本申請要求于2014年12月3日提交的美國臨時申請no.62/087,052的權(quán)益，其通過引用完整并入本文以提供公開的連續(xù)性。本發(fā)明涉及包含絲狀噬菌體基因3蛋白(g3p)中足以結(jié)合和/或解聚淀粉狀蛋白的部分，即g3p的n1-n2部分及其突變體和片段的多肽，其中已經(jīng)經(jīng)由氨基酸缺失、插入或取代修飾所述g3p氨基酸序列以除去推定的糖基化信號。本發(fā)明還涉及此類多肽，其還經(jīng)由另外的氨基酸取代修飾以在體內(nèi)使用時比相應(yīng)的野生型g3p氨基酸序列具有實質(zhì)性更小的免疫原性。本發(fā)明的多肽保留其結(jié)合和/或解聚淀粉狀蛋白的能力。本發(fā)明還涉及這些g3p修飾的多肽在治療和/或預(yù)防與淀粉狀蛋白的錯折疊或聚集有關(guān)的疾病的用途。已經(jīng)證明絲狀噬菌體g3p蛋白，特別是其包含g3p的n1-n2區(qū)的多肽部分結(jié)合并解聚各種淀粉狀蛋白，例如β-淀粉狀蛋白、tau蛋白、和朊病毒蛋白。參見共同未決的pct申請pct/us2012/066793和美國臨時申請us61/801,349和us61/801,849，其各自的公開內(nèi)容通過引用并入本文。另見r.krishnanetal.,j.mol.biol.(2014)。盡管有那種功效，但是預(yù)期在重組哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中此類多肽的產(chǎn)生可以在g3p序列中推定的天冬酰胺連接的糖基化信號上被糖基化不利影響。此外，對人系統(tǒng)性施用包含g3p或其n1-n2區(qū)的多肽可以引起不利的免疫應(yīng)答。這些現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)中無一鑒定與推定的糖基化有關(guān)的任何潛在問題。許多重組或其它方面非天然治療性蛋白質(zhì)或多肽的功效可以受到患者對治療性蛋白質(zhì)或多肽的不想要的免疫反應(yīng)限制。通過蛋白質(zhì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的主要因素是蛋白質(zhì)內(nèi)存在t細(xì)胞表位，即可以通過在主要組織相容性復(fù)合物(mhc)ii類分子上呈遞來刺激t細(xì)胞活性的氨基酸序列。t細(xì)胞表位通常定義為具有結(jié)合mhcii類分子的能力的任何氨基酸序列。當(dāng)與mhc分子結(jié)合時，t細(xì)胞表位可以被t細(xì)胞受體(tcr)識別，并且可以通過接合t細(xì)胞受體來促進(jìn)t細(xì)胞活化以促進(jìn)t細(xì)胞應(yīng)答。然而，通常理解，結(jié)合mhcii類分子的某些t細(xì)胞表位不刺激t細(xì)胞應(yīng)答，因為這些肽在接受蛋白質(zhì)施用的生物體內(nèi)被識別為“自身的”。在細(xì)胞內(nèi)治療性蛋白質(zhì)或多肽降解期間，某些t細(xì)胞表位可以作為肽釋放，然后由mhc的分子呈遞以觸發(fā)t細(xì)胞的活化。對于由mhcii類分子呈遞的肽，t細(xì)胞的此類活化然后可以例如通過直接刺激b細(xì)胞產(chǎn)生抗體應(yīng)答以生成此類抗體。mhcii類分子是一組高度多態(tài)性的蛋白質(zhì)，其在輔助t細(xì)胞選擇和活化中起著中心作用。人白細(xì)胞抗原組dr(hla-dr)是這組蛋白質(zhì)的主要同種型。然而，同種型(isotypes)hla-dq和hla-dp執(zhí)行相似的功能。在人中，dr同種型的約70種不同同種異型(allotypes)是已知的，對于dq，存在30種不同的同種異型，而對于dp47，已知不同的同種異型。每個個體攜帶2到4個dr等位基因，即兩個dq和兩個dp等位基因。對個體中的蛋白質(zhì)或多肽的免疫應(yīng)答受到t細(xì)胞表位識別的重大影響，所述t細(xì)胞表位識別是該個體hla-dr同種異型的肽結(jié)合特異性的功能。為了在全球人口的背景下鑒定蛋白質(zhì)或多肽內(nèi)的t細(xì)胞表位，希望考慮盡可能多種多樣的一組hla-dr同種異型的結(jié)合特性，從而覆蓋了盡可能高百分比的世界人口。t細(xì)胞表位鑒定是表位消除的第一步。實現(xiàn)t細(xì)胞表位檢測的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且公開在wo98/52976，wo00/34317,us2007/0269435；us7,208,147，kernetal.,naturemedicine4:975-978(1998)；和kwoketal.,trendsinimmunology22:583-588(2001)。在這些方法中，通過在治療性蛋白質(zhì)或多肽的一級序列中使用明智的氨基酸取代來除去預(yù)測或鑒定的t細(xì)胞表位。盡管這些參照文獻(xiàn)實現(xiàn)t細(xì)胞表位的推定鑒定，但是不能合理地預(yù)測避免對生物活性的負(fù)面影響的氨基酸取代的選擇。那只能通過對每種經(jīng)修飾的多肽測試此類活性來確定。因此，希望單獨或與降低g3p的n1-n2部分的免疫原性一起檢查和降低糖基化，而不破壞其淀粉狀蛋白結(jié)合/解聚性質(zhì)。這將允許包含g3p的n1-n2部分的多肽在哺乳動物細(xì)胞中制備，而沒有與糖基化相關(guān)的制造困難。此外，降低的免疫原性將允許包含該n1-n2部分的多肽被系統(tǒng)地長期施用用于治療和/或診斷目的。本發(fā)明通過鑒定g3p的n1-n2部分中推定的糖基化信號并提供其修飾來滿足這一需要，所述修飾防止糖基化，同時保持如pct/us13/62862(wo2014/055515)中所述的g3p多肽，或如pct/us2014/039760中所述的已經(jīng)經(jīng)過修飾而減少或消除免疫原性的g3p多肽(兩者均通過引用并入本文)的活性。因此，本發(fā)明的某些g3p多肽不僅被修飾以防止糖基化，而且還包含在這些潛在的t細(xì)胞表位內(nèi)的特定氨基酸取代以產(chǎn)生變體n1-n2序列，其將降低或消除該t細(xì)胞的免疫原性而不破壞變體n1-n2結(jié)合淀粉狀蛋白的能力，防止淀粉狀蛋白聚集，和/或?qū)崿F(xiàn)淀粉狀蛋白斑的解聚。在本發(fā)明的某些實施方案中，多肽包含已被修飾以除去糖基化信號的g3p或其淀粉狀蛋白結(jié)合片段。在一個實施方案中，本發(fā)明還提供了多肽，其包含n1-n2氨基酸序列或其突變體或片段(其由于一種或多種所鑒定的t細(xì)胞表位內(nèi)的一個或多個氨基酸取代而具有降低的免疫原性，并且缺乏糖基化信號)的變體。一方面，本發(fā)明提供融合蛋白，其包含融合到人免疫球蛋白fc區(qū)的變體n1-n2序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多肽的藥物組合物以及治療或預(yù)防與錯折疊和/或聚集的淀粉狀蛋白相關(guān)的疾病的方法，該方法通過對患有此類疾病或有此類疾病素因的受試者施用此類藥物組合物進(jìn)行。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明多肽的核酸分子，以及包含那些核酸分子的載體和含有此類載體的細(xì)胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于制備本發(fā)明多肽的方法。特別地，此類方法采用含有包含此類核酸分子的載體的核酸分子和/或細(xì)胞。附圖簡述圖1呈現(xiàn)了具有通過粗體和下劃線鑒定的五個t細(xì)胞表位和斜體的推定的糖基化信號的n1-n2-higg1-fc融合蛋白的氨基酸序列(seqidno:1)。氨基酸1-217構(gòu)成野生型g3p序列的n1-n2部分。氨基酸218-256代表由m13噬菌體中存在的野生型g3p富含甘氨酸的n2-c-端接頭組成的接頭區(qū)。該區(qū)域由陰影鑒定。氨基酸257-261代表由用于構(gòu)建編碼融合蛋白的核酸分子的多克隆位點編碼的氨基酸。蛋白質(zhì)的igg-fc部分開始于氨基酸262。圖2呈現(xiàn)了通過粗體和下劃線鑒定的三個t細(xì)胞表位和斜體、粗體和加下劃線的假定的糖基化信號的另一種g3p-higg1-fc融合蛋白的氨基酸序列(seqidno:2)。與seqidno:1相比，已經(jīng)通過取代v215a和g220e消除了第四個t細(xì)胞表位，并且已經(jīng)通過缺失對應(yīng)于seqidno:1的氨基酸258和259的氨基酸消除了第五個t細(xì)胞表位。圖3呈現(xiàn)了編碼具有n端哺乳動物信號序列的seqidno:1的g3p-higg1-fc融合蛋白的dna序列(seqidno:3)。圖4呈現(xiàn)了編碼具有n端哺乳動物信號序列的seqidno:2的g3p-higg1-fc融合蛋白的dna序列(seqidno:4)。圖5提供了在實施例1中描述的研究中表達(dá)的供體同種異型的頻率的比較。圖6呈現(xiàn)了本發(fā)明的多肽的氨基酸序列(seqidno:5)，其是與seqidno:2相比具有推定的糖基化信號(t41g)、表位1(t56h)和表位3(k174r)中的氨基酸變化的g3p-higg1-fc融合蛋白。取代的氨基酸是粗體、斜體、下劃線和灰色突出顯示。圖7呈現(xiàn)了編碼具有n端哺乳動物信號序列的多肽86的質(zhì)粒的dna序列(seqidno:6)。包括信號序列的編碼序列用粗體表示。與編碼seqidno:1的dna相比，密碼子變化由下劃線表示。圖8呈現(xiàn)了編碼具有n端哺乳動物信號序列的多肽86t41g的質(zhì)粒的dna序列(seqidno:7)。包括信號序列的編碼序列用粗體表示。與編碼seqidno:1的dna相比，密碼子變化由下劃線表示。圖9描繪了將seqidno:1的多肽與多肽86和多肽86t41g進(jìn)行比較的sds-page分析。圖10描繪了比較seqidno:1的多肽與多肽86和多肽86t41g的濾器延遲測定法(filterretardationassay)的結(jié)果。圖11描繪了如通過elisa測量，seqidno:1的多肽與多肽86t41g對三種不同類型纖維的比較結(jié)合。發(fā)明詳述在本申請中，關(guān)于參照(未修飾)氨基酸或核酸序列的術(shù)語“變體”(及其同源詞)是指含有一個或多個氨基酸取代、缺失或插入或密碼子的相應(yīng)取代、缺失或插入的序列。參照序列也稱為“起始氨基酸序列”或“起始序列”。變體不一定需要參照序列的物理操縱。只要序列與參照序列相比含有不同的氨基酸，它將被認(rèn)為是“變體”，而不管其是如何合成的。如本文中所用，術(shù)語“突變體”(及其同源詞)是指與本申請中所列的特定序列(例如，seqidno:1，seqidno:2等)相比已經(jīng)修飾的起始序列。如本文中所用，術(shù)語“修飾”(及其同源詞)是指參照氨基酸序列或核酸序列中的變化。當(dāng)起始序列被修改時，得到的序列是變體。修飾包括一個或多個氨基酸取代、缺失或插入，或相應(yīng)的密碼子的取代、缺失或插入。如本文中所用，術(shù)語“相應(yīng)的取代”是指在seqidno:1的氨基酸1-217的突變體或片段中的取代，在此類突變體或片段與seqidno:1的氨基酸1-217比對時，所述取代對應(yīng)于表1、表2、表6或表7中的等同氨基酸取代。結(jié)合和/或解聚淀粉狀蛋白的seqidno:1的氨基酸1-217的片段的例子包括但不限于包含seqidno:1的氨基酸1-67的任何片段。結(jié)合和/或解聚淀粉狀蛋白的seqidno:1的氨基酸1-217的突變體的例子包括但不限于：(1)seqidno:2的氨基酸1-217；(2)seqidno:1的氨基酸1-217、seqidno:2的氨基酸1-217、或攜帶用aaa取代氨基酸43-45處的vvv的seqidno:5的氨基酸1-217；(3)seqidno:1的氨基酸1-217、seqidno:2的氨基酸1-217、或具有取代c53w的seqidno:5的氨基酸1-217；(4)seqidno:1的氨基酸1-217、seqidno:2的氨基酸1-217、或具有氨基酸96-103缺失的seqidno:5的氨基酸1-217；(5)seqidno:1的氨基酸1-217、seqidno:2的氨基酸1-217、或攜帶用aga取代氨基酸212-214處的qpp的seqidno:5的氨基酸1-217；(6)seqidno:1的氨基酸1-217、seqidno:2的氨基酸1-217、或具有seqidno:5的取代w181a、f190a和f194a的氨基酸1-217；(7)pct/us2012/066793中公開的其它活性突變體和片段；(8)seqidno:5的氨基酸1-217；(9)seqidno:1的氨基酸2-217、seqidno:2的氨基酸2-217、或seqidno:5的氨基酸2-217；(10)seqidno:1的氨基酸3-217、seqidno:2的氨基酸3-217、或seqidno:5的氨基酸3-217；(11)下列任一項：seqidno:1的氨基酸1-217、seqidno:2的氨基酸1-217、或含有另外的n端甲硫氨酸殘基的seqidno:5的氨基酸1-217。絲狀噬菌體g3p蛋白的n1-n2部分先前已顯示具有淀粉狀蛋白結(jié)合和解聚性質(zhì)(參見pct/us2012/066793)。天然m13噬菌體的n1-n2部分由seqidno:1的氨基酸1-217表示。同樣的n1-n2氨基酸序列也存在于fd和f1絲狀噬菌體中。應(yīng)當(dāng)理解，seqidno:1的氨基酸218-256也是天然g3p序列的一部分，并且通常稱為連接g3p的n2區(qū)與g3p(ct)的c端域(也稱為n3域)的富含甘氨酸的接頭。seqidno:1的氨基酸257-261表示由用于構(gòu)建編碼seqidno:1的融合蛋白的核酸分子的多克隆位點編碼的氨基酸。