通用甲基化分析方法與流程
本申請要求于2015年12月17日提交的美國序列號14/973,637和于2014年12月19日提交的美國臨時申請?zhí)?2/094,850的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此通過引用以其整體并入本文。
在整個本申請中，引用了多個出版物。這些引用的全部對比文件被直接放置在權(quán)利要求書的前面。這些出版物的公開內(nèi)容在此通過引用以其整體并入本申請中以更充分地描述本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)。
背景技術(shù)：
dna甲基化是具有多個調(diào)節(jié)功能(比如x染色體失活、基因組印跡和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的抑制)的重要的表觀遺傳學機制(gollandbestor2005)。這種甲基化方法涉及通過被稱為dna甲基轉(zhuǎn)移酶(mtases)的酶甲基從s-腺苷l-甲硫氨酸(adomet)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶(c)的c5碳以產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶(5mc)(gollandbestor,2005)。人類基因組包含～2800萬個cpg位點，其中約70％在胞嘧啶的5位處甲基化(愛德華茲等，2010(edwardsetal.,2010))。異常或反常的dna甲基化已經(jīng)與越來越多的人類疾病有關(guān)，該人類疾病包括免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定(centromereinstability)和面部異常(icf)綜合癥、脆性x綜合征以及其它的發(fā)育疾病、年齡相關(guān)的神經(jīng)變性病癥、糖尿病和癌癥有關(guān)(羅伯森等，2005(robertsonetal.,2005)，由goll和bestor修訂,2005)。因此，越來越多地研究了dna甲基化狀態(tài)的表觀遺傳變化在正常表型改變和疾病相關(guān)的表性改變兩者中的作用，包括由nih發(fā)起的路標表觀基因組項目(roadmapepigenomicsproject)以建立多種細胞類型的參考表觀組。為了完成所述目標，可以以單堿基分辨率和高通量全面地分析dna甲基化狀態(tài)的全基因組方法和技術(shù)是至關(guān)重要的(蘇祖基等，2008，萊爾德，2010(suzukietal.,2008,laird,2010))。
已經(jīng)開發(fā)了超過30種甲基化分析技術(shù)，但是其都具有缺點(萊爾德，2010(laird,2010))。認為由蘇珊克拉克(susanclark)和瑪麗安弗羅默(mariannefrommer)在1994年報道的亞硫酸氫鹽基因組測序(bgs)(克拉克等，1994(clarketal.,1994))是最有用的方法。然而，bgs具有一些嚴重缺點：(1)在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化產(chǎn)生序列時存在嚴重的序列信息丟失，所述序列不能與基因組對齊；(2)對gc富集序列的強烈偏好(愛德華茲等，2010(edwardsetal.,2010))；(3)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化人工產(chǎn)品(artifacts)，以及(4)由于在嚴苛反應(yīng)條件下的高速鏈斷裂，需要大量的長起始dna(瓦內(nèi)克等，2002，1997(warneckeetal.,2002,1997))。盡管超過30項技術(shù)的發(fā)展，實現(xiàn)了鑒定dna的甲基化狀態(tài)(甲基化組分析)，全基因組甲基化模式的確定依然是麻煩的且昂貴的(clarketal.,1994)。為進一步促進全基因組dna甲基化分析，需要克服上述局限性的重大改進或新方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r是
本發(fā)明還提供了一種物質(zhì)組合物，其包含具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r是
所述化合物與cpg甲基轉(zhuǎn)移酶相連接。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生雙鏈dna衍生物的方法，其包含使所述雙鏈dna與cpg甲基轉(zhuǎn)移酶和具有以下結(jié)構(gòu)的s-腺苷甲硫氨酸類似物接觸：
其中r是能夠通過所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶從所述s-腺苷甲硫氨酸類似物上轉(zhuǎn)移到所述雙鏈dna的未甲基化胞嘧啶的5-碳上的化學基團，其是在使得所述化學基團與所述雙鏈dna的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共價結(jié)合的條件下進行，從而產(chǎn)生所述雙鏈dna衍生物，其中所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r是
本發(fā)明還提供了一種確定存在于已知序列的雙鏈dna序列中的胞嘧啶是否為未甲基化的方法，其包含：
a)通過使所述雙鏈dna與cpg甲基轉(zhuǎn)移酶和具有以下結(jié)構(gòu)的s-腺苷甲硫氨酸類似物接觸來產(chǎn)生所述雙鏈dna的衍生物：
其中r是化學基團，所述化學基團能夠通過所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶從所述s-腺苷甲硫氨酸類似物轉(zhuǎn)移到所述雙鏈dna的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化學基團與所述雙鏈dna的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共價結(jié)合，從而制備衍生的雙鏈dna，其中所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)；
b)通過在步驟a)中產(chǎn)生的衍生物的光轉(zhuǎn)化制備u類似物；
c)獨立地獲得所述雙鏈dna衍生物的單鏈；
d)對在步驟c)中獲得的所述單鏈進行測序；以及
e)將在步驟d)中測定的所述單鏈的序列與沒有產(chǎn)生衍生物的所述雙鏈dna的相應(yīng)鏈的序列進行比對，
其中在衍生物單鏈的所述單鏈中存在尿嘧啶類似物，其替代在沒有產(chǎn)生衍生物的所述雙鏈dna的相應(yīng)鏈中的預(yù)定位置上的胞嘧啶，表明了在所述雙鏈dna的所述位置上的所述胞嘧啶是未甲基化的。
本發(fā)明還提供了一種衍生的dna分子，其中所述衍生的dna分子不同于dna之處在于其包含核苷酸殘基，所述核苷酸殘基包含具有以下結(jié)構(gòu)的堿基：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r″、cn、no2、c(o)r″、s(o)2nhr″；
其中x是o或nr'；
其中r″是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r'是
并且其中所述糖是所述核苷酸殘基的糖。
本發(fā)明還提供了一種衍生的dna分子，其中所述衍生的dna分子不同于dna之處在于其包含核苷酸殘基，所述核苷酸殘基包含具有以下結(jié)構(gòu)的堿基：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
并且其中所述糖是所述核苷酸殘基的糖。
本發(fā)明還提供了一種用于衍生雙鏈dna分子或者用于確定存在于已知序列的雙鏈dna序列中的胞嘧啶是否為未甲基化的試劑盒，其包含：
a)具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)；以及
b)使用說明書。
本發(fā)明還提供了一種確定存在于已知序列的雙鏈dna序列中的胞嘧啶是否為未甲基化的方法，其包含：
a)通過使所述雙鏈dna與cpg甲基轉(zhuǎn)移酶和具有以下結(jié)構(gòu)的s-腺苷甲硫氨酸類似物接觸來產(chǎn)生所述雙鏈dna的衍生物：
其中r是化學基團，所述化學基團能夠通過所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶從所述s-腺苷甲硫氨酸類似物轉(zhuǎn)移到所述雙鏈dna的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化學基團與所述雙鏈dna的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共價結(jié)合，從而制備衍生的雙鏈dna，其中所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)；以及
b)確定在所述雙鏈dna中的預(yù)定位置上的胞嘧啶是否被所述化學基團r所修飾，
其中在所述雙鏈dna中預(yù)定位置上的所述胞嘧啶被所述化學基團修飾表示在所述雙鏈dna中的所述位置上的所述胞嘧啶為未甲基化的。
附圖說明
圖1.通過dna甲基轉(zhuǎn)移酶(mtase)使用adomet類似物將c轉(zhuǎn)化為u。mtase將化學轉(zhuǎn)化基團r從adomet類似物轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5位上。在轉(zhuǎn)移之后，在r基團與c之間的以光化學方式觸發(fā)的分子內(nèi)反應(yīng)促進4位上的脫氨基化以形成u類似物。dnamtase能夠?qū)⒍喾N官能團轉(zhuǎn)移到具有高序列特異性的雙鏈dna中的胞嘧啶的5位上。
圖2.5-all-omc的合成路線圖。
圖3.在5-all-omc的光輻照時間過程中的hplc圖譜。在輻照3小時之后，主峰是起始材料5-all-omc(ms-mw實測值298)(左側(cè))。在12小時光輻照之后，大多數(shù)起始材料被消耗產(chǎn)生ms-mw為299的新產(chǎn)物5-all-omu(右側(cè))。
圖4.新的以光化學方式產(chǎn)生的產(chǎn)物(5-all-omu)的uv吸收光譜顯示出在265nm處的最大吸收，其為典型的u吸收，而起始材料(5-all-omc)示出λmax＝274nm的期望的c吸收。
圖5.由5-aomc以光化學方式產(chǎn)生的產(chǎn)物與合成的5-aomu的混合物在hplc分析中表現(xiàn)為單一峰。
圖6.5-all-omc亞磷酰胺的合成。
圖7.引物延長的單堿基延伸ms分析表明在光輻照之后在dna鏈中的5-all-omc轉(zhuǎn)化為5-all-omu(c到u)，產(chǎn)生摻有adda(a)的引物延伸產(chǎn)物(mw3261)，而在對應(yīng)(counterpart)的dna鏈中，未修飾的c保持完整，產(chǎn)生摻有ddg的延伸產(chǎn)物(mw3277)(b)。
圖8.含有光反應(yīng)性部分的adomet類似物的實例結(jié)構(gòu)。r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；x是o或nr'；r'是h或烷基；并且n＝l至8。
圖9.含有光反應(yīng)性基團的adomet類似物的實例合成路線圖。
圖10.合成導(dǎo)致圖9中顯示的adomet類似物的溴化物中間體的實例合成路線圖。
圖11.基于dna甲基轉(zhuǎn)移酶輔助的cpg位點特異性c向u轉(zhuǎn)化的dna甲基化分析方法。優(yōu)化的adomet類似物用于將轉(zhuǎn)化基團遞送至未甲基化的cpg上以使得只有修飾的c可通過光觸發(fā)的分子內(nèi)反應(yīng)進一步轉(zhuǎn)化為u。后續(xù)測序允許dna甲基化狀態(tài)以單堿基分辨率讀出。
圖12.adomet類似物的實例結(jié)構(gòu)，其中光活性烯烴經(jīng)苯基、二甲氧基苯基(dimethoxyphenylgroup)或其它基團修飾。
圖13.當c經(jīng)長波吸收雙鍵(long-wavelengthabsorbingdoublebond)(比如苯基修飾的烯烴)修飾時，通過環(huán)加成中間體dna中的利用酶修飾的c向u衍生物的光催化轉(zhuǎn)化。
圖14.ru(bpy)32+的雙途徑光催化機制，所述ru(bpy)32+是可進行缺電子烯烴和富電子烯烴兩者的[2+2]環(huán)加成的多功能光催化劑。
