方面，本發(fā)明提供具有式ii結(jié)構(gòu)的褪黑激素衍生物：

r選自氫、烷基、芳?；⑼轷；?、酰氨基、取代的酰氨基、l和r¹¹b；

r¹、r²、r³、r⁴和r⁵各自是獨(dú)立選自氫、烷基、鹵素、羧基、羥基、烷氧基、芳?；⑼轷；?、酰氨基、取代的酰氨基、烷氧羰基、磺酸根合(sulfonato)、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧羰基烷基、磺酸根合烷基、l和r¹¹b的成員；

l是連接體；

r¹¹是在化合物和生物分子之間的得到的連接；并且

b是生物分子。

另一方面，利用本領(lǐng)域眾所周知的綴合化學(xué)，可以將式ii化合物與載體蛋白綴合，以制備抗體?；罨?nhs酯)可以與伯胺反應(yīng)，以形成穩(wěn)定的酰胺鍵。馬來酰亞胺和硫醇可一起反應(yīng)，并制備硫醚。烷基鹵化物與胺和硫醇反應(yīng)，以分別制備烷基胺和硫醚?？蓪⑻峁┠芫Y合至蛋白質(zhì)的反應(yīng)基團(tuán)的任何衍生物用于本文中。如本領(lǐng)域已知的，含有游離氨基基團(tuán)、游離羧酸基團(tuán)或游離巰基基團(tuán)的部分提供用于蛋白綴合的反應(yīng)基團(tuán)。例如，通過戊二醛交聯(lián)或者通過碳二亞胺交聯(lián)至蛋白質(zhì)上能用的羧酸基團(tuán)，可以將游離氨基基團(tuán)綴合至蛋白質(zhì)。并且，通過例如利用磺基琥珀酰亞氨基-4-(n-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-甲酸酯(sulfo-smcc)的蛋白質(zhì)的馬來酰亞胺活化，然后連接至巰基基團(tuán)，可將含游離巰基基團(tuán)的半抗原綴合至蛋白質(zhì)。

一種綴合的示例性示意圖如下，其中n是0-20的整數(shù)(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)：

可以使用本發(fā)明的綴合物從血清移出從哺乳動(dòng)物生成的抗體。例如，在一個(gè)方面，式ii的化合物具有式iib的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明還提供穩(wěn)定的衍生物褪黑激素和用于產(chǎn)生抗體的方法。該方法包括：

(a)提供包含褪黑激素(mt)衍生物的免疫原；

(b)在使得動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的條件下用免疫原免疫動(dòng)物；和

(c)從動(dòng)物移出抗體。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供與褪黑激素(mt)特異性結(jié)合的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其對(duì)選自色氨酸(trp)、血清素(5-ht)、5-羥色氨酸(5-htp)、5-羥基吲哚-3-乙酸(5-hiaa)、犬尿氨酸(kyn)、犬尿烯酸(kyna)、3-羥基犬尿氨酸(3-hk)、3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-haa)、喹啉酸(quin)、鄰氨基苯甲酸(ana)、血清素-o-硫酸酯和血清素-o-磷酸酯的一種或多種成員具有小于1％的交叉反應(yīng)性。

在某些其他方面，本發(fā)明提供測(cè)定來自哺乳動(dòng)物(如人)的流體樣品或組織樣品中褪黑激素的方法。該方法包括將樣品與本文所述的抗體合并，隨后確定抗體是否與樣品中的褪黑激素特異性結(jié)合。例如，在這些方法中，與來自樣品的褪黑激素的特異性抗體結(jié)合表示樣品中存在褪黑激素。

在某些情況下，本發(fā)明的抗體在免疫測(cè)定如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa例如競(jìng)爭(zhēng)性elisa)或ceer中使用，所述免疫測(cè)定可以使用用于檢測(cè)代謝產(chǎn)物水平和濃度的酶標(biāo)記。

l表示用于連接至生物分子如載體蛋白或生物素的連接基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，l包含聚乙二醇或peg。例如，l可以包含與環(huán)共價(jià)連接的末端氨基、羧酸或巰基。在某些情況下，末端氨基、羧酸或巰基被顯示并表示為-l-nh2或-l-c(o)oh或-l-sh。

r¹¹表示本發(fā)明化合物和生物分子如載體蛋白、肽或生物素之間的得到的連接(即，r¹¹包含與生物分子連接的連接基團(tuán))。

l是選自直接連接或共價(jià)聯(lián)接的成員，其中共價(jià)聯(lián)接是直鏈或支鏈的、環(huán)狀或雜環(huán)的、飽和的或不飽和的、具有1-60個(gè)選自c、n、p、o和s的原子，其中l(wèi)可以具有額外的氫原子以填充化合價(jià)，其中聯(lián)接含有以下的任何組合：醚、硫醚、胺、酯、氨基甲酸酯、脲、硫脲、氧基或酰胺鍵；或單鍵、雙鍵、叁鍵或芳族碳-碳鍵；或磷-氧、磷-硫、氮-氮、氮-氧或氮-鉑鍵；或芳族鍵或雜芳族鍵。在某些方面，l包含末端氨基、羧酸或巰基。

在某些方面，l具有下式：

-x¹-y¹-x²-

其中：x¹是選自二價(jià)基團(tuán)、直接連接、氧、任選取代的氮和硫的成員；y¹是選自直接連接和任選地被雜原子間斷的c1-c10亞烷基的成員；并且x²是選自二價(jià)基團(tuán)、直接連接、氧、任選取代的氮和硫的成員。

優(yōu)選地，x¹和x²的二價(jià)基團(tuán)各自獨(dú)立地選自直接連接、任選取代的亞烷基、任選取代的亞烷基氧基羰基、任選取代的亞烷基氨甲?；?、任選取代的亞烷基磺酰基、亞芳基磺?；?、任選地取代的亞芳基氧基羰基、任選地取代的亞芳基氨甲?；?、任選地取代的硫羰基、任選地取代的磺?；腿芜x地取代的亞磺?；?。

在某些優(yōu)選的方面，l是-(ch2)n-，其中r是1至10的整數(shù)，優(yōu)選地n是1至5的整數(shù)，如1至4，或1、2、3、4或5。

在一些情況下，褪黑激素半抗原、其變體或其衍生物和連接臂l(其中n是大約1-20)可用于將載體蛋白附加至氨基(或巰基)末端。在一些實(shí)施方案中，連接臂是peg。連接臂可包括peg1、peg2、peg3、peg4、peg5、peg6、peg7、peg8、peg9、peg10、peg11、peg12、peg13、peg14、peg15、peg16、peg17、peg18、peg19或peg20連接體。在一實(shí)施方案中，將穩(wěn)定的褪黑激素半抗原綴合或連接至載體蛋白例如bsa、rsa、msa、klh、ova等，以產(chǎn)生免疫原。在一些實(shí)施方案中，褪黑激素半抗原是文中所述的。半抗原還可以綴合至其他生物分子。例如，為了測(cè)試如此產(chǎn)生的抗體的親和力和特異性，可以將半抗原綴合或連接至生物素，以產(chǎn)生生物素化的半抗原例如生物素化的褪黑激素。

另一方面，利用本領(lǐng)域眾所周知的綴合化學(xué)，可以將褪黑激素化合物、其變體或其衍生物與載體蛋白綴合，以制備抗體。例如，活化酯(nhs酯)可以與伯胺反應(yīng)，以形成穩(wěn)定的酰胺鍵。馬來酰亞胺和硫醇可一起反應(yīng)，并制備硫醚。烷基鹵化物與胺和硫醇反應(yīng)，以分別制備烷基胺和硫醚?？蓪⑻峁┠芫Y合至蛋白質(zhì)的反應(yīng)基團(tuán)的任何衍生物用于本文中。如本領(lǐng)域已知的，含有游離氨基基團(tuán)、游離羧酸基團(tuán)或游離巰基基團(tuán)的部分提供用于蛋白綴合的反應(yīng)基團(tuán)。例如，通過戊二醛交聯(lián)或者通過碳二亞胺交聯(lián)至蛋白質(zhì)上能用的羧酸基團(tuán)，可以將游離氨基基團(tuán)綴合至蛋白質(zhì)。并且，通過例如利用磺基琥珀酰亞氨基-4-(n-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-甲酸酯(sulfo-smcc)的蛋白質(zhì)的馬來酰亞胺活化，然后連接至巰基基團(tuán)，可將含游離巰基基團(tuán)的半抗原綴合至蛋白質(zhì)。

當(dāng)將含有用于連接的羧酸基團(tuán)的載體蛋白連接至含有胺的代謝產(chǎn)物時(shí)，可以首先使用活化試劑，將羧酸轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性更強(qiáng)的形式，形成例如n-羥琥珀酰亞胺(nhs)酯或混合酐。含胺代謝產(chǎn)物用所產(chǎn)生的活化的酸處理以形成酰胺鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，備選地，nhs酯可以在代謝產(chǎn)物上并且胺可以在載體蛋白上。

本公開書還提供用于產(chǎn)生特異性地與血清素代謝產(chǎn)物褪黑激素結(jié)合的抗體(例如抗體、其抗體片段，及其抗原結(jié)合片段)的方法。該方法包括：(a)提供免疫原，所述免疫原包含綴合至載體蛋白的褪黑激素半抗原；(b)在使得動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的條件下用免疫原免疫動(dòng)物；和(c)從動(dòng)物移出特異性地與褪黑激素結(jié)合的抗體。動(dòng)物可以是綿羊、山羊、兔、大鼠、小鼠等。在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在其他實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體。褪黑激素半抗原可化學(xué)合成或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法生產(chǎn)。

在一實(shí)施方案中，通過文中公開的方法產(chǎn)生的、與褪黑激素特異性結(jié)合的分離或純化的抗體或其抗原結(jié)合片段，對(duì)色氨酸、血清素和犬尿氨酸途徑中的結(jié)構(gòu)類似化合物具有小于1％交叉反應(yīng)性例如0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0％交叉反應(yīng)性。在一些情況下，抗-褪黑激素抗體或其片段與結(jié)構(gòu)上類似于褪黑激素的色氨酸、血清素和犬尿氨酸途徑的代謝產(chǎn)物或化合物基本無交叉反應(yīng)性，所述代謝產(chǎn)物或化合物包括圖1的色氨酸122、5-羥基色氨酸125、血清素101、5-羥基吲哚乙酸115、犬尿氨酸131、犬尿烯酸135、鄰氨基苯甲酸140、3-羥基犬尿氨酸146、3-羥基鄰氨基苯甲酸149、喹啉酸160和黃尿酸148。文中提供了與褪黑激素特異性免疫反應(yīng)的多克隆抗體和單克隆抗體。

在一個(gè)方面，可以使用本發(fā)明的綴合物從血清移出或分離從哺乳動(dòng)物生成的抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些情況下，可將生物素化的褪黑激素或綴合至另一生物分子或化合物的褪黑激素用于從哺乳動(dòng)物移出抗-褪黑激素抗體。純化方法的詳細(xì)描述在下文公開。

在一些方面，本發(fā)明提供分離的或純化的單克隆抗體，其是與褪黑激素免疫反應(yīng)的，并由2015年11月17日以atcc登錄號(hào)_在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏并指定為1212-6c1e2f7的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。

c.犬尿氨酸途徑代謝產(chǎn)物–犬尿烯酸半抗原

犬尿氨酸途徑代謝產(chǎn)物在內(nèi)臟疼痛機(jī)理中發(fā)揮作用并且已經(jīng)與ibs中的低水平免疫活化聯(lián)系。僅1％的飲食色氨酸轉(zhuǎn)化成血清素并且超過95％代謝成犬尿氨酸。犬尿氨酸水平和“犬尿氨酸:色氨酸比率”在ibs患者中均顯著升高。通常，ibs患者顯示犬尿烯酸(kyna)濃度降低和鄰氨基苯甲酸(ana)和3-羥基鄰氨基苯甲酸增加。色氨酸沿犬尿氨酸途徑的代謝在患ibs-d的患者中被抑制。本發(fā)明提供確定色氨酸和犬尿氨酸途徑代謝產(chǎn)物的水平的免疫測(cè)定，所述水平對(duì)確定ibs患者狀態(tài)具有診斷價(jià)值。