多肽因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含起始氨基酸序列的變體的多肽，其中所述起始氨基酸序列選自：seqidno:1的氨基酸1-217或seqidno:2的氨基酸1-217和具有一種或多種下述修飾的任何前述項的突變體：用aaa取代氨基酸43-45處的vvv；取代c53w；氨基酸96-103的缺失；用aga取代氨基酸212-214處的qpp；取代w181a、f190a和f194a；氨基酸1的缺失；氨基酸1和2的缺失；和n端甲硫氨酸殘基的添加，其中：(a)修飾所述起始氨基酸序列以除去氨基酸39-41處的推定的糖基化信號；并且(b)所述多肽結(jié)合和/或解聚淀粉狀蛋白。在該實施方案的一個方面中，起始氨基酸序列選自seqidno:1的氨基酸1-217和seqidno:2的氨基酸1-217。如下實現(xiàn)推定的糖基化信號的消除：n39、a40和/或t41的一處或多處的氨基酸取代；n39、a40和/或t41的一處或多處的缺失；在n39和a40之間插入一個或多個氨基酸；并且在a40和t41之間插入一個或多個氨基酸，只要此類缺失、缺失或插入不再生糖基化信號。推定的糖基化序列是asn-x-thr/ser，其中x是除pro或cys外的任何氨基酸。因此，僅a40的某些取代將消除糖基化序列。在這些實施方案的一個方面，通過n39、a40和/或t41的一處或多處的氨基酸取代來實現(xiàn)消除推定的糖基化信號。在這些實施方案的更具體的方面中，通過氨基酸取代t41實現(xiàn)了推定的糖基化信號的消除。在這些實施方案的更具體的方面中，通過以下任何取代來實現(xiàn)推定的糖基化信號的消除：t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n、或t41a。在這些實施方案的最具體方面中，通過t41g取代來實現(xiàn)推定的糖基化信號的消除。在本發(fā)明的另一個實施方案中，與包含起始氨基酸序列的相應(yīng)多肽相比，已經(jīng)修飾為除去氨基酸39-41處推定的糖基化信號的多肽另外具有降低的免疫原性；并且與起始氨基酸序列相比，該變體具有1至9個氨基酸取代(除了已經(jīng)消除糖基化信號的任何取代之外)，其中每個氨基酸取代選自表1和表2中列出的氨基酸取代組。如本文中所用，術(shù)語“包含起始氨基酸序列的相應(yīng)多肽”是指除了糖基化信號的修飾和另外的取代之外，具有與包含起始氨基酸序列的多肽相同的氨基酸序列的多肽。表1：對seqidno:1或seqidno:3的氨基酸1-217的去免疫氨基酸取代。表2：對seqidno:1或seqidno:3的氨基酸1-217的交替或別的去免疫氨基酸取代。*在表1和表2中，指出的氨基酸各自在seqidno:1和3中相同。通過鑒定完全存在于n1-n2氨基酸序列內(nèi)的t細(xì)胞表位，得出表1和表2中列出的氨基酸取代。這通過針對來自最佳代表hla-dr同種異型的世界人口的社區(qū)血液供體分組的外周血單核細(xì)胞(pbmc)溫育n1-n2序列的不同重疊的肽部分鑒定潛在的t細(xì)胞表位完成。然后，將該信息針對已知t細(xì)胞表位的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行軟件分析，以鑒定那些潛在表位內(nèi)的最佳氨基酸取代。在實施例中詳細(xì)描述這些程序。在這些實施方案的一個方面中，1-9個另外的氨基酸取代(除了已經(jīng)消除糖基化信號的任何取代之外)選自表1中列出的那些。在上文列出的實施方案的更具體的方面中，多肽包含seqidno:1的氨基酸1-217的變體或僅具有特定單氨基酸取代的seqidno:2的氨基酸1-217的變體，其中取代選自表3中列出的取代之一：表3：seqidno:1的氨基酸1-217或seqidno:2的氨基酸1-217中的特定去免疫單氨基酸取代g48hg48kg48rg48sg48tt51gt51ht51kt51pt51rt51qt51ny54gy54hy54ky54py54rt56gt56ht56kt56pt56rm135am135dm135gm135hm135km135nm135rm135tr140ar140dr140er140gr140hr140qf141df141en143an143gs173gs173pm176gm176hm176km176nd178gd178nd178qd178sw181gw181hw181kw181rs173kk174rm176rd178t在這些實施方案的甚至更具體的方面中，特定的單氨基酸取代不在表位2(seqidno:1的氨基酸135-143)中。在一些實施方案中，多肽包含具有2-9個氨基酸取代(除了已經(jīng)消除糖基化信號的任何取代外)的seqidno:1的氨基酸1-217的變體或seqidno:2的氨基酸1-217的變體，其中所述取代位于表位1、2和3中的至少兩個中，并且其中所述取代選自表1和2中列出的取代。在更具體的方面中，在seqidno:1的氨基酸1-217的變體或seqidno:2的氨基酸1-217的變體中的至少兩個取代選自表1中列出的那些取代。在甚至更具體的方面中，多肽包含僅具有兩個氨基酸取代的seqidno:1或seqidno:2的變體，其中取代選自表4中列出的任何特定的兩個氨基酸取代：表4：seqidno:1的氨基酸1-217或seqidno:2的氨基酸1-217的兩個特定的去免疫氨基酸：y54k和m135ky54k和m135ty54k和r140qy54r和m135ky54r和m135ty54r和r140qt56h和m135kt56h和m135tt56h和r140qt56k和m135kt56k和m135tt56k和r140qy54k和d178ny54k和w181hy54k和w181ry54k和k174ry54r和d178ny54r和w181hy54r和w181ry54r和k174rt56h和d178nt56h和w181ht56h和w181rt56h和k174rt56k和d178nt56k和w181ht56k和w181rt56k和k174rm135k和d178nm135k和w181hm135k和w181rm135k和k174rm135t和d178nm135t和w181hm135t和w181rm135t和k174rr140q和d178nr140q和w181hr140q和w181rr140q和k174r在這些實施方案的更具體的方面中，兩個氨基酸取代都不在表位2(seqidno:1的氨基酸135-143)中。在這些實施方案的甚至更具體的方面中，兩個氨基酸取代是t56h和k174r。在另一個實施方案中，多肽包含seqidno:1的氨基酸1-217的變體或seqidno:2的氨基酸1-217的變體，其具有3-9個氨基酸取代(除了已經(jīng)消除了糖基化信號的任何取代外)，其中至少一個氨基酸取代在表位1、2和3之每種中，并且其中取代選自表1和表2中列出的取代。在更具體的方面中，seqidno:1的氨基酸1-217的變體或seqidno:2的氨基酸1-217的變體中的至少三個氨基酸取代選自表2中列出的取代。在甚至更具體的方面中，包含seqidno:1的氨基酸1-217的變體或seqidno:2的氨基酸1-217的變體的多肽僅具有三個氨基酸取代，其中所述取代選自表5中列出的任何特定的三個氨基酸取代。表5：seqidno:1的氨基酸1-215，seqidno:2的氨基酸1-217中的特定的去免疫的三個氨基酸取代：在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含g3p變體的多肽，其中1至9個取代之一是選自v215a、v215s、v215gorv215t、v215c、v215d、v215e、v215f、v215h、v215k、v215n、v215p、v215q或v215r的表位4中的取代。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含seqidno:1的氨基酸1-217的變體的多肽，其中1至9個取代之一是選自v215a、v215s、v215g、v215t、v215c、v215d、v215e、v215f、v215h、v215k、v215n、v215p、v215q或v215r的表位4中的取代。通過測試n1-n2序列的重疊潛在t細(xì)胞表位肽部分，申請人已經(jīng)確定seqidno:1中的v215是潛在t細(xì)胞表位(圖1中的表位4)的一部分，其跨越seqid的氨基酸215-223(n2的末端到富含甘氨酸的接頭的一部分)。在該實施方案的更具體的方面中，表位4具有v215a和g220e取代(如seqidno:2中一樣)。此外，與seqidno:1相比，表位4中的單一v215g取代不影響多肽結(jié)合或解聚淀粉狀蛋白的能力。通過軟件和數(shù)據(jù)庫分析類似地預(yù)測了上文列出的v215的每個其它取代以消除t細(xì)胞表位，同時對淀粉狀蛋白結(jié)合幾乎沒有或沒有影響。在更具體的方面中，包含seqidno:1的氨基酸1-217的變體的多肽具有除去在氨基酸39-41處推定的糖基化位點的修飾；上文列出的任一種v215取代；以及表1或表2中列出的1-8個氨基酸取代。在甚至更具體的實施方案中，1-8個氨基酸取代選自表1中列出的那些。在甚至更具體的方面，多肽具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代；選自v215a、v215s、v215gorv215t、v215c、v215d、v215e、v215f、v215h、v215k、v215n、v215p、v215q和v215r的v215取代；和選自表3中列出的那些取代的一種另外的單一氨基酸取代，其中單個氨基酸取代不在表位2。在更具體的方面中，包含seqidno:1的氨基酸1-217的變體的多肽具有除去氨基酸39-41處推定的糖基化位點的修飾；上文列出的任一種v215取代；和2-8個另外的氨基酸取代，其中另外的取代在表位1、2和3中的至少兩個中，并且其中取代選自表1或表2中所列的那些。在甚至更具體的實施方案中，表位1、2和3中至少兩種中的至少一個取代選自表1中列出的取代。在甚至更具體的實施方案中，多肽具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代；選自v215a、v215s、v215gorv215t、v215c、v215d、v215e、v215f、v215h、v215k、v215n、v215p、v215q和v215r的v215取代；和表4中列出的具體兩個氨基酸取代之一，其中氨基酸取代都不在表位2中。在更具體的方面中，包含seqidno:1的氨基酸1-217的變體的多肽具有除去氨基酸39-41處推定的糖基化位點的修飾；上文列出的任一種v215取代；和選自表1或表2中列出的取代的3-8個另外的氨基酸取代，其中表位1、2和3之每種包含另外的取代之一。在更具體的實施方案中，表位1、2和3之每種中的取代選自表1中列出的取代。在更具體的實施方案中，多肽具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代；選自v215a、v215s、v215gorv215t、v215c、v215d、v215e、v215f、v215h、v215k、v215n、v215p、v215q和v215r的v215取代；任選的g220e取代；和表5中列出的具體三個氨基酸取代之一。在更具體的實施方案中，多肽包含seqidno:2的氨基酸1-217的變體，其具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代；和選自表4中列出的取代的一對取代，其中取代之一在表位1中，并且另一個在表位3中。在該實施方案的一個方面中，t41取代是t41g。在該實施方案的備選方面中，一對取代是t56h和k174r，其中取代之一在表位1中，而另一個在表位3中。在該實施方案的甚至更具體的方面中，多肽包含seqidno:5的氨基酸1-215。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽是基本上由經(jīng)由肽接頭或直接與變體g3p氨基酸序列的c末端融合的人或人源化免疫球蛋白fc多肽序列組成的融合蛋白。如本文中所用，術(shù)語“肽接頭”是指不干擾多肽功能的一系列連續(xù)氨基酸。如上闡述，在seqidno:1和3中，氨基酸218-256代表通常存在于m13g3p蛋白質(zhì)中的富含甘氨酸的接頭?？梢栽诒景l(fā)明的多肽中使用該接頭或可以用不同的接頭替換它?；蛘?，fc多肽序列可以直接連接到編碼n2的最后一個氨基酸(例如，seqidno:1和3的氨基酸217)?？紤]到可用于本發(fā)明多肽的重組表達(dá)的載體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行接頭序列選擇和/或其缺乏，并且任何二級或三級結(jié)構(gòu)(如接頭)可賦予多肽。在該實施方案的一個方面中，fc多肽是人igg的fc部分。在更具體的方面中，多肽是seqidno:1或seqidno:3的變體，其具有除去氨基酸39-41處推定的糖基化位點的修飾。在甚至更具體的方面中，多肽是seqidno:1或seqidno:2的變體，其具有除去氨基酸39-41處推定的糖基化位點的修飾；和其中的1至9個另外的氨基酸殘基取代，其選自下述表1、表2或表6或表7中列出的氨基酸取代的組：表6：對seqidno:1的氨基酸215-223的去免疫氨基酸取代。表7：對seqidno:1的氨基酸215-223的交替和另外的去免疫氨基酸取代。*v215a和g220e已經(jīng)在seqidno:2中被取代，使得seqidno:2的變體不含在這些氨基酸殘基處的進(jìn)一步的取代。在一個實施方案中，多肽是seqidno:1的變體，其具有除去氨基酸39-41處推定的糖基化位點的修飾；和2-9個另外的氨基酸取代，其中另外的取代之一是表6和表7中列出的取代；并且取代中的至少另一個是表1和表2中列出的取代。在該實施方案的更具體的方面中，另外的取代之一是表6中列出的取代；并且取代中的至少另一個是表1中列出的取代。在該實施方案的甚至更具體的方面中，多肽沒有表位2中的取代。