圖15.a.當c用缺電子雙鍵修飾時，通過環(huán)加成中間體進行的ru(bpy)32+-可見光催化的dna中的5-位修飾c向u的光轉(zhuǎn)化。b.當c用富電子雙鍵修飾時，通過環(huán)加成中間體進行的ru(bpy)32+-可見光催化的dna中的5-位修飾的c向u的光轉(zhuǎn)化。
圖16.生成、分離、純化和分析突變體m.sssi的功能活性的方法的概括。
圖17.經(jīng)設(shè)計或在生成的過程中的his標記的野生型和突變型變異體。
圖18.用hpall消化1小時的野生型(wt)和突變體pcal7的凝膠照片。具有甲基化非敏感的mspl的野生型質(zhì)粒的消化作為對消化的完全控制。m.sssl的突變型變異體的體內(nèi)功能試驗的凝膠結(jié)果。用hpall消化的分離的質(zhì)粒的凝膠結(jié)果表明了正如預(yù)期的，野生型對hpall消化是完全耐受的，serser和alaser突變型質(zhì)粒對hpall消化是部分耐受的，而serala突變體由hpall完全消化。結(jié)果證實了serser和alaser突變體然而由于其較大的活性位點能夠以預(yù)期低于野生型的效率甲基轉(zhuǎn)移。
圖19.合成含有具有長波吸收的光反應(yīng)性基團的adomet類似物的實例方案。
圖20.光轉(zhuǎn)化測定。合成了具有在相同cpg位點的環(huán)境中在各鏈上的可光轉(zhuǎn)化的5-修飾的胞嘧啶(c')的寡核苷酸。在輻照之前，或者在不存在向u類似物(u')的光轉(zhuǎn)化的情況下，可通過限制性內(nèi)切酶hpaii切割位點，然后進行pcr擴增，其導(dǎo)致c'被正常c替換。在光轉(zhuǎn)化之后，pcr可將所得u'轉(zhuǎn)化為正常u，在這種情況下，可用bfai切割位點。在dna中包括其它限制性位點以產(chǎn)生使得凝膠上的條帶或者由質(zhì)譜法獲得的峰可容易分辨的片段尺寸。
圖21.5-phallomc合成路線的實例。
圖22.a.圖24中的化合物4的核磁共振(nmr)圖譜。b.圖24中的化合物6的核磁共振(nmr)圖譜。c.圖24中的化合物7的核磁共振(nmr)圖譜。
圖23.5-phall-omc的質(zhì)譜。
圖24.5-dimephall-omc的實例合成路線。
圖25.5-phall-omc向5-phall-omu的光化學轉(zhuǎn)化。(1.)直接的光解或三重態(tài)敏化(tripletsensitization)引發(fā)了[2+2]環(huán)加成。(2.)c的伯胺基被氧化為羰基。由于c中雙鍵的丟失，該反應(yīng)在水溶液(ph＝7)中自發(fā)地發(fā)生。(3.)在最后步驟，環(huán)裂可生成5-phall-omu。類似的dt衍生物的環(huán)裂已經(jīng)在文獻中被報道了(matsumura,etal.,2008,fujimoto,etal.,2010)。
圖26.上圖，在三重態(tài)敏化劑噻噸酮(tripletsensitizerthioxanthone)(tx；如右上角頂部的圖顯示的)存在下光輻照之前的5-phall-omc(如頂部中間的上圖所示)的hplc分析。插圖顯示了tx和5-phall-omc紫外吸收光譜；注意到，350nm的光不與胞嘧啶相互作用但是由tx強烈吸收。下圖：用350nm光光輻照20min之后的分析。雖然敏化劑(tx)的濃度保持不變，5-phall-omc被大部分消耗掉并且新的光產(chǎn)物出現(xiàn)了。主要的光產(chǎn)物被分離并且由ms、1h-nmr和13c-nmr鑒定為u的環(huán)丁基衍生物，直的加合物或交叉的加合物(如下圖左側(cè)所示的)。
圖27.5-phallomc(上圖)和分離的光產(chǎn)物(下圖)的13c-nmr分析。碳原子5、6、c和d觀察到主要位移。為了簡單起見，只有直的[2+2]環(huán)加合物被顯示了。這些結(jié)果(正如紅外光譜一樣)顯示了4位的氧化脫氨基作用，沒有對堿基配對位置產(chǎn)生影響。
圖28.光敏劑共軛模型化合物(photo-sensitizerconjugatedmodelcompound)(tx-ph-c)的合成。tx光敏劑到光活性基團的并入會增加去氨基反應(yīng)的專一性和效率。
圖29.上圖：包含敏化劑的adomet類似物，其遞送高效的光活性脫氨基基團到雙鏈dna中的未甲基化的cpg位點的胞嘧啶上。顯示了噻噸酮光敏劑。下圖：合成包含敏化劑的adomet類似物的方案。
圖30.包含光敏劑(tx)和可點擊部分(clickablemoieties)(疊氮基修飾在上面，炔烴在下面，兩者都被圈在該圖中)的adomet類似物的實例結(jié)構(gòu)。
圖31.光化學甲基化分析的總體方案的概要。引入修飾以通過點擊化學純化包含未甲基化的cpg位點的dna片段。這些包含未甲基化的cpg二核苷酸的dna片段在銅離子的存在下將被收集在包含互補修飾(炔烴或疊氮基)的磁珠上。該珠子在中性水溶液緩沖區(qū)中洗滌，結(jié)合的適配體和由pcr擴增的dna在測序文庫的構(gòu)建之前直接從珠子脫離。
圖32.化合物肉桂醇(環(huán)形)和圖21中的模型化合物5-phall-omc在乙腈(acn)溶液中的熒光光譜(λex＝282nm)。該圖顯示了當共價連接到c時由于單重態(tài)能量轉(zhuǎn)移到c和/或[2+2]環(huán)加成苯丙烯雙鍵(cinnamyldoublebond)為c，苯丙烯醚發(fā)色團(苯乙烯發(fā)色團)的熒光是高效淬火的。
圖33.為了通過激光閃光光解確定從三重態(tài)敏化劑噻噸酮向phall-omc的苯乙烯發(fā)色團的三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移的速率常數(shù)，使用了包含苯乙烯發(fā)色團的模型化合物肉桂醇。噻噸酮的光致激發(fā)產(chǎn)生了三重態(tài)，其由肉桂醇淬火，具有速率常數(shù)kq＝7.8x109m-1s-1，其接近于有可能三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移的最大速率常數(shù)。
圖34.在不存在和存在不同濃度的肉桂醇(0到0.25mm)的條件下，在氬氣飽和的乙腈溶液中，在脈沖激光器激發(fā)(355nm,5ns脈沖寬度)之后在625nm處監(jiān)測的噻噸酮三重態(tài)的瞬態(tài)吸收的衰退蹤跡。b.確定三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)。在不同濃度的肉桂醇的條件下，噻噸酮三重態(tài)的衰退的假一級速率常數(shù)。
具體實施方式
術(shù)語
除非另外規(guī)定，否則如本文所使用的，各以下術(shù)語將具有如下所列的定義。
a-腺嘌呤；
c-胞嘧啶；
dna-脫氧核糖核酸；
g-鳥嘌呤
rna-核糖核酸；
t-胸腺嘧啶；以及
u-尿嘧啶。
“核酸”可意指任何核酸分子，包括，但不限于，dna、rna及其雜合體。形成核酸分子的核酸堿基可以是堿基a、c、g、t和u以及其衍生物。這些堿基的衍生物是本領(lǐng)域公知的，并且在《pcr系統(tǒng)、試劑和消耗品》(pcrsystems，reagentsandconsumables)(珀金埃爾默目錄1996至1997年，羅氏分子系統(tǒng)公司，布蘭奇，新澤西州，美國(perkinelmercatalogue1996-1997,rochemolecularsystems,inc.,branchburg,newjersey,usa))中舉例說明。
核苷酸的“類型”是指a、g、c、t或u。堿基的“類型”是指腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
在本申請中為了簡單起見，c和dc可交換地使用，a和da、u和du、g和dg和t和dt也是一樣。同樣地，為簡單起見，t和u之間具有中間體的結(jié)構(gòu)類似物/性質(zhì)在本文被稱為u。
“突變型”dna甲基轉(zhuǎn)移酶是指修飾的dna甲基轉(zhuǎn)移酶，包括但不限制于修飾的m.sssi、m.hhal和m.cviji。
“質(zhì)量標記物”意指預(yù)定尺寸的分子實體，其能夠通過可斷裂的鍵連接在其它實體上。
“固體基底”可意指可黏附核酸或試劑的以固相存在的任何合適的介質(zhì)。非限制性實例包括芯片、顆?；蛑?。
“雜交”可意指基于序列互補性使一條單鏈核酸與另一條核酸退火。在核酸之間的雜交傾向取決于其環(huán)境的溫度和離子強度、核酸的長度以及互補程度。這些參數(shù)對雜交的影響是本領(lǐng)域公知的(參見薩姆布魯克j，弗里奇ef，馬尼亞蒂斯t.1989.分子克?。簩嶒炇沂謨?冷泉港實驗室出版社，紐約(sambrookj,fritschef,maniatist.1989.molecularcloning:alaboratorymanual.coldspringharborlaboratorypress,newyork.))。
本發(fā)明的實施例
本發(fā)明提供了一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r是
在一個或多個實施例中，r是
其中r1和r2獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r是
在一個或多個實施例中，r是
在一個或多個實施例中，r'是h或烷基。
本發(fā)明還提供了一種物質(zhì)組合物，其包含具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r是
所述化合物與cpg甲基轉(zhuǎn)移酶相連接。
在一個或多個實施例中，r是：
其中r1和r2獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r是
在一個或多個實施例中，r是：
在一個或多個實施例中，r'是h或烷基。
在一個或多個實施例中，所述化合物與所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶的活性位點相連接。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是sssi甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是hhai甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是cviji甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生雙鏈dna衍生物的方法，其包含使所述雙鏈dna與cpg甲基轉(zhuǎn)移酶和具有以下結(jié)構(gòu)的s-腺苷甲硫氨酸類似物接觸：
其中r是能夠通過所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶從所述s-腺苷甲硫氨酸類似物上轉(zhuǎn)移到所述雙鏈dna的未甲基化胞嘧啶的5-碳上的化學基團，其是在使得所述化學基團與所述雙鏈dna的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共價結(jié)合的條件下進行，從而產(chǎn)生所述雙鏈dna衍生物，其中所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r是
在一個或多個實施例中，所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
其中r1和r2獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r是
在一個或多個實施例中，所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
在一個或多個實施例中，r'是h或烷基。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是sssi甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是hhai甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是cviji甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，當能夠通過所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶從所述s-腺苷甲硫氨酸類似物轉(zhuǎn)移到所述雙鏈dna的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳上的所述化學基團與所述雙鏈dna的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共價結(jié)合時，所述化學基團允許所述未甲基化胞嘧啶的4-位上的光化學脫氨基化。
在一個或多個實施例中，所述未甲基化胞嘧啶在序列中直接與所述雙鏈dna的單鏈中的鳥嘌呤鄰接。