本文提供了穩(wěn)定的犬尿烯酸(kyna)、3-羥基犬尿氨酸(3-hk)、3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-haa)、喹啉酸和鄰氨基苯甲酸半抗原，它們可以綴合至生物分子例如載體蛋白并與佐劑組合，以刺激免疫應(yīng)答。半抗原還可以綴合至其他生物分子。在一實(shí)施方案中，綴合至或連接至載體蛋白的穩(wěn)定的犬尿烯酸(kyna)半抗原產(chǎn)生免疫原。在一些情況下，kyna半抗原是文中所述的。

本公開書還提供用于產(chǎn)生抗體的方法，該抗體特異性地與指定的犬尿氨酸途徑代謝產(chǎn)物例如犬尿烯酸(kyna)、其變體或其衍生物結(jié)合。該方法包括：(a)提供免疫原，所述免疫原包含與載體蛋白綴合的選自犬尿氨酸(k)、犬尿烯酸(kyna)、3-羥基犬尿氨酸(3-hk)、3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-haa)、喹啉酸和鄰氨基苯甲酸、其變體或其衍生物的半抗原，所述衍生物各自；(b)在使得動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的條件下用免疫原免疫動(dòng)物；和(c)從動(dòng)物移出抗體。動(dòng)物可以是綿羊、山羊、兔、大鼠、小鼠等。在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在其他實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體。

在一實(shí)施方案中，通過文中公開的方法產(chǎn)生的、與kyna特異性結(jié)合的分離或純化的抗體，對(duì)色氨酸、血清素和犬尿氨酸途徑中的結(jié)構(gòu)類似化合物具有小于1％交叉反應(yīng)性例如0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0％交叉反應(yīng)性。在一些情況下，抗-kyna抗體與結(jié)構(gòu)上類似于kyna的色氨酸、血清素和犬尿氨酸途徑的代謝產(chǎn)物或化合物基本無交叉反應(yīng)性，所述代謝產(chǎn)物或化合物包括圖1的色氨酸122、5-羥基色氨酸125、血清素101、褪黑激素120、5-羥基吲哚乙酸115、犬尿氨酸131、鄰氨基苯甲酸140、3-羥基犬尿氨酸146、3-羥基鄰氨基苯甲酸149、喹啉酸160和黃尿酸148。

還在另一方面，本發(fā)明提供式iii化合物：

其中，r¹、r²、r³、r⁴和r⁵各自是獨(dú)立選自氫、烷基、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、芳酰基、烷酰基、酰氨基、取代的酰氨基、氰基、羧基、烷氧羰基、磺酸根合(sulfonato)、烷氧基烷基、羧基、羧基烷基、烷氧羰基烷基、磺酸根合烷基(sulfonatoalkyl)、l和r¹¹b；l是連接體；r¹¹是在化合物和生物分子之間的得到的連接；并且b是生物分子。式iii化合物可用于制備抗犬尿烯酸135的特異性抗體。

另一方面，利用本領(lǐng)域眾所周知的綴合化學(xué)，可以將式iii化合物與載體蛋白綴合，以制備抗體。例如，活化酯(nhs酯)可以與伯胺反應(yīng)，以形成穩(wěn)定的酰胺鍵。馬來酰亞胺和硫醇可一起反應(yīng)，并制備硫醚。烷基鹵化物與胺和硫醇反應(yīng)，以分別制備烷基胺和硫醚?？蓪⑻峁┠芫Y合至蛋白質(zhì)的反應(yīng)基團(tuán)的任何衍生物用于本文中。如本領(lǐng)域已知的，含有游離氨基基團(tuán)、游離羧酸基團(tuán)或游離巰基基團(tuán)的部分提供用于蛋白綴合的反應(yīng)基團(tuán)。例如，通過戊二醛交聯(lián)或者通過碳二亞胺交聯(lián)至蛋白質(zhì)上能用的羧酸基團(tuán)，可以將游離氨基基團(tuán)綴合至蛋白質(zhì)。并且，通過例如利用磺基琥珀酰亞氨基-4-(n-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-甲酸酯(sulfo-smcc)的蛋白質(zhì)的馬來酰亞胺活化，然后連接至巰基基團(tuán)，可將含游離巰基基團(tuán)的半抗原綴合至蛋白質(zhì)。

一示例性綴合流程圖如下，其中l(wèi)包含末端sh：

可綴合至載體蛋白的犬尿烯酸半抗原的示例性實(shí)施方案。得到的免疫原可用于產(chǎn)生抗犬尿烯酸單克隆或多克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，利用包括下面化學(xué)結(jié)構(gòu)的犬尿烯酸免疫原產(chǎn)生文中所述的單克隆抗體。在其他實(shí)施方案中，從包含下面化學(xué)結(jié)構(gòu)的犬尿烯酸免疫原產(chǎn)生文中所述的多克隆抗體。

連接臂l(其中n是大約1-20)可用于通過硫綴合附加至載體蛋白。

l表示用于與生物分子如載體蛋白或生物素連接的連接基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，l包含聚乙二醇或peg。例如，l可以包含與環(huán)共價(jià)連接的末端氨基、羧酸或巰基。在某些情況下，末端氨基、羧酸或巰基被顯示并表示為-l-nh2或-l-c(o)oh或-l-sh。

r¹¹表示本發(fā)明化合物和生物分子如載體蛋白、肽或生物素之間的得到的連接(即，r¹¹包含與生物分子連接的連接基團(tuán))。

l是選自直接連接或共價(jià)聯(lián)接的成員，其中共價(jià)聯(lián)接是直鏈或支鏈的、環(huán)狀或雜環(huán)的、飽和的或不飽和的、具有1-60個(gè)選自c、n、p、o和s的原子，其中l(wèi)可以具有額外的氫原子以填充化合價(jià)，其中聯(lián)接含有以下的任何組合：醚、硫醚、胺、酯、氨基甲酸酯、脲、硫脲、氧基或酰胺鍵；或單鍵、雙鍵、叁鍵或芳族碳-碳鍵；或磷-氧、磷-硫、氮-氮、氮-氧或氮-鉑鍵；或芳族鍵或雜芳族鍵。在某些方面，l包含末端氨基、羧酸或巰基。

在某些方面，l具有下式：

-x¹-y¹-x²-

其中：x¹是選自二價(jià)基團(tuán)、直接連接、氧、任選取代的氮和硫的成員；y¹是選自直接連接和任選地被雜原子間斷的c1-c10亞烷基的成員；并且x²是選自二價(jià)基團(tuán)、直接連接、氧、任選取代的氮和硫的成員。

優(yōu)選地，x¹和x²的二價(jià)基團(tuán)各自獨(dú)立地選自直接連接、任選取代的亞烷基、任選取代的亞烷基氧基羰基、任選取代的亞烷基氨甲?；?、任選取代的亞烷基磺酰基、亞芳基磺酰基、任選地取代的亞芳基氧基羰基、任選地取代的亞芳基氨甲?；?、任選地取代的硫羰基、任選地取代的磺酰基，和任選地取代的亞磺酰基。

在某些優(yōu)選的方面，l是-(ch2)n-，其中r是1至10的整數(shù)，優(yōu)選地n是1至5的整數(shù)，如1至4，或1、2、3、4或5。

可以使用本發(fā)明的綴合物從血清移出從哺乳動(dòng)物生成的抗體。例如，在一個(gè)方面，式iiic的化合物，具有式iii的結(jié)構(gòu)：

其中r¹、r³、r⁴和r⁵各自是氫。

本文提供了穩(wěn)定的kyna半抗原、其變體或其衍生物，它們可以綴合至生物分子例如載體蛋白并與佐劑組合，以刺激免疫應(yīng)答。在一些情況下，kyna半抗原、其變體或其衍生物和連接臂l(其中n是大約1-20)可用于將載體蛋白附加至氨基(或巰基)末端。在一些實(shí)施方案中，連接臂是peg。連接臂可包括peg1、peg2、peg3、peg4、peg5、peg6、peg7、peg8、peg9、peg10、peg11、peg12、peg13、peg14、peg15、peg16、peg17、peg18、peg19或peg20連接體。在一實(shí)施方案中，穩(wěn)定的kyna半抗原綴合或連接至載體蛋白例如bsa、rsa、msa、klh、ova等，產(chǎn)生免疫原。半抗原還可以綴合至其他生物分子。例如，為了測(cè)試如此產(chǎn)生的抗體的親和力和特異性，可以將半抗原綴合或連接至生物素，以產(chǎn)生生物素化的半抗原例如生物素化的kyna。

在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供與犬尿烯酸特異性結(jié)合的分離或純化的抗體或其抗原結(jié)合片段，并且其中抗體對(duì)選自圖1的色氨酸122、5-羥色氨酸125、血清素101、5-羥基吲哚乙酸(5-hiaa)115、犬尿氨酸131、鄰氨基苯甲酸140、3-羥基犬尿氨酸146、3-羥基鄰氨基苯甲酸149、喹啉酸160、黃尿酸148和褪黑激素120的一種或多種成員具有小于1％的交叉反應(yīng)性。

在一些方面，本發(fā)明提供分離的或純化的單克隆抗體，其是與kyna免疫反應(yīng)的，并由2015年11月17日以atcc登錄號(hào)_在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏并指定為1194-6h5b11a7的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。所述抗體與色氨酸、血清素和犬尿氨酸途徑的其他結(jié)構(gòu)類似的代謝產(chǎn)物或化合物基本無交叉反應(yīng)性。

d.利用免疫測(cè)定檢測(cè)生物樣品中的代謝產(chǎn)物

在某些其他方面，本公開書提供用于檢測(cè)、測(cè)量或定量來自受試者(如人受試者)的生物樣品中褪黑激素水平的測(cè)定方法和試劑盒。在一些實(shí)施方案中，與正常受試者相比，所述人受試者患與較高或較低水平的褪黑激素、5-hiaa和/或犬尿烯酸相關(guān)的病癥。在一些情況下，病癥是腸易激綜合征，其包括下述亞型中的任何一種：具有便秘的ibs(ibs-c)、具有腹瀉的ibs(ibs-d)、混合的ibs(ibs-m)以及未分型的ibs(ibs-u)。方法可包括利用抗5-hiaa、生物素化的5-hiaa的抗體、抗犬尿烯酸、生物素化的犬尿烯酸的抗體、抗褪黑激素、生物素化的褪黑激素的抗體及其任何組合。

在某些其他方面，本發(fā)明提供用于測(cè)定、測(cè)量或檢測(cè)來自哺乳動(dòng)物(如人)的生物樣品例如流體樣品或組織樣品中的血清素代謝產(chǎn)物的存在或水平的方法。在一些實(shí)施方案中，血清素代謝產(chǎn)物是5-羥基吲哚乙酸(5-hiaa)。在一些情況下，所述方法包括測(cè)量或定量從人受試者獲得的生物樣品中5-hiaa的量或濃度。所述方法可包括在形成抗體和5-hiaa(如果樣品中存在)的復(fù)合物的條件下，將樣品與特異性地與5-hiaa結(jié)合的抗體合并?？贵w可以是文中所述的抗-5hiaa抗體中的任何一種。在一些實(shí)施方案中，樣品和抗-5hiaa抗體還與固定化的5-hiaa衍生物合并。固定化的5-hiaa衍生物可以是文中所述的生物素化的5-hiaa，其已經(jīng)連接或結(jié)合至抗生蛋白鏈菌素包被的固體基質(zhì)例如抗生蛋白鏈菌素-包被的多孔板。在一些實(shí)施方案中，樣品、抗-5hiaa抗體和固定化的5-hiaa衍生物同時(shí)接觸或添加在一起。在一些情況下，樣品和抗-5-hiaa抗體一起孵育一段預(yù)選時(shí)間，然后和固定化的5-hiaa或生物素化的5-hiaa一起孵育。在其他情況下，將固定化的或生物素化的5-hiaa衍生物與抗-5-hiaa抗體一起孵育一段預(yù)選時(shí)間，然后與樣品一起孵育。還在其他情況下，樣品、抗-5hiaa抗體和固定化的5hiaa以任何順序依次接觸在一起?？赏ㄟ^測(cè)量結(jié)合至固定化5-hiaa衍生物的抗-5-hiaa抗體水平，并計(jì)算樣品中相應(yīng)的5-hiaa水平，測(cè)定樣品中5-hiaa的水平。換言之，可以直接測(cè)量與固定化5-hiaa衍生物復(fù)合的抗-5hiaa抗體水平，且間接定量樣品中5-hiaa的水平。在一些情況下，與結(jié)合至固定化5-hiaa衍生物的抗-5-hiaa抗體水平相比，樣品中存在反比例的5-hiaa。