在該實施方案的另一個更具體的方面中，多肽具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代。在該實施方案的更具體的方面中，多肽具有t41g取代。在另一個實施方案中，多肽是seqidno:1的變體，其具有除去在氨基酸39-41處推定的糖基化位點的修飾；并且具有3-9個另外的氨基酸取代，其中至少一個另外的取代選自表6和表7中列出的取代，并且其中表位1、2和3中至少兩種含有至少一個選自表1和表2中列出的取代。在更具體的方面中，多肽具有表6中列出的取代中的至少一個和選自表1中列出的取代的表位1、2、3中至少兩種中的至少一個取代、在該實施方案的更具體的方面中，多肽沒有表位2中的取代。在該實施方案的另一個更具體的方面中，多肽具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代。在該實施方案的更具體的方面中，多肽具有t41g取代。在該實施方案的交替方面中，多肽僅具有兩個另外的取代，其中一個在表位1上，而另一個在表位3中。在該實施方案的甚至更具體的方面，多肽僅具有兩個另外的取代，其中一個是t56h，而另一個是k174r。在另一個實施方案中，多肽是seqidno:1的變體，其具有除去在氨基酸39-41處推定的糖基化位點的修飾；并具有4-9個氨基酸取代；表6和表7中列出的至少一個取代；以及選自表1和表2中列出的取代的表位1、2和3之每種中的至少一個取代。在該實施方案的具體方面中，多肽具有表6中列出的至少一個取代和表位1、2和3之每種中選自表1中所列的取代的至少一個取代。在另一個更具體的方面中，多肽具有表6中列出的至少一個取代；以及至少一個具體取代，分別在表3、表4或表5中列出的一個、兩個或三個氨基酸取代。在該實施方案的另一個更具體的方面中，多肽是seqidno:1的變體，并且具有表6中列出的氨基酸取代之僅一種和選自下組的僅一個、兩個或三個另外的氨基酸取代：分別列于表3、表4或表5中的特定的一個、兩個或三個氨基酸取代之一。在該實施方案的另一個甚至更具體的方面中，多肽具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代。在該實施方案的更具體的方面中，多肽具有t41g取代。在替換實施方案中，多肽是seqidno:2的變體，其具有除去在氨基酸39-41處推定的糖基化位點的修飾；和1至9個另外的氨基酸殘基取代，其選自表1和表2中列出的氨基酸取代的組。在更具體的方面中，至少一個另外的取代在表1中列出。在該實施方案的甚至更具體的方面中，多肽沒有表位2中的取代。在該實施方案的另一個甚至更具體的方面中，多肽具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代。在該實施方案的更具體的方面，多肽具有t41g取代。在另一個實施方案中，多肽是seqidno:2的變體，其具有除去在氨基酸39-41處推定的糖基化位點的修飾；和2-9個另外的氨基酸取代和表位1、2和3的至少兩種中的至少一個取代，其選自表1和2中列出的任何取代。在更具體的方面，表位1、2和3的至少兩種中的至少一個取代選自表1中列出的取代。在該實施方案的甚至更具體的方面，多肽沒有表位2中的取代。在該實施方案的另一個甚至更具體的方面，多肽具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代。在該實施方案的更具體的方面中，多肽具有t41g取代。在該實施方案的另一方面，多肽包含表位1中至少一個氨基酸取代和表位3中至少一個氨基酸取代。在該實施方案的甚至更具體的方面中，多肽包含t56h和k174r取代。在另一個更具體的方面中，多肽是seqidno:2或seqidno:5的變體，并且具有3-9個氨基酸取代，其中至少一個取代在表位1、2和3之每種中，并且選自表1和表2中列出的任何取代。在更具體的方面，表位1、2和3之每種中的至少一個取代選自表1中列出的取代。在甚至更具體的實施方案中，該多肽是seqidno:2或seqidno:5的變體，并且僅具有一個、兩個或三個氨基酸取代，其選自分別在表3、表4或表5中所列的特定的一個、兩個或三個氨基酸取代之一。在該實施方案的甚至另一個更具體的方面中，多肽具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代。在該實施方案的更具體的方面中，多肽具有t41g取代。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽是seqidno:2的變體，其具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代；和僅2個另外的氨基酸取代，其選自表4中列出的任何特定的兩個氨基酸取代。在該實施方案的具體方面中，多肽具有t41g取代。在該實施方案的更具體的方面中，多肽具有t41g取代。在該實施方案的另一個更具體的方面，一個另外的氨基酸取代在表位1中，而另一個另外的氨基酸取代在表位3中。在該實施方案的更具體的方面中，一個另外的氨基酸取代是t56h，而另一個另外的氨基酸取代是k174r。在該實施方案的甚至更具體的方面中，多肽具有seqidno:5中列出的氨基酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽是seqidno:2的變體，其具有選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的t41取代；和僅3個另外的氨基酸取代，其選自表5中列出的任何特定的三個氨基酸取代。在該實施方案的具體方面中，多肽具有t41g取代。核酸分子、序列、載體和宿主細(xì)胞在其它實施方案中，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼包含上述g3p變體的任何多肽或融合蛋白的核酸序列。在該實施方案的一個方面中，分離的核酸分子包含seqidno:3的核苷酸64-714或seqidno:5的核苷酸64-708的變體，其通過破壞由seqidno:3或4的核苷酸181-189(對應(yīng)于seqidno:1或3的氨基酸39-41處的氨基酸nat)編碼的推定的糖基化位點的密碼子取代、框內(nèi)密碼子插入或框內(nèi)密碼子缺失修飾。在這些實施方案的更具體的方面中，seqidno:3或4的核苷酸64-714的變體通過密碼子取代修飾，所述密碼子取代破壞由seqidno:3或4的核苷酸181-189編碼的推定的糖基化位點。在這些實施方案的甚至更具體的方面中，seqidno:3或4的核苷酸64-714的變體通過在核苷酸187-189(其編碼seqidno:1和2的t41)處的密碼子取代修飾，所述密碼子取代編碼選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的氨基酸取代。在這些實施方案的甚至更具體的方面，取代的密碼子取代選自gga、tgg、cat、gtt、att、ctt、agg、aaa、tat、ttc、gac、gag、cag、aat和gct。在這些實施方案的甚至更具體的方面中，seqidno:3或4的核苷酸64-714的變體通過編碼氨基酸取代t41g的核苷酸187-189處的密碼子取代修飾。在這些實施方案的甚至更具體的方面中，取代的密碼子取代是gga。在另一個實施方案中，除了破壞由seqidno:3或4的核苷酸181-189編碼的推定的糖基化位點的修飾外，seqidno:3或4的核苷酸64-714的變體還由1-9個密碼子取代組成，其中每個密碼子取代對應(yīng)于選自表1和表2中列出的取代的氨基酸取代，以及以下v215氨基酸取代中的任一種：v215a、v215s、v215g或v215t、v215c、v215d、v215e、v215f、v215h、v215k、v215n、v215p、v215q和v215r。在這些實施方案的甚至更具體的方面中，變體核酸序列通過選擇用于編碼上文列出的任一種v215氨基酸取代的一個密碼子取代；以及1-8個另外的密碼子取代來修飾，其中選擇每個另外的密碼子取代來編碼表1中列出的氨基酸取代。在這些實施方案的更具體的方面，變體核酸序列通過選擇編碼上文列出的任一種v215氨基酸取代的一個密碼子取代；和2-8個另外的密碼子取代修飾，其中每個另外的密碼子取代編碼表1中列出的氨基酸取代，并且密碼子取代存在于表位1、2和3中的至少兩個中的每一個中。在更具體的實施方案中，通過選擇用于編碼上文列出的任一種v215氨基酸取代的一個密碼子取代；和3-8個另外的密碼子取代來修飾，其中每個另外的密碼子取代編碼表1中列出的氨基酸取代，并且密碼子取代存在于表位1、2和3之間每個中。在更具體的實施方案中，變體核酸序列通過選擇用于編碼v215a氨基酸取代的一個密碼子取代；和選擇用于編碼表3中列出的單個氨基酸取代之一的一個另外的密碼子取代修飾。在該實施方案的更具體的方面，選擇用于編碼表3中列出的單個氨基酸取代之一的一個另外的密碼子取代不編碼表位2中的氨基酸取代。在另一個具體實施方案中，變體核酸序列通過選擇用于編碼上文列出的v215a氨基酸取代的一個密碼子取代修飾；和選擇用于編碼表4中列出的特定兩個氨基酸取代之一的兩個另外的密碼子取代修飾。在該實施方案的更具體的方面中，選擇用于編碼表4中列出的特定的兩個氨基酸取代之一的兩個另外的密碼子取代不編碼表位2中的氨基酸取代。在更具體的實施方案中，變體核酸序列通過選擇用于編碼上文列出的v215氨基酸取代的一個密碼子取代；和選擇用于編碼表5中列出的特定三個氨基酸取代之一的三個另外的密碼子取代來修飾。在其它實施方案中，分離的核酸分子包含seqidno:3的核苷酸64-1530或seqidno:6的核苷酸64-1524的變體，其中所述序列通過破壞由seqidno:3或4的核苷酸181-189編碼的推定的糖基化位點(對應(yīng)于seqidno:1或3的氨基酸39-41處的氨基酸nat)的密碼子取代、框內(nèi)密碼子插入或框內(nèi)密碼子缺失修飾。在這些實施方案的更具體的方面，seqidno:3的核苷酸64-1530或seqidno:4的核苷酸64-1524的變體通過密碼子取代修飾，所述密碼子取代破壞由seqidno:3或4的核苷酸181-189編碼的推定的糖基化位點。在這些實施方案的更具體的方面，seqidno:3的核苷酸64-1530或seqidno:4的核苷酸64-1524的變體通過核苷酸187-189(即，其編碼seqidno:1和2的t41)處的密碼子取代修飾，所述密碼子取代編碼選自t41g、t41w、t41h、t41v、t41i、t41l、t41r、t41k、t41y、t41f、t41d、t41e、t41q、t41n和t41a的密碼子取代。在這些實施方案的甚至更具體的方面，取代的密碼子取代選自gga、tgg、cat、gtt、att、ctt、agg、aaa、tat、ttc、gac、gag、cag、aat和gct。在這些實施方案的甚至更具體的方面，seqidno:3或4的核苷酸64-714的變體通過編碼氨基酸取代t41g的核苷酸187-189處的密碼子取代修飾。在這些實施方案的更具體的方面，取代的密碼子取代是gga在另一個實施方案中，除了破壞由seqidno:3或4的核苷酸181-189編碼的推定的糖基化位點的修飾外，seqidno:3的核苷酸64-1530或seqidno:4的核苷酸64-1524的變體進(jìn)一步由1-9個密碼子取代組成，其中每個密碼子取代對應(yīng)于選自表1，表2中列出的取代和下列v215氨基酸取代中的任一個：v215s、v215g或v215t、v215c、v215d、v215e、v215f、v215h、v215k、v215n、v215p、v215q和v215r。在該實施方案的更具體的方面，每個密碼子取代對應(yīng)于選自表1中列出的取代和上文列出的任一個v215取代。在更具體的實施方案中，變體核酸序列通過選擇用于編碼上文列出的任一個v215氨基酸取代的一個密碼子取代和1-8個另外的密碼子取代修飾，其中每個另外的密碼子取代對應(yīng)于選自表1中列出取代的氨基酸取代。在更具體的方面，該變體具有對應(yīng)于表3中列出的特定一個氨基酸取代之一的一個另外的密碼子取代。在該實施方案的更具體的方面，選擇用于編碼表3中列出的單個氨基酸取代之一的一個另外的密碼子取代不編碼表位2中的氨基酸取代。在另一個實施方案中，除了破壞由seqidno:3或4的核苷酸181-189編碼的推定的糖基化位點的修飾外，seqidno:3的核苷酸64-1530或核苷酸64-1524的變體具有由選擇用于編碼上文列出的任一個v215氨基酸取代的一個密碼子取代；和2-8個另外的密碼子取代組成的修飾，其中每個另外的密碼子取代對應(yīng)于表1中列出的氨基酸取代，并且密碼子取代存在于表位1、2和3中的至少兩個中的每個中。在更具體的方面，該變體具有對應(yīng)于表4中列出的特定的兩個氨基酸取代之一的兩個另外的密碼子取代。在該實施方案的更具體的方面，選擇用于編碼表4中列出的特定的兩個氨基酸取代之一的兩個另外的密碼子取代不編碼表位2中的氨基酸取代。在該實施方案的更具體的方面，表4中的特定的兩個氨基酸取代是t56h和k174r。在該實施方案的更具體的方面，變體核苷酸序列是seqidno:8。在另一個實施方案中，除了破壞seqidno:3或4的核苷酸181-189編碼的推定的糖基化位點的修飾之外，seqidno:3的核苷酸64-1530，或seqidno:6的核苷酸64-1524中任一個的變體具有由一個選擇用于編碼任一個上文列出的v215氨基酸取代的密碼子取代；和3-8個另外的密碼子取代組成的修飾，其中每個另外的密碼子取代對應(yīng)于表1中列出的氨基酸取代，并且在表位1、2和3之每種中存在密碼子取代。在更具體的方面，變體具有對應(yīng)于表5中列出的特定三個氨基酸取代之一的三個另外密碼子取代。在本發(fā)明的核酸分子的其它實施方案中，核酸分子還包含編碼信號序列的核酸序列，所述信號序列同相(inphase)且直接與編碼變體g3p的核酸序列的5'端融合。在這些實施方案的一個方面，編碼信號序列的核酸序列是seqidno:3的核苷酸1-63。本發(fā)明的核酸分子涵蓋與上文描述的任何核酸的核酸分子簡并，但編碼與由上文描述的任何核酸的核酸分子編碼的相同氨基酸序列的核酸序列。