本發(fā)明涉及α-1-微球蛋白(a1m)用于減少在用放射性核素標記的小分子來治療惡性腫瘤(malignancy)如神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤期間在放射性核素診斷(rd)、放射性核素治療(rnt)和放射免疫治療(rit)中觀察到的腎臟相關的副作用。小分子包括受體配體(參見生長抑制素衍生物)、親和體(affibody)、雙體抗體(diabody，雙價抗體，雙特異抗體，雙鏈抗體)和抗體片段(fab、fv、scfv等)。

此外，本發(fā)明涉及a1m用于治療急性和/或慢性腎損傷。

背景技術：

在過去15年中，肽受體放射性核素治療(prrt)已成功用來治療轉移性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[1]。用治療性放射性核素標記的生長抑素類似肽如奧曲肽用來治療生長抑素受體陽性腫瘤[2]。然而，腎毒性和慢性腎功能不全是prrt的典型副作用。盡管有保護措施如帶正電荷的氨基酸的輸注，但已在經(jīng)歷prrt的患者中觀察到腎功能的延遲喪失，這是由于近端腎小管再吸收并保留在間質中[1]。因此，腎臟是在prrt中的劑量限制器官。已經(jīng)觀察到用¹⁷⁷lu-dotatate加以治療的患者遭受每年3.8％的肌酸酐清除率損失，以及用⁹⁰y-dotatoc加以治療的患者則遭受每年7.3％的肌酸酐清除率損失[3]。另一種利用小分子候選物來進行治療的方法是親和體分子、雙體抗體和抗體片段以及免疫偶聯(lián)物(即，fab、scfv等)。在臨床前和臨床研究中，那些已經(jīng)被顯示具有高腎累積并伴隨高腎放射性。

腎毒性的問題還沒有得到充分的解決并且仍然需要識別或開發(fā)這樣的方式，其增加使用prrt的安全并減少相關器官毒性。此外，還在重復的放射性核素診斷(放射性核素成像)期間，alata(低至合理可行的)原則將受益自開發(fā)方式來減少來自電離輻射的生物效應。

技術實現(xiàn)要素：

肽受體放射性核素治療(prrt)在臨床使用中是用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的治療。起因于肽的腎小球濾過接著局部輻射和自由基的產(chǎn)生的腎毒性是副作用，其限制上述方法的劑量和用途。α1-微球蛋白(a1m)是人自由基清除蛋白，其顯示可防止輻射誘導的體外細胞損傷以及對周圍細胞的損傷。a1m是在肝臟中合成，分泌到血液中，平衡到血管外區(qū)室以及在腎臟中過濾。

旨在開發(fā)針對prrt的腎毒副作用的基于a1m的療法，作為概念的第一個證據(jù)，本發(fā)明人已比較了在小鼠中注射重組a1m和生長抑素類似物奧曲肽(octreotide)的動力學和生物分布。兩種分子都是主要定位于腎臟，并且與奧曲肽相比，具有a1m的更快速動力學。在靜脈(i.v.)注射以后，在10和20分鐘時，分別發(fā)現(xiàn)在每克腎組織中最大為76％的注射的a1m和46％的注射的奧曲肽。重要地，至少長達注射后60分鐘，a1m分子被證明是完整的全長。腎臟的放射自顯影表明，在10-60分鐘以后，標記的a1m和奧曲肽主要局限于皮質。免疫組化分析和熒光顯微術揭示了兩種物質主要共定位(co-localization)于近端小管的腔和上皮細胞。結果表明a1m和奧曲肽的高度相似的藥物動力學和生物分布，因而使得能夠使用a1m來在prrt期間保護腎臟組織。

依據(jù)本文報道的與上面簡要提到的結果，本發(fā)明涉及a1m和prrn(肽受體輻射核素)組合用于放射性核素治療。

更具體地，本發(fā)明涉及：

α1-微球蛋白(a1m)，其用于治療需要放射性核素治療(rnt)或放射免疫治療(rit)的惡性腫瘤，其中a1m用作與rnt或rit的共治療(co-treatment)；

a1m和用放射性核素標記的化合物用于治療需要放射性核素治療(rnt)或放射免疫治療(rit)的惡性腫瘤；

a1m，用于治療腎損傷。

在借助于單或多成像的放射性核素診斷(核醫(yī)學成像)期間，a1m用于減少來自電離輻射的不想要的生物效應。a1m用來實現(xiàn)alara原理并減少對于患者的電離輻射的不需要的效果。

如下所述，用放射性核素標記的化合物選自由肽受體配體、親和體和抗體片段組成的組。用放射性核素標記的化合物是耦合到發(fā)射輻射的放射性核素的肽。

prrt是分子靶向治療的一種形式，其是通過使用耦合到發(fā)射輻射的放射性核素的小肽來進行。小肽是生長抑素類似物。這種類似物包括奧曲肽、蘭瑞肽(lanreotide)、tyr³-奧曲肽(tyr³-octreotide)(toc)、tyr³-奧曲肽酸(tyr³-octrotate)(tate)以及dota⁺-螯合物dotadoc、dodatate和dota-蘭瑞肽。其它生長抑素類似物包括som230(帕瑞肽)、dopastatin和奧曲肽lar。用發(fā)射中等和/或高能β粒子如釔-90(⁹⁰y)或鎦-177(¹⁷⁷lu)的放射性核素來標記的生長抑素類似物并靜脈內(nèi)(i.v.)給予患者。對患有生長抑素受體陽性腫瘤的患者進行上述治療。神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(net)的許多但不是所有形式表達一種或多種生長抑素受體亞型。在prrn的給予以后，它結合于定位于腫瘤的生長抑素受體并且prrn被保留在腫瘤中。發(fā)射電離輻射的放射性核素的衰減在組織中存儲能量，從而導致高吸收劑量。

在本文中，本發(fā)明不限于具體prrn如上文提到的那些prrn，而是用任何合適的能夠發(fā)射電離輻射的放射性核素標記的任何分子，其旨在在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如放射性核素標記的小分子、親和體分子、雙體抗體、fab、fv、scfv片段和其它免疫偶聯(lián)物或其它受體配體。優(yōu)選的是，選擇的prrn分布于腎臟并具有與a1m相當?shù)膭恿W，以實現(xiàn)a1m的最佳保護效果。

如上所述，其中a1m將是有用的療法之一是神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的治療。神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(net)包括癌癥的異質組，其經(jīng)常保持無癥狀的直到原發(fā)性腫瘤已經(jīng)轉移。

其他療法是那些療法，其可能會導致腎損傷。這樣的療法包括鏈球菌感染、大腸桿菌感染(ehus)、自體免疫性(sle)、糖尿病等的治療。

在任何情況下，可以預期的是，a1m具有對腎組織的保護作用。

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是新生物，其起源于內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)的細胞。這種類型的腫瘤包括胃腸胰腺腫瘤(所謂的dep-net)，例如，產(chǎn)生于小腸、十二指腸、胃、或胰腺，但還產(chǎn)生于大腸或肺或許多其他組織。在腸中發(fā)生的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤還被稱為類癌瘤。