另一方面，本發(fā)明提供用于測(cè)定來自哺乳動(dòng)物(如人受試者)的生物樣品例如流體樣品或組織樣品中的血清素代謝產(chǎn)物例如褪黑激素的存在或水平的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括在形成抗體和褪黑激素(如果樣品中存在)復(fù)合物的條件下，將從受試者獲得的樣品與特異性地與褪黑激素結(jié)合的抗體合并?？贵w可以是文中公開的任何抗-褪黑激素抗體。在一些實(shí)施方案中，樣品和抗-褪黑激素抗體還與固定化的褪黑激素合并。固定化的褪黑激素可以是文中所述的生物素化的褪黑激素，其已經(jīng)連接或結(jié)合至抗生蛋白鏈菌素包被的固體基質(zhì)例如抗生蛋白鏈菌素-包被的多孔板。在一些實(shí)施方案中，樣品、抗-抗體和固定化的褪黑激素同時(shí)接觸或添加在一起。在一些情況下，樣品和抗-褪黑激素抗體一起孵育一段預(yù)選時(shí)間，然后和固定化的褪黑激素或生物素化的褪黑激素一起孵育。在其他情況下，將固定化的褪黑激素或生物素化的褪黑激素與抗-褪黑激素抗體一起孵育一段預(yù)選時(shí)間，然后與樣品一起孵育。還在其他情況下，樣品、抗-褪黑激素抗體和固定化的褪黑激素以任何順序依次接觸在一起?？赏ㄟ^測(cè)量結(jié)合至固定化褪黑激素的抗-褪黑激素抗體水平，并計(jì)算樣品中相應(yīng)的褪黑激素水平，測(cè)定樣品中褪黑激素的水平。例如，可以直接測(cè)量與固定化褪黑激素復(fù)合的抗-褪黑激素抗體水平，且間接定量樣品中的褪黑激素水平。在一些情況下，與結(jié)合至固定化褪黑激素的抗-褪黑激素抗體水平相比，樣品中存在反比例的褪黑激素。

在其它方面，本發(fā)明提供用于測(cè)定來自哺乳動(dòng)物(如人受試者)的生物樣品例如流體樣品或組織樣品中的犬尿氨酸代謝產(chǎn)物例如犬尿烯酸(kyna)的存在或水平的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在形成抗體和褪黑激素(如果樣品中存在)復(fù)合物的條件下，將從受試者獲得的樣品與特異性地與kyna結(jié)合的抗體合并?？贵w可以是文中公開的任何抗kyna抗體。在一些實(shí)施方案中，樣品和抗-kyna抗體還與固定化的kyna合并。固定化的kyna可以是文中所述的生物素化的kyna，其已經(jīng)連接或結(jié)合至抗生蛋白鏈菌素包被的固體基質(zhì)例如抗生蛋白鏈菌素-包被的多孔板。在一些實(shí)施方案中，樣品、抗體和固定化的kyna同時(shí)接觸或添加在一起。在一些情況下，樣品和抗-kyna抗體一起孵育一段預(yù)選時(shí)間，然后和固定化的kyna或生物素化的kyna一起孵育。在其他情況下，將固定化的或生物素化的kyna與抗-kyna抗體一起孵育一段預(yù)選時(shí)間，然后與樣品一起孵育。還在其他情況下，樣品、抗-kyna抗體和固定化的kyna以任何順序依次接觸在一起。可通過測(cè)量結(jié)合至固定化的kyna的抗-kyna抗體水平，并計(jì)算樣品中相應(yīng)的kyna水平，測(cè)定樣品中的kyna水平。在一些實(shí)施方案中，可以直接測(cè)量與固定化kyna復(fù)合的抗-kyna抗體水平，且間接定量樣品中的kyna水平。在一些情況下，與結(jié)合至固定化kyna的抗-kyna抗體水平相比，樣品中存在反比例的kyna。

在一些實(shí)施方案中，樣品是全血樣品、血漿樣品或血清樣品?？梢詮氖茉囌呃缛耸茉囌叻蛛x或獲得所述樣品。在一些情況下，已診斷受試者患ibs。在其他情況下，受試者未被診斷患ibs。在一些情況下，受試者疑似患ibs。在其他情況下，受試者正在經(jīng)受或者顯示ibs的一種或多種癥狀。在一些實(shí)施方案中，用于測(cè)定方法的樣品是稀釋的樣品。樣品可以是未處理的樣品。在一些情況下，用于本方法的樣品體積是少于大約100μl，例如大約99μl、90μl、85μl、80μl、75μl、70μl、65μl、60μl、55μl、50μl、45μl、40μl、35μl、30μl、25μl、20μl、15μl、10μl、5μl或更少。樣品體積可以是少于大約50μl，例如大約50μl、45μl、40μl、35μl、30μl、25μl、20μl、15μl、10μl、5μl或更少。

在一些實(shí)施方案中，測(cè)定方法需要少于24小時(shí)來完成，例如需要23hrs、22hrs、21hrs、20hrs、19hrs、18hrs、17hrs、16hrs、15hrs、14hrs、13hrs、12hrs、11hrs、10hrs、9hrs、8hrs、7hrs、6hrs、5hrs、4hrs、3hrs、2hrs、1hr、30分鐘或更少時(shí)間完成。

在一些方面，利用免疫測(cè)定，完成結(jié)合的抗-代謝產(chǎn)物抗體水平或代謝產(chǎn)物水平的測(cè)量步驟。免疫測(cè)定提供檢測(cè)生物液體中代謝產(chǎn)物的可靠的且靈活的方法。本發(fā)明提供高特異性和靈敏度的可信的免疫測(cè)定，其用于檢測(cè)和定量一種或多種色氨酸、血清素、犬尿氨酸代謝產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，免疫測(cè)定是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)例如競(jìng)爭(zhēng)性elisa或接近免疫測(cè)定例如ceer^tm。

在一些實(shí)施方案中，文中所述的抗體可綴合至任何可檢測(cè)標(biāo)記或部分，該標(biāo)記或部分可用于測(cè)量形成的抗原-抗體復(fù)合物。在一些情況下，抗體直接綴合至可讀信號(hào)例如生色團(tuán)、膠體金、有色乳膠、熒光團(tuán)等。在其他情況下，抗體綴合至酶、肽或其他生物分子。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供其中實(shí)施抗體-抗原反應(yīng)的測(cè)定方法。在一個(gè)elisa實(shí)施方案中，從受試者獲得的樣品中存在的抗原或代謝產(chǎn)物如5-hiaa、褪黑激素或kyna允許與對(duì)待測(cè)試代謝產(chǎn)物特異性的酶標(biāo)記的例如過氧化物酶標(biāo)記的抗體反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物。隨后如此形成的抗原-抗體復(fù)合物允許與檢測(cè)底物反應(yīng)，從而測(cè)量酶例如過氧化物酶或磷酸酶的活性。在一些實(shí)施方案中，代謝產(chǎn)物特異性抗體不是酶標(biāo)記的，而使用識(shí)別代謝產(chǎn)物特異性抗體的酶標(biāo)記的第二抗體?？蓪z測(cè)底物用于與第二抗體的酶標(biāo)記反應(yīng)，以便測(cè)量酶的活性。酶標(biāo)記抗體可以是堿性磷酸酶-、β-半乳糖苷酶-或hrp-標(biāo)記的抗體。

可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的任何檢測(cè)底物。例如，對(duì)于化學(xué)發(fā)光法，底物可以是魯米諾、elisapico化學(xué)發(fā)光底物(thermofisher)和dynalight^tm化學(xué)發(fā)光底物(thermofisher)。對(duì)于比色反應(yīng)，可以使用底物例如4-氯-1-萘酚、p-硝基苯基磷酸酯(pnpp)、opd、onpg或tmb。對(duì)于熒光反應(yīng)，可以使用底物例如4-甲基umbelliferyl磷酸酯二鈉鹽(mup)、quantablu^tm熒光底物(thermofisher)和red試劑(thermofisher)。因此，利用例如分光計(jì)或其他檢測(cè)設(shè)備，可以測(cè)量代謝產(chǎn)物的存在、濃度和或水平。

在另一elisa實(shí)施方案中，可將代謝產(chǎn)物或其衍生物固定。本發(fā)明的抗體可以用來與固定化的代謝產(chǎn)物結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。含有代謝產(chǎn)物的樣品可以用于就抗體-抗原結(jié)合而言競(jìng)爭(zhēng)。此后，綴合物可以由具有酶標(biāo)記的另一種抗體(第二抗體)檢測(cè)。酶標(biāo)記隨后與檢測(cè)試劑或底物反應(yīng)然后被監(jiān)測(cè)。在其他情況下，本發(fā)明的抗體綴合至可檢測(cè)部分或標(biāo)記，并可以在不利用第二抗體的條件下，反應(yīng)和/或被檢測(cè)。

檢測(cè)本文所述的任何代謝產(chǎn)物的測(cè)定方法可以包括本領(lǐng)域已知的任何免疫測(cè)定法。在一些方面，測(cè)定在液相中進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，測(cè)定在固相或固體支持物上進(jìn)行，例如，在珠或微量平板(例如96孔微量滴定板)上進(jìn)行?？捎糜谶@些方法中的免疫測(cè)定的非限制性例子是放射免疫測(cè)定、微陣列測(cè)定、熒光偏振免疫測(cè)定、包含fret的免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)或ceer^tm。

本領(lǐng)域中已知的可用于半抗原檢測(cè)的任何elisa可以用于即時(shí)測(cè)定。半抗原的elisa通常利用競(jìng)爭(zhēng)性樣式，即，其中樣品中的半抗原(代謝產(chǎn)物)與經(jīng)標(biāo)記的半抗原(例如，生物素-半抗原或酶-半抗原綴合物)競(jìng)爭(zhēng)抗-半抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)，從而當(dāng)樣品中存在更多半抗原時(shí)，更少的經(jīng)標(biāo)記的半抗原結(jié)合。因此，在這些競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定法中，樣品中增加量的半抗原導(dǎo)致更少的酶與固相結(jié)合，并且因此導(dǎo)致更少的可檢測(cè)信號(hào)。在這類競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，樣品可以與經(jīng)標(biāo)記的半抗原一起添加以直接競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)，或樣品和經(jīng)標(biāo)記的半抗原可以依次添加，從而僅經(jīng)標(biāo)記的半抗原簡(jiǎn)單結(jié)合而樣品半抗原不結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，elisa是直接競(jìng)爭(zhēng)性elisa或間接競(jìng)爭(zhēng)性elisa。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中產(chǎn)生的抗體直接或間接地與固相結(jié)合，間接結(jié)合是其中固相用抗-抗體(例如與兔igg抗體結(jié)合的山羊抗體(山羊抗兔igg)包被并且抗體與抗-抗體結(jié)合?？?抗體也稱作“第二抗體”。在這些測(cè)定中，將樣品和經(jīng)標(biāo)記的半抗原添加至固相以競(jìng)爭(zhēng)經(jīng)包被的固相上的抗體結(jié)合位點(diǎn)。在洗滌后，生成信號(hào)，其測(cè)量與固相結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的半抗原的量。