對于重組生產(chǎn)，本發(fā)明的任何核酸分子可以插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，該載體含有插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件，或者在rna病毒載體的情況下，復(fù)制和翻譯的必要元件。編碼核酸以適當(dāng)?shù)拈喿x框插入載體中。因此，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸分子和序列的載體。該載體包括但不限于dna載體、噬菌體載體、病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。克隆本發(fā)明的核酸分子和序列的適當(dāng)載體的選擇可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用載體與所選擇的實施表達(dá)的宿主細(xì)胞的相容性的公知知識來進(jìn)行。這可以在任何哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞等中完成。這些細(xì)胞類型中的每一種的合適載體是本領(lǐng)域公知的，并且通常是可商購的。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了攜帶含有本發(fā)明的核酸分子或核酸序列的載體的宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化或以其他方式使本發(fā)明的載體進(jìn)入宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。攜帶載體的細(xì)胞在合適條件下培養(yǎng)時將產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。用于重組生產(chǎn)本發(fā)明多肽的載體和細(xì)胞的具體實例在下面的實施例部分中列出。藥物組合物在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含含有變體g3p的任何多肽或融合蛋白(任選地與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑一起)的藥物組合物?！八幬锝M合物”是指治療有效量的具有生理學(xué)上合適的載體和/或賦形劑的如本文中所述的組合物。藥物組合物不對生物體引起顯著的刺激?？苫Q使用的短語“生理上合適的載體”和“藥學(xué)上可接受的載體”是指不對生物體引起顯著刺激并且不消除所施用的組合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。術(shù)語“賦形劑”是指添加到藥物組合物以進(jìn)一步促進(jìn)活性成分施用的惰性物質(zhì)。實例但不限于包括例如鹽水、碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和淀粉類型、纖維素衍生物、明膠、植物油、聚乙二醇和表面活性劑，包括例如聚山梨酯(polysorbate)20?？梢允褂靡环N或多種包含賦形劑和助劑的生理學(xué)上可接受的載體(其有利于將活性成分加工成藥學(xué)上可使用的組合物)以常規(guī)方式配制根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物。適當(dāng)?shù)呐渲苿┤Q于所選擇的施用途徑和所遞送的組合物的性質(zhì)(例如，多肽的大小和溶解度)。在這些實施方案的一個方面，藥物組合物配制用于注射或輸注到患者的血液中。在這些實施方案的另一方面，藥物組合物配制用于直接施用于患者的腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)，例如通過直接髓內(nèi)、鞘內(nèi)或心室內(nèi)注射。本文中所述的組合物可以配制用于腸胃外施用，例如通過推注或連續(xù)輸注。用于腸胃外施用的藥物組合物包括水溶性形式的組合物的水溶液。此外，活性成分的懸浮液可以制備為油性或基于水的注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，懸浮液還可含有合適的穩(wěn)定劑或藥劑(例如表面活性劑如聚山梨酯(tween20))，其增加活性成分的溶解度以允許制備高度濃縮的溶液?？梢允褂没诘鞍踪|(zhì)的藥劑，如例如白蛋白來阻止本發(fā)明的多肽吸附到遞送表面(即，iv袋、導(dǎo)管、針等)上。對于口服施用，可以通過將活性化合物與本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體組合來容易地配制組合物。配制劑可以以單位劑量形式呈現(xiàn)于例如在小瓶、安瓿或多劑量容器(任選地具有防腐劑)中。組合物可以是在油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制藥劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。單一劑型可以為液體或固體形式。單一劑型可以不經(jīng)修飾直接施用于患者或者可以在施用前稀釋或重建。在某些實施方案中，單一劑型可以以推注形式施用，例如單次注射、單次口服劑量，包括含有多個片劑、膠囊，丸劑等的口服劑量。在備選實施方案中，可以在一段時間里施用單一劑型，如通過輸注，或經(jīng)由植入的泵，如icv泵。在后一個實施方案中，單一劑型可以是預(yù)填充適量的包含變體g3p的多肽或融合蛋白的輸液袋或泵儲器?；蛘?，輸液袋或泵儲器可以通過將適當(dāng)劑量的變體g3p與輸液袋或泵儲器溶液混合剛好在對患者施用前制備。本發(fā)明的另一方面包括制備本發(fā)明的藥物組合物的方法。用于制備藥物的技術(shù)可以參見例如"remington'spharmaceuticalsciences,"mackpublishingco.,easton,pa.(最新版本)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。適用于本發(fā)明上下文的藥物組合物包括其中以有效實現(xiàn)意圖目的的量含有活性成分的組合物。治療或診斷有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，特別是鑒于本文中提供的詳細(xì)公開內(nèi)容?？梢詥为氄{(diào)整劑量和間隔以提供足以治療或診斷特定腦疾病、病癥或狀況的噬菌體展示載體的腦水平(最小有效濃度，mec)。mec將隨每種制劑而異，但可以從體外數(shù)據(jù)估算。實現(xiàn)mec所必需的劑量取決于個體特征。也可以使用mec值確定劑量間隔。制劑應(yīng)使用方案施用，所述方案將腦水平維持在mec上達(dá)10-90％的時間，優(yōu)選在30-90％之間，最優(yōu)選為50-90％。根據(jù)要治療的狀況的嚴(yán)重性和響應(yīng)性，給藥可以是單次或多次施用，治療過程持續(xù)數(shù)天至數(shù)周或直到實現(xiàn)治愈或達(dá)到疾病狀態(tài)的減少。當(dāng)然，待施用的組合物的量將取決于治療或診斷的受試者、痛苦的嚴(yán)重性、處方醫(yī)生的判斷等。在某些實施方案中，要施用的多肽的量選自0.1-100mg/kg受試者體重；0.5-50mg/kg；1-30mg/kg；1-10mg/kg；3-30mg/kg；1-3mkg/kg；3-10mg/kg；和10-30mg/kg。在一些實施方案中，每周一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、或每月一次對受試者施用肽。如果需要的話，本發(fā)明的組合物可以呈現(xiàn)在包裝或分配器裝置中，如fda批準(zhǔn)的試劑盒，其可以含有一種或多種含有活性成分的單位劑型。包裝可以例如包括金屬或塑料箔，如泡罩包裝。包裝或分配器裝置可以附有用于施用的用法說明。包裝或分配器也可以由管理制造、使用或銷售藥物的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的格式與容器相關(guān)聯(lián)的通知來容納，該通知反映了該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)組合物或人或獸醫(yī)施用的形式。例如，此類通知可以是美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于處方藥的標(biāo)簽或批準(zhǔn)的產(chǎn)品插頁的通知。包含配制在相容的藥物載體中的本發(fā)明的制劑的組合物也可以制備，置于適當(dāng)?shù)娜萜髦?，并?biāo)記用于治療指定的狀況，如同上文進(jìn)一步詳述的那樣。應(yīng)當(dāng)理解，上文和下文的描述都僅僅是示例性和解釋性的，而不限制本發(fā)明，如要求保護(hù)。治療用途本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的多肽、核酸分子或組合物之任一種在治療蛋白質(zhì)錯折疊疾病中的用途，所述蛋白質(zhì)錯折疊疾病包括但不限于涉及以下任何一種的疾?。篺aβ42、fαsyn或ftau。在治療的情況下，術(shù)語“患者”、“受試者”和“受體”可互換使用，并且包括人以及其它哺乳動物。在一些實施方案中，患者是對于與蛋白質(zhì)錯折疊疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物呈陽性的人。在一個實施方案中，患者表現(xiàn)出β-淀粉狀蛋白沉積物，如通過用florbetapir的pet成像檢測。術(shù)語“治療”及其同源詞旨在意味著減輕、減緩或逆轉(zhuǎn)表現(xiàn)出疾病的一種或多種臨床癥狀的患者的疾病進(jìn)展?！爸委煛币惨鈭D指減輕、減緩或逆轉(zhuǎn)表現(xiàn)出疾病的一種或多種臨床癥狀的患者的疾病癥狀。在一個實施方案中，患者表現(xiàn)出如通過用florbetapir的pet成像檢測的β-淀粉狀蛋白沉積物，并且通過治療減少β-淀粉狀蛋白沉積物的數(shù)量。在一個實施方案中，患者表現(xiàn)出如通過本發(fā)明的多肽或多肽組合物檢測的β-淀粉狀蛋白沉積物，并且通過治療減少或維持β-淀粉狀蛋白沉積物的數(shù)量。在另一個實施方案中，患者表現(xiàn)出如通過pet成像檢測到的任何類型的淀粉狀蛋白沉積物，并且通過治療改善了患者的認(rèn)知功能。認(rèn)知功能的改善可以通過mckhannetal.,alzheimer’s&dementia7(3):263-9(2011)的方法和測試來測定?！邦A(yù)防”不同于治療，并且指在任何臨床癥狀發(fā)作前將組合物施用于個體。包括使用本發(fā)明的任何多肽或其組合物的預(yù)防。預(yù)防可以牽涉僅僅基于一種或多種遺傳標(biāo)志物而已知疾病風(fēng)險增加或確定形成疾病的個體。許多遺傳標(biāo)志物已被鑒定用于各種蛋白質(zhì)錯折疊疾病。例如，具有人淀粉狀蛋白前體蛋白(happ)中的瑞典突變(swedishmutation)、印第安納突變(indianamutation)或倫敦突變(londonmutation)之一種或多種的個體在形成早發(fā)性阿爾茨海默(alzheimer)氏病中的風(fēng)險增加，并且因此是用于預(yù)防的候選者。同樣，在亨廷頓蛋白基因中具有三核苷酸cag重復(fù)的個體，特別是具有36個或更多個重復(fù)的個體將最終形成亨廷頓(huntington)氏病，因此也是預(yù)防的候選者。術(shù)語“蛋白質(zhì)錯折疊”指以由聚集蛋白(淀粉狀蛋白形成肽)，諸如但不限于β-淀粉狀蛋白、血清淀粉狀蛋白a、半胱氨酸蛋白酶抑制劑c、iggkappa輕鏈或朊病毒蛋白形成淀粉狀蛋白為特征的疾病。已知與錯折疊和/或聚集淀粉狀蛋白有關(guān)的疾病包括阿爾茨海默氏病，其包括早發(fā)性阿爾茨海默氏病、遲發(fā)性阿爾茨海默氏病、和癥狀前阿爾茨海默氏病(presymptomaticalzheimer'sdisease)、帕金森氏病(parkinson’sdisease)、saa淀粉樣變性(saaamyloidosis)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑c(cystatinc)、遺傳性冰島綜合征(hereditaryicelandicsyndrome)、衰老(senility)、多發(fā)性硬化(multiplemyeloma)、朊病毒疾病(priondiseases)，包括但不限于庫魯病(kuru)、克羅伊茨費爾特-雅各布病(creutzfeldt-jakobdisease,cjd)、gerstmann-straussler-scheinker病(gss)、家族致命性失眠癥(fatalfamilialinsomnia，ffi)、羊瘙癢癥(scrapie)、和牛海綿狀腦炎(bovinespongiformencephalitis，bse)；肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，als)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellarataxia，sca1)、(sca3)、(sca6)、(sca7)、亨廷頓病、齒狀核紅核蒼白球丘腦下部核萎縮(entatorubral-pallidoluysianatrophy)、脊髓延髓肌肉萎縮癥(spinalandbulbarmuscularatrophy)、遺傳性腦淀粉狀蛋白血管病(hereditarycerebralamyloidangiopathy)、家族性淀粉樣變性(familialamyloidosis)、前顳葉癡呆(frontotemporallobedementia)、英國人/丹麥人癡呆(british/danishdementia)、進(jìn)行性核上麻痹(progressivesupranuclearpalsy，psp)和家族性腦病(familialencephalopathy)。