一旦癌細胞已經(jīng)擴散，則治療變得困難的并且手術切除是很難或不可能的。存在幾種治療方案來治療晚期net，其包括手術、生長抑素類似物、化療等，雖然其中大部分對于完全緩解而言不是最理想的。依據(jù)疾病的階段以及腫瘤的尺寸和侵襲性來確定療法的選擇。

prrt似乎在控制進行性net方面是高效的。雖然完全反應率是相對較低的，但在治療以后，具有部分緩解和病情穩(wěn)定的患者的百分率是高的。

如上所述，然而，prrt治療選項受限于腎臟重吸收和放射性標記肽的保留，從而導致劑量限制腎放射毒性。已在若干患者中描述了輻射性腎病。為了實現(xiàn)腎臟保護，已連同帶正電荷的氨基酸、牛明膠溶液(佳樂施)或白蛋白片段一起來共給予prrn。然而。尚未發(fā)現(xiàn)最佳溶液。

放射性核素腫瘤治療機制包括在靶組織中的細胞死亡(壞死和凋亡)，以及各種形式的針對活細胞的非致死性應激，包括“氧化應激”。通過溶劑和細胞組分的電離來誘導氧化應激，以及通過來自電離輻射的細胞壞死來誘導次級氧化應激。氧化應激被定義為增加的組織氧化，其是由于在氧化化合物的產(chǎn)生和氧化劑的解毒/氧化組織的修復之間的失調(diào)[4]。氧化應激的主要介質是反應性氧類(ros)。ros和自由基與蛋白質、dna和其它分子成分反應以引起人細胞和組織的氧化，其導致靶分子的不需要的修飾、功能喪失和細胞死亡。主要通過擾亂氧化過程的區(qū)室化，壞死誘導氧化應激。在放射性核素治療期間，可以觀察到“旁觀者效應”，即應激反應，其中沒有直接暴露于輻射的細胞遭受間接損害。通過來自直接照射的細胞的應激因素的傳播來誘導旁觀者效應并且表現(xiàn)為在未照射的旁觀者細胞中的細胞死亡、基因組不穩(wěn)定性和基因表達的變化[4-7]。已建議氧化劑和ros作為旁觀者效應的介質[8-10]。

抗氧化劑是保護因子，其消除氧化劑或防止有害的氧化反應[4]。人有機體可以響應氧化應激來產(chǎn)生抗氧化劑。這樣的內(nèi)源性抗氧化劑包括過氧化物降解酶，超氧化物歧化酶(sod)，過氧化氫降解酶，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶，以及血紅素降解酶，血紅素加氧酶-1(ho-1)。通常發(fā)生的26kda血漿和組織蛋白，α1-微球蛋白(a1m)，最近被顯示參與防范氧化組織損傷，其中通過作為自由基和血紅素的清除劑以及氧化的還原酶和抑制劑[11-15]。最近的幾篇論文表明，a1m保護細胞培養(yǎng)物和器官移植物以防止氧化損傷[16-18]，其中部分地通過積累在線粒體中以及保護線粒體功能[19]。確實，在動物模型中，人重組a1m的輸注已成功應用于體內(nèi)治療氧化應激相關疾病先兆子癇[20]和血紅蛋白誘導腎小球損傷[21]。在本發(fā)明中特別感興趣的是，a1m已經(jīng)顯示出，在照射的細胞培養(yǎng)物的旁觀者細胞中會抑制細胞死亡、凋亡、和應激反應基因的上調(diào)[22,23]。

基于藥代動力學研究，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在給予以后，a1m和基于生長抑素類似物的prrn均快速分布于腎臟。a1m的保護作用的前提條件在于，在其定位于腎臟以后，蛋白質不會立即降解。如本文中的實施例所示，在靜脈注射以后至少60分鐘，在腎臟中發(fā)現(xiàn)的大部分a1m仍然完好無損。因而，a1m可以發(fā)揮對由prrt引起的腎臟損傷的保護作用。

本發(fā)明人已經(jīng)表明，在幾分鐘內(nèi)，>30％的靜脈給予的¹²⁵i-標記的a1m是位于腎臟中。基于本發(fā)明人的觀察、和示出的a1m針對輻射誘導組織損傷的保護性能，本發(fā)明人提出使用a1m輸注作為用來改善prrt的方法，其中通過減少腎毒性。這樣的基于a1m的方法的前提條件是治療性a1m和奧曲肽的高度共定位。在本文的實驗部分中，在器官和細胞水平上探討了重組人a1m和奧曲肽的動力學和生物分布。

為了評估治療性a1m的輸注是否將能夠防止在經(jīng)歷prrt的患者中觀察到的副作用，重要的是，研究和比較了在這些腫瘤的治療中使用的a1m與生長抑素類似物的動力學和分布。在器官和細胞水平上，這些分子的共定位的程度是特別感興趣的并且進行了深入探討，如在本文的實驗部分中報道的，其中使用幾種成像技術。

進行的生物分布研究顯示，對于兩種分子在腎臟中的高特異性攝取，其中對于a1m和奧曲肽，最大攝取分別為注射后10和20分鐘，以及在清除期期間具有重疊動力學(圖1)。這表明，應同時，或在奧曲肽注射不久之后，進行任何保護性a1m輸注。a1m自腎臟的快速清除還建議，可能需要a1m的幾次輸注以完全保護腎臟。

反映生物分布結果，非侵入性spect成像顯示在腎臟中兩種分子的高攝取。與髓質相比，在腎皮質中可以觀察到較高濃度的奧曲肽和a1m，其提示，在20分鐘以后，已經(jīng)共定位在這些區(qū)域中。

a1m的保護作用的前提條件當然是，在其定位于在腎臟中以后，上述蛋白質并不立即降解。本發(fā)明人因此探討了蛋白質在腎勻漿液中的尺寸。如從圖2中可以看出，注射后至少長達60分鐘，在腎臟中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)的a1m顯示全長尺寸。類似于大多數(shù)小血漿蛋白質，a1m在腎臟中的自然途徑是從血液到原尿的腎小球濾過，接著在近端腎小管上皮中的重吸收和溶酶體降解[29,30]。在尿中仍然可以發(fā)現(xiàn)一小部分的a1m[24]。因此可以推測，雖然預期大部分在近端腎小管細胞中被降解，但顯著量的a1m可以逃逸腎小管重吸收和降解并在開始的10-60分鐘期間保持完整和功能。