文中提供了完成上文所述測(cè)定方法的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含特異性地與5-hiaa結(jié)合的抗體，例如抗-5hiaa單克隆抗體或多克隆抗體和任選生物素化的5-hiaa衍生物?？?-hiaa單克隆抗體可以由雜交瘤克隆產(chǎn)生，所述雜交瘤克隆具有2015年11月17日保藏的atcc登錄號(hào)_并指定為1204-10g6f11h3。

在其他實(shí)施方案中，試劑盒包含特異性地與褪黑激素結(jié)合的抗體，例如抗-褪黑激素單克隆抗體或多克隆抗體和任選生物素化的褪黑激素。單克隆抗體可以由雜交瘤克隆產(chǎn)生，所述雜交瘤克隆具有2015年11月17日保藏的atcc登錄號(hào)_并指定為1212-6c1e2f7。

還在其他實(shí)施方案中，試劑盒包含特異性地與犬尿烯酸結(jié)合的抗體，例如抗-犬尿烯酸單克隆抗體或多克隆抗體和任選生物素化的犬尿烯酸。單克隆抗體可以由雜交瘤克隆產(chǎn)生，所述雜交瘤克隆具有2015年11月17日保藏的atcc登錄號(hào)_并指定為1194-6h5b11a7。

在一些情況下，試劑盒還包括完成文中所討論測(cè)定方法的操作說明書。試劑盒可包括標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照代謝產(chǎn)物例如5-hiaa標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照、褪黑激素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照或犬尿烯酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照代謝產(chǎn)物包含預(yù)選或已知濃度的關(guān)注的代謝產(chǎn)物。

e.多克隆抗體

文中提供的多克隆抗體可以是任何同種型例如主要抗體同種型iga、igd、ige、igg和igm中的一種。在一些實(shí)施方案中，抗體可以分類為igg1、igg2、igg3、igg4、iga1或iga2抗體。在一些情況下，抗體具有κ輕鏈或λ輕鏈。

優(yōu)選地在動(dòng)物中通過多次皮下(sc)或腹內(nèi)(ip)注射本發(fā)明的抗原和佐劑，產(chǎn)生多克隆抗體。使用雙官能或衍生化劑，使關(guān)注的抗原與載體蛋白綴合可能是有用的，所述載體蛋白在待免疫的物種中是免疫原性的。雙官能或衍生化劑的非限制性例子包括馬來酰亞氨基苯甲?；腔牾啺孵?經(jīng)半胱氨酸殘基綴合)、n-羥琥珀酰亞胺(經(jīng)賴氨酸殘基綴合)、戊二醛、琥珀酐、socl2和r¹n＝c＝nr，其中r和r¹是不同的烷基。

通過以下方式將動(dòng)物針對(duì)本發(fā)明的抗原或其免疫原性綴合物或衍生物免疫：將例如100μg(對(duì)于兔)或5μg(對(duì)于小鼠)的抗原或綴合物與3體積的弗氏完全佐劑組合并且在多個(gè)部位皮內(nèi)注射該溶液。一個(gè)月后，通過在多個(gè)部位用弗氏不完全佐劑中的約1/5至1/10的原始量的綴合物通過皮下注射，強(qiáng)化免疫該動(dòng)物。7至14日后，將動(dòng)物放血并且對(duì)血清測(cè)定抗體滴度。通常將動(dòng)物強(qiáng)化免疫直至滴度平臺(tái)期。優(yōu)選地，將動(dòng)物用相同抗原的綴合物強(qiáng)化免疫，但是可以使用與不同免疫原性抗原的綴合和/或通過不同交聯(lián)試劑的綴合。在某些情況下，聚集劑如明礬可以用來增強(qiáng)免疫反應(yīng)。產(chǎn)生多克隆抗體的方法的詳細(xì)描述可見于antibody,alaboratorymanual，harlow和lane編，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.(1988)。

f.單克隆抗體

文中提供的單克隆抗體可以是任何同種型例如主要抗體同種型iga、igd、ige、igg和igm中的一種。在一些實(shí)施方案中，抗體可以分類為igg1、igg2、igg3、igg4、iga1或iga2抗體。在一些情況下，抗體具有κ輕鏈或λ輕鏈。在一些實(shí)施方案中，抗5-hiaa單克隆抗體或具有2015年11月17日保藏的atcc登錄號(hào)_并指定為1204-10g6f11h3的雜交瘤克隆產(chǎn)生的單克隆抗體是igg1κ抗體。在其他實(shí)施方案中，抗褪黑激素單克隆抗體或具有2015年11月17日保藏的atcc登錄號(hào)_并指定為1212-6c1e2f7的雜交瘤克隆產(chǎn)生的單克隆抗體是igg3κ抗體。還在其他實(shí)施方案中，抗kyna單克隆抗體或具有2015年11月12日保藏的atcc登錄號(hào)_并指定為1194-6h5b11a7的雜交瘤克隆產(chǎn)生的單克隆抗體是igg1κ抗體。

單克隆抗體通常從基本上均質(zhì)的抗體群體中獲得，即，該群體含有的個(gè)體抗體是相同的，除了可能以微小量出現(xiàn)的可能天然存在的突變之外。因此，修飾語“單克隆”表明該抗體的特征為不是獨(dú)立(discrete)抗體的混合物。例如，單克隆抗體可以使用由kohler等人，nature,256:495(1975)描述的雜交瘤方法產(chǎn)生，或可以通過本領(lǐng)域已知的任何重組dna方法產(chǎn)生(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)4,816,567)。

在雜交瘤方法中，使小鼠或其他適宜的宿主動(dòng)物(例如倉(cāng)鼠)如上所述那樣免疫，以激發(fā)出產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體與用于免疫的關(guān)注多肽特異性結(jié)合?？蛇x地，在體外免疫淋巴細(xì)胞。隨后使用合適的融合劑(fusingagent)如聚乙二醇，使經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞(見，例如，goding，monoclonalantibodies:principlesandpractice,第59-103頁(yè)(1986))。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞鋪種并且在合適的培養(yǎng)基中培育，所述培養(yǎng)基優(yōu)選地含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺少酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hgprt)，則用于雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基通常將包含防止hgprt缺陷型細(xì)胞生長(zhǎng)的次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(hat培養(yǎng)基)。

優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是這些細(xì)胞，它們高效融合、支持由所選擇的抗體產(chǎn)生細(xì)胞穩(wěn)定高水平地產(chǎn)生抗體，和/或?qū)ε囵B(yǎng)基(如hat培養(yǎng)基)敏感。用于產(chǎn)生人單克隆抗體的這類優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系的例子包括，但不限于，鼠骨髓瘤系，如來自mopc-21和mpc-11小鼠腫瘤的那些(從salkinstitutecelldistributioncenter；sandiego,ca可獲得)、sp-2或x63-ag8-653細(xì)胞(從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；rockville，md可獲得)，和人骨髓瘤或小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系(參見，例如，kozbor,j.immunol.,133:3001(1984)；和brodeur等人,monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,marceldekker,inc.,newyork,第51-63頁(yè)(1987))。

可以測(cè)定其中雜交瘤細(xì)胞正在生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的針對(duì)關(guān)注多肽的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選地，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測(cè)定如放射免疫測(cè)定(ria)或酶-聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)確定由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性?？梢允褂美鏼unson等人,anal.biochem.,107:220(1980)的斯卡查德(scatchard)分析確定單克隆抗體的結(jié)合親和力。

在鑒定到產(chǎn)生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，所述克隆可以通過有限稀釋法亞克隆并且通過標(biāo)準(zhǔn)方法培育(參見，例如，goding,brodeur等人,monoclonalantibodies:principlesandpractice,academicpress,第59-103頁(yè)(1986))。用于此目的的合適培養(yǎng)基包括例如d-mem或rpmi-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可以作為腹水腫瘤在動(dòng)物中體內(nèi)培育?？梢酝ㄟ^常規(guī)的抗體純化方法，例如，蛋白a-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳法、透析或親和層析法，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水液或血清分開。

使用常規(guī)方法(例如，通過使用能夠與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)，可以輕易地分離出編碼所述單克隆抗體的dna并測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞充當(dāng)此dna的優(yōu)選來源。一旦分離，則可以將dna置入表達(dá)載體中，隨后將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至否則不產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞、猴(simian)cos細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中，以誘導(dǎo)單克隆抗體在重組宿主細(xì)胞中的合成。參見，例如，skerra等人,curr.opin.immunol.,5:256-262(1993)；和pluckthun,immunolrev.,130:151-188(1992)。也可以例如通過以下方式修飾這種dna：將人重鏈恒定結(jié)域和輕鏈恒定結(jié)域的編碼序列替換同源性鼠序列(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)4,816,567；和morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851(1984))或?qū)⒎敲庖咔虻鞍锥嚯牡木幋a序列的全部或部分與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)接合。

在又一個(gè)實(shí)施方案，單克隆抗體或其抗體片段可以從抗體噬菌體文庫(kù)分離，使用例如mccafferty等人,nature,348:552-554(1990)；clackson等人,nature,352:624-628(1991)；和marks等人.,j.mol.biol.,222:581-597(1991)中描述的技術(shù)。在marks等人,biotechnology,10:779-783(1992)中描述了通過鏈改組產(chǎn)生高親和力(nm范圍)人單克隆抗體。在waterhouse等人,nuc.acidsres.,21:2265-2266(1993)中描述了組合型感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)的策略的應(yīng)用。因而，這些技術(shù)是用于產(chǎn)生單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤方法的有效備選。

g.抗體片段

已經(jīng)開發(fā)了用于產(chǎn)生抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段通過蛋白酶解消化完整抗體來衍生(參見，例如，morimoto等人,j.biochem.biophys.meth.,24:107-117(1992)；和brennan等人,science,229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可以使用重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生這些片段。例如，抗體片段可以從上文討論的抗體噬菌體文庫(kù)分離。備選地，fab'-sh片段可以從大腸桿菌細(xì)胞直接回收并且化學(xué)地偶聯(lián)以形成f(ab')2片段(參見，例如carter等人,biotechnology,10:163-167(1992))。根據(jù)另一種方法，f(ab')2片段可以從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物直接分離。用于產(chǎn)生抗體片段的其他技術(shù)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。在其他實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈fv片段(scfv)。參見，例如，pct公開號(hào)wo93/16185；和美國(guó)專利號(hào)5,571,894和5,587,458?？贵w片段也可以是線性抗體，如美國(guó)專利號(hào)5,641,870中所描述。此類線型抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。

h.雙特異性抗體

雙特異性抗體是對(duì)至少兩個(gè)不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。示例性雙特異性抗體可以與相同的關(guān)注多肽的兩個(gè)不同表位結(jié)合。其他雙特異性抗體可以將關(guān)注多肽的結(jié)合位點(diǎn)與一種或多種另外抗原的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)組合。可以將雙特異性抗體制備為全長(zhǎng)抗體或其抗體片段(例如，f(ab')2雙特異性抗體)。

用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)基于共表達(dá)兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)，其中兩個(gè)鏈具有不同特異性(見，例如，millstein等人,nature,305:537-539(1983))。因?yàn)槊庖咔虻鞍字劓満洼p鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四合瘤(quadroma))產(chǎn)生10種不同抗體分子的可能混合物，其中僅一種分子具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析進(jìn)行正確分子的純化。pct公開號(hào)wo93/0882和traunecker等人,emboj.,10:3655-3659(1991)中公開了相似的方法。

根據(jù)不同方法，具有所需結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))與免疫球蛋白恒定域序列融合。融合物優(yōu)選地具有免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)域，包括鉸鏈區(qū)、ch2區(qū)和ch3區(qū)的至少部分。優(yōu)選的是使得第一重鏈恒定區(qū)(ch1)含有對(duì)于所述融合物至少之一中存在輕鏈結(jié)合必需的位點(diǎn)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，如果所需，免疫球蛋白輕鏈的dna插入單獨(dú)的表達(dá)載體中并且共轉(zhuǎn)染至合適的宿主生物中。在構(gòu)建中所用的比率不等的3條多肽鏈提供最佳產(chǎn)率時(shí)的實(shí)施方案中，這在調(diào)節(jié)3條多肽片段的相互比例方面提供大的靈活性。然而，當(dāng)至少兩條多肽鏈以等比率的表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)率時(shí)或當(dāng)該比率沒有特定意義時(shí)，能夠?qū)?條或全部3條多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體中。