可以使用本發(fā)明的多肽和組合物治療“蛋白質(zhì)錯折疊”疾病。這些錯折疊和/或聚集的淀粉狀蛋白蛋白質(zhì)疾病中的許多發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)中。cns中發(fā)生的疾病的一些例子是帕金森氏?。话柎暮Ｄ喜。活~顳癡呆(ftd)，包括具有以下臨床綜合征的患者：行為變型ftd(bvftd)、進(jìn)行性非流暢性失語(pnfa)和詞義性癡呆(sd)；額顳葉變性(ftld)；和亨廷頓氏病。本發(fā)明的多肽和組合物可用于治療以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)中發(fā)生的錯折疊和/或聚集的淀粉狀蛋白為特征的疾病。蛋白質(zhì)的錯折疊和/或聚集也可發(fā)生在cns之外。淀粉樣變性a(aa)(對此，前體蛋白是血清急性期載脂蛋白，saa)和多發(fā)性骨髓瘤(前體蛋白免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈)是兩種廣泛已知的在cns外部發(fā)生的蛋白質(zhì)錯折疊和/或聚集的蛋白質(zhì)疾病。其它實例包括由α2-微球蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白(transthyretin)(家族性淀粉樣多神經(jīng)病(familialamyloidoticpolyneuropathy)[fap]、家族性淀粉樣心肌病(familialamyloidoticcardiomyopathy)[fac]和老年系統(tǒng)性淀粉樣變性(senilesystemicamyloidosis)[ssa])、(載脂)血清aa((apo)serumaa)、載脂蛋白ai、aii和aiv、凝溶膠蛋白(芬蘭形式的家族性淀粉狀蛋白多神經(jīng)病(finnishformoffamilialamyloidoticpolyneuropathy))、溶菌酶、纖維蛋白原、半胱氨酸蛋白酶抑制劑c(腦淀粉狀蛋白血管病(cerebralamyloidangiopathy)，遺傳性腦出血伴淀粉樣變性，冰島型(hereditarycerebralhemorrhagewithamyloidosis,icelandictype))，(載脂)降鈣素、胰島淀粉狀蛋白多肽(iapp淀粉樣變性)、心房利鈉因子、催乳素、胰島素、lactahedrin、角質(zhì)上皮蛋白(kerato-epithelin)、乳鐵蛋白(lactoferrin)、牙源性成釉細(xì)胞相關(guān)蛋白和精液凝固蛋白i(semenogelini)形成的淀粉狀蛋白的疾病。本發(fā)明的多肽和組合物可用于治療涉及在cns外發(fā)生的蛋白質(zhì)的錯折疊和/或聚集的疾病。神經(jīng)變性性疾病還可以牽涉tau損傷。綜述于leeetal.,annu.rev.neurosci.24:1121-159(2001)。tau蛋白是中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元兩者的軸突中表達(dá)的微管關(guān)聯(lián)蛋白。涵蓋神經(jīng)變性tau病變(有時稱為tauopathies)。tau病變的實例包括阿爾茨海默氏病、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis)/帕金森-癡呆綜合征(parkinsonism-dementiacomplex)、嗜銀顆粒癡呆(argyrophilicgraindementia)、皮質(zhì)基底變性(corticobasaldegeneration)、克羅伊茨費爾特-雅各布病(creutzfeldt-jakobdisease)、拳擊員癡呆(dementiapugilistica)、彌漫性神經(jīng)原纖維纏結(jié)伴鈣化(diffuseneurofibrillarytangleswithcalcification)、唐氏綜合征(down’ssyndrome)、額顳癡呆(frontotemporaldementias)，包括與染色體17聯(lián)系的前顳癡呆伴帕金森癥(frontotemporaldementiawithparkinsonismlinkedtochromosome17)、病、哈-斯病(hallervorden-spatzdisease)、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良(myotonicdystrophy)、尼曼-皮克病c型(niemann-pickdiseasetypec)、非guamanian運(yùn)動神經(jīng)元病伴神經(jīng)原纖維纏結(jié)(non-guamanianmotorneurondiseasewithneurofibrillarytangles)、皮克氏病(pick’sdisease)、腦炎后帕金森病(postencephaliticparkinsonism)、朊病毒蛋白腦淀粉狀蛋白血管病(prionproteincerebralamyloidangiopathy)、進(jìn)行性皮質(zhì)下膠質(zhì)增生(progressivesubcorticalgliosis)、進(jìn)行性核上麻痹、亞急性硬化性全腦炎、和僅纏結(jié)的癡呆。這些疾病中的一些還可以包含纖維淀粉狀蛋白β肽的沉積物。例如，阿爾茨海默氏病表現(xiàn)出淀粉狀蛋白β沉積物和tau損傷兩者。類似地，朊病毒介導(dǎo)的疾病，如克羅伊茨費爾特-雅各布病、朊病毒蛋白腦淀粉狀蛋白血管病、和綜合征也可以具有tau損傷。因此，指出疾病是“tau病變”不應(yīng)解讀為從其它神經(jīng)變性性疾病分類或分組排除該疾病，其僅僅為了方便而提供。可以使用本發(fā)明的多肽和組合物治療神經(jīng)變性性疾病以及牽涉tau損傷的疾病。在一個實施方案中，藥物組合物或配制劑用于在表現(xiàn)出與淀粉狀蛋白存在相關(guān)的癥狀或?qū)τ谂c蛋白質(zhì)錯折疊疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，如florbetapir(av-45，elililly)呈陽性的患者中降低淀粉狀蛋白的方法，包括對患者施用有效量的如本文中所述的藥物組合物或配制劑。在一個實施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、實質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈內(nèi)注射或輸注。在一個實施方案中，藥物組合物或配制劑用于在表現(xiàn)出與淀粉狀蛋白存在相關(guān)的癥狀或?qū)τ谂c蛋白質(zhì)錯折疊疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，如florbetapir(av-45，elililly)呈陽性的患者中維持淀粉狀蛋白的水平的方法，包括對患者施用有效量的如本文中所述的藥物組合物或配制劑。在一個實施方案中，給藥途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、實質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈內(nèi)注射或輸注。在一個實施方案中，藥物組合物或配制劑用于在患者中解聚淀粉狀蛋白的方法，包括對具有淀粉狀蛋白的患者施用有效量的如本文中所述的藥物組合物或配制劑。在一個實施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、實質(zhì)內(nèi)注射或輸注，或靜脈內(nèi)注射或輸注。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或制劑用于引起腦中β-淀粉狀蛋白沉積物的解聚的方法，包括對有此需要的患者的腦直接注射有效量的如本文所述的藥物組合物，從而導(dǎo)致腦中的β-淀粉狀蛋白沉積物的降低。在備選實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或配制劑用于引起腦中的β-淀粉狀蛋白沉積物的解聚的方法，包括對有此需要的患者注射靜脈內(nèi)遞送有效量的如本文所述的藥物組合物，從而導(dǎo)致腦中的β-淀粉狀蛋白沉積物的減少。在一個實施方案中，藥物組合物或配制劑用于減少腦中淀粉狀蛋白形成的方法。減少大腦中的淀粉狀蛋白形成可以預(yù)防、治療或減少蛋白質(zhì)錯折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重性。在一個實施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、實質(zhì)內(nèi)注射或輸注，或靜脈內(nèi)注射或輸注。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或配制劑用于在腦中促進(jìn)淀粉狀蛋白清除的方法。促進(jìn)淀粉狀蛋白清除可以預(yù)防、治療或減少蛋白質(zhì)錯折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重性。在一個實施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、實質(zhì)內(nèi)注射或輸注，或靜脈內(nèi)注射或輸注。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或配制劑用于抑制腦中淀粉狀蛋白聚集的方法。抑制腦中淀粉狀蛋白聚集可以預(yù)防、治療或減少蛋白質(zhì)錯折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重性。在一個實施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、實質(zhì)內(nèi)注射或輸注，或靜脈內(nèi)注射或輸注。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或配制劑用于清除腦中的毒性淀粉狀蛋白寡聚體的方法。清除腦中的毒性淀粉狀蛋白寡聚物可以預(yù)防、治療或減少蛋白質(zhì)錯折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重性。在一個實施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、實質(zhì)內(nèi)注射或輸注，或靜脈內(nèi)注射或輸注。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或配制劑用于防止在腦中形成毒性淀粉狀蛋白寡聚體的方法。防止在腦中形成毒性寡聚物可以預(yù)防、治療或減少蛋白質(zhì)錯折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重性。在一個實施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、實質(zhì)內(nèi)注射或輸注，或靜脈內(nèi)注射或輸注。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或配制劑用于保護(hù)神經(jīng)元免受淀粉狀蛋白損傷的方法。保護(hù)神經(jīng)元免受淀粉狀蛋白損傷可以預(yù)防、治療或減少蛋白質(zhì)錯折疊或神經(jīng)變性疾病的癥狀或嚴(yán)重性。在一個實施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、實質(zhì)內(nèi)注射或輸注，或靜脈內(nèi)注射或輸注。在一個實施方案中，預(yù)防性給予用于保護(hù)神經(jīng)元免受淀粉狀蛋白損傷的本發(fā)明的藥物組合物或配制劑。在一些實施方案中，患者對于與蛋白質(zhì)錯折疊和/或聚集疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物呈陽性。在一個實施方案中，生物標(biāo)志物是florbetapir(av45，elililly)。在一些實施方案中，患者表現(xiàn)出與淀粉狀蛋白的存在相關(guān)的神經(jīng)變性性疾病的癥狀。在各種實施方案中，淀粉狀蛋白是faβ42、fαsyn或ftau中的任一種。在某些實施方案中，神經(jīng)變性性疾病是帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、或亨廷頓氏病。在一個實施方案中，神經(jīng)變性性疾病是阿爾茨海默氏病。在一個實施方案中，神經(jīng)變性性疾病是阿爾茨海默氏病，并且患者表現(xiàn)出β-淀粉狀蛋白，如通過顯像劑florbetapir(av-45,elililly)檢測。在一些實施方案中，患者表現(xiàn)出朊病毒介導(dǎo)的疾病的癥狀。在某些實施方案中，朊病毒介導(dǎo)的疾病選自克羅伊茨費爾特-雅各布病、庫魯病、致命性家族性失眠、或綜合征。在一些實施方案中，患者表現(xiàn)出除了阿爾茨海默氏病外的神經(jīng)變性性tau病變的癥狀。在某些實施方案中，要治療的疾病選自：嗜銀顆粒癡呆、皮質(zhì)基底變性、拳擊員癡呆、彌漫性神經(jīng)原纖維纏結(jié)伴鈣化、唐氏綜合征、額顳癡呆，包括與染色體17聯(lián)系的前顳癡呆伴帕金森癥、哈-斯病、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、尼曼-皮克病c型、非guamanian運(yùn)動神經(jīng)元病伴神經(jīng)原纖維纏結(jié)、皮克氏病、腦炎后帕金森病、進(jìn)行性皮質(zhì)下膠質(zhì)增生、進(jìn)行性核上麻痹、亞急性硬化性全腦炎、和僅纏結(jié)的癡呆。