本發(fā)明還提供了一種確定存在于已知序列的雙鏈dna序列中的胞嘧啶是否為未甲基化的方法，其包含：
a)通過使所述雙鏈dna與cpg甲基轉(zhuǎn)移酶和具有以下結(jié)構(gòu)的s-腺苷甲硫氨酸類似物接觸來產(chǎn)生所述雙鏈dna的衍生物：
其中r是化學基團，所述化學基團能夠通過所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶從所述s-腺苷甲硫氨酸類似物轉(zhuǎn)移到所述雙鏈dna的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化學基團與所述雙鏈dna的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共價結(jié)合，從而制備衍生的雙鏈dna，其中所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)；
b)通過在步驟a)中產(chǎn)生的衍生物的光轉(zhuǎn)化來制備u類似物；
c)獨立地獲得所述雙鏈dna衍生物的單鏈；
d)對在步驟c)中獲得的所述單鏈進行測序；以及
e)將在步驟d)中測定的所述單鏈的序列與沒有產(chǎn)生衍生物的所述雙鏈dna的相應(yīng)鏈的序列進行比對，
其中在衍生物單鏈的所述單鏈中存在尿嘧啶類似物，其替代在沒有產(chǎn)生衍生物的所述雙鏈dna的相應(yīng)鏈中的預(yù)定位置上的胞嘧啶，表明了在所述雙鏈dna的所述位置上的所述胞嘧啶是未甲基化的。
在一個或多個實施例中，所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
其中r1和r2獨立地為h烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)。
在一個或多個實施例中，所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
在一個或多個實施例中，r'是h或烷基。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是m.sssi甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是m.hhai甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是m.cviji甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述未甲基化胞嘧啶在序列中直接與所述雙鏈dna的單鏈中的鳥嘌呤鄰接。
在一個或多個實施例中，當能夠通過所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶從所述s-腺苷甲硫氨酸類似物轉(zhuǎn)移到所述雙鏈dna的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳上的所述化學基團與所述雙鏈dna的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共價結(jié)合時，所述化學基團允許所述未甲基化胞嘧啶的4-位上的光化學脫氨基化。
在一個或多個實施例中，在步驟d)中所述測序是通過合成測序。
在一個或多個實施例中，所述通過合成測序包含使衍生的單鏈與dna聚合酶、引物寡核苷酸、datp、dctp、dgtp、dttp以及連接有可檢測標記的三磷酸雙脫氧核苷酸接觸。
在一個或多個實施例中，所述可檢測標記是放射性或有熒光的。
在一個或多個實施例中，所述可檢測標記是質(zhì)量標記物。
在一個或多個實施例中，所述可檢測標記是具有電性能的分子，該電性能通過例如減小此類電流影響納米孔中的離子電流。在一個或多個實施例中，所述方法還包含在步驟d)之前將所述單鏈與固體載體相連接。本發(fā)明還提供了一種衍生的dna分子，其中所述衍生的dna分子不同于dna之處在于其包含核苷酸殘基，所述核苷酸殘基包含具有以下結(jié)構(gòu)的堿基：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r″、cn、no2、c(o)r″、s(o)2nhr″；
其中x是o或nr'；
其中r″是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r'是
并且其中所述糖是所述核苷酸殘基的糖。
在一個或多個實施例中，r'是：
其中r1和r2獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r″、cn、no2、c(o)r″、s(o)2nhr″；
其中x是o或nr″；
其中r″是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
前提條件是，當r'是
在一個或多個實施例中，r'是
在一個或多個實施例中，r″是h或烷基。
本發(fā)明還提供了一種衍生的dna分子，其中所述衍生的dna分子不同于dna之處在于其包含核苷酸殘基，所述核苷酸殘基包含具有以下結(jié)構(gòu)的堿基：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)，
并且其中所述糖是所述核苷酸殘基的糖。
在一個或多個實施例中，r″是以下結(jié)構(gòu)：
其中r1和r2獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)。
在一個或多個實施例中，r″是：
在一個或多個實施例中，r'是h或烷基。
本發(fā)明還提供了一種用于衍生雙鏈dna分子或者用于確定存在于已知序列的雙鏈dna序列中的胞嘧啶是否為未甲基化的試劑盒，其包含：
a)具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：
其中r是
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)；以及
b)使用說明書。
在一個或多個實施例中，r是以下結(jié)構(gòu)：
其中r1和r2獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)。
在一個或多個實施例中，r是
在一個或多個實施例中，r'是h或烷基。
在一個或多個實施例中，所述試劑盒還包含cpg甲基轉(zhuǎn)移酶。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是m.sssi甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是m.hhai甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是m.cviji甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
本發(fā)明還提供了一種確定存在于已知序列的雙鏈dna序列中的胞嘧啶是否為未甲基化的方法，其包含：
a)通過使所述雙鏈dna與cpg甲基轉(zhuǎn)移酶和具有以下結(jié)構(gòu)的s-腺苷甲硫氨酸類似物接觸來產(chǎn)生所述雙鏈dna的衍生物：
其中r是化學基團，所述化學基團能夠通過所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶從所述s-腺苷甲硫氨酸類似物轉(zhuǎn)移到所述雙鏈dna的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化學基團與所述雙鏈dna的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共價結(jié)合，從而制備衍生的雙鏈dna，其中所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
其中r1、r2和r3獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)；以及
b)確定在所述雙鏈dna中的預(yù)定位置上的胞嘧啶是否被所述化學基團r所修飾，
其中在所述雙鏈dna中預(yù)定位置上的所述胞嘧啶被所述化學基團r修飾表示在所述雙鏈dna中的所述位置上的所述胞嘧啶為未甲基化的。
在一實施例中，所述方法進一步包括在步驟b)之前的c類似物向u類似物光轉(zhuǎn)化的步驟。
在一個或多個實施例中，所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
其中r1和r2獨立地為h、烷基、芳基、c(o)nh2、c(o)r'、cn、no2、c(o)r'、s(o)2nhr'；
其中x是o或nr'；
其中r'是h、烷基或芳基；并且
其中n是1至8的整數(shù)。
在一個或多個實施例中，所述化學基團具有以下結(jié)構(gòu)：
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是sssi甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是hhai甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是cviji甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是m.sssi甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是m.hhai甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，所述cpg甲基轉(zhuǎn)移酶是m.cviji甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體。
在一個或多個實施例中，確定在所述雙鏈dna中的預(yù)定位置上的胞嘧啶是否被所述化學基團r所修飾包含將所修飾的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶類似物。
在一個或多個實施例中，所述方法還包含通過光催化反應(yīng)將在dna衍生物中的修飾的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶類似物。
在一個或多個實施例中，所述光催化反應(yīng)使用三(聯(lián)吡啶)釕(ii)氯化物(ru(bpy)32+)催化劑來進行。
在一個或多個實施例中，所述(ru(bpy)32+)催化劑是ru(bpy)3cl2。
在一個或多個實施例中，所述(ru(bpy)32+)催化劑是ru(bpy)3(pf6)2。
在一個或多個實施例中，用于所述光催化反應(yīng)的光源是家用燈泡。
在一個或多個實施例中，用于所述光催化反應(yīng)的光源是激光。
在一個或多個實施例中，所述激光的波長為400nm至600nm。
在一個或多個實施例中，所述光催化反應(yīng)是通過采用大于350nm波長的光輻照來進行。
在一個或多個實施例中，所述光催化反應(yīng)是通過采用具有長波吸收性能的催化劑來進行。
在一個或多個實施例中，所述光催化反應(yīng)是通過采用300nm-700nm波長范圍的光輻照來進行。
在一個或多個實施例中，所述光催化反應(yīng)進一步是在0℃-90℃溫度范圍來進行。
在一個或多個實施例中，所述光催化反應(yīng)進一步是在具有ph在4到10之間的緩沖溶液中來進行。
本發(fā)明提供了用于甲基化分析的方法。用于甲基化分析的方法公開于美國專利申請公開號us2011-0177508al中，其在此通過引用并入本文。
本發(fā)明提供了dna甲基轉(zhuǎn)移酶的用途。dna甲基轉(zhuǎn)移酶的實例包括但不限于m.sssi、m.hhai和m.cviji以及經(jīng)修飾的m.sssi、m.hhai和m.cviji。主要將這些酶修飾為具有降低的特異性以使得在adomet類似物上的r基團可被更有效地轉(zhuǎn)移到未甲基化的c殘基上，包括在dna中的cpg位點的環(huán)境中。這樣的經(jīng)修飾的m.sssi和m.hhai基因的實例已經(jīng)描述于文獻(劉克納維卡斯等(2012)改造dna胞嘧啶-5-甲基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)以用于dna的序列特異性標記《核酸研究》,40(22),11594-602；kriukiene等(2013)通過cpg位點的共價捕獲的dna未甲基化分析.《自然》第4卷:doi:10.1038/ncomms3190(lukinaviciusetal(2012)engineeringthednacytosine-5methyltransferasereactionforsequence-specificlabelingofdna.nucleicacidsres40:11594-11602；kriukeneetal(2013)dnaunmethylomeprofilingbycovalentcaptureofcpgsites.naturecommun4:doi:10.1038/ncomms3190))。