在這種方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由在一條臂中具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和在另一條臂中的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)組成。這種非對(duì)稱結(jié)構(gòu)有利于所需的雙特異性化合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分離，因?yàn)槊庖咔虻鞍纵p鏈在雙特異性分子的僅一半中的存在提供了便利的分離方式。參見，例如，pct公開號(hào)wo94/04690和suresh等人,meth.enzymol.,121:210(1986)。

根據(jù)美國(guó)專利號(hào)5,731,168中描述的另一個(gè)方法，可以將一對(duì)抗體分子之間的界面工程化以最大化從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分?jǐn)?shù)。優(yōu)選的界面包含抗體恒定域的ch3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在這種方法中，來自第一抗體分子的界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈由較大側(cè)鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側(cè)鏈替換為較小側(cè)鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與一條或多條大側(cè)鏈具有相同或相似尺寸的互補(bǔ)性“空穴”。這提供了相對(duì)于其他不想要的終產(chǎn)物(如同型二聚體)而言增加異二聚體產(chǎn)率的機(jī)制。

雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“雜綴合物”抗體。例如，雜綴合物中的抗體之一可以偶聯(lián)至抗生物素蛋白，另一種偶聯(lián)至生物素?？梢允褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法產(chǎn)生雜綴合物抗體。合適的交聯(lián)劑和技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且在例如，美國(guó)專利號(hào)4,676,980中公開。

用于從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的合適技術(shù)也是本領(lǐng)域已知的。例如，可以利用化學(xué)連接制備雙特異性抗體。在某些情況下，雙特異性抗體可以通過其中完整抗體被蛋白酶解以產(chǎn)生f(ab')2片段的方法產(chǎn)生(參見，例如，brennan等人,science,229:81(1985))。這些片段在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉存在下還原以穩(wěn)定鄰位二硫醇并防止分子間二硫化物形成。產(chǎn)生的fab'片段隨后轉(zhuǎn)化成硫代硝基苯甲酸酯(tnb)衍生物。隨后將fab'-tnb衍生物之一通過用巰基乙胺還原再轉(zhuǎn)化成fab'-硫醇并且與等摩爾量的其他fab'-tnb衍生物混合以形成雙特異性抗體。

在一些實(shí)施方案中，fab'-sh片段可以從大腸桿菌直接回收并且化學(xué)地偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。例如，完全人源化的雙特異性抗體f(ab')2分子可以通過shalaby等人,j.exp.med.,175:217-225(1992)中所述的方法產(chǎn)生。每種fab'片段單獨(dú)從大腸桿菌分泌并經(jīng)歷體外定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。

也已經(jīng)描述了用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接產(chǎn)生并分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已經(jīng)使用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生雙特異性抗體。參見，例如，kostelny等人,j.immunol.,148:1547-1553(1992)。來自fos和jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩個(gè)不同抗體的fab'部分連接?？贵w同型二聚體在鉸鏈區(qū)經(jīng)還原以形成單體和隨后再氧化以形成抗體異二聚體。也可以將這種方法用于抗體同型二聚體的產(chǎn)生。hollinger等人,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)描述的“雙抗體(diabody)”技術(shù)已經(jīng)為產(chǎn)生雙特異性抗體片段提供替代性機(jī)制。所述片段包含通過連接體與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)，其中所述連接體太短，以至于不允許相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)。因而，迫使一個(gè)片段的vh和vl結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)片段的互補(bǔ)性vl和vh結(jié)構(gòu)域配對(duì)，因而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。在gruber等人,j.immunol.,152:5368(1994)中描述了通過使用單鏈fv(sfv)二聚體產(chǎn)生雙特異性抗體片段的另一種策略。

i.抗體純化

通過技術(shù)人員已知的方法可以純化的抗體。純化方法尤其包括選擇性沉淀、液相色譜、hplc、凝膠電泳、色譜聚集、凝膠電泳、透析和各種親和技術(shù)。選擇性沉淀可以利用硫酸銨、乙醇(cohn沉淀)、聚乙二醇或本領(lǐng)域可用的其他物質(zhì)。液相色譜基質(zhì)尤其包括離子交換基質(zhì)deae、聚天冬氨酸)、羥基磷灰石、分子排阻基質(zhì)(例如基于交聯(lián)瓊脂糖、丙烯酰胺、葡聚糖等的那些)、疏水基質(zhì)(例如藍(lán)色瓊脂糖)。親和技術(shù)通常取決于與免疫球蛋白fc域相互作用的蛋白質(zhì)。來自金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureas)的蛋白a可以用來純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(lindmark等人,j.immunol.meth.,62:1-13(1983))。來自c和g鏈球菌的蛋白g可用于全部小鼠同種型和人γ3(guss等人,emboj.,5:1567-1575(1986))。通過k輕鏈相互作用結(jié)合免疫球蛋白(ig)的大消化鏈球菌(peptostreptococcusmagnus)細(xì)胞壁蛋白質(zhì)蛋白(bdbioscience/clontech.paloalto，ca.)可用于ig亞型igm、iga、igd、igg、ige和igy的親和純化。所述蛋白質(zhì)的重組形式還是市售的。如果抗體含有金屬結(jié)合殘基例如構(gòu)建的含有組氨酸標(biāo)簽(tag)的噬菌體顯示抗體，可以使用金屬親和色譜。

當(dāng)充足的量的特異性細(xì)胞群是可用的時(shí)，可以用細(xì)胞制備抗原親和基質(zhì)，以提供用于純化的抗體的親和方法。親和性配體與之連接的基質(zhì)最經(jīng)常是瓊脂糖，但是其他基質(zhì)是可用的。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)如控制孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯)苯允許比用瓊脂糖可以實(shí)現(xiàn)的更快的流速和更短的處理時(shí)間。在抗體包含ch3結(jié)構(gòu)域的情況下，bakerbondabx^tm樹脂(j.t.baker；phillipsburg,n.j.)可用于純化。取決于待回收的抗體，可用于蛋白純化的其他技術(shù)如在離子交換柱上分級(jí)、乙醇沉淀、反相hplc、在二氧化硅上層析、在肝素sepharose^tm上層析、在陰離子或陽(yáng)離子交換樹脂(如聚天冬氨酸柱)上層析、層析聚焦，sds-page和硫酸銨沉淀也是可用的。

當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，抗體可以在分離的宿主細(xì)胞內(nèi)部、在宿主細(xì)胞的周質(zhì)空間中產(chǎn)生或從宿主細(xì)胞直接分泌至培養(yǎng)基中。如果抗體在胞內(nèi)產(chǎn)生，首先移除顆粒狀碎片，例如，通過離心或超濾。carter等人,biotech.,10:163-167(1992)描述了用于分離分泌至大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的方法。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞糊狀物在乙酸鈉(ph3.5)、edta和苯甲基磺酰氟(pmsf)存在下融化約30分鐘。通過離心移除細(xì)胞碎片。在抗體分泌入培養(yǎng)基的情況下，通常使用市售的蛋白濃縮濾器，例如，amicon或milliporepellicon超濾單元，濃縮來自這類表達(dá)系統(tǒng)的上清液。可以在前述任意步驟中包含蛋白酶抑制劑如pmsf以抑制蛋白水解，并且可以包含抗生素以防止外來污染物增長(zhǎng)。

在任何一個(gè)或多個(gè)初步純化步驟后，包含關(guān)注抗體和雜質(zhì)的混合物可以經(jīng)歷低ph疏水相互作用層析，使用ph在約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選地以低鹽濃度(例如，從約0-0.25m鹽)進(jìn)行。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在本發(fā)明的方法和組合物中也可以使用與抗體具有相似功能的任何結(jié)合分子，例如，對(duì)樣品中一種或多種關(guān)注分析物特異的結(jié)合分子或結(jié)合配偶物。合適的抗體樣分子的例子包括但不限于結(jié)構(gòu)域抗體、單抗體(unibody)、納米體、鯊魚抗原反應(yīng)性蛋白、avimer、adnectin、anticalm、親和性配體、phylomer、適配體、親和體、trinectin等。

j.評(píng)價(jià)分離的抗體反應(yīng)性的方法

數(shù)種方法可實(shí)現(xiàn)抗體的產(chǎn)生和選擇性。例如，向小鼠或兔子或其他哺乳動(dòng)物，注射對(duì)應(yīng)于關(guān)注的代謝產(chǎn)物的合成和純化的抗原，以產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解許多方法可用于抗體的產(chǎn)生，例如，antibodies,alaboratorymanual,harlow和lane編著,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,n.y.(1988)中所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將也理解，也可以通過多種方法從遺傳信息制備模擬抗體(例如，保留其功能性結(jié)合區(qū))的結(jié)合片段或fab片段。參見，例如，antibodyengineering:apracticalapproach,borrebaeck編著,oxforduniversitypress,oxford(1995)；和huse等人,j.immunol.,149:3914-3920(1992)。

隨后可以通過以下方式選擇通過這些方法產(chǎn)生的抗體：首先用純化的關(guān)注抗原(如本文所述的生物素化的半抗原)就親和力和特異性篩選并且，如果需要，將結(jié)果與抗體和需要從結(jié)合作用中排除的其他抗原的親和力和特異性比較。篩選方法可以包括在微量滴定平板的獨(dú)立孔中固定純化的抗原。平板可以具有固定在其上的抗生蛋白鏈菌素并且隨后將含有潛在抗體或抗體群組的溶液置于各個(gè)微量滴定孔中并且孵育約30分鐘至2小時(shí)。隨后洗滌微量滴定孔并且將經(jīng)標(biāo)記的第二抗體(例如，與堿性磷酸酶綴合的抗小鼠抗體，如果生成的抗體是小鼠抗體)添加至孔并且孵育約30分鐘并且隨后洗滌。將底物添加至孔并且其中針對(duì)固定化的抗原(如生物素化的抗原)的抗體存在時(shí)，顏色反應(yīng)將出現(xiàn)。

隨后可以對(duì)如此鑒定的抗體進(jìn)一步分析親和力和特異性。在開發(fā)針對(duì)靶代謝產(chǎn)物的免疫測(cè)定時(shí)，純化的靶代謝產(chǎn)物充當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物，以其判斷使用已經(jīng)選出的抗體的免疫測(cè)定的靈敏度和特異性。因?yàn)楦鞣N抗體的結(jié)合親和力可能不同，例如某些抗體組合可能在空間上彼此干擾，抗體的測(cè)定性能可能是比該抗體的絕對(duì)親和力和特異性更重要的量度。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以采用許多方案產(chǎn)生抗體或結(jié)合性片段并且就關(guān)注的代謝產(chǎn)物的親和力及特異性篩選和選擇，但是這些方案不改變本發(fā)明的范圍。

iii.使用方法

本發(fā)明還提供使用本文中的代謝產(chǎn)物的存在或濃度(量或水平)確定受試者中腸易激綜合征(ibs)的診斷的方法。該方法包括通過本文所述的測(cè)定方法測(cè)量患者的血液、血漿或血清中的一種或多種代謝產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供確定患者是否對(duì)例如ibs的治療響應(yīng)的方法。該方法包括通過本文所述的測(cè)定方法測(cè)量患者的血液、血漿或血清中的一種或多種代謝產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，基于治療施用之前或之后，ibs患者的生物樣品中5-hiaa、褪黑激素和/或犬尿烯酸水平預(yù)測(cè)治療的效力。本方法可用于測(cè)定ibs患者是否對(duì)治療已經(jīng)具有臨床響應(yīng)。

在某些其他方面，本發(fā)明提供評(píng)價(jià)先前診斷患有ibs的患者或者預(yù)后ibs患者的方法。該方法包括通過本文所述的測(cè)定方法測(cè)量患者的血液、血漿或血清中的一種或多種代謝產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，方法包括在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量ibs患者的生物樣品中5-hiaa、褪黑激素和/或犬尿烯酸的水平，在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量患者的第二個(gè)生物樣品中5-hiaa、褪黑激素和/或犬尿烯酸的水平，并計(jì)算兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)水平之間的變化或差異。該方法還可以包括利用統(tǒng)計(jì)學(xué)算法，以預(yù)測(cè)與先前(例如，ibs的初次診斷)相比，患者患更不嚴(yán)重或更嚴(yán)重ibs的可能性。在一些情況下，統(tǒng)計(jì)學(xué)算法可用于預(yù)測(cè)患者的ibs亞型。