α1-微球蛋白-一般背景

a1m在肝臟中以高速率被合成，分泌進入血流并穿過血管壁轉運到所有器官的血管外區(qū)室。還在其他組織(血細胞、腦、腎、皮膚)中但以較低的速率來合成蛋白質。由于小尺寸，自由a1m從腎臟中的血液中迅速過濾。

a1m是脂鈣蛋白超家族的成員，上述超家族是一組蛋白質，其來自動物、植物和細菌，并具有保守的三維結構，但具有非常多樣化的功能。每種脂鈣蛋白組成自160-190個氨基酸鏈，其被折疊成具有疏水內(nèi)部的β-桶袋。至少12種人脂鈣蛋白基因是已知的。a1m是到目前為止在哺乳動物、鳥、魚和青蛙中已經(jīng)確定的26kda血漿和組織蛋白。通過x射線晶體學確定的a1m的三維結構示于圖3。a1m是在肝臟中以高速率被合成，分泌進入血流并快速(t1/2＝2-3分鐘)穿過血管壁轉運到所有器官的血管外區(qū)室。在血液和間質組織中，發(fā)現(xiàn)a1m：具有游離的單體形式以及作為與較大分子(iga、白蛋白、凝血酶原)的共價復合物。由于小尺寸，自由a1m從腎臟中的血液中迅速過濾。然后再吸附主要部分，但顯著量被排泄到尿。

a1m的序列和結構性能

人a1m的全序列是已知的。蛋白質組成自具有183個氨基酸殘基的多肽。已從其它哺乳動物、鳥類、兩棲動物、和魚類，檢測，分離和/或測序了許多另外的a1mcdna和/或蛋白質。a1m的肽鏈的長度在物種間略有差異，這主要是由于在c端中的差異。不同推導的氨基酸序列的對齊比較表明，同一性的百分率從在嚙齒動物或原蹄動物(ferungulate)和人之間的大約75-80％變化到在魚和哺乳動物之間大約45％。在位置34處的游離半胱氨酸側鏈是保守的。已經(jīng)顯示此基團參與氧化還原反應(見下文)，參與與其它血漿蛋白質的復合物形成以及參與結合于黃棕色發(fā)色團。a1m的三維結構顯示，c34是暴露和定位在脂鈣蛋白袋的開口附近的溶劑(見圖3)。

在本文中，術語“α1-微球蛋白”旨在覆蓋α1-微球蛋白，如在seqidno:1(人a1m)以及seqidno:2(人重組a1m)中確定的，以及它們的具有類似的治療活性的同源物、片段或變體。因而，如在本文中所使用的，a1m是指相對于seqidno:1或seqidno:2具有至少80％序列同一性的蛋白質。優(yōu)選的是，如在本文中所使用的，a1m相對于seqidno:1或seqidno:2具有至少90％序列同一性。甚至更優(yōu)選的是，如在本文中所使用的，a1m相對于seqidno:1或seqidno:2具有至少95％如99％或100％序列同一性。在優(yōu)選的方面，α1-微球蛋白是依據(jù)seqidno:1或2(如本文中確定的)。在圖12中，給出序列表：人a1m和人重組a1m的氨基酸序列(分別為seqidno1和2)以及相應的核苷酸序列(分別為seqidno3和4)。然而，如在本文中所使用的，術語a1m還包括a1m的同源物、變體和片段，其具有如在下文中確定的蛋白質的重要部分。

如上所述，依據(jù)本文的描述還可以使用a1m的同源物。在理論上，來自所有物種的a1m可用于本文所述的目的，包括迄今發(fā)現(xiàn)的最原始的a1m，其來自魚(鰈)。a1m還可以以分離的形式獲自人、猩猩、松鼠猴、大鼠、裸鼢鼠、小鼠、兔、豚鼠、母牛、青蛙、雞、海象、海牛和鰈。

重要的是要注意，即使a1m和尿抑胰酶素具有相同的前體，但它們具有不同的氨基酸組成并具有不同的性能。a1m屬于所謂的脂鈣蛋白家族，而尿抑胰酶素(還記為烏司他汀)則屬于蛋白酶抑制劑超家族。

考慮a1m的同源物、變體和片段，以下已被確定為蛋白質的用于抗氧化作用的重要部分：

y22(酪氨酸，位置22，堿基對64-66)

c34(半胱氨酸，位置34，堿基對100-102)

k69(賴氨酸，位置69，堿基對205-207)

k92(賴氨酸，位置92，堿基對274-276)

k118(賴氨酸，位置118，堿基對352-354)

k130(賴氨酸，位置130，堿基對388-390)

y132(酪氨酸，位置132，堿基對394-396)

l180(亮氨酸，位置180，堿基對538-540)

i181(異亮氨酸，位置181，堿基對541-543)

p182(脯氨酸，位置182，堿基對544-546)

r183(精氨酸，位置183，堿基對547-549)

(在整個文件中氨基酸和核苷酸的編號是指seqid1和3，還見圖3和4；如果采用來自其它物種的其它a1m、a1m類似物或它們的重組序列，則本領域技術人員將知道如何確定活性部位或負責酶活性的部位的氨基酸)。

因而，在那些情況下，其中相對于seqidno:1或2之一，a1m例如具有80％(或90％或95％)序列同一性，優(yōu)選的是，在分子中的適當?shù)胤教幋嬖谏衔奶岬降陌被帷?/p>

在三個位置處，用寡糖來替代人a1m：兩種唾液酸化復合型、很可能雙觸角碳水化合物，其連接于n17和n96，以及一種更簡單的寡糖，其連接于t5。來自不同物種的a1m蛋白質的碳水化合物含量變化很大，雖然，在一系列不同的糖基化模式中，范圍自在非洲爪蟾中根本沒有糖基化。然而，一個糖基化位點，其對應于在人中的n96，在哺乳動物中是保守的，這提示這種特定的碳水化合物可能是功能上重要的。

當純化自血漿或尿時，a1m是黃棕色。上述顏色是起因于異質化合物，其共價結合于主要位于袋的入口處的各種氨基酸側基。這些修飾表示由a1m體內(nèi)共價捕獲的有機氧化劑的氧化降解產(chǎn)物，例如血紅素、犬尿氨酸和酪氨酰自由基。

a1m還是電荷和尺寸異質的以及更高棕褐色的a1m分子是更帶負電荷的。對于這種異質性的可能的解釋是，不同的側基被不同的自由基修飾到不同程度，以及修飾會改變蛋白質的凈電荷。共價連接的有色物質已被定位于c34，以及k92、k118和k130，后者具有100至300da的分子量。發(fā)現(xiàn)色氨酸代謝產(chǎn)物犬尿氨酸共價連接于在來自血液透析患者的尿的a1m中的賴氨酰殘基以及在這種情況下似乎是蛋白質的棕色的來源[6]。合成自由基abts(2,2′-連氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸)的氧化片段結合于y22和y132的側鏈。

c34是a1m的反應中心。它變得非常帶負電的，這意味著，它具有高電位來放棄電子，其中通過k69、k92、k118和k130的帶正電的側鏈的接近，其誘導c34巰基的脫質子化，其是硫原子的氧化的前提條件。初步數(shù)據(jù)顯示，c34是已知的最負電基團之一。

理論上，氨基酸，其表征a1m(c34、y22、k92、k118、k130、y132、l180、i181、p182、r183)的性能，這將在下面更詳細地描述，可以以相似的三維結構被安排在另一構架上，例如具有同樣全局折疊的蛋白質(另一種脂鈣蛋白)或完全人造有機或無機分子如塑料聚合物、納米顆?；蚪饘倬酆衔?。

某些氨基酸的三維排列(藍色橢圓形，由，，+“來描述賴氨酸)、a1m構架(桶)、電子流以及自由基捕獲示于圖4。

因此，同源物，片段或變體，其包含結構，該結構包括反應中心和它的周圍(如上所述的)，是優(yōu)選的。

可以對本公開的多肽的結構進行修飾和變化并且仍然導致具有和多肽類似特征的分子(例如，保守氨基酸取代)。例如，某些氨基酸可以代替在序列中的其它氨基酸而沒有明顯的活性損失。由于，正是多肽的互相作用的能力和特性限定了多肽的生物功能活性，所以可以進行多肽序列中的某些氨基酸序列取代并且仍獲得具有相似特性的多肽。