本發(fā)明提供了即用的方法和過程，其中通過可裂解的連接子與堿基結(jié)合的可檢測標記是染料、熒光團、生色團、組合的熒光能量轉(zhuǎn)移標記物、質(zhì)量標記物、電泳團(electrophore)或能夠減小納米孔中離子電流的分子。組合的熒光能量標記物及其生產(chǎn)方法公開于美國專利號6,627,748中，其在此通過引用并入本文。
可用于本文所述方法的實施例的可檢測標記物及其將核酸黏附在表面上的方法公開于美國專利號6,664,079和7,074,597中，其在此通過引用并入本文。
本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中將dna與固體基底相結(jié)合。本發(fā)明還提供了即用的方法，其中dna是通過1,3-偶極疊氮化物-炔的環(huán)化加成化學反應(yīng)與固體基底結(jié)合。本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中dna是通過聚乙二醇分子與固體基底結(jié)合的。本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中dna炔標記的。本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中dna是通過聚乙二醇分子與固體基底結(jié)合的，而且所述固體基底是疊氮化物-官能化的。本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中dna是通過疊氮連接、炔基連接，或者生物素-抗生蛋白鏈菌素相互作用固定在固體基底上的。核酸的固定化在由克里斯汀維特曼(2005)編著的《dna在芯片ii上的固定化》，斯普林格出版公司，柏林(immobilizationofdnaonchipsii,editedbychristinewittmann(2005),springerverlag,berlin)中描述，其在此通過引用并入本文。本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中dna是通過聚乙二醇分子與固體基底結(jié)合的，而且所述固體基底是疊氮化物-官能化的，或者dna是通過疊氮連接、炔基連接或者生物素-抗生蛋白鏈菌素相互作用固定在固體基底上的。在一個實施例中，dna或核酸是通過與dna相容的共價位點-特異偶聯(lián)化學作用與固體表面連接/結(jié)合的。
本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中所述固體基底的形式為芯片、顆粒、孔、毛細管、玻片、薄片、濾紙、纖維、多孔介質(zhì)或者柱。本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中所述固體基底是金、石英、二氧化硅、塑料、玻璃、尼龍、金剛石、銀、金屬、聚丙烯，或者石墨烯。本發(fā)明還提供了即用的方法，其中所述固體基底是多孔的。芯片或顆?？捎胐na微陣列法常用的材料制作，例如玻璃或尼龍。顆粒/微顆?？梢来喂潭ㄔ谛酒?。
本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中將約1000個或更少的dna拷貝與所述固體基底結(jié)合。本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中將2×l07、l×l07、l×l06或l×l04個或更少的dna拷貝與所述固體基底結(jié)合。
本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中核苷酸類似物包含螢光團cy5、bodipy-fl-510、rox和r6g中的一種。
本發(fā)明還提供了即用的方法和過程，其中dna聚合酶是9°n聚合酶或其變體。可以用于本發(fā)明的dna聚合酶包括，例如大腸桿菌(e.coli)dna聚合酶i、噬菌體t4dna聚合酶、sequenasetm、taqdna聚合酶、9°n聚合酶(外-)a485l/y409v、phi29或bst2.0?？梢杂糜诒景l(fā)明的rna聚合酶包括，例如，噬菌體sp6，t7和t3rna聚合酶。
用于生產(chǎn)可裂解地加帽的和/或可裂解地連接的核苷酸類似物的方法公開于美國專利號6,664,079中，其在此通過引用并入本文。
在美國專利申請公開號2003-0232371a1中描述了dna甲基化，其在此通過引用以其整體并入本文。
本文描述的多種要素的所有組合和附屬組合均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可以通過參考下述的實驗細節(jié)來更好地理解本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地意識到特定的實驗細節(jié)只是用以說明如在所附權(quán)利要求書中更加完整地描述的本發(fā)明。
實驗細節(jié)
特定序列的dna甲基化首先通過南方印跡技術(shù)(southernblotting)來分析，其是先用對甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶(msre)，如hpaii來裂解，但當中心cpg二核苷酸為甲基化時，其無法裂解序列5'-ccgg-3'(瓦爾韋克和弗拉維爾，1978(waalwijkandflavell,1978))。所述方法很強烈，并且當用于未甲基化的且存在于許多拷貝中的線粒體dna的印跡被反復(fù)探測時，所述方法為完全消化提供了內(nèi)部的控制。但是，msre方法冗長且昂貴，需要相對大量的放射性核苷酸，并且對于每個片段只能檢驗少量的cpg位點，因為所有cpg位點中僅有～20％落在已知msre的識別序列中。如果給定的片段含有許多cpg位點，而只有一個或者幾個位點是未甲基化的，則通常將所述序列評分為未甲基化的。msre提供了最佳控制的甲基化分析方法，但是其低通量和其它缺點意味著其不能構(gòu)成全基因組甲基化分析平臺的基礎(chǔ)。
已經(jīng)開發(fā)出用于單個或少量cpg位點快速甲基化分析的許多其它的基于pcr的方法；例如甲基化敏感的pcr(msp；施泰格瓦爾德等，1990(steigerwaldetal.,1990))、cobra(伊茲和萊爾德，2002(eadsandlaird,2002))和甲基-光(鄭等，2001(trinhetal.,2001))。這些方法快速且便宜，但只能檢驗少量的cpg位點；其不適于無偏好性的全基因組甲基化分析。在發(fā)現(xiàn)了特定的甲基化異常與特定的病癥有關(guān)之后，這些關(guān)注的方法或許適用于臨床樣本的診斷和預(yù)后測試。
微陣列分析法的應(yīng)用已經(jīng)取得了很大的成功(例如，敬田等，2002(gitanetal.，2002))。但是，微陣列法不能確定重復(fù)序列(其包含基因組中大多數(shù)的5-甲基胞嘧啶；羅林斯等，2006(rollinsetal.,2006))的甲基化狀態(tài)，并且cpg島由于其高的g+c含量產(chǎn)生高的噪聲水平。微陣列法不能檢查每個cpg二核苷酸的甲基化狀態(tài)。再次，盡管所述方法有其優(yōu)點，但其不適合于全基因組的甲基化分析。
甲基化分析的重要進展來自蘇珊克拉克(susanclark)和瑪麗安弗羅默(mariannefrommer)在1994年引入了亞硫酸氫鹽基因組測序(bgs)(克拉克等，1994(clarketal.,1994))。bgs依靠亞硫酸氫鈉對胞嘧啶4-位上的氧化脫氨基能力，從而將堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。在5-位上的甲基防止了亞硫酸氫鹽跨5-6雙鍵的加成，其使得5-甲基胞嘧啶抗亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。pcr擴增，接著dna測序產(chǎn)生c泳道，其中的每個條帶對應(yīng)于起始dna中的5-甲基胞嘧啶；所有未甲基化的胞嘧啶被測序為胸腺嘧啶。bgs是一項超越早期的基因組測序方法的重大進展(丘奇&吉爾伯特，1984(church&gilbert,1984))。
但是，當用于全基因組甲基化分析時，bgs有嚴重的缺點。首先，除非一個序列在存在亞硫酸氫鹽處理和不存在亞硫酸氫鹽處理兩種情況下并比較結(jié)果，否則bgs不能知道在終序列的胸腺嘧啶是在起始物質(zhì)中的胸腺嘧啶或胞嘧啶。這就大大降低了dna的信息含量。結(jié)果，就不用新的超高通量的dna測序方法，由于序列讀數(shù)短，很大百分比的序列不能在基因組圖的單一位置上繪制出來。幾乎沒有什么重復(fù)序列能在圖上表示出來。bgs主要限制在基因組預(yù)先選擇的區(qū)域內(nèi)，在所述區(qū)域內(nèi)可設(shè)計引物以選擇性地擴增目的區(qū)域。通過這種方法不能獲得全基因組的甲基化分析，這是因為基因組的許多區(qū)域不允許設(shè)計獨特的成套引物的緣故。cpg島尤其成問題，因為不含cpg二核苷酸的引物位點不能在大多數(shù)的cpg島中發(fā)現(xiàn)。其次，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化要求dna是單鏈的；任何雙鏈dna將抵抗轉(zhuǎn)化并被評分為甲基化了的。結(jié)果，亞硫酸氫鹽處理必須在十分苛刻的條件下進行(0.2n氫氧化鈉，在升高溫度條件下進行數(shù)小時)。在這樣的條件下，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化與鍵斷裂是競爭反應(yīng)，只有當95％以上的dna被裂解成小于350bp時，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化才會趨于完全(瓦內(nèi)克等，2002(warneckeetal.，2002))。這就意味著必須使用大量的起始dna，而且dna—定要長。這就妨礙了使用石蠟切片的dna，其中dna幾乎都<300bp，并且還妨礙了使用少量dna，如在早期胚胎、小組織切片檢查的情況下以及其他大量的dna不能獲得的情況。第三，在某些序列環(huán)境中，cpg二核苷酸固有地抵抗亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化(瓦內(nèi)克等，2002(warneckeetal.,2002))，被評分為甲基化的假位點。第四，所有c-g堿基配對的缺失給pcr擴增步驟帶來很大的偏好性，其有利于從未轉(zhuǎn)化的或已經(jīng)甲基化了的起始物質(zhì)衍生而來的pcr產(chǎn)物(瓦內(nèi)克等，1997(warneckeetal.，1997))。每一個這樣的人工產(chǎn)品都可能是嚴重的。
綜合來看，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化時的序列信息缺失、強的pcr偏好性、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的人工產(chǎn)品，以及需要大量長的起始dna使得常規(guī)bgs不適于通過超高通量的dna測序的全基因組甲基化分析。
過去幾年中，所述實驗室已經(jīng)開發(fā)出新的方法將正常人類基因組分段成甲基化的和未甲基化的區(qū)室，并且已經(jīng)確定了來自分段的基因組的超過3千萬個堿基對的cpg二核苷酸的甲基化狀態(tài)以表征正常人類基因組的甲基化概況(羅林斯等，2006(rollinsetal.，2006))。在那項研究中，開發(fā)了新的計算方法將基因組的注解特征繪制在非常大的序列數(shù)據(jù)的集合上。盡管這個依賴于將dna用酶分段成甲基化的和未甲基化的區(qū)室的方法提供了更多cpg位點的甲基化狀態(tài)信息，其要比所有其他方法加起來的總數(shù)還多，但它還是不能進行全基因組的甲基化分析，因為現(xiàn)有技術(shù)尚不能克服它的缺點。
甲基化異常的實例通過羅林斯等，(2006)(rollinsetal.，(2006))的方法來識別。應(yīng)注意，本文公開的方法可用于任何測序的基因組；乳腺癌被表征了是因為已知在這些細胞的基因組中存在高度異常的甲基化模式，并且這些基因組提供了出色的測試系統(tǒng)。