提供以下實(shí)施例旨在說明，但不限制要求保護(hù)的本發(fā)明。

途徑代謝產(chǎn)物的間接競(jìng)爭(zhēng)性elisa測(cè)定

這個(gè)實(shí)施例描述了與本文提供的代謝產(chǎn)物如色氨酸、血清素和犬尿氨酸途徑中的代謝產(chǎn)物(圖1)特異性結(jié)合的分離的抗體的應(yīng)用。這個(gè)實(shí)施例還顯示這些抗體可以用于競(jìng)爭(zhēng)性elisa測(cè)定中，以精確和有效地檢測(cè)、測(cè)量和定量樣品(例如，患者血清)中的特異性代謝產(chǎn)物(圖2)?？贵w顯示無交叉反應(yīng)性(或者基本無交叉反應(yīng)性)檢測(cè)。競(jìng)爭(zhēng)性elisa提供代謝產(chǎn)物濃度的準(zhǔn)確、定量的測(cè)量。

競(jìng)爭(zhēng)性elisa是針對(duì)充當(dāng)免疫原性綴合物(例如，抗原)的合成產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物類似物(半抗原)產(chǎn)生的新抗體。專門設(shè)計(jì)類似物具有投射小分子并且激發(fā)對(duì)半抗原特異的免疫反應(yīng)的連接體。

生物素化的半抗原

對(duì)于各途徑代謝產(chǎn)物或其衍生物，產(chǎn)生生物素化的半抗原。代替用連接臂綴合至載體蛋白，連接體被綴合至生物素。例如，化學(xué)合成5-hiaa的生物素化苯并唑衍生物，以含有在衍生物苯基末端的連接臂和在連接體另一端的生物素。

競(jìng)爭(zhēng)性elisa

圖2提供了用來檢測(cè)患者血清中途徑代謝產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性elisa的示例性實(shí)施方案。通過用生物素化的關(guān)注半抗原(例如，生物素化的5-hiaa、褪黑激素或犬尿烯酸)包被抗生蛋白鏈菌素平板，產(chǎn)生測(cè)定平板?；颊哐寤蜓逑♂屢号c針對(duì)關(guān)注的代謝產(chǎn)物(半抗原)的抗體(例如，抗-5-hiaa抗體)混合，并且隨后轉(zhuǎn)移至該平板。將平板在室溫孵育1小時(shí)。選擇孵育條件，以為抗體結(jié)合至生物素化的半抗原或至血清中的代謝產(chǎn)物提供足夠的時(shí)間。將平板用洗滌緩沖液例如pbs緩沖液洗滌幾次。添加第二抗體例如山羊抗-兔抗體-hrp綴合物或者山羊抗-鼠抗體-hrp綴合物，并平板在室溫孵育1小時(shí)。將平板用洗滌緩沖液洗滌幾次。添加底物溶液用于檢測(cè)反應(yīng)，例如顏色反應(yīng)、熒光反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)或發(fā)光反應(yīng)。添加終止溶液以停止底物反應(yīng)。隨后，在分光光度計(jì)中適當(dāng)波長(zhǎng)處，讀取平板，監(jiān)測(cè)檢測(cè)反應(yīng)?；诮Y(jié)合至生物素化的半抗原的抗體的測(cè)量濃度，可以計(jì)算關(guān)注的代謝產(chǎn)物的濃度。在所述類型的測(cè)定中，樣品中代謝產(chǎn)物量和結(jié)合抗體的測(cè)量水平之間存在反相關(guān)。

特異性地與5-羥基吲哚乙酸(5-hiaa)結(jié)合的抗體的產(chǎn)生

本實(shí)施例描述特異性地與穩(wěn)定的5-羥基吲哚乙酸(5-hiaa)苯并唑衍生物結(jié)合的抗體的產(chǎn)生。該衍生物包括peg連接體和載體蛋白例如bsa。本實(shí)施例還顯示所述抗體可用于免疫測(cè)定，例如競(jìng)爭(zhēng)性elisa中，以檢測(cè)樣品例如患者血清中的代謝產(chǎn)物。

a.合成含有peg連接體和載體蛋白或生物素的穩(wěn)定的5-hiaa苯并唑衍生物

下面的流程圖解釋說明唑-吲哚中間體1、唑-吲哚中間體2、唑-吲哚中間體3、a-5、a-8、唑并-吲哚-peg-ss-酸、唑-吲哚-peg-生物素-酯和唑-吲哚-peg-生物素-酸的合成。

步驟1-唑并-吲哚中間體1：將5-羥基-1h-吲哚-3-基)-乙酸(2.0g，10.46mmol)溶解于無水甲醇(21ml)中，加入無水甲苯(42ml)，以得到溶液。在攪拌下，于室溫滴加2mtms-重氮甲烷己烷溶液(5.2ml，10.46mmol)，以釋放氣體。歷經(jīng)兩個(gè)小時(shí)的一段時(shí)間，在室溫加入另外兩份2mtms-重氮甲烷己烷溶液(2.6ml，5.23mmol)。將溶劑濃縮至10ml體積，加入甲苯(20ml)，將溶劑濃縮，以得到油狀物，將其經(jīng)利用己烷/乙酸乙酯的sio2快速色譜純化，得到作為油狀物的中間體1(2.15g，95％)。步驟1如下文所示。

步驟2-唑并-吲哚中間體2：將唑并-吲哚中間體1(1000mg，4.87mmol)溶解于無水二甲氧基乙烷(dme)(92ml)中，得到溶液，將其冷卻至5℃。加入(4-氨基甲基-芐基)-氨基甲酸叔丁酯(1.267g，5.36mmol)，然后加入mno2(4.24g，48.7mmol)，以得到黑色混懸液，將其升溫至室溫，并攪拌16小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至5℃，并加入另外的mno2(461mg，1.95mmol)。將反應(yīng)混合物升溫至室溫，攪拌5小時(shí)，然后經(jīng)硅藻土墊過濾(1cm)。將黑色的濾液濃縮，經(jīng)利用己烷/乙酸乙酯的sio2快速色譜純化，得到作為淺黃色固體物的中間體2(442mg，21％)。步驟2如下所示，其中r1-r10＝x、h、烷基、酸基團(tuán)、芳基酯、烷基酯或磺酸酯，以及所述基團(tuán)的任何組合。

步驟3-唑并-吲哚中間體3：將唑并-吲哚中間體2(442mg，1.02mmol)懸浮于dcm(4.0ml)中，在室溫滴加茴香硫醚(0.404ml，3.44mmol)，然后滴加tfa(1.9ml，24.6mmol)，以得到溶液。1.5小時(shí)后，將反應(yīng)混合物用甲苯(20ml)稀釋，得到油狀物，將溶劑濃縮，得到綠色混懸液，將其與甲苯(20ml)共-蒸發(fā)至10ml體積，得到混懸液。將固體物濾出，用甲苯洗滌5次，用己烷洗滌5次，得到綠色固體物，將其在真空干燥箱(0.1mmhg)中干燥，得到不吸潮的綠色固體物(557mg，50wt％假定的純度)。步驟3如下所示。

步驟4-唑并-吲哚-peg-ss-酸：通過溫和加熱，將唑并-吲哚-peg-ss-酯(68mg，0.0439mmol)溶解于二氧雜環(huán)己烷(1.4ml)中，得到溶液，將其冷卻至rt。在攪拌下，于rt滴加1.0mlioh水溶液(0.351ml，0.351mmol)，得到溶液，將其在室溫?cái)嚢?h。濃縮溶劑，得到油狀物，將其懸浮于二氧雜環(huán)己烷(1.4ml)中，并將混合物用1nhcl(0.351ml，0.351mmol)酸化至ph1，得到溶液。濃縮溶劑，得到殘留物，將其大部分溶解于meoh(25ml)中。過濾混合物，并將濾液濃縮，得到油狀物，將其經(jīng)hplc純化(ch3cn-h2o，0.1％tfa)，得到標(biāo)題化合物，為油狀物(20mg，30％)。

唑并-吲哚-peg-生物素-酯.本步驟描述5hiaa的唑并-吲哚-peg-生物素-酯衍生物的合成。將peg-生物素-n-羥基琥珀酰亞胺酯(100mg，0.106mmol)溶解于無水dmf(0.35ml)中，在室溫下加入唑并-吲哚中間體3(95.5mg，0.212mmol，93％純度)，然后加入diea(0.148ml，0.850mmol)，得到溶液，將其在rt下攪拌2天。濃縮溶劑，得到油狀物(246mg)，將其經(jīng)hplc(ch3cn-h2o，0.1％tfa)純化，得到標(biāo)題化合物，為油狀物(123mg，100％)。該步驟顯示于圖5a中。

唑并-吲哚-peg-生物素-酸.本步驟描述5hiaa的唑并-吲哚-peg-生物素-酸衍生物的合成。將唑并-吲哚-peg-生物素-酯(160mg，0.138mmol)溶解于二氧雜環(huán)己烷(2.2ml)中，得到溶液。在攪拌下，于室溫滴加1.0mlioh水溶液(0.551ml，0.551mmol)，得到渾濁溶液，將其在室溫?cái)嚢?小時(shí)。濃縮溶劑，得到殘留物，將其溶解于h2o(2.8ml)中，并用1nhcl(0.414ml,0.411mmol)，在4℃將混合物酸化至ph1，得到渾濁溶液。在30-40℃下，真空(1mmhg)濃縮溶劑，得到殘留物(120mg)，將其經(jīng)hplc純化(ch3cn-h2o，0.1％tfa)，得到標(biāo)題化合物，為油狀物(61mg，50％)。該步驟顯示于圖5b中。

b.生產(chǎn)抗5-hiaa苯并唑衍生物的抗體

生產(chǎn)抗文中所述的5-hiaa苯并唑衍生物的單克隆抗體。例如，使唑并-吲哚-peg-ss-酸通過胺或硫醇活化與載體蛋白連接(圖3a)。將免疫原注射到小鼠，以產(chǎn)生單克隆抗體，或者注射到兔中，以產(chǎn)生多克隆抗體(圖4a和4b)。將本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法用于抗體產(chǎn)生，例如antibody,alaboratorymanual，harlow和lane編，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.(1988)中所述的技術(shù)。

還將5hiaa苯并唑衍生物連接至生物素，而不是載體蛋白(圖3a)。使用以下測(cè)定法，將所述生物素化的半抗原用于測(cè)試所生成抗體的有效性和特異性。將生物素化的關(guān)注半抗原(2μg/ml)在室溫包被到抗生蛋白鏈菌素平板上1小時(shí)。在大約4℃，將抗原包被在板上大約2小時(shí)。為了評(píng)價(jià)針對(duì)衍生化抗原產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體的特異性或靈敏度，將抗體加入到孔中，并在室溫下孵育大約1小時(shí)。將平板用沖洗緩沖液例如pbs等洗滌幾次。加入山羊抗-鼠抗體-hrp綴合物，并在室溫下孵育大約1小時(shí)。將平板用緩沖液洗滌幾次。添加顏色底物，用于顏色反應(yīng)。在大約405nm處讀取平板之前，添加終止溶液。圖6a顯示小鼠單克隆抗體的滴度試驗(yàn)。在1:200稀釋時(shí)，抗體的滴度是非常高的，并可進(jìn)一步稀釋。