在作出這樣的變化時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。在本領域中通常理解在對多肽賦予交互式生物功能中親水氨基酸指數(shù)的重要性。眾所周知的是，某些氨基酸可以代替具有類似親水指數(shù)或得分的其它氨基酸并且仍然導致具有類似生物活性的多肽?；谄涫杷院碗姾商匦?，已指定每種氨基酸的親水指數(shù)。這些指數(shù)是：異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。

認為，氨基酸的相對親水特性確定了得到的多肽的二次結構，其反過來限定多肽與其它分子的相互作用，如酶、底物、受體、抗體、抗原等。在本領域中已知的是，可以用具有類似親水指數(shù)的另一種氨基酸來替代氨基酸并且仍然獲得功能相當?shù)亩嚯?。在這樣的變化中，其親水指數(shù)是在±2內(nèi)的氨基酸的替代是優(yōu)選的，那些親水指數(shù)是在±1內(nèi)的氨基酸的替代是特別優(yōu)選的，以及那些親水指數(shù)是在±0.5的氨基酸的替代是甚至更特別優(yōu)選的。

還可以基于親水性來進行類似氨基酸的替代，尤其是其中借此產(chǎn)生的生物功能等效多肽或肽旨在用于免疫學實施方式。以下親水性值已賦予氨基酸殘基：精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；蘇氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。據(jù)了解，氨基酸可以代替另一種具有類似的親水性值的氨基酸并且仍然獲得生物等效多肽，以及尤其是，免疫等效多肽。在這樣的變化中，其親水性值是在±2內(nèi)的氨基酸的替代是優(yōu)選的，那些親水性值是在±1內(nèi)的氨基酸的替代是特別優(yōu)選的，以及那些親水性值是在±0.5內(nèi)的氨基酸的替代是甚至更特別優(yōu)選的。

如上所述，氨基酸替代通?；诎被醾孺溔〈南鄬ο嗨菩?，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、尺寸等?？紤]到一種或多種上述特征的示例性替代是本領域技術人員所熟知的并且包括但不限于(原始殘基：示例性替代)：(ala：giy、ser)、(arg：lys)、(asn：gin1his)、(asp：giu、cys、ser)、(gin：asn)、(giu：asp)、(giy：ala)、(his：asn、gin)、(ile：leu、vai)、(leu：ile、vai)、(lys：arg)、(met：leu、tyr)、(ser：thr)、(thr：ser)、(trp：tyr)、(tyr：trp、phe)、以及(vai：lle、leu)。因而本公開的實施方式設想如上所述的多肽的功能或生物等同物。尤其是，多肽的實施方式可以包括變體，其相對于感興趣的多肽具有約50％、60％、70％、80％、90％、和95％序列同一性。

在本文中，通過參數(shù)“同一性”來描述在兩個氨基酸序列之間或在兩個核酸序列之間的同源性?？梢岳每捎糜诘鞍踪|和dna序列對比的全smith-waterman序列對比來進行序列的比對和同源性得分的計算。默認評分矩陣blosum50和同一性矩陣分別用于蛋白質和dna序列對比。對于在缺口中的第一殘基的懲分，對于蛋白質是-12以及對于dna是-16，而對于在缺口中的另外殘基的懲分，對于蛋白質是-2以及對于dna是-4。可以借助于fasta程序包版本v20u6來進行序列對比。

可以利用“clustalw”來進行蛋白質序列的多序列對比。可以利用蛋白質序列對比作為模板，用來自dna序列的相應的密碼子替換氨基酸，來進行dna序列的多序列對比。

可替換地，不同的軟件可以用于序列對比氨基酸序列和dna序列。例如通過利用來自emboss程序包(http://emboss.org)版本2.8.0的needle程序來確定兩個氨基酸序列的序列對比。needle程序實施其中描述的全局序列對比算法。使用的替代矩陣是blosum62，空位開放罰分是10，以及空位擴展罰分是0.5。

在氨基酸序列；例如seqidno:1和不同氨基酸序列(例如，seqidno:2)之間的同一性的程度被計算為在兩個序列的序列對比中精確匹配的數(shù)目除以“seqidno:1”的長度或“seqidno:2”的長度，以最短者為準。以百分比同一性為單位來表示結果。

當兩個序列在重疊的相同位置處具有相同氨基酸殘基時，則發(fā)生精確匹配。

如果相關，可以通過wilbur-lipman方法，利用laser-gene^tmmegalign^tm軟件(dnastar,inc.,madison,wl)，并借助于同一性表和以下多序列對比參數(shù)：缺口罰分為10以及缺口長度罰分為10，來確定在兩個核苷酸序列之間的同一性的程度。成對序列對比參數(shù)是ktuple＝3，缺口罰分＝3，以及窗口＝20。

可以通過i)序列對比兩個氨基酸序列，其中利用needle程序，并借助于blosum62替代矩陣、為10的空位開放罰分、和為0.5的空位擴展罰分；ii)計數(shù)在序列對比中精確匹配的數(shù)目；iii)精確匹配的數(shù)目除以兩個氨基酸序列中最短者的長度；以及iv)將iii)的除法的結果轉換成百分率，來確定多肽的氨基酸序列相對于seqidno:1的氨基酸的同一性的百分率。以類似的方式來計算相對于本發(fā)明的其它序列的同一性的百分率。

通過舉例的方式，多肽序列可以與參比序列相同，即是100％相同的，或，與參比序列相比，它可以包括多達一定整數(shù)的氨基酸改變，以致％同一性小于100％。這樣的改變選自：至少一個氨基酸缺失、替代(包括保守和非保守替代)、或插入，以及其中所述改變可以發(fā)生在參比多肽序列的氨基或羧基末端位置處或在那些末端位置之間的任何位置處，其單獨散布在參比序列的氨基酸之間，或在參比序列內(nèi)的一個或多個連續(xù)基團中。