在另一個實施方案中，可以通過任何合適的途徑，如例如吸入和靜脈內(nèi)輸注直接對患者施用單獨或與合適的載體，如例如脂質(zhì)納米顆粒、聚合物載體、或載體，如病毒載體聯(lián)合的本發(fā)明的核酸分子(即，編碼變體g3p的核酸分子，所述變體g3p表現(xiàn)出降低的免疫原性，并擁有結(jié)合淀粉狀蛋白，解聚淀粉狀蛋白斑，和/或防止淀粉狀蛋白的聚集的能力)治療上文描述的任何疾病狀況。適用于該治療的編碼本發(fā)明變體g3p的核酸分子可以是dna或rna。診斷在本發(fā)明的另一方面中，本文所述的多肽和組合物用于與本文中所述的各種疾病相關(guān)的診斷應(yīng)用中。例如，當(dāng)在體內(nèi)或體外用作顯像劑時，本發(fā)明的組合物的結(jié)合可以是所述蛋白質(zhì)錯折疊疾病之一的診斷的一部分。當(dāng)用作診斷劑時，本發(fā)明的多肽可以進(jìn)一步包含可檢測標(biāo)記物，或者可以在體內(nèi)以其它方式檢測。各種標(biāo)記物可以使用用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)附著到診斷組合物的淀粉狀蛋白結(jié)合組分。標(biāo)記物的實例包括熒光標(biāo)記物和放射性標(biāo)記物?？梢允褂脴O其多種的放射性標(biāo)記物，但通常標(biāo)記物通常選自放射性標(biāo)記物，包括但不限于18f、11c、和123i。這些和其他放射性同位素可以使用公知的化學(xué)附著到蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，使用正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(positronemissiontomography，pet)檢測標(biāo)記物。然而，用于檢測放射性同位素的任何其它合適的技術(shù)也可用于檢測放射性示蹤劑?？梢耘c對β-淀粉狀蛋白特異性的顯像劑，例如f18-av-45，elililly組合使用本發(fā)明的多肽和組合物作為診斷顯像劑。由于目前沒有用于非β-淀粉狀蛋白聚集體的已知顯像劑，使用本發(fā)明的診斷組合物以及β-淀粉狀蛋白特異性顯像劑將導(dǎo)致基于差異檢測的非β-淀粉狀蛋白聚集體的檢測。因此，在一個實施方案中，將本發(fā)明的診斷組合物與β-淀粉狀蛋白顯像劑組合使用作為顯像劑以檢測非β-淀粉狀蛋白聚集體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽或組合物用作診斷顯像劑以檢測包括腦在內(nèi)的cns中的β-淀粉狀蛋白。本發(fā)明的診斷組合物可以使用與治療組合物所述的相同的途徑施用。在一個實施方案中，施用途徑選自鞘內(nèi)注射或輸注、直接心室內(nèi)注射或輸注、實質(zhì)內(nèi)注射或輸注、或靜脈內(nèi)注射或輸注。實施例實施例1：在g3p中cd4+t細(xì)胞表位的定位合成了跨越seqidno:1的氨基酸1-240(具有12個氨基酸重疊的15個氨基酸長)的序列的87個重疊肽，并在t細(xì)胞表位定位測定中測試來自人cd4+t細(xì)胞的應(yīng)答。在一式六份pbmc培養(yǎng)物中測試單個肽，并評估t細(xì)胞應(yīng)答以鑒定表位的位置以及它們的相對效力。從uknationalbloodtransfusionservice(addenbrooke’shospital,cambridge,uk)獲得的健康社區(qū)供體血沉棕黃層(buffycoat)(來自24小時內(nèi)抽取的血液)中并且根據(jù)由addenbrooke’shospital本地研究倫理委員會(localresearchethicscommittee)授予的批準(zhǔn)通過lymphoprep(axis-shield,dundee,uk)密度離心分離pbmc(外周血單核細(xì)胞)。使用rosetteseptm(stemcelltechnologiesinc，london，uk)消耗了cd8+t細(xì)胞。通過使用基于hlassp-pcr的組織分型試劑盒(biotest，solihull，uk)鑒定hla-dr單倍型表征供體。還測定了對對照新抗原蛋白(klh蛋白(pierce(perbio)，cramlington，uk)和源自ifv和ebv的肽)的t細(xì)胞應(yīng)答。然后，將pbmc冷凍并儲存在液氮中直至需要。選擇55名供體的分組用于測定法以最好地代表在世界人口中表達(dá)的hla-dr同種異型的數(shù)量和頻率。針對世界人口中表達(dá)的同種異型分析分組中表達(dá)的同種異型揭示了，實現(xiàn)覆蓋>80％，并且所有主要的hla-dr等位基因(世界人口中表達(dá)的具有頻率>5％的個體同種異型)得到了充分呈現(xiàn)。個體供體單倍型的詳細(xì)情況以及世界人口和樣本群體中表達(dá)的mhcii類單倍型頻率的比較分別顯示于表8和圖3。表8：供體詳情和單倍型對來自每個供體的pbmc解凍，計數(shù)，并且評估存活力。將細(xì)胞在室溫培養(yǎng)基(invitrogen，paisley，uk)中恢復(fù)，然后將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至2-3x106個pbmc/ml(增殖細(xì)胞儲液)。以1-3mg規(guī)模合成了15個氨基酸長的肽，其具有游離n末端胺和c末端羧酸。將肽溶解在dmso中至10mm的濃度，并且通過在孔中稀釋至培養(yǎng)基中至終濃度為5μm制備肽培養(yǎng)儲液。對于每個肽和每個供體，在平底96孔板中建立了一式六份培養(yǎng)物。陽性和陰性對照培養(yǎng)物兩者也一式六份測試。對于每個供體，還包括三個對照(klh蛋白和源自ifv和ebv的肽)。對于陽性對照，以終濃度2.5μg/ml使用pha(sigma，dorset，uk)。將培養(yǎng)物溫育總共6天，然后對每個孔添加0.75μci3[h]-胸苷(perkinbeaconsfield,uk)。將培養(yǎng)物再培養(yǎng)18小時，然后使用tomtecmachiii細(xì)胞收獲儀收獲到過濾墊上。通過在microplatebetacounter(perkinbeaconsfield,uk)上以paralux，低背景計數(shù)模式的meltilextm(perkinbeaconsfield,uk)閃爍計數(shù)測定每個孔的cpm。為了分析數(shù)據(jù)，使用等于或大于si≥2.00的刺激指數(shù)(si)的閾值(考慮到邊界si≥1.90-1.99的響應(yīng))。陽性響應(yīng)由以下統(tǒng)計和經(jīng)驗閾值定義：1.通過使用不成對的兩個樣本學(xué)生t檢驗比較測試孔的cpm與培養(yǎng)基對照孔得出的響應(yīng)顯著性(p<0.05)2.刺激指數(shù)大于2.00(si≥2.00)，其中si＝測試孔的平均cpm/平均cpm培養(yǎng)基對照孔。以這種方式呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表示為si≥2.00，p<0.05。此外，通過計算來自重復(fù)培養(yǎng)物的原始數(shù)據(jù)的cv和sd來評估測定內(nèi)變化。增殖測定法建立在一式六份培養(yǎng)物中(“未調(diào)整的數(shù)據(jù)”)。為了確保測定內(nèi)的變化性較低，在除去最大和最小cpm值后也分析了數(shù)據(jù)(“調(diào)整后的數(shù)據(jù)”)，并且使用這兩個數(shù)據(jù)集比較了供體響應(yīng)的si。通過計算對研究中所有肽的陽性響應(yīng)(如上定義)的平均頻率加上sd以給出背景響應(yīng)率來鑒定t細(xì)胞表位。在調(diào)整和未調(diào)整的數(shù)據(jù)兩者中誘導(dǎo)高于背景響應(yīng)率的增殖響應(yīng)的任何肽被認(rèn)為含有t細(xì)胞表位。當(dāng)兩個重疊的肽誘導(dǎo)增殖響應(yīng)率時，認(rèn)為t細(xì)胞表位處于重疊區(qū)域中?；诖耍跍y試的多肽中鑒定出以下t細(xì)胞表位：表位1：ctgdetqcygtw(seqidno:1的氨基酸46-57)表位2：tfmfqnnrfrnr(seqidno:1的氨基酸133-144)表位3：sskamydaywng(seqidno:1的氨基酸172-183)表位4：pvnagggsgggs(seqidno:1的氨基酸214-225)表位5：sgsgamvrsdkthtc(seqidno:1的氨基酸253-267)實施例2：通過計算機(jī)分析設(shè)計t細(xì)胞表位4和5中的取代使用itopetm和tcedtm計算機(jī)技術(shù)，使用來自表位區(qū)域的重疊9聚體來分析在t細(xì)胞測定中呈陽性的肽序列。[perryetal.,drugsrd9(6):385-96(2008)]。每個9聚體針對mhcii類等位基因的數(shù)據(jù)庫(總共34個)進(jìn)行測試，并且基于擬合和與mhcii類分子的相互作用評分。此外，每個9聚體都針對已知cd4+t細(xì)胞表位的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast搜索，以鑒定9聚體與來自先前t細(xì)胞測定法中刺激t細(xì)胞應(yīng)答的無關(guān)蛋白的數(shù)據(jù)庫肽之間的任何高序列同源性?；趤碜杂嬎銠C(jī)分析的信息，鑒定了從鑒定的表位潛在除去cd4+t細(xì)胞表位活性的取代。表位5跨越天然n2-ct的富含gly的接頭的c末端，由用于產(chǎn)生seqidno:1的n1-n2-人igfc融合蛋白的pfuse載體的多克隆位點(“mcs”)編碼的氨基酸和人igfc區(qū)的n端。計算機(jī)分析涉及seqidno:1的m258和v259作為負(fù)責(zé)t細(xì)胞活性的p1錨點。根據(jù)它們在n1-n2編碼區(qū)之外的位置，這兩個氨基酸的除去不會導(dǎo)致功能喪失。這兩種氨基酸由mcs編碼。因此，使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锿ㄟ^定點誘變產(chǎn)生修飾mcs并消除編碼seqidno:1的m258和v259的核苷酸的雙鏈dna分子。這繼之以使用mcs中的ecori和bglii限制性位點將所得到的誘變dna序列重新克隆回到pfuse載體中。所得到的成熟(缺乏信號序列)融合蛋白省略了m258和v259。該融合蛋白在下述測定中與seqidno:1融合蛋白保持相同的與abeta結(jié)合的能力。表位4與n2域和天然的富含gly的接頭重疊。g3p蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(未顯示)表明，表位4位于遠(yuǎn)離淀粉狀蛋白結(jié)合區(qū)域，并因此可耐受氨基酸取代而不影響活性。鑒定為p1錨定的v215(seqidno:1)以側(cè)鏈朝向蛋白質(zhì)核心的輕微取向表面暴露。從結(jié)構(gòu)分析來看，表6和表7中列出的v215的任何取代都應(yīng)該除去表位。此外，也應(yīng)容納如表6和表7中列出的該表位內(nèi)其它氨基酸的任何取代。通過使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锿ㄟ^定點誘變從上述核苷酸序列衍生編碼包含v215a取代(seqidno:4)和省略m258和v259的n1-n2-igfc的核酸序列。與上文描述的具有seqidno:1或缺乏m258和v239的成熟融合蛋白的氨基酸序列的融合蛋白相比，所得到的成熟融合蛋白(seqidno:2)在結(jié)合測定中表現(xiàn)出與abeta的增加的結(jié)合。使用seqidno:4的核酸序列作為親本序列，以創(chuàng)建摻入表位1、2和3中的所有修飾的基因。實施例3：通過計算機(jī)分析設(shè)計t細(xì)胞表位1、2和3中的取代表位1僅位于n1-n2的推定的abeta結(jié)合部分的c端。表位1的計算機(jī)分析突出顯示seqidno:1的氨基酸48-56作為用于氨基酸取代和t細(xì)胞表位除去的區(qū)域?；诂F(xiàn)有氨基酸的性質(zhì)、表面暴露以及與g3p的淀粉狀蛋白結(jié)合區(qū)的相互作用(如g3p的x射線晶體結(jié)構(gòu)解釋)，在該9聚體內(nèi)的氨基酸是靶向用于取代的。特別地，g48、t51、y54和t56是靶向用于取代的，具有表1中指示的變化。此區(qū)域中的其它潛在的氨基酸取代列于表2。表位2的itopetm分析指出了seqidno:1的氨基酸135-143作為降低或消除該表位的靶物。基于x射線晶體結(jié)構(gòu)，seqidno:1的氨基酸136-139形成環(huán)區(qū)，其與n1-n2的鉸鏈區(qū)形成鍵，因此對于淀粉狀蛋白結(jié)合活性可以是重要的。對這些氨基酸的改變不太優(yōu)選，并且僅在表2中呈現(xiàn)。更優(yōu)選的變化是對m135、r140、f141和n143，并且列于表1中。對這9個氨基酸的區(qū)域的其它潛在變化列于表2中。在表位3中鑒定seqidno:1的氨基酸173-182作為通過計算機(jī)分析的取代的靶物。表位3位于n2域的α螺旋部分，因此該策略是避免引入疏水性殘基和小極性不帶電殘基。此外，我們希望避免將極性殘基酸性殘基引入該表位的c末端?；趚射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)，我們靶向s173、d174、m176、d178和w182，用于具有表1中指出的變化的取代。