在文中所述的5-hiaa的競(jìng)爭(zhēng)性elisa測(cè)定中，對(duì)于單克隆抗體，游離5-hiaa與結(jié)合至的測(cè)定平板的生物素化的5-hiaa競(jìng)爭(zhēng)。圖6b顯示游離5-hiaa量的增加(0ng/ml至100ng/ml；右側(cè)至左側(cè))致使更少的單克隆抗體結(jié)合至生物素化的5-hiaa(或者更低的od)。圖6c顯示在不同濃度5-hiaa(0ng/ml至80mg/ml)，不同稀釋(1:100-1:800)的抗-5hiaa單克隆抗體的滴度。圖6d顯示5-hiaa特異性單克隆抗體對(duì)衍生化的血清素(5-ht)不是免疫反應(yīng)性的。該圖還顯示抗血清素的單克隆抗體不與衍生化的5-hiaa結(jié)合。

抗體特異性測(cè)試顯示抗5-hiaa的單克隆抗體是特異性的，并且不與類似化合物例如血清素、褪黑激素、5-羥基色氨酸或色氨酸結(jié)合。事實(shí)上，這些其他化合物顯示與單克隆抗體0至<0.5％的交叉反應(yīng)性(圖7a和7b)。圖8顯示在基于免疫的測(cè)定中，用抗5-hiaa單克隆抗體可產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。

特異性地與褪黑激素結(jié)合的抗體的產(chǎn)生

本實(shí)施例描述特異性地與褪黑激素結(jié)合的抗體的產(chǎn)生。實(shí)施例顯示該抗體可用于免疫測(cè)定例如競(jìng)爭(zhēng)性elisa中，以檢測(cè)患者樣品中的褪黑激素。

褪黑激素(5-甲氧基-n-乙酰基色胺)是衍生自血清素的化合物。血清素n-乙酰基轉(zhuǎn)移酶將血清素轉(zhuǎn)化為n-乙酰血清素，其被羥基吲哚-o-甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為褪黑激素。

褪黑激素在ibs的發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用(konturek等人，jphysiolpharmacol，2007，58：381-405；bebeuik等人，jpinealres，1994，16：91-99)。褪黑激素顯示強(qiáng)的抗氧化和抗炎活性。褪黑激素還調(diào)控腸能動(dòng)性。研究已表明褪黑激素對(duì)平滑肌的運(yùn)動(dòng)活性具有抑制作用。ibs一直與異常的胃腸道運(yùn)動(dòng)功能、內(nèi)臟超敏反應(yīng)、社會(huì)心理因素、自主神經(jīng)功能障礙和粘膜炎癥相關(guān)。

a.產(chǎn)生含有褪黑激素的免疫原

褪黑激素是合成產(chǎn)生的。將peg(peg1-peg20)連接體連接(綴合)至褪黑激素。然后，將載體蛋白例如bsa通過氨基或硫醇活化，連接至連接體的游離末端(圖3b)。將所述褪黑激素抗原用于產(chǎn)生特異性地與褪黑激素結(jié)合的多克隆和單克隆抗體。

根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，產(chǎn)生抗體。根據(jù)例如諸如greenfield,ea.“generatingmonoclonalantibody”inantibody:alaboratorymanual，第1版，cshlpress，紐約，1988中所述的那些方法，產(chǎn)生單克隆抗體。用褪黑激素抗原和佐劑免疫兔子，產(chǎn)生多克隆抗體。兔子接受褪黑激素抗原的增強(qiáng)免疫接種，以增加其免疫應(yīng)答和抗體滴度。圖9顯示放血前三只免疫兔子和放血1-9的抗體滴度。該圖顯示兔子#16401(1)產(chǎn)生特異性地與褪黑激素結(jié)合的抗體。

還合成產(chǎn)生生物素化的褪黑激素綴合物。將peg(peg1-peg12)連接體連接(綴合)至褪黑激素。然后，將生物素通過氨基或硫醇活化，連接至連接體的游離末端。將所述綴合物用于免疫測(cè)定，以測(cè)試文中所述抗-褪黑激素抗體的親和力和特異性(圖10a和10b)。

b.測(cè)定抗褪黑激素抗體

為了測(cè)試所生成的抗-褪黑激素抗體的有效性和特異性，使用以下測(cè)定。將生物素化的褪黑激素在室溫包被到抗生蛋白鏈菌素平板上1小時(shí)。將平板洗滌并且用封閉緩沖液(例如，superblock^tm緩沖液)封閉以最小化非特異性結(jié)合。將兔抗血清系列稀釋(1:100、1:125、1:250、1:500、1:1000)并轉(zhuǎn)移至平板的各個(gè)孔。在競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定中，將競(jìng)爭(zhēng)(測(cè)試)化合物加入到孔中，并在室溫下孵育大約1小時(shí)。在一些情況下，測(cè)試化合物是褪黑激素或者結(jié)構(gòu)上類似的化合物例如血清素、色氨酸、5-hiaa等。在一些孔中，未加入測(cè)試化合物。

將平板在室溫(rt)孵育約1小時(shí)，伴以回轉(zhuǎn)振搖。將平板用洗滌緩沖液(例如，pbst)洗滌幾次。將山羊抗兔抗體-辣根過氧化物酶(hrp)綴合物稀釋(1:5000)，添加至每個(gè)孔并在室溫孵育1小時(shí)。將平板在洗滌緩沖液(例如，pbst)中洗滌幾次以除去過量的hrp綴合物。添加顯色底物并且將平板在室溫孵育進(jìn)行hrp催化的反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色(例如，在暗處15分鐘)。在顯色后，添加終止溶液(例如，4nnaoh)以終止底物反應(yīng)。在大約405nm或用于檢測(cè)反應(yīng)的適當(dāng)波長(zhǎng)處讀取平板。

將測(cè)定用于測(cè)量文中所述多克隆抗體的結(jié)合活性和特異性。還將測(cè)定進(jìn)行調(diào)整，以便利用山羊抗-鼠抗體-hrp綴合物代替識(shí)別兔抗體的第二抗體，測(cè)試針對(duì)褪黑激素產(chǎn)生的單克隆抗體。

為了測(cè)定抗褪黑激素抗體對(duì)抗原是否是特異性的，測(cè)試競(jìng)爭(zhēng)性化合物例如褪黑激素、血清素、色氨酸和5-hiaa。圖10a顯示隨著褪黑激素的量減少(8.00mm至0mm)，檢測(cè)到更多的多克隆抗體，由于結(jié)合至固定化的生物素化褪黑激素。圖10b顯示在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試中1mm褪黑激素的加入，降低結(jié)合至生物素化褪黑激素的抗體的量。相反，血清素、色氨酸或5-hiaa的加入不改變結(jié)合至固定化抗原的抗-褪黑激素抗體的量。所述數(shù)據(jù)顯示對(duì)于褪黑激素，所述抗-褪黑激素多克隆抗體是高度特異性的，并且與結(jié)構(gòu)上類似于褪黑激素的化合物無交叉反應(yīng)性。

完成類似的競(jìng)爭(zhēng)性elisa，以測(cè)試來自不同雜交瘤克隆(2f1d11h4、6c1e2f7、6c2h4c8、7c7f1g2、7c8a1d2和7f8h9g5)的單克隆抗體的特異性。加入到用固定化褪黑激素包被的孔中之前，將單克隆抗體用測(cè)試化合物(1mm褪黑激素、1mm血清素、1mm色氨酸或1mm5-hiaa)孵育。圖11顯示來自克隆6c1e2f7、6c2h4c8、7c7f1g2和7c8a1d2的抗體是對(duì)褪黑激素特異性的，并不與具有與褪黑激素類似的結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物結(jié)合。

利用標(biāo)準(zhǔn)elisa，測(cè)定抗-褪黑激素單克隆抗體的靈敏度。將生物素化的褪黑激素固定至抗生蛋白鏈菌素包被的多孔板中。向板中，加入系列稀釋的單克隆抗體，以便能產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。將板在室溫下孵育大約1小時(shí)。將孔用沖洗緩沖液洗滌幾次。加入hrp綴合的第二抗體(山羊抗-小鼠igg)，并在室溫下孵育大約1小時(shí)。將板用沖洗緩沖液洗滌幾次。添加比色檢測(cè)試劑。添加終止試劑，以終止反應(yīng)。在適當(dāng)波長(zhǎng)處讀取板。圖12顯示特異性地與褪黑激素結(jié)合的單克隆抗體(來自克隆6c1e2f7)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。抗體的特異性是7.26ng/ml。

特異性地與犬尿烯酸(kyna)結(jié)合的抗體的產(chǎn)生

a.用于制備多克隆抗體的犬尿烯酸免疫原的合成

化合物24：6-(6-氨基己酰氨基)-4-羥基喹啉-2-甲酸。

下面的流程圖解釋說明化合物24的合成。

步驟1：將boc-氨基-己酸(21，277mg，1.2mmol)、dipea(0.21ml，1.2mmol)和hatu(456mg,1.2mmol)的混合物在dcm(5ml)和乙腈(5ml)中攪拌30min。

步驟2：向化合物22(218mg，1mmol)在水(5ml)和乙腈(5ml)的混合物中，加入nahco3(840mg，10mmol)，隨后在劇烈攪拌下，緩慢加入步驟1的反應(yīng)混合物。此后，將混合物再攪拌4hrs，然后通過飽和nahso4酸化，這產(chǎn)生沉淀。將固體物濾出，以得到中間體23。

步驟3：在60℃下，將步驟2的固體23與lioh-h2o(410mg，10mmol)于meoh(10ml)中攪拌4hrs，然后用飽和nahso4溶液酸化至ph3，濃縮。將產(chǎn)生的固體物過濾，用水洗滌，干燥。然后，將其懸浮于dcm(2ml)中，隨后加入tfa(2ml)。將漿狀物在室溫?cái)嚢?hrs，然后濃縮。產(chǎn)生的固體物用乙酸乙酯(30ml)攪拌5min，將不溶解的濾出，并用乙酸乙酯洗滌，并干燥得到灰色固體物，為需要的化合物24(120mg)。ms:318.0(m+h)⁺6-(6-氨基己酰氨基)-4-羥基喹啉-2-甲酸。

為了產(chǎn)生kyna的免疫原性綴合物，將peg(peg1-peg20)連接體連接(綴合)至化學(xué)合成的kyna半抗原，然后，將載體蛋白例如bsa通過氨基或硫醇活化，連接至連接體的游離末端(圖3c)。將文中所述的kyna抗原用于產(chǎn)生特異性地與kyna結(jié)合的多克隆抗體。

化合物27：4-羥基-6-(6-(6-(5-((3as,4s,6ar)-2-氧代六氫-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)己酰氨基)己酰氨基)喹啉-2-甲酸的合成.

將化合物25(327mg，1.5mmol)和lioh-h2o(430mg，10mmol)的混合物在meoh(10ml)中攪拌過夜，然后用6nhcl小心酸化至ph7，濃縮，以除去meoh。然后，將粗產(chǎn)物用乙腈和水(10ml/10ml)稀釋，并加入nahco3(1.26g)，隨后加入生物素-lc-lc-nhs(852mg，1.5mmol)。將混合物劇烈攪拌1天，經(jīng)6nhcl酸化，將產(chǎn)生的固體物過濾，并用meoh沖洗，隨后用水沖洗，然后干燥，產(chǎn)生純的化合物27(140mg)。ms:657.2(m+h)⁺，4-羥基-6-(6-(6-(5-((3as,4s,6ar)-2-氧代六氫-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)己酰氨基)己酰氨基)喹啉-2-甲酸。

還合成產(chǎn)生生物素化的kyna綴合物。將peg(peg1-peg12)連接體連接(綴合)至kyna半抗原。然后，將生物素通過氨基或硫醇活化，連接至連接體的游離末端。將所述綴合物用于免疫測(cè)定，以測(cè)試文中所述抗-kyna抗體的親和力和特異性(圖13a、13b、14a、14b、15a、16a和16b)。

b.用于制備單克隆抗體的犬尿烯酸免疫原的合成

文中提供了合成犬尿烯酸的方法。

在100ml的圓底燒瓶中，將6-溴-4-羥基-喹啉-2-甲酸甲酯(犬尿烯酸甲酯)(564mg，2.0mmol)溶解于干燥的dmf(12ml)中，然后向反應(yīng)燒瓶中加入k2co3粉末(691mg，5.0mmol)。5min后，利用注射器，加入溴芐(0.285ml，2.4mmol)。反應(yīng)在室溫持續(xù)4小時(shí)。利用tlc(用20％etoac的己烷溶液)檢測(cè)反應(yīng)，觀察到完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。然后，向反應(yīng)混合物中加入水(15ml)，并用etoac(3x20ml)萃取。將有機(jī)層合并并用水(20ml)和1.0nhcl(20ml)和鹽水(20ml)洗滌。將有機(jī)層經(jīng)硫酸干燥并蒸發(fā)。然后，將產(chǎn)品經(jīng)真空柱色譜(vcc)利用10-50％etoac-己烷純化。將純的產(chǎn)品級(jí)分合并，并蒸發(fā)，得到為純態(tài)的黃褐色固體物的需要的產(chǎn)物4-芐氧基-6-溴-喹啉-2-甲酸甲酯(285mg)，和具有一定雜質(zhì)的420mg。¹hnmr(499mhz，氯仿-d)δ8.43(d,j＝2.2hz,1h),8.10(d,j＝9.0hz,1h),7.83(dd,j＝9.0,2.3hz,1h),7.70(s,1h),7.57–7.50(m,2h),7.49–7.38(m,3h),5.37(s,2h),4.08(s,3h).