保守氨基酸變體還可以包含非自然發(fā)生的氨基酸殘基。非自然發(fā)生的氨基酸包括但不限于反式3-甲基脯氨酸、2,4-亞甲基脯氨酸、順式4-羥脯氨酸、反式-4-羥脯氨酸、n-甲基-甘氨酸、別蘇氨酸、甲基蘇氨酸、羥基-乙基半胱氨酸、羥乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氫吡啶羧酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3,3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正纈氨酸、2-氮雜苯基-丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸、以及4-氟苯丙氨酸。用于將非自然發(fā)生的氨基酸殘基并入蛋白質的幾種方法在本領域中是公知的。例如，可以采用體外系統(tǒng)，其中利用化學氨基?；种苿﹖rna來抑制無義突變。用于合成氨基酸和氨基酰化trna的方法在本領域中是公知的。在包含大腸桿菌s30提取物和市售酶以及其它試劑的無細胞系統(tǒng)中，進行含有無義突變的質粒的轉錄和翻譯。通過色譜法來純化蛋白質。在第二種方法中，通過突變的mrna和化學氨基?；种苿﹖rna的微注射，在爪蟾卵母細胞中進行翻譯。在第三種方法中，在缺乏天然氨基酸，其即要被替換，的情況下(例如，苯丙氨酸)以及在所期望的非自然發(fā)生的氨基酸(例如，2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸)的存在下，培養(yǎng)大腸桿菌細胞。將非自然發(fā)生的氨基酸并入蛋白質以代替它的自然對應物?？梢酝ㄟ^體外化學修飾，將自然發(fā)生的氨基酸殘基轉化到非自然發(fā)生的物種。化學修飾可以與定位誘變結合以進一步擴大替代的范圍。可以通過其他技術例如人造腳手架、氨基酸替代等來提供可替代的化學結構，其提供足以支持a1m的抗氧化性能的3維結構。此外，設想模擬如上所列和如圖3和4所示的a1m的活性部位的結構具有和a1m相同的功能。

藥物組合物和劑量

本發(fā)明還提供了試劑盒，其包含：

i)包含prrn的藥物組合物，以及

ii)包含a1m的藥物組合物。

試劑盒具有含有上述兩種組合物的一個包的形式。

包含prrn的藥物組合物通常是已投放市場的組合物。

包含a1m(或如本文所定義的它們的類似物、片段或變體)的藥物組合物旨在用于靜脈給予。因此，可以將a1m配制在液體中，例如在溶液、分散體、乳液、懸浮液等中。如從本文的實施例可以看出，用于靜脈給予的適宜的載體可以由10mmtris-hcl，ph8.0以及9.125mnacl組成。

對于腸胃外使用，合適的溶劑包括水、植物油、丙二醇以及一般批準用于此類目的的有機溶劑。通常，涉及用于具體配方類型的相關賦形劑和涉及用于制備具體配方的方法，本領域技術人員可以在gennaro等人編輯的“remington’spharmaceuticalscience”(mackpublishingcompany)中、在rowe等人編輯的“handbookofpharmaceuticalexcipients”(phppress)中以及在官方專著(例如，ph.eur.或usp)中找到指導。

將連同放射性核素治療劑量一起以一個或幾個劑量來給予a1m。優(yōu)選地，將靜脈給予每個劑量，作為單劑量，作為單劑量接著在短時間至長達60分鐘期間的緩慢輸注，或僅作為在短時間至長達60分鐘期間的緩慢輸注。將和放射性核素治療肽的同時，或在放射性核素劑量的注射之前的0-60分鐘至放射性核素劑量的注射之后的0-30分鐘期間，給予第一劑量。在放射性核素治療劑量的注射以后，可以添加另外的a1m劑量，但可能不是必要的。每個劑量含有與患者體重相關的a1m的量：1-15mga1m/kg患者。在本文的實施例中描述的研究中，采用7mg/kg的劑量(小鼠模型)。

附圖說明

圖1示出在正常nmri小鼠中¹²⁵i-a1m(左上)和¹¹¹in-奧曲肽(右上)的生物分布。左下圖示出，隨著時間的推移，在腎臟中兩種分子的攝取。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為來自4只動物的％ia/g±sem。

圖2示出，在正常nmri小鼠中，在注射后的10、20和60分鐘時，在腎臟和血清中全長a1m的存在。對動物靜脈注射150μga1m，然后在指定的時間點收集血液和腎臟。允許凝聚血液并通過離心來分離血清。在1mlpbs中均化一個腎臟并離心。將來自腎勻漿液的1μl血清和6μl上清施加于sds-page，轉移到pvdf膜以及用抗a1m加以印跡。每個泳道表示單獨的小鼠。

圖3示出a1m的三維結構。該圖是利用pymol[molinspiration,m.v.(2014)]和來自人a1m的晶體結構的坐標[meining,w.,andskerra,a.(2012)所產(chǎn)生。人α1-微球蛋白的晶體結構揭示了潛在的血紅素結合位點。biochemj445,175-182]。以綠絲帶示出β-鏈和α-螺旋。c34、k92、k118、k130和h123的側鏈，其參與a1m的功能活性，顯示為具有藍色氮原子的綠色棒。四個脂鈣蛋白環(huán)被標記為#1-#4。

圖4示出一些氨基酸(藍色橢圓形，賴氨酸是由，，+“來描述)、a1m-構架(桶)、電子流和自由基捕獲的三維排列。

圖5a-d示出在不同的注射后時間的a1m和奧曲肽-a647的管狀定位。靜脈注射a1m和奧曲肽-a647結合物并在注射以后的20分鐘(a,c)和4小時(b,d)終止動物。在共聚焦顯微圖像(20x/0.8物鏡)中，按照在皮質、髓質和集合管中的所選擇的管狀分布曲線來測量共定位a1m(綠色)和奧曲肽-a647(紅色)的百分率。利用dapi(藍色)來可視化細胞核。代表性剖面(a,b)顯示不同程度的共定位(黃色)，以及來自所有探討的樣品的共定位數(shù)據(jù)表示為代表性區(qū)域(c,d)的平均值±sem。比例尺表示50μm。

圖5e-f示出在不同的注射后時間a1m和奧曲肽-a647的細胞共定位。靜脈注射a1m和奧曲肽-a647結合物以及在注射以后的20分鐘和4小時終止動物(e，左和右)。在高分辨率共聚焦顯微圖像(63x/1.4物鏡)中，按照在皮質中的所選擇的管狀分布曲線來測量共定位a1m(綠色)和奧曲肽-a647(紅色)的百分率。利用dapi(藍色)來可視化細胞核。代表性剖面(e)示出不同程度的細胞內(nèi)共定位(黃色)，以及來自所有探討的樣品的共定位數(shù)據(jù)表示為代表性區(qū)域(f)的平均值±sem。比例尺表示20μm。

圖6示出注射有5mbq¹¹¹in-奧曲肽(a和b)和5mbq¹²⁵i-a1m(c和d)以及成像40分鐘的正常nmri小鼠的臨床前spect/ct圖像。a和c示出整個動物的重建三維視圖以及b和d示出通過腎臟的平面切片。腎臟顯示高攝取以及在腎皮質中可以看到兩種分子的濃度。對于¹²⁵i-a1m，可以觀察到在甲狀腺中的輕微攝取。

圖7示出在正常小鼠的腎臟中，¹¹¹in-奧曲肽和¹²⁵i-a1m的攝取的數(shù)字放射自顯影圖像。(a)¹²⁵i-a1m，20分鐘腹腔注射(p.i.)；(b)¹²⁵i-a1m，1小時腹腔注射；(c)¹¹¹in-奧曲肽，20分鐘腹腔注射；(d)¹¹¹in-奧曲肽，1小時腹腔注射。所有圖像示出在腎皮質中兩種分子的局部攝取。需要注意的是，已調(diào)節(jié)每個圖像的比例以最佳說明在每個腎臟切片中放射性核素的相對分布。