柯雷馬桑斯卡斯(klimasauskas)和溫霍爾德(weinhold)組先前的研究工作(達爾霍夫等，2006a，2006b(dalhoffetal.，2006a，2006b))已經(jīng)表明多種官能團可以通過合成的adomet類似物由dna甲基轉(zhuǎn)移酶有效地轉(zhuǎn)移到dna中胞嘧啶的5-位上，在adomet類似物中甲基已經(jīng)被多種官能團的任意一種所取代。具體地說，dalhoffetal.(2006a)用一系列取代甲基的官能團合成了合成的adomet變異體，其還實現(xiàn)了dna甲基轉(zhuǎn)移酶的有效運行。接著dalhoffetal(2006b)證實了通過使用dna甲基轉(zhuǎn)移酶具有基本上100％效率，多種官能團向胞嘧啶和鳥嘌呤重復(fù)(cpg位點)的dna位點中cs的5位轉(zhuǎn)移。
hagaetal.(1993)證實了在丙酮中的2.3-二甲基-2-丁烯存在下胞嘧啶到相應(yīng)的環(huán)丁烷光加合物(通過光引發(fā)的增加兩種或以上反應(yīng)物形成的產(chǎn)品)的光轉(zhuǎn)化(在光的影響下的轉(zhuǎn)化)。這種化學過程由matsumuraetal.,(2008)和fujimotoetal.(2010)應(yīng)用用于c到u的dna上的轉(zhuǎn)化。申請人的調(diào)查試圖應(yīng)用從這些關(guān)于adomet、使用甲基轉(zhuǎn)移酶的酶促轉(zhuǎn)移和c到u的光轉(zhuǎn)化的調(diào)查研究導(dǎo)出的知識以設(shè)計新穎的方法用于單細胞、全基因組甲基化組分析。
對于給定的甲基轉(zhuǎn)移酶，可將諸如生物素那樣的龐大基團加成到每個識別位點上。這里，dna甲基轉(zhuǎn)移酶m.sssi可用于將特定的反應(yīng)性基團轉(zhuǎn)移到每個未甲基化的cpg二核苷酸中胞嘧啶的5-位上；非cpg的胞嘧啶不會被修飾。如果所述胞嘧啶是甲基化的，則所述反應(yīng)被阻斷—只有未甲基化的cpg二核苷酸被衍生。轉(zhuǎn)移的基團的最重要之處在于其改變了測序過程中或者pcr擴增過程中的堿基配對，以便識別在起始dna中甲基化的或者未甲基化的cpg二核苷酸。所述方法在概念上與亞硫酸氫鹽基因組測序有關(guān)，但并不具有使得bgs不能用于全基因組甲基化分析的缺點。
實例1：基于在cpg島中的胞嘧啶的dna甲基轉(zhuǎn)移酶輔助的位點特異性轉(zhuǎn)化的全基因組dna甲基化分析的方法
開發(fā)了基于獨特且新穎方法的優(yōu)越的甲基化分析方法。柯雷馬桑斯卡斯(klimasauskas)和溫霍爾德(weinhold)組(達爾霍夫等，2006a，2006b(dalhoffetal.,2006a2006b))合成了s-腺苷-l-甲硫氨酸(adomet)類似物，其中甲基已經(jīng)被多種官能團所替代，并表明dna甲基轉(zhuǎn)移酶能夠特異性地將這些官能團轉(zhuǎn)移到在dnacpg位點中的胞嘧啶的5位上。效率基本上為100％(達爾霍夫等，2006a，2006b(dalhoffetal.,2006a,2006b))。因此，dna甲基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)用于大量化學基團與dna的序列特異性、共價連接，為大量天然dna的精確、靶向官能化和標記提供了新的分子工具。
利用所述能力來使用cpg位點特異性dna甲基轉(zhuǎn)移酶來用合適的反應(yīng)性中間體修飾c的5位，所述反應(yīng)性中間體隨后將c轉(zhuǎn)化為尿苷(u)類似物。這樣的轉(zhuǎn)化策略滿足上述標準并克服了現(xiàn)有方法中的缺點，因此推進了全基因組dna甲基化分析領(lǐng)域。
開發(fā)了基于dna甲基轉(zhuǎn)移酶輔助的在未甲基化的cpg二核苷酸中的c的位點特異性轉(zhuǎn)化的新全基因組甲基化分析方法。在所述方法中，將用c-反應(yīng)性官能團衍生的adomet類似物用作dna甲基轉(zhuǎn)移酶的底物以將反應(yīng)性官能團轉(zhuǎn)移到在未甲基化的cpg二核苷酸中的c的5位上(圖1)。例如，cpg位點特異性細菌dna甲基轉(zhuǎn)移酶m.sssi(其通過使用adomet作為供體使得所有的cpg二核苷酸甲基化)可被使用以促使未甲基化的cpg二核苷酸中的c's到u's的化學轉(zhuǎn)化；這通過酶的精確的cpg位點識別和在c的5位的鍵的形成的高選擇性實現(xiàn)(renbaumetal.,1990)。adomet類似物被開發(fā)了，實現(xiàn)m.sssi直接轉(zhuǎn)移基團到dna的未甲基化c's以便于這些經(jīng)修飾的cpgc's向u's的高效光轉(zhuǎn)化，具有對dna的最小損傷。在中性水溶液中，這些利用酶連接的反應(yīng)性基團或官能團引發(fā)高效分子內(nèi)反應(yīng)，導(dǎo)致c轉(zhuǎn)化為u類似物。在轉(zhuǎn)化之后，轉(zhuǎn)化的dna的高通量dna測序提供了單個堿基分辨率甲基化分析；未甲基化的胞嘧啶被測序為胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶被測序為胞嘧啶。
亞硫酸氫鹽基因組測序是當前針對甲基化組分析的黃金標準方法(katjaetal.,2013)。該方法需要導(dǎo)致未甲基化c轉(zhuǎn)化為u的亞硫酸氫鹽治療dna。甲基化c's仍然未受到影響。在亞硫酸氫鹽治療的dna的測序時這些甲基化c's此后被識別，因為這些是唯一的讀為胞嘧啶的c's。在另一方面，未甲基化的胞嘧啶(其已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為u)被讀為胸苷。
所述方法具有許多創(chuàng)新方面，相比于bgs表現(xiàn)出多種優(yōu)勢。首先，在所述新方法中，使所有cpg二核苷酸甲基化的cpg位點特異性細菌dna甲基轉(zhuǎn)移酶m.sssi將轉(zhuǎn)化化學基團轉(zhuǎn)移到每個未甲基化cpg二核苷酸中的胞嘧啶的5位上；由于酶的嚴格的cpg位點識別和對于c的5位的高區(qū)域選擇性，非cpg胞嘧啶和5-甲基c's未被修飾。這具有比傳統(tǒng)亞硫酸氫鹽化學法顯著的優(yōu)勢，包括只有未甲基化cpg位點的特異性轉(zhuǎn)化，其代替了當使用亞硫酸氫鹽時的所有未甲基化的胞嘧啶。這增加了針對轉(zhuǎn)化的序列信息含量并從而促進基因組讀取的對齊。意味著仍然有可能識別基因組中經(jīng)轉(zhuǎn)化的序列的相應(yīng)序列。
相反，在bgs時，所有未甲基化c's被轉(zhuǎn)化。這是大量的正在被轉(zhuǎn)化的核苷酸甚至于經(jīng)轉(zhuǎn)化的dna通常不再類似于親本dna。因此，很難識別在轉(zhuǎn)化的dna中哪段相當于親本dna中的相同區(qū)域。因此，bgs引起序列信息的丟失。再者，通過不直接作用于所有c's，在本發(fā)明的方法中使用的化學轉(zhuǎn)化有希望不易于受到dna裂解的影響并且導(dǎo)致遠遠不及bgs的dna損傷，其能夠?qū)^長dna片段進行測序。
此外，通過不直接作用于所有胞嘧啶，轉(zhuǎn)化化學法毒性低且導(dǎo)致遠遠不及bgs的dna損傷，其能夠?qū)^長dna片段進行測序(目前的亞硫酸氫鹽方法通常限于分析<500bp的dna片段)。
其次，當在胞嘧啶的5位上用反應(yīng)性基團修飾時，進一步的轉(zhuǎn)化限于修飾的c并且以高效的分子內(nèi)形式發(fā)生。此外，轉(zhuǎn)化化學作用的多功能性允許精細地優(yōu)化轉(zhuǎn)化以確保最小程度的dna損傷并保留最大的dna序列信息。
第三、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化還面對需要單鏈dna的劣勢；雙鏈dna對轉(zhuǎn)化是耐藥的并且甚至當未甲基化時被讀為甲基化的。因此，亞硫酸氫鹽治療必須在非常嚴格的條件(在高溫下，0.2nnaoh，數(shù)小時)下進行，使得使用大量的最初的dna成為必要(warneckeetal.,2002)。
第四、bgs的可靠性進一步通過在某些序列環(huán)境下的cpg二核苷酸的耐受性被減小到亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化(warneckeetal.,2002)。
第五、轉(zhuǎn)化步驟之后的pcr(聚合酶鏈反應(yīng)即擴增dna的方式)擴增步驟有利于從未轉(zhuǎn)化或甲基化的原始材料得到的產(chǎn)物，引入較大的偏離(warneckeetal.,1997)。相反，由于其特異性、高效性和溫和的轉(zhuǎn)化條件，dna甲基轉(zhuǎn)移酶輔助的c的光轉(zhuǎn)化有希望消除bgs的缺陷，比如信息含量的丟失、非cpg胞嘧啶的反應(yīng)性和大量的長的dna(作為原始材料)的需要。
上文討論了亞硫酸氫鹽測序及其限制。相反地，由于dna甲基轉(zhuǎn)移酶輔助的c轉(zhuǎn)化的特異性、高效和溫和轉(zhuǎn)化條件，其保留了bgs的主要優(yōu)點(測試每個cpg二核苷酸的甲基化的能力)同時避免了bgs的缺點如信息含量的缺失、非cpg胞嘧啶的反應(yīng)性以及對于大量長dna作為起始材料的需求。因此，新方法比現(xiàn)有方法更簡單且更易于自動化和用于高通量新一代測序的dna樣品制備，提供了全面分析基因組dna甲基化模式的新的且可靠的方法。
在dna甲基轉(zhuǎn)移酶的化學和生物學研究中的進展已經(jīng)產(chǎn)生了新的工具試劑盒來化學修飾在未甲基化cpg中的c的5位從而引發(fā)在所述特定c上的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。研究了在dna中的合適的c到u轉(zhuǎn)化的多種化學機制。例如，據(jù)報道，光輻照可通過2+2環(huán)加成在烯烴與c的5,6位雙鍵之間產(chǎn)生5,6-環(huán)丁烷中間體，導(dǎo)致共軛體系的中斷，以及在4位上的脫氨基化(芳賀町等，1993(hagaetal.,1993))。值得注意的是，所述化學法已經(jīng)用于在dna上的c向u轉(zhuǎn)化(松村等，2008，藤本吉秀等，2010(matsumuraetal.,2008,fujimotoetal.,2010))。
實例2：5位修飾的脫氧胞苷到脫氧尿苷的光化學轉(zhuǎn)化。
對于酶輔助的位點特異性c向u轉(zhuǎn)化，先決條件是5位連接的化學轉(zhuǎn)化部分應(yīng)能夠觸發(fā)分子內(nèi)反應(yīng)導(dǎo)致c向u的轉(zhuǎn)化。雖然從未報道過這樣的實例，但是通過設(shè)計和合成脫氧胞苷來開始本研究，其中脫氧胞苷的5位上衍生有光反應(yīng)性部分。通過連接插入c的雙鍵與5位之間的具有1至5個碳單元的含雙鍵的鏈來設(shè)計5位修飾的c。已經(jīng)合成了模型化合物之一5-烯丙氧基甲基-dc(5-all-omc)，其中雙鍵是來自5位的3碳單元，隨后在圖2中示出了合成路線。產(chǎn)物通過hrms和1hnmr進行完全表征。
然后，在水溶液中在約300nm下進行5-all-omc的光輻照長達12小時，并通過hplc和uv吸收來分離和監(jiān)測反應(yīng)產(chǎn)物。ms和hplc圖譜顯示5-all-omc(mw298)以光化學方式高效地轉(zhuǎn)化為新產(chǎn)物5-all-omu(mw299)(圖3)。
在相同條件下，在光輻照之后c和5-甲基-c兩者均保持完整。新的以光化學方式產(chǎn)生的產(chǎn)物(5-all-omu)的uv吸收光譜顯示出在265nm處的最大吸收，其為典型的u吸收，而起始材料(5-all-omc)示出λmax＝274nm的期望的c吸收(圖4)。結(jié)果表明5-all-omc通過光輻照轉(zhuǎn)化為u類似物。為了進一步證明所述轉(zhuǎn)化，合成并表征了5-all-omu。由5-all-omc以光化學方式產(chǎn)生的產(chǎn)物與合成的5-all-omu的混合物在hplc中表現(xiàn)為單一峰(圖5)，表明新產(chǎn)物與5-all-omu相同。以光化學方式產(chǎn)生的5-all-omu也通過1nmr進行表征。
這些數(shù)據(jù)清楚地證明，使用烯烴部分對c的5位的修飾可導(dǎo)致在溫和條件下通過光輻照高效地形成u類似物。
實例3：在dna中的c向u類似物的位點特異性光化學轉(zhuǎn)化
為了測試光化學方法用于在真正的dna鏈上將c轉(zhuǎn)化為u的可行性，合成了完全受保護的5-all-omc亞磷酰胺(圖6)并且通過標準寡核苷酸合成法將5-all-omc(c*)摻入16聚體寡核苷酸5'-tacga(c*)gagtgcggca-3'中。在hplc純化之后，通過maldi-tofms來表征修飾的16聚體，產(chǎn)生mw為5001的峰，等于所計算的質(zhì)量。然后，進行寡核苷酸5'-tacga(c*)gagtgcggca-3'的光輻照以將c*轉(zhuǎn)化為u類似物。在dna中的c*轉(zhuǎn)化結(jié)果通過使用單堿基延伸ms分析來檢測(圖7)。在所述分析中，將光輻照的寡核苷酸用引物5'-tgccgcactc-3'(mw2964)進行退火，然后用ddntp和dna聚合酶孵育。在dna聚合酶的幫助下，可將4個ddntp中的一個選擇性地摻入引物的3'端。光化學誘導(dǎo)的c向u的轉(zhuǎn)化應(yīng)能夠引導(dǎo)dda的摻入，產(chǎn)生mw為3261的延長的引物，否則應(yīng)摻入ddg得到mw3277的延長的引物。