在25ml圓底燒瓶中，將4-芐氧基-6-溴-喹啉-2-甲酸甲酯(372mg，1.0mmol)溶解于dmf(5.0ml)中，并脫氣。然后，向燒瓶中，加入磷酸鉀(467mg，2.2mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(57.75mg，0.05mmol)，并在115℃繼續(xù)加熱16小時(shí)。完成后，蒸發(fā)揮發(fā)物，并加入水(5.0ml)，并用etoac(3x20ml)萃取。合并的有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥并蒸發(fā)。然后，在利用己烷-etoac(0-100％)的真空柱色譜上純化。用50％etoac洗脫需要的產(chǎn)物。將純的產(chǎn)物級(jí)分合并，并蒸發(fā)，得到4-芐氧基-6-[4-(芐氧基羰基氨基-甲基)-苯基]-喹啉-2-甲酸甲酯(255mg，48％產(chǎn)率)，為淡黃綠色固體物，經(jīng)lcms和nmr確證。¹hnmr(499mhz,dmso-d6)δ8.38(d,j＝1.8hz,1h),8.22–8.11(m,2h),7.88(t,j＝6.1hz,1h),7.76(d,j＝7.9hz,2h),7.70(s,1h),7.65–7.58(m,4h),7.58–7.51(m,1h),7.49–7.26(m,6h),5.55(s,2h),5.06(s,2h),4.27(d,j＝6.3hz,2h),3.96(s,3h).ms:533.5[m+h]對(duì)于c33h28n2o5計(jì)算的。

文中提供了合成生物素化的犬尿烯酸的方法。

在250ml圓底燒瓶中，將4-芐氧基-6-[4-(芐氧基羰基氨基-甲基)-苯基]-喹啉-2-甲酸甲酯(532mg，1.0mmol)溶解于meoh(40ml)和ch2cl2(30ml)中。然后，將溶液脫氣并加入10％pd-c(85mg)。然后，利用氣球，將溶液氫化過夜，隨后在lc-ms和tlc上分析。將反應(yīng)溶液經(jīng)硅藻土床過濾，并用甲醇洗滌硅藻土層。然后，利用濃hcl，酸化得到的透明溶液，以使黃色沉淀可視化。然后，將溶液蒸發(fā)，得到黃色固體物。lcms:309[m+h]，對(duì)于c18h16n2o3計(jì)算的。

本文提供了合成犬尿烯酸-peg-二硫化物的方法。

在4.0ml棕色玻璃瓶中，將犬尿喹啉胺(kynurenicamine)鹽酸鹽(68mg，0.2mmol)和peg12-生物素-nhs酯(94.1mg，0.1mmol)懸浮于dmf(1.0ml)中，并在室溫下攪拌16小時(shí)。利用lcms，確證本反應(yīng)混合物中產(chǎn)物的存在。將產(chǎn)物在硅膠真空柱色譜上純化，用ch2cl2-meoh(0-20％)梯度洗脫。將純產(chǎn)物級(jí)分合并，并蒸發(fā)，得到淺黃色固體物(42mg)。¹hnmr(499mhz,甲醇-d4)δ8.49(d,j＝2.2hz,1h),8.10(dd,j＝8.8,2.2hz,1h),7.96(t,j＝9.4hz,2h),7.78–7.67(m,2h),7.45(d,j＝7.9hz,2h),6.97(s,1h),4.57(s,1h),4.47(d,j＝4.3hz,3h),4.29(dd,j＝7.9,4.4hz,1h),4.06(s,3h),3.79(t,j＝5.9hz,2h),3.70–3.45(m,54h),3.35(t,j＝5.4hz,2h),3.24–3.12(m,1h),2.92(dd,j＝12.7,5.0hz,1h),2.68(d,j＝4.4hz,1h),2.53(t,j＝6.0hz,2h),2.21(t,j＝7.3hz,2h),1.79–1.53(m,4h),1.44(q,j＝7.6hz,2h).ms:1133.3[m-h]，對(duì)于c55h33n5o18s計(jì)算的。

甲基酯的水解：將上述得到的產(chǎn)物溶解于thf(1.5ml)中，并加入0.5mlioh溶液(0.4ml)。反應(yīng)在室溫持續(xù)2小時(shí)，然后用1nhcl(0.3ml)酸化。將樣品在lcms上檢測(cè)。觀察具有足夠純度(>85％)的需要的產(chǎn)物。通過將樣品連接至高真空過夜，將樣品充分干燥。

在4.0ml棕色玻璃瓶中，將犬尿喹啉胺鹽酸鹽(68mg，0.2mmol)和ss-peg-nhs酯(111mg，0.1mmol)懸浮于dmf(1.0ml)中，并在室溫下攪拌16小時(shí)。利用lcms，確證本反應(yīng)混合物中產(chǎn)物的存在。將產(chǎn)物在硅膠真空柱色譜上純化，用ch2cl2-meoh(0-15％)梯度洗脫。將純的產(chǎn)物級(jí)分合并，并蒸發(fā)，得到膠狀固體物(28mg)。¹hnmr(499mhz,甲醇-d4)δ8.48(dd,j＝21.2,2.2hz,1h),8.13–8.02(m,1h),7.93(dd,j＝19.9,8.8hz,1h),7.71(dd,j＝16.0,8.2hz,2h),7.44(t,j＝9.4hz,2h),6.96(d,j＝16.4hz,1h),4.54(s,3h),4.46(d,j＝5.7hz,2h),4.05(d,j＝7.3hz,4h),3.83–3.66(m,8h),3.66–3.47(m,50h),3.23(q,j＝7.4hz,2h),2.92–2.82(m,3h),2.67(s,4h),2.53(t,j＝5.9hz,2h),1.37(d,j＝6.6hz,17h).ms:1494.6[m-h]，對(duì)于c74h102n4o24s2計(jì)算的。

甲基酯的水解：將上述得到的產(chǎn)物溶解于thf(1.5ml)中，并加入0.5mlioh溶液(0.4ml)。反應(yīng)在室溫持續(xù)2小時(shí)，然后用1nhcl(0.3ml)酸化。將樣品的等分試樣在lcms上檢測(cè)。觀察具有足夠純度(>85％)的需要的產(chǎn)物。通過將樣品連接至高真空過夜，將樣品充分干燥。

c.抗犬尿烯酸抗體

根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，產(chǎn)生抗體。根據(jù)例如greenfield,ea.“generatingmonoclonalantibody”inantibody:alaboratorymanual，第1版，cshlpress，紐約，1988中所述的那些方法，產(chǎn)生單克隆抗體。用褪黑激素抗原和佐劑免疫兔子，產(chǎn)生多克隆抗體。兔子接受褪黑激素抗原的增強(qiáng)免疫接種，以增加其免疫應(yīng)答和抗體滴度。

為了測(cè)試所生成抗-褪黑激素抗體的有效性和特異性，使用以下測(cè)定。將生物素化的犬尿烯酸在室溫包被到抗生蛋白鏈菌素板上1小時(shí)。將板洗滌并且用封閉緩沖液(例如，superblock^tm緩沖液)封閉以最小化非特異性結(jié)合。將兔抗血清系列稀釋并轉(zhuǎn)移至板的各個(gè)孔。在競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定中，將競(jìng)爭(zhēng)(測(cè)試)化合物加入到孔中，并在室溫下孵育大約1小時(shí)。在一些情況下，測(cè)試化合物是褪黑激素或者結(jié)構(gòu)上的類似化合物例如血清素、色氨酸、5-hiaa、犬尿氨酸等。在一些孔中，未加入測(cè)試化合物。

將板在室溫(rt)孵育約1小時(shí)，伴以回轉(zhuǎn)振搖。將板用洗滌緩沖液(例如，pbst)洗滌幾次。將山羊抗兔抗體-辣根過氧化物酶(hrp)綴合物稀釋(1:5000)，添加至每個(gè)孔并在室溫孵育1小時(shí)。將板在洗滌緩沖液(例如，pbst)中洗滌幾次以除去過量的hrp綴合物。添加顯色底物并且將板在室溫孵育，進(jìn)行hrp催化的反應(yīng)，以產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色(例如，在暗處15分鐘)。在顯色后，添加終止溶液(例如，4nnaoh)以終止底物反應(yīng)。在大約405-450nm或用于檢測(cè)反應(yīng)的適當(dāng)波長(zhǎng)處讀取板。

圖13a顯示用kyna免疫原免疫的兔血清中抗kyna多克隆抗體的反應(yīng)性。該圖顯示競(jìng)爭(zhēng)性elisa測(cè)定的結(jié)果，其中將生物素化的kyna包被至多孔板的表面。圖13b顯示親和純化的兔抗kyna多克隆抗體的結(jié)合靈敏度。利用標(biāo)準(zhǔn)方法，將抗體純化。在競(jìng)爭(zhēng)性elisa中，將多克隆抗體的量稀釋1:250-1:2500，并且評(píng)價(jià)不同濃度的游離kyna。

將類似的競(jìng)爭(zhēng)性elisa用于評(píng)價(jià)根據(jù)文中所述產(chǎn)生的單克隆抗體的特異性和靈敏度。結(jié)果顯示來自雜交瘤克隆4b11h9a2和6h5b11a7的抗體特異性地與kyna結(jié)合，并且對(duì)3-oh-dl-犬尿氨酸、血清素、色氨酸、n-乙?；?5-羥基-色胺和5-oh-喹啉無交叉反應(yīng)性(圖14a)。結(jié)構(gòu)類似于kyna的化合物不干擾抗體與kyna的結(jié)合。圖14b顯示小鼠單克隆抗-kyna抗體的滴定。即使當(dāng)稀釋時(shí)，抗體保持對(duì)kyna的免疫反應(yīng)性。

圖15a和15b顯示雜交瘤克隆6h5b11a7產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體特異性地與犬尿烯酸結(jié)合。如圖15a中所示，在本文提供的競(jìng)爭(zhēng)性elisa中，游離kyna抗原與固定化的kyna抗原就對(duì)抗體的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。隨著游離kyna量的增加，更少的抗體結(jié)合至固定化抗原，且od值降低。圖15b顯示小鼠單克隆抗-kyna抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖16a和16b顯示文中公開的競(jìng)爭(zhēng)性elisa的示例性實(shí)施方案的結(jié)果。在圖16a中，將tmb底物用于比色反應(yīng)。在圖16b中，將發(fā)光底物用于檢測(cè)反應(yīng)。利用發(fā)光底物的測(cè)定提供比tmb底物測(cè)定更高的靈敏度。

應(yīng)當(dāng)理解本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案的目的僅在于說明，并且在其教導(dǎo)下的多種修改或改變將會(huì)提示給本領(lǐng)域技術(shù)人員并且將包括在本申請(qǐng)的主旨與范圍內(nèi)和所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文中引用的全部出版物、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^引用的方式完整并入用于所有目的。

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