圖8顯示在靜脈注射以后20分鐘在腎臟中a1m免疫反應性的分布。靜脈注射a1m，在20分鐘以后終止動物，以及借助于k323抗a1m抗體，利用免疫組化分析，來檢測a1m免疫反應性。左圖片顯示在皮質(a)、髓質(b)、和集合管(collectingduct)(c)中具有a1m-免疫反應性的代表性區(qū)域；用a-c來指示這些區(qū)域的位置以及在右圖片的示意圖中用框加以突出。在a-c中比例尺表示100μm。

圖9顯示在靜脈注射以后20分鐘和4小時在腎臟中a1m免疫反應性和奧曲肽-a647的分布。在皮質(a)、髓質(b)、和集合管(c)中，借助于k323抗a1m抗體，利用免疫組化分析(左列；明視場顯微術)或免疫熒光(中間和右列；共聚焦顯微術)，來檢測a1m免疫反應性。在注射以后20分鐘(中間)和4小時(右)，探討了a1m免疫熒光(綠色)和奧曲肽-a647(紅色)的分布，以及它們的管狀共定位(黃色)。利用dapi(藍色)來可視化細胞核。比例尺表示50μm。

圖10顯示在靜脈注射以后，a1m免疫熒光和奧曲肽-a647的細胞共定位。靜脈注射a1m和奧曲肽-a647結合物以及在注射以后20分鐘時終止動物。高分辨率(63x/1.4物鏡)共聚焦顯微圖像顯示a1m免疫熒光(綠色)和奧曲肽-a647熒光(紅色)的細胞內(nèi)分布。用dapi(藍色)來染色細胞核，以及鬼筆環(huán)肽-德克薩斯紅標記(灰色)用來描述管狀分布曲線。通過測量沿著就在細胞核外的細胞質中的輪廓的熒光強度(b；黃線)來顯示在一個細胞中強調(diào)熒光的分辨率(a；箭頭)，從而給出沿著在紅色和綠色通道中輪廓的強度(c)，作為具有8位(256強度水平)/通道的強度分布(d)。比例尺表示10μm。

圖11示出實施例2的結果。

圖12示出序列seqid1-4。

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具體實施方式

實施例1

實驗

材料與方法

重組人a1m

在大腸桿菌中表達重組人a1m，純化并再折疊，如由kwasek等所描述的[25]，但具有另外的離子交換層析步驟。這是通過對用20mmtris-hcl，ph8.0加以平衡的deae-sephadexa-50(gehealthcare，uppsala，sweden)的柱施加a1m來進行。在1ml/分鐘的流率下，用線性鹽梯度(從20mmtris-hcl，ph8.0，至20mmtris-hcl，0.2mnacl)來洗脫a1m。合并并濃縮含有a1m的餾分(根據(jù)在280nm處的吸光率)。

a1m的¹²⁵i-標記

利用氯胺t方法[26]來用¹²⁵i來放射性標記a1m。簡要地，在0.5m磷酸鈉，ph7.5中，分別以1mg/ml和10mci/ml的最終濃度，混合a1m和¹²⁵i(perkin-elmer,nez033005mc)。將氯胺t加入0.4mg/ml并允許在冰上反應2分鐘，然后通過添加nahso3至0.8mg/ml來停止反應。通過凝膠色譜法，用sephadexg-25柱(pd10,gehealthcare,buckinghamshire,uk)，從游離碘化物分離蛋白結合碘。獲得約50-200kbq/μg蛋白質的比活性。

奧曲肽

生長抑素類似物肽奧曲肽購買自mallinckrodtpharmaceuticals(http://www.mallinckrodt.com/)以及根據(jù)商家的指示標記有¹¹¹in和alexa647(hilytefluor647；anaspec,seraing,belgium)。這些化合物分別被稱為¹¹¹in-奧曲肽和奧曲肽-647。

動物研究

遵照對實驗室動物保護的國家立法和動物研究倫理委員會的批準(lunduniversity,sweden)，進行所有動物實驗。使用6-8周齡的雄性和雌性nmri正常小鼠(taconic,ry,denmark)。

生物分布

進行生物分布研究以確定¹²⁵i-a1m和¹¹¹in-奧曲肽的藥物動力學和生物分布。通過尾靜脈注射，將¹²⁵i-a1m(100kbq，1μg)和¹¹¹in-奧曲肽(100kbq，10μg)靜脈給予nmri小鼠(n＝3/注射分子和時間點)。注射后10、20、40、60分鐘(a1m和奧曲肽)，4和24小時(奧曲肽)，終止動物，并取樣血液和器官，然后稱重和測量(用nai(ti)孔計數(shù)器(wallacwizard1480wizard,perkinelmer))。器官特異性攝取值計算為百分比注射活性/克組織(％ia/g)或百分比注射活性(％ia)。

數(shù)字放射自顯影

利用biomolex700成像系統(tǒng)(biomolexas,norway)來進行數(shù)字放射自顯影。對兩組(n＝2)正常小鼠靜脈注射¹²⁵i-a1m(0.5mbq，5μg)和¹¹¹in-奧曲肽(0.5mbq，50μg)。利用干冰來冰凍在包埋介質中的腎臟并用恒冷切片機(leicamicrosystemsab,sweden)切片成50μm厚切片，然后用biomolex系統(tǒng)加以成像。利用內(nèi)部軟件來重建圖像。

蛋白質印跡

對來自已靜脈注射有非標記a1m(100μl/動物，1.5mg/ml)的動物的腎臟和血清進行sds-page分析。在注射后10、20和60分鐘時終止動物，取樣血液和腎臟，然后洗滌腎臟并放置在1mlpbs中。在機械組織均化以后，在10,000xg下離心組織10分鐘，然后將上清轉移到新管并用于進一步分析(如下所述)。通過在1,000xg下離心10分鐘，從血液樣品獲得血清。在還原條件下運行sds-page凝膠，并利用轉印跡turbo傳送系統(tǒng)(bio-rad,delaware,usa)將分離的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(immobilon-p,millipore,bedford,ma,usa)。隨后阻斷pvdf膜并用兔多克隆抗a1m抗血清的igg部分(k322，5μg/ml)來溫育過夜，如前所述[28]，接著用alexafluor647山羊抗兔igg(稀釋3000x；分子探針)加以溫育。利用chemidocmp成像系統(tǒng)(biorad)來顯影膜。

spect成像

在nanospect/ct(bioscan,washingtondc,usa)的成像期間，用2％至3％異氟醚氣體(baxter；deerfield,il,usa)來麻醉動物。用大約5mbq的¹²⁵i-a1m(大約30μg)和5mbq的¹¹¹in-奧曲肽來靜脈注射動物并腹腔注射20m借助于nsp-106多針孔小鼠準直儀來成像。對于¹²⁵i成像，20％的能量窗口集中于35kev光峰以及對于¹¹¹in，則集中于175和241光峰。利用hispect軟件(scivis；goettingen,germany)來重建spect數(shù)據(jù)。在每個全身spect以前進行ct成像。在1小時時的spect成像以后，切除腎臟并包埋在o.c.t^tm化合物(sakurafinetek；alphenaandenrijn,thenetherlands)中，然后冰凍在干冰上。以10μm的厚度，冰凍切片冰凍樣品，用于biomolex系統(tǒng)的放射自顯影分析。用mayer的蘇木素和鉻變素2r、ch2r(兩者均來自histolab；gothenburg,sweden)來染色腎切片，然后利用光學顯微鏡滑動掃描儀(miraxmidi,carlzeiss；oberkochen,germany)加以掃描。