在表2中列出該區(qū)域中的其它潛在的氨基酸取代。實施例4：產(chǎn)生具有減少的t細(xì)胞表位的n1-n2-人iggfc多肽制備了各編碼含有表3中列出的不同單氨基取代的n1-n2-人iggfc融合蛋白的58種不同的核酸分子。這是通過使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋飳eqidno:4的定點誘變引入期望的取代，然后將pcr擴(kuò)增的誘變的序列重新克隆到pfuse-higg1-fc2載體(toulouse,france,目錄號pfuse-hg1fc2)中來實現(xiàn)的。在freestyle293-f細(xì)胞(invitrogen,paisley,scotland,目錄號r790-07)中的單獨pfuse-higg1-fc2載體中瞬時表達(dá)編碼這些“去免疫”的fc融合多肽的基因。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將細(xì)胞在freestyle293培養(yǎng)基(invitrogen，目錄號12338)中稀釋至1×106/ml，確保存活力>90％。將質(zhì)粒dna和聚乙烯亞胺(pei)分別稀釋于optimem(invitrogen，目錄號31985)中并溫育5分鐘，然后將pei緩慢添加到dna中，并將dna/pei混合物在室溫下溫育5分鐘。溫育后，將dna/pei混合物逐滴添加到293-f細(xì)胞，同時旋轉(zhuǎn)燒瓶。將轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物在37℃，8％co2在以135rpm旋轉(zhuǎn)的軌道振蕩器平臺上溫育6-7天，隨后收獲它們。通過離心收獲含有多肽的培養(yǎng)基，并使用10xpbs進(jìn)行ph調(diào)節(jié)。通過在4℃旋轉(zhuǎn)過夜將蛋白質(zhì)與蛋白a瓊脂糖凝膠珠(sigma，dorset，uk)結(jié)合。將珠1xpbs清洗兩次并轉(zhuǎn)移到sigmaprep旋轉(zhuǎn)柱(sigma)中。通過使用0.1m甘氨酸ph3.0離心洗脫樣品，并在收集管中使用1/10體積的1mtris-hclph8.0中和。使用2mlzebaspin柱(pierce，cramlington，uk，目錄號89890)將洗脫液緩沖液交換到1xpbs中。將樣品過濾滅菌，并測量每個樣品的280nm處的吸光度。實施例5：去免疫多肽的abeta結(jié)合分析a.abeta(aβ)纖維制備。將aβ42(1mg，rpeptidea-1002-2)溶于六氟異丙醇(hfip，1ml)中，充分渦旋振蕩，并在室溫下溫育2-18小時，直到出現(xiàn)澄清溶液。將等分試樣(100μl，100μg)置于1.5mleppendorf管中，并在真空(速度vac，eppendorf，concentrator5301)下干燥2-3小時。將所得單體重懸于20μldmso中，移液并充分渦旋振蕩，直到完全溶解。將溶液用260μl10mmhcl溶液(aβ42終濃度為80μm)稀釋并渦旋振蕩20秒。將澄清溶液在37℃下溫育(無搖動)3天以允許聚集。為了用于測定法，將來自所得儲備溶液的aβ42纖維在pbs中稀釋50倍至1.6μm終濃度。b.elisa板制備。向96孔板(f96maxisorpnunc-immunoplate；目錄號：442404，批次125436和128158；denmark)的各孔中添加200μl的1％bsa溶液。將板密封并在7℃下溫育3小時。然后用pbs(250μl/孔)×3清洗板。我們向每個孔中添加50μl稀釋的aβ42纖維溶液(1.6μm)，并在37℃下開蓋溫育過夜以完成干燥。將pbs(50μl/孔)添加至對照孔(不含aβ42纖維)。然后將板用水清洗2次，并且用pbs清洗1次(每次清洗250μl/孔)。c.elisa測定法。對每個孔以及非aβ42纖維包被的孔添加50μl中不同濃度的每種多肽(以及seqidno:2的多肽)，并在37℃下溫育1小時。然后將平板用pbs-t(pbs中的0.05％tween20)清洗三次并且用pbs清洗3次(每次清洗250μl/孔)。然后，我們對每個孔添加在pbs-t+1％乳(difcotm脫脂乳,becton,dickinsonandcompany.usa,目錄號：232100，批次號：7320448)中以1:2500(最終0.32μg/ml)稀釋的50μl綴合有hrp的山羊抗人抗fcγ(jacksonlabs,目錄號109-035-008,批次號：106617)，并且于37℃溫育40min。然后，將平板用pbs-t清洗6次，并且用pbs清洗2次(每次清洗250μl/孔)。然后，我們添加50μl/孔的opd溶液(15mg/7.5ml0.05m檸檬酸鹽緩沖液ph-5.5/3μlh2o2)，并且使顏色顯色3-6分鐘。我們接下來加入25μl/孔的4nhcl溶液以停止反應(yīng)。讀取板在492nm和405nm處的吸光度。從492nm吸光度中減去405nm的吸光度，并將結(jié)果繪制為多肽濃度的函數(shù)。然后計算每種去免疫多肽的結(jié)合的ic50，并與針對seqidno:2的多肽計算的ic50進(jìn)行比較。結(jié)果示于下表9。表9：與seqidno:2的多肽相比，在表位1、2或3中具有單個另外的氨基酸取代的多肽的abeta結(jié)合ic50的相對變化*數(shù)字反映了ic50(取代多肽)/ic50(seqidno:2的多肽)。多個值反映了結(jié)合測定法中的重復(fù)測試。實施例6：全蛋白cd4+t細(xì)胞應(yīng)答分析為了與seqidno:1相比分析本發(fā)明任何多肽的cd4+t細(xì)胞應(yīng)答，進(jìn)行了全蛋白t細(xì)胞測定法。從如實施例1中制備的20份健康人供體血沉棕黃層中分離出pbmc。將pbmc在培養(yǎng)基中從冷凍復(fù)蘇，并使用miltenyicd14微珠和ls柱(miltenyibiotech，oxford，uk)分離cd14+細(xì)胞。將單核細(xì)胞重懸浮于補(bǔ)充有1000u/mlil-4和1000u/mlgm-csf的(“dc培養(yǎng)基”)中，至4-6x106pbmc/ml，然后分配在24孔板中(2ml終培養(yǎng)體積)。在第2天通過置換一半體積的dc培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞。到第3天，單核細(xì)胞已經(jīng)分化成半成熟樹突細(xì)胞(dc)，其與包含40μg/ml的測試多肽或40ug/ml的seqidno:1的多肽和100μg/mlklh的抗原或僅培養(yǎng)基預(yù)先溫育。將半成熟dc與抗原溫育24小時，之后通過清洗細(xì)胞兩次除去過量的抗原，并重懸于補(bǔ)充有50ng/mltnf-α的dc培養(yǎng)基(peprotech，london，uk)中。在第7天通過置換補(bǔ)充有50ng/mltnfα的半體積dc培養(yǎng)基飼養(yǎng)dc，并在第8天收獲成熟dc。計數(shù)收獲的成熟dc，并使用錐蟲藍(lán)染料排除評估存活力。然后對dc進(jìn)行γ-照射(4000rad)，并在aim-v培養(yǎng)基中以2x105個細(xì)胞/ml重懸，然后在t細(xì)胞增殖和elispot測定中如下使用分析。另外，在第8天，還制備了新鮮的cd4+t細(xì)胞。為了純化cd4+t細(xì)胞，在培養(yǎng)基中復(fù)蘇pbmc，并使用miltenyicd4微珠和ls柱(miltenyibiotech，oxford，uk)分離cd4+細(xì)胞，并以2x106個細(xì)胞/ml重懸于培養(yǎng)基中。在第8天，建立t細(xì)胞增殖測定法，其中將1x105個自體cd4+t細(xì)胞添加到96孔u(yù)底板中的1x104抗原負(fù)載的dc(10:1的比率)中，將培養(yǎng)基添加至終體積200ul/孔。在第14天，在25ul中每孔用1uci[3h](perkinelmer,beaconsfield,uk)將測定板脈沖6小時，然后使用tomtecmachiii(hamdenct,usa)細(xì)胞收獲儀收獲到過濾墊(perkinelmer)上。在一式六份培養(yǎng)物中進(jìn)行測試所有多肽。通過在1450microbetawallactrilux液體閃爍計數(shù)器(perkinelmer)上以paralux，低背景計數(shù)的meltilextm(perkinelmer)閃爍計數(shù)測定每個孔的每分鐘計數(shù)(cpm)。僅相對于僅培養(yǎng)基的對照標(biāo)準(zhǔn)化每個抗原的每分鐘計數(shù)。對于elispot測定法，將elispot平板(millipore，watford，uk)用pbs中的100ul/孔il-2捕獲抗體(r&dsystems，abingdon，uk)包被。然后將板在pbs中清洗兩次，在封閉緩沖液(pbs中1％bsa(sigma))中溫育過夜，并在培養(yǎng)基中清洗。在第8天，將1x105個自體cd4+t細(xì)胞添加至96孔elispot平板中的1x104個抗原負(fù)載的dc(10:1比率)。在一式六份培養(yǎng)物中測試所有多肽制劑。對于每個供體pbmc，還包括陰性對照(單獨培養(yǎng)基)、無細(xì)胞對照和pha(10ug/ml)陽性對照。在7天再溫育期后，通過在dh2o和pbs中三次連續(xù)清洗顯現(xiàn)elispot平板，之后添加在pbs/1％bsa中的100ul過濾的生物素化檢測抗體(r&dsystems，abingdon，uk)。在37℃溫育1.5小時后，將板在pbs中進(jìn)一步清洗三次，并添加pbs/1％bsa中的100μl過濾的鏈霉抗生物素蛋白-ap(r&dsystems)1小時(在室溫下溫育)。棄去鏈霉抗生物素蛋白ap，并且將平板在pbs中清洗4次。將bcip/nbt(r&dsystems)添加至每個孔，并在室溫下溫育30分鐘。通過用dh2o清洗孔和孔的背部三次來停止點顯現(xiàn)。在immunoscantm分析儀上掃描干燥的板，并使用immunoscantm版本4軟件測定每孔的斑點數(shù)(spw)。對于增殖和il-2elispot測定法兩者，結(jié)果表示為刺激指數(shù)(si)，其定義為測試多肽相對于僅培養(yǎng)基的對照的cpm(增殖測定)或斑點(elispot測定)的比率，其使用對于陽性t細(xì)胞應(yīng)答，si等于或大于2(si≥2.0)的閾值進(jìn)行。實施例7：在t細(xì)胞表位1、2和3中兩種或更多種中的雙重和三重取代的設(shè)計。基于結(jié)合測定的結(jié)果，在表位1、2和3處選擇以下取代以存在于與seqidno:2相比含有兩個氨基酸取代的多肽中，每個取代在不同的表位中。表10：包含兩個表位和三個表位修飾的變體的氨基酸取代。通過使用合適的起始dna(通常編碼如實施例3中列出的那樣制備的兩個取代之一的dna)的定點誘變制備編碼具有表10中列出的兩個氨基酸取代(各在不同表位中)的n1-n2-人igfc融合蛋白的dna。將所得的編碼這些融合蛋白的dna用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并且表達(dá)和純化，如實施例4中列出，并按實施例5列出測試結(jié)合。然后，基于兩個氨基取代的多肽上的結(jié)合測定結(jié)果設(shè)計在表位1、2和3的每種中具有一個取代的多肽。測定表位1、2和3的每種中具有一個取代的多肽的abeta結(jié)合，以及t細(xì)胞應(yīng)答，如實施例6中列出的。特別地，如下表11中指示，通過用seqidno:2中的某些氨基酸取代以下雙重和三重表位變體。表11：本發(fā)明的雙重和三重表位變體多肽。使用實施例5中列出的elisa測定法測定上文指出的多肽與β-淀粉狀蛋白的結(jié)合。結(jié)果列于表12和13中。相對結(jié)合值反映了ic50(seqidno:2)/ic50(測試多肽)(例如與seqidno:2的多肽相比，數(shù)值越少，多肽的結(jié)合越大)。多個值反映了結(jié)合測定中的重復(fù)測試。表12：seqidno:2的多肽與本發(fā)明的示例性多肽的相對結(jié)合值。實施例8：乙酸纖維素濾器延遲測定法。此測定法用于監(jiān)測淀粉狀蛋白纖維脫穩(wěn)定(解聚)或重塑成非淀粉狀蛋白生成性(non-amyloidogenic)或可溶性聚集體。該測定法主要改編自chang,e.andkuret,j.,analbiochem373,330-6,(2008)和wanker,e.e.etal.,methodsenzymol309,375-86,(1999)。具體地，將2.5μmfaβ淀粉狀蛋白纖維制劑與不同濃度的本發(fā)明的變體融合多肽(1nm至2μm)在37℃預(yù)溫育3天。溫育后，將具有和沒有融合多肽的纖維稀釋并在真空印跡上在乙酸纖維素膜上點樣。將膜用pbs大量清洗，并用針對aβ的n末端特異性的抗體探測1小時。使用綴合有hrp的二抗定量保留在膜上的纖維聚集體。使用光密度掃描儀分析和數(shù)字化點顏色?；诿總€點的信號強(qiáng)度對添加至每個點的融合多肽的濃度計算ec50(半最大有效濃度)。如從上述實施例可以看出，本發(fā)明的變體多肽全部表現(xiàn)出如通過elisa測定法測定的對aβ的結(jié)合。測試的大多數(shù)變體多肽也表現(xiàn)出aβ的解聚，如通過點印跡測定法測定的。實施例9：具有經(jīng)修飾的糖基化信號的多肽的構(gòu)建和分析我們使用seqidno:3或編碼多肽no.86作為定點誘變的起始材料的核苷酸序列seqidno:4的修飾形式的核苷酸序列構(gòu)建缺乏seqidno:1或seqidno:2的氨基酸39-41處的糖基化信號的多肽。