一個堿基延長的引物(one-baseelongatedprimer)的實際ms測量示出mw為3261，其與摻有單個ddatp的引物的mw相匹配，因此，確認了在模板上存在互補的u，并證明了在dna上的c*向u類似物的光化學轉(zhuǎn)化(圖7上面)。在對照實驗中，在相同條件下進行未修飾的對應(yīng)物5'-tacgacgagtgcggca-3'的光輻照。所得引物延長產(chǎn)物的單堿基延伸ms分析給出mw為3277，其與用單個ddgtp延伸的引物的mw相匹配(圖7下面)，清楚地表明在dna片段中只有將c的5位用光反應(yīng)性部分修飾，才能將其高效地轉(zhuǎn)化為u類似物。還測量了可能的光輻照誘導(dǎo)的dna損傷。在所使用的條件下(300nm，經(jīng)過10小時)，沒有觀察到dna損傷。
上述研究表明使用光反應(yīng)性部分進行的c的5位修飾提供了c向u的高效轉(zhuǎn)化的新途徑，而不存在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的缺點。因此，證明了c向u的cpg位點特異性轉(zhuǎn)化的可行性并且所述結(jié)果提供了所述dna甲基轉(zhuǎn)移酶輔助的dna甲基化分析方法的基礎(chǔ)和原理。
實施例4：由5位反應(yīng)性部分觸發(fā)的c向u轉(zhuǎn)化化學作用的研究
將5位衍生的脫氧胞苷模型化合物的文庫用于系統(tǒng)地篩選和優(yōu)化最有效地將c轉(zhuǎn)化為u的c反應(yīng)性官能團。在圖8中列出了部分模型化合物。
用作dna甲基轉(zhuǎn)移酶底物的adomet類似物的種類是adohcy的锍衍生物，其中光活性基團(r)替代了adomet中的甲基(圖8)。這樣的含有光活性基團(r)的adomet類似物用作cpg特異性dna甲基轉(zhuǎn)移酶如m.sssi的底物并且作為酶反應(yīng)的結(jié)果，可將這些光活性基團(r)轉(zhuǎn)移到dna中的未甲基化cpg二核苷酸的c的5位上。
(1)光活性基團(r)包括烯烴(圖8，a、b、c、d、e)，其在光輻照時與c的5,6雙鍵形成了環(huán)丁烷中間體，并且進一步導(dǎo)致c向u的轉(zhuǎn)化。光活性基團(r)還包括用r1、r2和r3修飾的烯烴，其促進光反應(yīng)。r1、r2和r3為氫、烷基、芳基、酰胺、羧酸、酯、硝基、氰基、醛基、酮和磺胺。這樣的烯烴或r1、r2和r3修飾的烯烴可通過多個長度的碳鏈(n＝1至8)從adomet類似物的硫原子上分離?？蓪⑼榛溁蚩苫瘜W斷裂的結(jié)構(gòu)(如酯連接子)插入adomet類似物中的上述烯烴與硫原子之間。
(2)光活性基團(r)包括上述烯烴共軛丁二烯部分(圖8，c)。這樣的丁二烯通過多個長度的碳鏈與adomet類似物中的硫原子相連。
(3)光活性基團(r)包括馬來酸酐和馬來酰亞胺類似物(圖8，f、g、h、i)，其通過包含多個長度的碳鏈的飽和鍵或雙鍵來與adomet類似物中的硫原子相連。
(4)光活性基團(r)還包括含n,n雙鍵的官能團，其可用于在光輻照時與c的5,6雙鍵進行光反應(yīng)。例如，r可以為含四唑的部分(圖8，j、k、1)，其通過包含多個長度的碳鏈的飽和鍵或雙鍵來與adomet類似物中的硫原子相連。
實例5：含光反應(yīng)性基團的adomet類似物的合成
通過在溫和的酸性條件下使用光反應(yīng)性部分的相應(yīng)三氟甲磺酸酯(triflates)或溴化物進行的adohcy的區(qū)域選擇性s-烷基化來進行具有期望的延伸的側(cè)鏈的adomet類似物的合成。在adohcy烷基化之后，預(yù)期得到锍的立體異構(gòu)體混合物，進一步進行rp-hplc(反相高效液相色潽法)純化以分離酶活性的s-差向異構(gòu)體以用于后續(xù)轉(zhuǎn)移反應(yīng)。在圖9中示出了adomet類似物的合成路線的實例。adomet類似物合成所需的光反應(yīng)性部分的三氟甲磺酸酯或溴化物可使用如圖10中所示的可市購起始材料來合成。
實例6：dna甲基轉(zhuǎn)移酶引導(dǎo)的在含cpg的dna上的c反應(yīng)性官能團的轉(zhuǎn)移以及后續(xù)的位點特異性c向u的轉(zhuǎn)化。
基于上述實驗結(jié)果來設(shè)計adomet衍生物并且鑒定了所合成的adomet衍生物的可能文庫。根據(jù)報道的方法(達爾霍夫等，2006a，2006b(dalhoffetal.,2006a,2006b))通過在溫和的酸性條件下使用光反應(yīng)性部分的相應(yīng)三氟甲磺酸酯或溴化物進行的adohcy的區(qū)域選擇性s-烷基化來進行具有期望的延伸的側(cè)鏈的adomet類似物的合成(圖10)。在adohcy烷基化之后，預(yù)期得到锍的立體異構(gòu)體混合物，進一步進行rp-hplc純化以分離酶活性的s-差向異構(gòu)體以用于后續(xù)轉(zhuǎn)移反應(yīng)。以adomet類似物作為底物，使用cpg位點特異性dna甲基轉(zhuǎn)移酶(m·sssi)將光反應(yīng)性基團轉(zhuǎn)移到在合成的dna和基因組dna樣品兩者上的未甲基化胞嘧啶的5位上(圖11)。將maldi-tofms用于評估反應(yīng)性部分轉(zhuǎn)移到dna上的效率。此外，使用上文所獲得的優(yōu)化反應(yīng)條件來進行c向u的位點特異性光化學轉(zhuǎn)化。將單堿基延伸實驗(圖7)用于研究在dna上的轉(zhuǎn)化效率。
鑒定了理想的adomet類似物，并優(yōu)化了修飾官能團的酶轉(zhuǎn)移和在dna上的轉(zhuǎn)化兩者的條件。通過篩選最佳波長、強度和其他條件(溫度、時間、緩沖劑、ph和輔助成分)來進一步優(yōu)化光輻照條件以使轉(zhuǎn)化產(chǎn)率最大化并使在dna上的可能副反應(yīng)最小化。
實例7：將dna甲基轉(zhuǎn)移酶輔助的轉(zhuǎn)化化學作用與新一代dna測序組合以達到實際(real-world)dna甲基化分析
在c到u類似物的dna甲基轉(zhuǎn)移酶輔助的cpg位點特異性轉(zhuǎn)化確認之后，由乳房癌細胞系mcf-7(對于其具有非常大量的甲基化數(shù)據(jù))可確定在實際基因組dna制備中的甲基化模式。通過蛋白酶k消化、苯酚提取以及針對10mmtrishcl，ph7.2的透析來純化dna。然后，使dna與上文所鑒定的最佳adomet衍生物和m·sssi(紐英倫生物技術(shù)有限公司(newenglandbiolabs,inc.))反應(yīng)。然后，使衍生的dna經(jīng)歷高通量dna測序(圖11)，將在ncbi參考序列中顯示為tpg的cpg二核苷酸評分為在起始dna中的未甲基化cpg二核苷酸。已經(jīng)開發(fā)并驗證了所需軟件(愛德華茲等，2010(edwardsetal.,2010))。
將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶類似物之后，來自加成的反應(yīng)基團的惰性“尾部”保留在胞嘧啶的5-位上。所述尾部延伸到dna螺旋的主槽中，但是公知的是，所述位置的修飾并不干擾聚合酶延伸過程中核苷酸的摻入，并且已經(jīng)在大量的應(yīng)用中修飾了所述位置(莒等，2006(ju，etal.，2006))，包括具有大的加合物如生物素、地高辛配基(digoxigenin)以及大的熒光部分的dna和rna的聚合酶催化的標記。這樣的修飾并未顯著干擾與dntp結(jié)合的效率或特異性。這允許將確定的樣品制備方案(乳液pcr或橋接pcr)和高通量dna測序技術(shù)與基因組dna的酶輔助的cpg位點特異性c向u轉(zhuǎn)化結(jié)合起來。
因此，所述新的全基因組dna甲基化分析方法的工作流程(圖11)由以下組成：1)c反應(yīng)性部分向c的5位的酶轉(zhuǎn)移；2)導(dǎo)致c向u類似物轉(zhuǎn)化的光反應(yīng)；3)對制備樣品進行測序；以及4)整合高通量dna測序以及使用適于酶輔助的和基于光化學的c向u轉(zhuǎn)化的任何測序平臺的數(shù)據(jù)解釋。所述工作流程的確認為方案的進一步自動化建立了基礎(chǔ)。
實例8：非cpg甲基化的檢測
一些細胞類型包含非cpg甲基化(利斯特等，2009(listeretal.,2009))，其功能目前尚未知。通過m.sssi方案的簡單修飾來取代m.cviji，可繪制出所有非cpg甲基化的～22％，m.cviji使gpc二核苷酸中的胞嘧啶甲基化(許等，1998(xuetal.,1998))，對于m.sssi，其特異于cpg二核苷酸。
實例9：甲基化分析和單個分子測序
所述技術(shù)還可用于通過dna經(jīng)過納米孔室時的電子特性來鑒定堿基的單個分子測序技術(shù)。開發(fā)了adohcy衍生物，其允許衍生的胞嘧啶的精確鑒定以便區(qū)分胞嘧啶與5甲基胞嘧啶。這表示技術(shù)的簡單延伸，其允許極快速且經(jīng)濟地繪制基因組甲基化模式。此處建立的甲基-seq方法提供了不僅可通過所有目前方法進行測序而且完全適于正在開發(fā)的新的單個分子方法的轉(zhuǎn)化的dna。
實例10：在對dna有利的波長下光輻照介導(dǎo)的c向u的轉(zhuǎn)化
在可用來研究dna中的合適的c向u轉(zhuǎn)化的多種化學機制中，可轉(zhuǎn)化c(其在5位上未甲基化)為u衍生物的最有希望的化學機理是烯烴和c的5,6位雙鍵之間的光輻照介導(dǎo)的[2+2]環(huán)加成。光輻照介導(dǎo)的[2+2]環(huán)加成導(dǎo)致c中共軛體系的中斷且產(chǎn)生了烯烴與5,6位雙鍵之間的5,6-環(huán)丁烷中間體。由于共軛體系的中斷，在4位上的進一步脫氨基化(芳賀町等，1993(haga,etal.,1993))可容易地發(fā)生，導(dǎo)致u衍生物的形成。值得注意的是，已經(jīng)將所述化學作用應(yīng)用于在dna上的c向u轉(zhuǎn)化(松村等，2008，藤本吉秀等，2010(matsumura,etal.,2008,fujimoto,etal.,2010))。甲基化的c不能經(jīng)歷具有烯烴底物的[2+2]環(huán)加成并且因此在該方法中不能轉(zhuǎn)化為u。
已證明，可使用模型化合物5-烯丙氧基甲基-dc(5-all-omc)通過300nm光輻照來將5位上被含烯烴的化學基團修飾的c光轉(zhuǎn)化為u類似物。
再者，建議使用針對光輻照(其對dna沒有損傷影響)的光源。鑒于此，在光反應(yīng)性雙鍵處的進一步化學修飾經(jīng)建議延長共軛體系使得烯烴反應(yīng)中心的光吸收性能在光的較長波長處出現(xiàn)，保證在用大于350nm的波長且成為可見光譜的輻照時的光環(huán)加成和氧化脫氨基作用。
共軛延長的修飾提供了各種各樣的烯烴，其經(jīng)測試以優(yōu)化含有可用于設(shè)計和合成adomet類似物種類的合適的雙鍵。各種各樣的修飾有吸電子基團或給電子基團的互補雙鍵種類可被用于衍生adomet類似物。在另一方面，針對空間和能量有利的分子內(nèi)環(huán)加成，這些修飾的雙鍵和c的5,6雙鍵之間的距離也被考慮。
圖12顯示了adomet類似物的實例結(jié)構(gòu)，其中光活性的烯烴經(jīng)苯基、二甲氧基或其它的基團修飾。通過采用dna甲基轉(zhuǎn)移酶和此類經(jīng)設(shè)計的adomet類似物作為底物可進行長波吸收光反應(yīng)性部分在cpg位點的5位上的連接。如圖13所示，通過采用dna安全的光輻照(大于330nm)，實現(xiàn)了隨后的c到u的轉(zhuǎn)化。在cpg位點的光反應(yīng)性部分直接從長波輻照得到光能并且引發(fā)了進一步具有c's中5,6雙鍵的環(huán)加成。c的環(huán)丁烷中間體容易經(jīng)歷羥基化和去氨基，導(dǎo)致了dna內(nèi)u類似物的形成并且最終實現(xiàn)了在光輻照條件下cpg位點特定的c到u的轉(zhuǎn)變。
對類似于圖13中顯示的adomet類似物的熒光研究已經(jīng)證明了光激發(fā)的苯乙烯發(fā)色團(ph-＝-)通過[2+2]環(huán)加成和/或從苯乙烯發(fā)色團到c的單重態(tài)能量轉(zhuǎn)移(參見圖33)快速失活。利用苯乙烯發(fā)色團的更高的摩爾吸光系數(shù)，能量轉(zhuǎn)移到c發(fā)色團還導(dǎo)致[2+2]環(huán)加成和隨后的轉(zhuǎn)化為u。