腎臟-樣品制備和a1m的免疫標記

在同時靜脈注射150μga1m(未結合的)和100μgalexa647標記的奧曲肽(奧曲肽-647)的10、20、40、60分鐘和4小時以后，處死動物。評估所有時間點，但僅包括從20分鐘至4小時的腎臟，其顯示在細胞水平上的詳細分析，包括激光共焦掃描顯微術和定量圖像分析。重要地，對野生型和裸鼠，進行所有實驗并評估，顯示出具有相同的標記模式。然而，僅包括野生型數(shù)據(jù)。

在安樂死以后，直接除去腎臟，并冰凍和包埋在tissuetec中。在恒冷切片機(microm,hm500om,walldorf,gmbh)中切片組織塊，以及用superfrost加載玻片(merck,darmstadt,germany)來收集切片(10μm)。進行連續(xù)切片，收集3-4個切片/載玻片，其中相鄰載玻片用于色素原免疫組化分析(ihc)或免疫熒光(if)標記。將切片后固定在4％多聚甲醛(pfa,sigma,st.louis,mo,usa，溶解于pbs，0.1m,ph7.4)中15分鐘，然后在pbs中沖洗兩次，時間為5分鐘。

對于a1m的單標記，用0.03％過氧化氫(h2o2,merck,darmstadt,germany)來溫育切片5分鐘，用于色素原可視化(ihc)。對于色素原和熒光可視化，用1％牛血清白蛋白(bsa,sigma,st.louis,mo,usa；稀釋在pbs中)來溫育切片30分鐘。然后，在4℃下，用兔抗人a1m(k:323，igg)，稀釋1:7500(在pbs中，其含有1％bsa、0.02％tritonx-100(sigma,st.louis,mo,usa)，來溫育切片16小時。

對于a1m的色素原可視化，在室溫下，用與辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔igg(hrp,dakoglostrup,denmark)來溫育切片20分鐘。在室溫下，通過在含有0.03％h2o2的二氨基聯(lián)苯胺(dab)溶液中溫育10分鐘來進行免疫反應。在pbs中沖洗(2x10分鐘)切片，并用蘇木素(mayers,hematoxylinmayershtxhistolabproductsab,gothenburg,sweden)加以復染色，接著在梯度酒精系列中脫水以及浸沒在100％二甲苯中。在pertex(histolabproductsab,gothenburg,sweden)中封固和蓋玻片切片。

對于a1m的if標記，其用于奧曲肽-647的同時檢測，用初級抗體來溫育切片，如上所述用于色素原檢測，接著結合alexafluor488的次級山羊抗兔igg(af488,invitrogen,分子探針,usa)，其1:150稀釋在含有1％bsa的pbs中。在室溫下進行溫育45分鐘，接著在室溫下在4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi，核標記，invitrogen,分子探針,usa)中溫育15分鐘。在室溫下，還用結合德克薩斯紅(結合于f肌動蛋白)的鬼筆環(huán)肽來溫育切片的子集1小時以形態(tài)上描述管狀結構。在pbs中沖洗切片，然后抗褪色溶液(prolonggold,invitrogen,分子探針,usa)中封固和蓋玻片。

在腎切片中a1m和奧曲肽-647的光學檢測

可視化色素原單標記的a1m并以明場顯微鏡(leicadmre)加以數(shù)字記錄。用leica數(shù)碼相機(dfc500)來收集數(shù)字圖像。校正用于說明的圖像的色平衡、亮度和反差。

為了在組織和細胞水平上if標記的a1m(a1m-af488)和奧曲肽-647的同時可視化，使用了zeiss共焦激光掃描顯微鏡(clsm,lsm510meta,dept.biology,lunduniversity)。通過來自alexafluor488(a1m)、hilytefluor647(奧曲肽)、德克薩斯紅(f肌動蛋白)和dapi(細胞核)的發(fā)射的掃描來檢查切片。

通過皮質、髓質和集合管的區(qū)域來收集數(shù)字圖像數(shù)據(jù)，一個或多個光學部分(z-堆疊)。圖像文件用于計算a1m-af488和奧曲肽-647熒光的單獨存在和共存。為了文檔化，選擇來自每個切片的3個腎臟區(qū)域作為代表性區(qū)域(通過采集軟件zen2009所標記和存儲的x/y階段位置)。用20x/0.8planapochromat物鏡(提供1.8μm厚光學部分，其具有約400nmx/y光學分辨率)、以及用63x/1.4油浸沒planapochromat物鏡(提供0.9μm厚光學部分，其具有約250nmx/y光學分辨率)來進行掃描(以1024x1024幀尺寸)。光學部分和掃描深度的選擇確定自在掃描場中大多數(shù)核(dapi標記)的中心位置。對顯示af488、hilytefluor647、dapi和德克薩斯紅熒光的通道進行順序掃描。對于每個通道，選擇具有最高熒光強度的腎臟剖面作為參比，從其優(yōu)化采集設置(激光功率、pmt檢測器增益、數(shù)字偏移)并用于所有掃描區(qū)域。本文提供的圖像說明選自個別光學部分，其含有用于定量測量的區(qū)域/結構。

在腎切片中奧曲肽-647和a1m的定量圖像分析

奧曲肽-647熒光和a1m-af488if的clsm圖像用于定量分析。探討了在腎結構(來自皮質、髓質和集合管)中以及在管狀上皮細胞內(nèi)的詳細分布。分析了三(3)個區(qū)域/clsm圖像以及10至20個之間的圖像/動物。借助于imagej軟件(版本1.49g,rasband,w.s.imagej,nih,usa)，開發(fā)了分析協(xié)議以用作宏腳本。簡要地，clsm圖像的顯示是借助于”疊加圖像”，其呈現(xiàn)所有合并在一起的通道(用于af488、hl647、dapi和德克薩斯紅)的復合圖像。樣品區(qū)的選擇是依據(jù)管狀結構的形態(tài)來進行并且由核和/或鬼筆環(huán)肽標記來描述。利用套索函數(shù)來劃定用于測量的個別區(qū)域。然后綠色(a1m-af488)和紅色(奧曲肽-647)通道用作輸入圖像，以及利用”共定位”插件程序，探討了單獨的綠色或紅色像素或它們的共定位的比率。利用origin9.0軟件(microcal,northampton,ma,usa)來進行統(tǒng)計分析。在圖5中的直方圖顯示在每個時間點獲自3個腎臟的代表性數(shù)據(jù)并且被繪制為平均值±sem。