使用quickchange定點誘變試劑盒(agilent)和以下引物誘變源自pfuse-higg1-fc2載體(invivogen)并編碼與哺乳動物信號序列融合的多肽86的質(zhì)粒載體：正向引物：gctgtctgtggaatgctggaggcgttgtagtttg(seqidno:8)反向引物：caaactacaacgcctccagcattccacagacagc(seqidno:9)遵循制造商的指示來創(chuàng)建t41g取代。使用得到的載體(seqidno:7)轉(zhuǎn)化neb5-α感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離并測序期望的質(zhì)粒。然后使用商品化的expi293tm表達(dá)系統(tǒng)(lifetehcnologies)將純化的載體用于轉(zhuǎn)化expi293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天，將expi293細(xì)胞以2x106個活細(xì)胞/ml的密度接種。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將500μg過濾滅菌的質(zhì)粒稀釋到opti-memi中至總體積25ml。在單獨的管中，將1.333mlexpifectaminetm293試劑在25mlopti-memi中稀釋并通過顛倒混合。在室溫下溫育5分鐘后，將稀釋的dna添加到稀釋的expifectaminetm293試劑中并再溫育20-30分鐘。將dna-expifectaminetm293試劑復(fù)合物緩慢添加到500ml細(xì)胞(>3×106個細(xì)胞/ml)中，同時輕輕地旋轉(zhuǎn)燒瓶。在約18小時后，將expifectaminetm293轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑i和ii(分別為2.5ml和25ml)添加到轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，并將細(xì)胞在37℃，8％co2，135rpm在軌道振蕩器上再溫育5天。通過在4℃下以10,000rpm離心20分鐘收集含有表達(dá)的融合蛋白(稱為“多肽86-t41g”)的培養(yǎng)基。將上清液在5mlhitraprproteinaff柱(gehealthcare)上純化，所有步驟在4℃進(jìn)行。用5體積的洗脫緩沖液(0.1m甘氨酸，ph3)再生該柱，并在5-10體積的20mm磷酸鈉緩沖液中清洗，然后使用5ml/min的流速施加細(xì)胞培養(yǎng)基。將柱用5-10體積的20mm磷酸鈉緩沖液清洗，然后用0.1m甘氨酸ph3洗脫出結(jié)合的多肽86-t41g。將1至3ml級分收集在具有1mtris-hclph9的管中以調(diào)節(jié)ph。通過nanodrop2000c上的280nm處的吸光度測定產(chǎn)率。在sds-pagetgx凝膠(biorad)上分離5μl每種含蛋白質(zhì)的級分，并且考馬斯染色2小時。將含有多肽86-t41g的級分合并，并在4℃下在d-pbs中透析過夜。最終的多肽86-t41g樣品在ultrafree旋轉(zhuǎn)過濾器上滅菌，并且在nanodrop2000c上測量濃度。通過sds-page分析純化的多肽86-t41g(seqidno:6)，并以比多肽86稍低的分子量(表觀小約500道爾頓)作為單條帶遷移(圖9)。我們認(rèn)為這種較低的分子量是由于氨基酸41處的t到g變化，以及n39上糖基化的喪失所致。也通過在superdex200增加10/300柱上的尺寸排阻層析分析純化的多肽86-t41g。將柱清洗并用100ml磷酸鹽緩沖鹽水(“pbs”)平衡。將100微克(100μg)多肽86-t41g在pbs中稀釋至200μl的最終體積并加載到柱上。然后以0.75ml/分鐘的速率用1.5柱體積的pbs洗脫柱。通過分光光度法在214nm和280nm監(jiān)測級分中的蛋白質(zhì)，并表明尖峰，指示同質(zhì)性(數(shù)據(jù)未顯示)。使用實施例5中所述的elisa分析純化的多肽86-t41g的abeta結(jié)合。與用于seqidno:1多肽的20.6-27.01nm和用于多肽86的34.5nm比較，此測定法中abeta結(jié)合的ec50計算為13.15nm。使用實施例8中所述的乙酸纖維素濾膜延遲測定法將純化的多肽86-t41g與seqidno:1的多肽和多肽86進(jìn)行abeta結(jié)合的比較。該測定的結(jié)果示于圖10中。然后，將純化的多肽86-t41g與多肽86和seqidno:1的多肽(以及人源化a33抗體和匙孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin)作為陽性對照)進(jìn)行比較，使用占人hla單倍型的95％的50種不同pbmc供體在全蛋白質(zhì)cd4+t細(xì)胞應(yīng)答測定中；以及實施例6中描述的elispot細(xì)胞因子(il-2)測定中進(jìn)行。結(jié)果示于下表13和14中。表13：pbmct細(xì)胞增殖應(yīng)答測定結(jié)果。樣品均值sisd％應(yīng)答seqidno:12.210.3212多肽862.661.024多肽86t41g2.110.154人源化a333.291.8312klh4.743.2884表14：elispotil-2測定結(jié)果。樣品均值sisd％應(yīng)答seqidno:12.510.6414多肽862.831.034多肽86t41g2.330.224人源化a332.460.3320klh4.574.3286如從上表可以看出，seqidno:1的多肽(在氨基酸39-41處推定的糖基化位點或任何推定的t細(xì)胞表位中沒有氨基酸改變)對于12％供體(6/50)引起增殖應(yīng)答(“si”)>2倍背景。多肽86和多肽86t41g引起來自顯著更少的供體pbmc(4％；2/50)的增殖應(yīng)答，其中具有增殖應(yīng)答的響應(yīng)者也略高于背景的2倍。這指示多肽86t41g對人受試者的較低的預(yù)計免疫原性。il-2測定證實t細(xì)胞應(yīng)答測定結(jié)果。還將多肽86t41g與seqidno:1的多肽進(jìn)行比較對abeta42纖維、nac纖維和tau-mtbr纖維的結(jié)合。纖維和elisa板制備。通過渦旋振蕩將aβ42肽(rpeptidea-1002-2)溶解在六氟異丙醇中并在室溫下溫育18小時。將等分試樣在真空下干燥并儲存在-20℃。將100μgaβ42單體溶于20μldmso中，通過渦旋振蕩溶解，并在10mmhcl溶液中稀釋至80μm。將aβ42肽溶液在37℃下溫育3天，并且用tht熒光測定驗證纖維形成。老化斑塊的非淀粉狀蛋白β組分(nac)是α-突觸核蛋白的聚集片段，作為帕金森氏病的標(biāo)志的聚集體。將nac肽((bachemh2598)以600um溶解于20mmnahco3中，并且在4℃下以100,000xg離心1小時。用2nhcl中和上清液，并且以1:1與10mmhcl混合。在37℃溫育肽4天，并且通過tht熒光測定證實纖維形成。根據(jù)frostetal.jbiolchem.2009may8；284(19):12845-52制備了包含tau的微管結(jié)合部分的纖維(tau-mtbr纖維)。簡言之，將40um的tau-mtbr蛋白與40um低分子量肝素(fisherscientific，bp2524)和2mmdtt在37℃下溫育3天。通過tht熒光測定證實原纖維(fibril)形成。在pbsa-0.02％中將纖維稀釋至1μm，并且通過在37℃下溫育過夜，在maxisorpnuncimmunoplateelisa板(thermofishercatno.442404)上干燥包被。在superblock(thermofishercatno.37515)中將孔封閉200μl/孔，室溫下1小時，并在pbst-0.05％中清洗。結(jié)合測定和結(jié)果。將seqidno:1的多肽和多肽86t41g分別以50和200nm添加到纖維elisa，并在37℃下溫育1小時。用pbst-0.05％6x200μl清洗孔，之后用山羊抗人iggfc片段特異性hrp(jacksonlabscatno.109-035-008)(tbst-0.05％；1％乳封閉(labscientificcatno.732-291-1940)中1:2500)在室溫下溫育45分鐘。將板在4x200ultbst-0.05％,2x200ulpbs中清洗，然后每孔添加50μltmb溶液(sigmat0440)。讓反應(yīng)顯色8分鐘，并通過每孔添加50μl2nhcl停止。在tecan板讀數(shù)器(infinitem1000pro)中記錄450nm處的吸光度。從用graphpadprism計算的一式三份孔的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差取出數(shù)據(jù)點。通過減去不與每個底物的任一多肽溫育的孔中的平均吸光度校正背景值。如圖11中所示，多肽86t41g與seqidno:1的多肽相比以相同或更高親和力結(jié)合aβ42mnac和tau-mtbr纖維。我們還通過類似的方案構(gòu)建了seqidno:1的以下變體，僅修飾以消除推定的糖基化位點(括號中指出的取代)：多肽200(n39a)多肽201(n39q)多肽202(t41m)多肽203(t41w)多肽204(t41h)多肽205(t41v)多肽206(t41i)多肽207(t41l)多肽208(t41r)多肽209(t41k)多肽210(t41y)多肽211(t41f)多肽212(t41d)多肽213(t41e)多肽214(t41q)多肽215(t41n)多肽216(t41a)多肽217(t41g)。實施例10：多肽217和seqidno:1的藥代動力學(xué)(pk)研究。動物處理和樣品收集。對c57bl6小鼠(8-12周；hilltoplabanimals)施用單一20mg/kg腹膜內(nèi)劑量的多肽seqidno:1(n＝22)或使用的多肽217(n＝22)。一次將多肽seqidno:1施用(20mg/kg,i.p.)到22只小鼠。將多肽217一次施用(20mg/kg，i.p.)到單獨的一組22只小鼠。每只動物在不同時間(給藥后0h、6h、9h、12h、1d、3d、7d和14d)收集血液一次。從血液樣品中分離血漿，保存在100μl等分試樣中，并用于所有后續(xù)分析。收集血液后，將小鼠實施安樂死，用pbs經(jīng)心灌注，并收獲其腦。將腦切成對半，并且每個半球進(jìn)一步分成嘴(rostral)、尾(caudal)、海馬和小腦部分。將血漿運(yùn)輸?shù)絠ntertek(sandiego,ca)進(jìn)行藥代動力學(xué)分析，而左額皮質(zhì)運(yùn)輸?shù)絚ambridgebiomedical(boston，ma)進(jìn)行pk分析。血漿elisa分析。將分析的所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在室溫(“rt”)下暴露于217mm乙酸達(dá)30分鐘，然后在(1:1.5v/v1mtrisph9.5:樣品)中中和。酸解離步驟溶解存在于不溶性級分中的多肽。使用夾心式elisa測定法測量血漿中的多肽水平。maxisorptm板在4℃下用在碳酸鹽緩沖液(ph9.6)中的來自儲液的1:1,000稀釋液(3.7μg/ml,0.37μg/孔)的兔抗m13(abcam:ab6188)包被過夜。用含有0.1％tween-20的pbs(“pbst”)清洗板三次并用pbs中的1％乳在37℃下封閉2小時，隨后在室溫下1小時。再次用pbst清洗板三次，然后將樣品或標(biāo)準(zhǔn)品添加到孔，并在37℃下溫育1小時。然后將孔用pbst清洗3次，并在室溫下與hrp標(biāo)記的山羊抗人igg(重鏈和輕鏈,bethel:a80-219p；1:10,000)一起溫育30分鐘。用pbst清洗孔3次，然后將板在室溫下用tmb底物顯色。在最高標(biāo)準(zhǔn)品的a450在0.6-0.8之間后停止反應(yīng)。從450nm處讀取的吸光度減去650nm處的參照吸光度定量多肽的水平。在1:20、1:300和1:3000的稀釋度下分析血漿；在這些稀釋度下沒有觀察到基質(zhì)干擾。下文表15中顯示了結(jié)果。表15：血漿藥代動力學(xué)參數(shù)。腦elisa分析。使用trippurem-bio級珠狀管和precellys024裂解勻漿器(5,000rpm兩次20秒，在均質(zhì)化循環(huán)之間以5秒間隔)將腦組織(左額皮質(zhì))在冷pbs中勻漿。在4℃下將勻漿物以14,000rpm離心5分鐘。將上清液移至新管中，并且用于所有后續(xù)分析。使用piercebca蛋白測定試劑盒測定腦裂解物的蛋白質(zhì)含量。以1:2稀釋使用裂解物。夾心式elisa測定法用于測量腦中的多肽水平。maxisorptm板在4℃下在碳酸鹽緩沖液中用1:1,000的兔抗m13(abcam:ab6188)(3.7μg/ml，0.37μg/孔)包被過夜。將板用pbst清洗3次，并用pbs中的1％乳在37℃封閉2小時，然后在室溫下1小時。然后用pbst將板清洗3次，并將樣品或標(biāo)準(zhǔn)品添加至孔，并在37℃下溫育1小時。用pbst再次清洗板3次，然后將孔與hrp標(biāo)記的驢抗人igg(重和輕鏈，jacksonimmunoresearch:709-035-149；1:10,000)在室溫下溫育30分鐘。用pbst清洗3次后，將板在室溫下用tmb底物顯色15分鐘。停止反應(yīng)并在450nm處讀取吸光度。相對于裂解物的蛋白質(zhì)含量表示腦中多肽的水平。下表16中顯示了結(jié)果。表16：腦藥代動力學(xué)參數(shù)參數(shù)seqidno:1多肽217cmax2.5ng/mg2.7ng/mgtmax3d3dbeta-階段半衰期3天7天auc14.44天*ng/mg32.90天*ng/mg當(dāng)前第1頁12