對于導(dǎo)致光環(huán)加成中間體形成的更有效的光反應(yīng)，各種類的光敏劑或光催化劑還被用于便于激發(fā)，尤其那些具有長波長吸收性能的光敏劑或光催化劑，比如噻噸酮(tx)和其衍生物。在長波長輻照時，tx可被激發(fā)以生成三重態(tài)(tx)*中間體，其能夠轉(zhuǎn)移能量且生成上述提到的(圖12和13)包含部分的5位修飾的雙鍵的激發(fā)三重態(tài)。
此類從tx到類似于圖13中顯示的adomet類似物的domet類似物中的苯乙烯發(fā)色團的三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移的速率常數(shù)由激光閃光光解確定為7.8x109ms-1。該高速率常數(shù)接近于針對三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移的理論最大速率常數(shù)。生成的包含部分的三重態(tài)激發(fā)雙鍵很容易與導(dǎo)致環(huán)丁烷中間體形成的c的5,6雙鍵反應(yīng)，其便于c向u的轉(zhuǎn)化。
再者，由于三重激發(fā)態(tài)較長的壽命，公知[2+2]環(huán)加成從三重激發(fā)態(tài)，相比單重激發(fā)態(tài)(由直接光解生成)，通常更有效地進行。
或者，除了促進c向u光轉(zhuǎn)化的多種5位修飾基團之外，通過使用與光催化劑三(聯(lián)吡啶)釕(ii)氯化物(ru(bpy)32+)組合使用的可見光將溫和且有效的光反應(yīng)條件應(yīng)用于在實際dna中的c向u轉(zhuǎn)化。
用可見光(λmax＝452nm)輻照ru(bpy)32+產(chǎn)生光激發(fā)狀態(tài)ru*(bpy)32+，其可從相對富電子的胺堿基提取電子。然后，所得ru(bpy)3+復(fù)合物將芳基烯酮還原為參與[2+2]環(huán)加成的關(guān)鍵自由基負離子中間體。在另一方面，ru*(bpy)33+還可將電子傳給電子受體，然后，所得ru(bpy)32+使富電子苯乙烯氧化，提供可經(jīng)歷后續(xù)[2+2]環(huán)加成的自由基正離子。因此，無論是經(jīng)過還原淬滅循環(huán)(reductivequenchingcycle)還是氧化淬滅循環(huán)，ru*(bpy)32+均證明為烯烴的[2+2]光環(huán)加成的有力光氧化還原催化劑(艾斯查等，2008；2010；杜等，2009(ischayetal.,2008；2010；duetal.,2009))。其雙途徑光催化機制使ru(bpy)32+成為可進行缺電子烯烴和富電子烯烴兩者的[2+2]環(huán)加成的多功能光催化劑(michael,etal.,2008；2010)(圖14)。所述優(yōu)點提供了廣泛的缺電子烯烴和富電子烯烴兩者，從其中可篩選和優(yōu)化可用于設(shè)計和合成adomet類似物的合適的含雙鍵種類。當通過使用dna甲基轉(zhuǎn)移酶和這樣的adomet類似物作為底物將光反應(yīng)性部分連接在cpg位點的5位上時，通過ru2+-可見光光催化完成后續(xù)的c向u轉(zhuǎn)化。因此，組合作為光催化劑的該ru2+復(fù)合體的使用和具有cpg修飾的dna的可見光輻照提供了針對位點特定的c向u轉(zhuǎn)化的另一個選項。
圖15示出ru(bpy)32+-可見光催化dna中的5位修飾的c向u的光轉(zhuǎn)化的兩個實例。ru(bpy)32+復(fù)合物的實例可以為ru(bpy)3cl2和ru(bpy)3(pf6)2?？梢姽夤獯呋磻?yīng)混合物包含ru(bpy)32+復(fù)合物、叔胺(例如，n,n-二異丙基乙胺(i-pr2net))、季銨陽離子(如mv(pf6)2、甲基紫或mv2+)、mg2+或li+。光源可以為普通家用燈泡或激光(波長為400nm至600nm)。
因此，光反應(yīng)介導(dǎo)的c向u的轉(zhuǎn)化的條件包括在從300nm到700nm波長，在具有ph在4到10之間的緩沖溶液中0℃到90℃的溫度之間，具有或不具有上述提到的光敏劑或光催化劑連同其它必要的成分的光輻照。
實例11：m.sssi的誘變
針對全基因組、單個cpg甲基化分析(其通過采用新穎的利用酶的活性在單細胞水平處是有效的)和光化學策略(其利用s-腺苷-l-甲硫氨酸(adomet)的合成類似物)的方法正在被開發(fā)。該技術(shù)的重要成分是cpg特異的胞嘧啶-5dna甲基轉(zhuǎn)移酶，m.sssi。
來自螺原體物種的細菌限制性甲基轉(zhuǎn)移酶m.sssi正常地轉(zhuǎn)移锍連接的甲基基團從s-腺苷l-甲硫氨酸(adomet)到雙螺旋dna的胞嘧啶-磷酸酯-鳥苷(cpg)二核苷酸中的胞嘧啶殘基的5位。之前的研究已經(jīng)表明了m.sssi可轉(zhuǎn)移其它的锍連接的部分從合成的adomet衍生物到dna，正如在klimauauskasetal.,u.s.patentapplicationpublicationno.2012/0088238al中所描述的。kriukieneetal.(2013)證明了在替換谷氨酸鹽142和天門冬素(aspargine)370為丙氨酸時m.sssi轉(zhuǎn)移酶活性增加100倍。然而，雖然有利的選擇性減小產(chǎn)生了，幾乎確定的是，由于adomet結(jié)合位點增加的疏水性和adomet結(jié)合位點中氨基酸側(cè)鏈的尺寸的急劇減小引起了酶活性的有害的下降。進行了類似的m.sssi的誘變并且還生成具有被替換為絲氨酸的谷氨酸鹽142和天門冬素(aspargine)370的突變體。
圖16概括了用于生成、分離和分析突變體m.sssi活性的實驗設(shè)計。
m.sssl已經(jīng)經(jīng)設(shè)計以增加來自合成的adomet類似物的反應(yīng)性基團轉(zhuǎn)移的效率。突變q142和n370均位于m.sssl的活性位點并且這些殘基到非極性的丙氨酸的突變有可能打開活性位點，從而促進更有效的結(jié)合到大于甲基基團的底物。這里，在替換上述提到的氨基酸為絲氨酸之后m.sssl的效率進一步被研究了。假設(shè)在dna和adomet存在下通過恢復(fù)adomet結(jié)合位點的親水性和不嚴格的特異性同時維持提高的丙氨酸突變體的轉(zhuǎn)移速率，絲氨酸突變體比丙氨酸變異體更穩(wěn)定。還設(shè)計了m.sssiq142s/n370a和q142a/n370s變異體以進一步研究在這兩個位點不同組合的取代對酶的轉(zhuǎn)移活性的影響。
細菌菌株
下面的菌株被用于表達m.sssi:大腸桿菌k12菌株er1821f-glnv44el4-(mcra-)rfbdlrelalendalspotlthi-1·(mcrc-mrr)114::is10(wait-reesetal1991)。該菌株是從新英格蘭生物實驗室得到。
細菌菌株er1821經(jīng)選擇，因為它具有刪除的基因，其為mcrbc(特異性地限制通過不同組合的序列特異性的胞嘧啶甲基化酶修飾的dna的酶)指定遺傳密碼。
在lb介質(zhì)中，在37℃，細菌正常地生長[sambrook,1989]。通過采用標準的cacl2方法在化學上它們被使得有競爭力的(tuetal.,2008)。有競爭力的細胞具有～107cfu/ugdna的轉(zhuǎn)化效率。通過采用標準的丙三醇協(xié)議，一批細胞也被使得是電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的[sambrook,1989]。電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞具有～108cfu/gdna的轉(zhuǎn)化。
質(zhì)粒和寡核苷酸
表達載體pcal7被選擇，因為它指導(dǎo)存在于螺原體物種內(nèi)的dnam.sssi變異體的表達并且具有與哺乳動物dna甲基轉(zhuǎn)移酶(cpg)相同的序列特異性，但是更高的轉(zhuǎn)化數(shù)(turnovernumber)以及不需要半甲基化的底物(renbaumandrazin,1992)。
pcal7是被用于表達cpg特異性的dna甲基轉(zhuǎn)移酶m.sssi的7.4kb質(zhì)粒。定向誘變被用于通過使結(jié)合輔因子的袋(cofactor-bindingpocket)中的兩個保守位置(q142a/n370a)突變設(shè)計野生型m.sssi為his標記的突變的變異體。按照tuetal.,2013協(xié)議進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。通過采用來自富酶泰斯(生物技術(shù)公司)(fermentaslifesciences)的genejet質(zhì)粒小量提取試劑盒(genejetplasmidminiprepkit)進行質(zhì)粒的小規(guī)模制備。
用于研究突變體sssi的活性的dna是dnmtl基因的460bppcr擴增的片段。它含有許多位點使得它有用于研究酶轉(zhuǎn)移的效率。
引物經(jīng)設(shè)計用于插入6xhis標記物、定向誘變和測序(用于驗證序列中的突變)。通過采用stratagene軟件，用于誘變的引物經(jīng)設(shè)計。用于測序的引物經(jīng)手動地設(shè)計以從預(yù)期的突變退火～100bp。對于6xhis標記物插入。類似于涉及非重疊引物對的使用的naismithetal.(2008)描述的方法的方法經(jīng)設(shè)計以提高插入較大的18bp片段的可能性。如下表1列舉了用于定向誘變的引物。從集成dna技術(shù)公司(integrateddnatechnologies)訂購引物。
表1用于6xhis標記物插入(his)的引物對，替換q142和n370。引物中的his插入被強調(diào)并且在his正義引物和反義引物之間的重疊區(qū)是斜體的。
使用化學感受態(tài)細胞(competentcells)的定向誘變
在7.4kbpcal7質(zhì)粒上進行定向誘變以插入his標記物和替換突變。采用表1中列舉的引物，由安捷倫科技的quickchangell協(xié)議中概述的寡核苷酸定向誘變實施的誘變。簡單地說，質(zhì)粒是用引物集擴增的pcr，轉(zhuǎn)化為er1821細胞且被覆蓋在氨比西林培養(yǎng)皿上。2-4個菌落經(jīng)挑選用于小規(guī)模制備(使用genejet質(zhì)粒小量提取試劑盒)。接著小規(guī)模制備菌落連同測序引物被寄到genewizinc用于測序以確認誘變的成功。
采用電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(electrocompetentcells)的定向誘變
定向誘變在pcal7質(zhì)粒上實施以通過采用安捷倫科技的quickchangell-e協(xié)議中概述的協(xié)議引入置換突變。簡單地說，通過采用誘變引物、提取的氯仿、析出的乙醇pcr擴增的質(zhì)粒用水稀釋到6μl。2μl該溶液經(jīng)電穿孔到50μl的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌中，然后其通過添加到200μlsoc中稀釋。然后50μl的該溶液被覆蓋到氨比西林培養(yǎng)皿上，隨后緊接著上述提到的小規(guī)模制備和測序過程。
野生型和突變型變異體(其被制備或在正在被設(shè)計的過程中)連同它們的名稱被提供在圖17中。由定向誘變生成的置換通過測序被確認，結(jié)果被概括在表2中。his標記物的插入同樣通過測序被確認(表3)。
表2、生成m.sssi突變型變異體的置換的測序確認。突出該置換的核苷酸。wt顯示了在未突變的質(zhì)粒(沒有his插入)中在針對替換的位點處的序列。
表3.n末端6xhis標記物插入的測序確認
測序誘變后的質(zhì)粒確認了置換的存在。對于6xhis標記物的插入，通過使用naismithetal(2008)中描述的pcr條件，設(shè)計了一組非重疊性引物使得新合成的dna在后續(xù)的擴增循環(huán)中被用作模板。該方法的效率非常低。這使得申請人使用ss質(zhì)粒，his標記物進入的質(zhì)粒最初作為模板被插入以生成其它的突變型變異體和his標記的野生型變異體。
為了增加誘變的效率，電穿孔細胞被制備以及針對具有誘變產(chǎn)物的e4102s的轉(zhuǎn)化，化學轉(zhuǎn)化由電穿孔代替。相比它們的化學上感受態(tài)的對應(yīng)物，電穿孔細胞具有高10倍的轉(zhuǎn)化效率。如預(yù)期的，這些細胞的使用大幅度地提高每個誘變反應(yīng)的菌落數(shù)目到～50菌落(相比針對具有化學上感受態(tài)細胞的誘變僅僅1或2)。然而，測序結(jié)果顯示了這些菌落中高于50％包含親本dna，沒有理想的突變。合適的片段的觀察(其通過采用nebcutter可生成)暗示了如在凝膠的帶中所觀察的，1350bp片段(其包含m.sssi序列、復(fù)制起點和amp抗性序列(resistancesequence))也許在大腸桿菌內(nèi)正在循環(huán)。