結果

生物分布

圖1示出在注射后10、20、40和60分鐘時¹¹¹in-奧曲肽的體內(nèi)生物分布，在注射后10、20、40和60分鐘以及注射后4和24小時時¹²⁵i-a1m的離體生物分布。還圖示了隨著時間的推移在腎臟中兩種分子的比較攝取(％ia/g)。對于¹¹¹in-奧曲肽和¹²⁵i-a1m，觀察到在腎臟中的高攝取，其中峰值分別在注射后的10和20分鐘。通過sds-page和蛋白質印跡，探討了在血液血清和溶解腎臟中注射的非標記的a1m的尺寸分布。如圖2所示，a1m，作為均勻帶，遷移，其中在腎臟和血清中表觀分子量總是約25kda，以及次要的弱帶為50kda。強帶最可能表示理論分子量為22.6kda的單體a1m以及后者則表示二聚體形式。在10分鐘時看到最高量，其支持在圖1下圖片中示出的¹²⁵i-標記的a1m的動力學。這些結果表明，在血液和腎臟中發(fā)現(xiàn)的a1m是完整的、全長，因此降解是微不足道的。

spect/ct圖像分析

對¹¹¹in-奧曲肽和¹²⁵i-a1m進行定性spect/ct分析以及可視化在中腎臟的活性分布。在圖6中的spect/ct圖像表明在腎臟中兩種分子的高攝取。雖然與¹¹¹in-奧曲肽相比(圖6a和b)，可以看到在外圍腎臟結構中¹²⁵i-a1m的明顯較高濃度(圖6c和d)，但兩種分子似乎共定位在腎皮質中。還可以看到在甲狀腺中¹²⁵i-a1m的輕微攝取。已忽略匯集在膀胱中的¹¹¹in-奧曲肽的活性，這是因為強信號使它難以表明在腎臟中的分布和攝取。

數(shù)字放射自顯影

在圖7中顯示的數(shù)字放射自顯影結果清楚地說明兩種分子在腎皮質中的定位，其反映了spect/ct結果。可以觀察到，在注射后20和60分鐘，結果是類似的，其表明，在20分鐘以后，已完成肽和蛋白質的定位。在這些圖像中不能觀察到進一步的亞區(qū)室化；然而，在皮質中活性分布不是完全同質的。在前兩個圖像(7a和b)和接著的兩個圖像(7c和d)之間可以觀察到反差和分辨率的明顯差異。除它的低能量轉換電子(30.6kev)之外，¹²⁵i還在27.5和27.2kev下發(fā)射低能x射線光子。這些光子貢獻于在圖像中的噪聲以及與轉換電子的能量上的接近使得它們難以從最終圖像中排除。

熒光顯微術

a1m免疫反應性主要分布在皮質中，并在髓質和集合管中具有降低的免疫反應性。此外，a1m免疫反應性標記的強度在皮質中最高，在髓質中較弱以及在集合管中最弱。在圖8和9(左圖片)中示出在腎臟20分鐘腹腔注射的所選區(qū)域中a1m免疫反應性的分布。強標記存在于管狀結構的子集中，其被在形態(tài)上加以描述以連累近端小管和腎小球的子集。a1m和奧曲肽-a647的熒光雙標記表明它們的管狀共存，以及高度的細胞共定位(圖5、9和10)。在髓質和皮質中，20分鐘腹腔注射，存在兩種分子的強標記，其包括高度的管狀共存和細胞共定位(還見圖10)。在4小時腹腔注射，存在兩種分子的熒光檢測的顯著下降，其在皮質和髓質中是非常低的以及在集合管中不存在(圖9)。依據(jù)20分鐘和4小時腹腔注射的clsm圖像，進行兩種分子的管狀定位的定量分析，并且顯示20分鐘腹腔注射相應程度的共定位(圖5)。當在細胞水平上研究在管狀結構中的共定位時，如在圖5中可視化和量化的，在皮質中看到類似結果。通過在指定輪廓(圖5)中個別像素的強度的比較，來表明a1m和奧曲肽-a647的細胞內(nèi)共定位。

實施例2

借助于在prrt中的a1m，腎臟的短期輻射保護

除非下文另有說明，在實施例1下提到的材料與方法還用于實施例2。

目的：8天¹⁷⁷lu-奧曲肽prrt腎臟損傷小鼠模型的初步測試，包括用a1m加以治療

放射性核素活性：150mbq¹⁷⁷lu-dotatate(¹⁷⁷lu-dota0,tyr3]奧曲肽酸)

輻射保護和安全：150mbq¹⁷⁷lu-dotatate在1cm的距離處產(chǎn)生7msv/h。

a1m劑量：7mg/kg(在載體2中：10mmtris-hcl，ph8.0+0.125mnacl)

a1m治療時間點：t＝0和t＝+60分鐘。nb，在t＝0時，分開注射¹⁷⁷lu-dotatate和a1m。

分析方法：

1.血液

2.尿

3.在腎臟中的基因表達

4.組織化學一般組織損傷

5.免疫組化分析

凋亡tunel，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶

γh2ax雙鏈斷裂

6.放射自顯影

7.器官活性測量

協(xié)議：

取決于可用性(lu-177-oct(奧曲肽))，將優(yōu)先考慮組，具體如下：1天、8天、4天。

樣品處理：

1.血液：

在管中的樣品血液，依據(jù)使用說明書進行離心并將血漿/血清轉移到新管，在-80℃下冷凍。

2.尿：

在-80℃下立即冷凍。

3.腎臟：

a.將一個腎臟pcr-解剖成2片。放入2個不同的管(一個用于mrna以及一個用于蛋白質提取)并放置在干冰上。

b.顯微術和放射自顯影

·在哥本哈根成像的一些腎臟

·在液氮中立即干燥并冷凍腎臟

4.器官活性：

根據(jù)和以前的研究相同的協(xié)議，一個腎臟用于活性分析。還見下點6。

5.spect分析：

在第8天對第4組(至少3只動物)進行

6.另外的器官：

如果可能的話，還處理肝臟、脾、心臟、腸、原腸、腦、胰腺、肺和皮膚(放置在干冰上)并根據(jù)以前的協(xié)議來分析活性。后來的器官用于蛋白質分析。

結果

在第一實驗中，對balb/c(nu/nu)鼠注射150mbq177lu-奧曲肽(dotatate)、150mbq177lu-奧曲肽(dotatate)+150μga1m、或僅緩沖液(對照)。留下小鼠1天或8天，然后處死，并采樣血漿和尿，如上所述。因而，收集了6組(n＝4)樣品：

作為腎臟功能的初步估計，測量在血漿中的肌酸酐，以及測量在尿樣品中的白蛋白(圖11)。血漿肌酸酐是腎小球濾過率(gfr)的標志物，以及結果表明，在1和8天以后，dotatate注射導致顯著增加的肌酸酐水平，即降低的gfr。a1m的同時輸注使gfr恢復到對照水平，以及在8天以后效果是非常顯著的(p<0.01)。為了估計蛋白尿，在1和8天以后，通過dotatate注射，會顯著升高在尿中的白蛋白濃度，以及在1天以后是更顯著的。在1天以后，同時a1m治療導致顯著減少的蛋白尿，但在8天以后則不是如此。

總結來說，177lu-奧曲肽注射導致受損的腎臟功能(減少的腎小球濾過和蛋白尿)，其可以借助于與a1m一起的共治療加以治療。

序列表

<110>布·阿克斯特羅姆

斯特凡·漢松

<120>用于在放射性核素治療中保護腎臟的α-1-微球蛋白

<130>p015472pct1

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>183

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>1

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<210>3

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