m.sssi活性是由限制性保護實驗(restrictionprotectionassay)評估。m.sssi表達pcal7質(zhì)粒通過采用genejet質(zhì)粒小量提取試劑盒分離并且通過采用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶hpall針對甲基化測試。用1uhpall和ixcutsmartbuffer(由新英格蘭生物實驗室提供)培養(yǎng)200ng質(zhì)粒并且在37℃培養(yǎng)1小時。10μι該溶液與1μι6xdna負載染料混合并且被裝載到1.5％瓊脂凝膠上。通過采用bio-radgeldoc，該凝膠被觀察。
具有m.sssi突變的變異體的體內(nèi)功能試驗的結(jié)果被顯示在圖18中。來自突變體的質(zhì)粒被分離且用hpall被消化。觀察到，serser(ssslq142s/n370s)和alaser(m.sssiq142a/n370s)突變型質(zhì)粒對hpall消化是部分耐受的，然而serala(m.sssiq142s/n370a)突變體由hpall是完全消化的。
假設(shè)從細菌分離的突變型質(zhì)粒對hpall消化是耐受的，如果它正在表達功能性的甲基轉(zhuǎn)移酶。用hpall消化的分離的質(zhì)粒的凝膠結(jié)果(參見圖18)表明了正如預(yù)期的，野生型對hpall消化是完全耐受的，serser和alaser突變型質(zhì)粒對hpall消化是部分耐受的，然而serala突變體完全地由hpall消化。結(jié)果確定了serser和alaser突變體能夠以預(yù)期低于野生型的效率(由于其較大的活性位點)甲基轉(zhuǎn)移。
未來的努力將集中于完成誘變以及his標記的野生型和其它的突變型m.sssi蛋白的純化。隨后蛋白進一步針對它們的甲基轉(zhuǎn)移酶活性被測試。同時，通過使用質(zhì)粒dna，針對酶轉(zhuǎn)移和光轉(zhuǎn)化的高效率，合成的adomet經(jīng)篩選且經(jīng)優(yōu)化以及最后通過采用最佳的adomet衍生物進行實驗以確定在現(xiàn)實世界基因組dna制備中的甲基化模式，尤其那些具有大量的甲基化數(shù)據(jù)(例如，來自乳腺癌細胞株mcf-7的dna)。隨后的高流通量下一代測序以單基對分辨率(singlebasepairresolution)促進dna甲基化狀態(tài)被讀出并且驗證方法的準確性。
依賴這些實驗的成功，這種針對dna甲基化組的分析的新方法可在單細胞水平上有效且節(jié)約地使用。來自單細胞的全基因組測序被認為基因組生物學中需要的下一步并且在許多臨床應(yīng)用中被預(yù)期有用；因此，該方法允許僅僅涉及平行的待完成的稍微修飾dna測序協(xié)議的全基因組甲基化分析。
實例12：包含理想的長波長吸收光反應(yīng)性部分的adomet類似物的合成法
在溫和的酸性條件下通過特定選擇的具有對應(yīng)的光反應(yīng)性部分的三氟甲磺酸酯或溴化物的adohcy的s-烷基化實施具有理想的長波長吸收光反應(yīng)性部分的adomet類似物的合成。在adohcy的烷基化之后，預(yù)期到锍的非對映的混合物以及進一步rp—hplc(反相高效液相色譜法)純化被進行以分離針對后續(xù)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的利用酶的活性s-差向異構(gòu)體。針對adomet類似物的合成路線的實例被顯示在圖19中。通過使用市售的原始材料可以制備針對此類adomet類似物合成所需要的光反應(yīng)性部分的三氟甲磺酸酯或溴化物。
adomet衍生物包含比由adomet承載的甲基基團體積更大的連接锍的光活性基因。因此，申請人引入了用丙氨酸或絲氨酸取代體積大的谷氨酸鹽(q)142和天門冬素(n)370的氨基酸置換以擴大m.sssi的adomet的結(jié)合口袋(參見實施例11)。通過這種修飾，將增加轉(zhuǎn)移大體積的來自adomet衍生物的光活性基團的效率。申請人已經(jīng)得到下述的m.sssi的突變體：q142s,n370s；q142sn370a；q142a,n370s；q142q,n370s；q142q,n370a；q142s,n370n；q142a,n370n。每個酶已經(jīng)被純化并且針對dna中大體積的光活性基團從adomet衍生物到未甲基化cpg二核苷酸的轉(zhuǎn)移效率經(jīng)測試。
實例13：光轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進一步測試
測試合成的單鏈dna分子中的5位用光活性基團修飾的c向u類似物轉(zhuǎn)化的可替代方法利用合成的雙鏈dna分子，其利用簡單的基于凝膠的限制性內(nèi)切核酸酶測定。
將至少50個堿基對的dna分子的兩個鏈合成為含有在cpg環(huán)境中的一個修飾的c的寡核苷酸。使用標準的基于亞磷酰胺的合成化學法將在兩個鏈中的相同cpg部分中的c用之前所述的5位修飾的可光轉(zhuǎn)化類似物中的一個來替代。以這樣的方式設(shè)計寡核苷酸，在pcr之后，將所得雙鏈dna分子在不存在光轉(zhuǎn)化的情況下用一種限制性酶裂解，在存在光轉(zhuǎn)化的情況下用不同的限制性酶裂解。光轉(zhuǎn)化事件的確認是通過在瓊脂糖凝膠上檢測所得限制性片段，或者隨后變性，通過maldi-tof質(zhì)譜檢測單鏈片段來進行。另外的限制性位點使得在凝膠上的片段易于辨別，而在合成的dna分子長度中在別處的另外可修飾cpg位點提供了用于在彼此不同的短距離下測試多個c類似物的光轉(zhuǎn)化的另外選項。示出了這樣的測定的實例(圖20)。
實例14：用于測試光轉(zhuǎn)化反應(yīng)的模型化合物的合成
由于用于轉(zhuǎn)化5-all-omc為5-all-omu類似物的uvb輻照(300nm)的可能的損傷影響，胞啶的苯丙烯類衍生物(phenylallylderivativeofcytidine)(5-phall-omc)，以致較長的有利dna的波長可被用來引發(fā)c向u的轉(zhuǎn)化，反而被合成了。具體地說，模型化合物5-phallomc和5-dimephall-omc已經(jīng)被合成了。針對5-phall-omc的合成路線的實例被顯示在圖21中。圖20中的化合物4、6和7的核磁共振(nmr)光譜分別被顯示在圖22a、b和c中。5-phall-omc的質(zhì)譜被顯示在圖23中。針對5-dimephall-omc的合成路線的實例被顯示在圖24中。
在三重態(tài)光敏劑噻噸酮(tx)的存在下用350nm光輻照5-phall-omc。5-phall-omc轉(zhuǎn)化為u類似物的詳細機理被顯示在圖25中。利用在4位的氧化脫氨基作用，大部分原始材料被轉(zhuǎn)化為環(huán)丁基衍生物，如質(zhì)譜、紅外光譜以及1h和13cnmr所確認的。
新產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)是高于原始材料5-phall-omc的1個質(zhì)量單元，表明了可能的u類似物是從5-phall-omc生成的。圖26顯示了在三重態(tài)敏化劑噻噸酮的存在下在光輻照之前5-phall-omc的hplc分析。插圖顯示了tx和5-phall-omc的uv吸收光譜；注意到350nm光不與胞嘧啶相互作用但是強烈地由tx吸收。圖26(下圖)顯示了在用350nm光光輻照20分鐘之后的分析。雖然敏化劑(tx)的濃度保持不變，5-phall-omc大部分被消耗掉且新的光產(chǎn)物出現(xiàn)了。13cnmr光譜(圖27所顯示的)明確地確認了在直的或交叉的結(jié)構(gòu)中[2+2]環(huán)加合物的形成。
實施例15：模型化合物的合成，其中光敏劑(tx)共價地被連接到光反應(yīng)性官能團(functionality)用于測試光轉(zhuǎn)化反應(yīng)
為了增加效率并且減小預(yù)料不到的副反應(yīng)的可能性，tx敏化劑共價地被連接到苯基發(fā)色團。分子內(nèi)三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移在幾納秒內(nèi)使得tx三重態(tài)無效以在這種苯烯基發(fā)色團中引起三重態(tài)激發(fā)部分(圖28)，然后其通過[2+2]環(huán)加成與c的雙鍵反應(yīng)(turro,etal.,2010)。由于從微秒到納秒tx三重態(tài)壽命的數(shù)量級減小(由于分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移)，比如電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的不想要的副反應(yīng)(其損傷dna)是高度地不太可能的。圖28顯示了針對模型化合物(其具有共價連接的光敏劑(tx))的一種合成路線。
實施例16：包含adomet類似物的光敏劑的合成
包含敏化劑的adomet類似物遞送高效的光活性脫氨基基團到雙鏈dna中未甲基化的cpg位點的胞嘧啶上。一種化合物的結(jié)構(gòu)和合成方案被提供在圖29中。
實施例17：包含光敏劑(tx)和用于cpg位點富集和測序的可點擊部分的adomet類似物的合成
在人類基因組dna中cpg二核苷酸約5倍未被讀出并且在cpg島中被濃縮(bestoretal.,2014)，結(jié)果在讀取較短的下一代測序(short-readnext-generationsequencing)中，全部dna序列中約20僅僅％甚至包含單個的cpg二核苷酸。這意味著約80％的測序成本被浪費了。檢測非常少量的腫瘤dna尤其有用且有必要。這可以通過向圖30中顯示的adomet類似物添加疊氮基或炔烴部分來完成以致衍生的dna(其包含未甲基化的cpg二核苷酸)可被捕獲且通過點擊化學在炔烴或疊氮基磁珠上純化(kolbetal.,2001)。結(jié)果是流通量的5倍增加。疊氮基和炔烴修飾的光活性基團被顯示圖30中。
實施例18：通過采用包含光敏劑(tx)和可點擊部分的adomet類似物的cpg位點富集的光化學甲基化分析
為了增加光化學甲基化分析的效率，這些dna片段(其包含未甲基化的cpg二核苷酸)具體地用點擊化學抽取，如圖31中所顯示的。如果經(jīng)轉(zhuǎn)移的基團具有炔烴部分，修飾有疊氮基的磁珠被用于捕獲；具有疊氮基部分的經(jīng)轉(zhuǎn)移的基團在炔烴衍生的珠子上捕獲(kriukieneetal.,2013)。然后捕獲的dna經(jīng)處理用于下一代dna測序。這將保證只有那些dna片段(其包含一個或多個未甲基化的cpg位點)會經(jīng)歷測序。注意到：該方法具有單個cpg分辨率并且所有甲基化的cpg位點經(jīng)測序為cpg位點以及所有的未甲基化的cpg位點經(jīng)測序為tpg's。
再者，圖32顯示了乙腈溶液中兩種化合物的熒光光譜(·ex＝282nm)。當脫氧胞苷部分共價地被連接到圖21中的5-phall-omc時，苯乙烯發(fā)色團的熒光丟失是由快速分子內(nèi)[2+2]環(huán)加成(產(chǎn)生u的第一反應(yīng)步驟)和/或從苯乙烯發(fā)色團到脫氧胞苷部分的單重態(tài)能量轉(zhuǎn)移引起的。利用苯乙烯發(fā)色團較高的摩爾吸光系數(shù)，能量轉(zhuǎn)移到脫氧胞苷發(fā)色團還導(dǎo)致[2+2]環(huán)加成和后續(xù)的向u轉(zhuǎn)化。
公知[2+2]環(huán)加成相比從單重激發(fā)態(tài)，通常從三重激發(fā)態(tài)更有效地進行。通過激光閃光光解和瞬態(tài)吸收光譜，顯示了圖21中的5-phall-omc的苯乙烯發(fā)色團的三重激發(fā)態(tài)可有效地通過采用噻噸酮由三重態(tài)敏化占據(jù)。
噻噸酮衍生物在接近uv光譜區(qū)直至400nm(對dna不是有害的光譜區(qū))具有極好的光吸收性能。為了確定通過激光閃光光解的三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移的速率常數(shù)，使用了圖21中的模型化合物5-phall-omc，其包含苯乙烯發(fā)色團。光致激發(fā)噻噸酮生成的三重態(tài)(其由苯乙烯發(fā)色團(圖21中的5-phall-omc淬火，具有速率常數(shù)7.8x109m-1s-1，其是有可能三重態(tài)轉(zhuǎn)移的最大速率常數(shù)(圖33)))。
圖34顯示了在不存在和存在不同濃度的圖21中的5-phall-omc(0到0.25mm)下在氬氣飽和的乙腈溶液中在脈沖光激發(fā)(355nm,5ns脈沖寬度)之后在625nm監(jiān)測的噻噸酮三重態(tài)的瞬態(tài)吸收的衰退蹤跡(圖34a)和三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)的確定(圖34b)。
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