本發(fā)明涉及多特異性抗體、用于產(chǎn)生它們的方法、含有所述抗體的藥物組合物及其用途。發(fā)明背景本領(lǐng)域已知能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的工程化蛋白質(zhì)，如雙特異性或多特異性抗體。這類多特異性結(jié)合蛋白可以使用細(xì)胞融合、化學(xué)綴合或重組dna技術(shù)生成。最近已經(jīng)開發(fā)了類型廣泛的重組多特異性抗體樣式，例如由如igg抗體樣式與單鏈結(jié)構(gòu)域融合的四價(jià)雙特異性抗體(見例如coloma,m.j.等人,naturebiotech15(1997)159-163；wo2001/077342；和morrison,s.l.,naturebiotech25(2007)1233-1234)。多特異性抗體生成中的一個(gè)缺點(diǎn)是形成錯(cuò)配的副產(chǎn)物，所述副產(chǎn)物不得不通過復(fù)雜的純化程序與所需的多特異性抗體分離并降低生產(chǎn)率。一種避免錯(cuò)配副產(chǎn)物問題的方法，稱作“杵入臼技術(shù)”，旨在通過向ch3結(jié)構(gòu)域引入突變以修飾接觸界面，迫使兩個(gè)不同的抗體重鏈配對(duì)。在一條鏈上，將大體積氨基酸替換為具有短側(cè)鏈的氨基酸以產(chǎn)生“臼”。相反，將具有大側(cè)鏈的氨基酸引入另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生“杵”。通過共表達(dá)這兩條重鏈(和兩條相同的輕鏈，必須對(duì)于兩條重鏈適宜)，相對(duì)于同型二聚體形成(“臼-臼”或“杵-杵”)，觀察到高產(chǎn)率的異二聚體形成(“杵-臼”)(ridgway,j.b.等人,proteineng.9(1996)617-621；和wo96/027011)?？梢酝ㄟ^使用噬菌體展示方案，重塑兩個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域的相互作用表面并引入二硫鍵以穩(wěn)定異二聚體，以進(jìn)一步增加異二聚體百分?jǐn)?shù)(merchant,a.m.等人,naturebiotech.16(1998)677-681；atwell,s.等人,j.mol.biol.270(1997)26–35)。wo2010/115598a1公開基于單特異性全長igg分子的三價(jià)雙特異性抗體，其中在每一個(gè)重鏈相應(yīng)c末端處融合重鏈可變域和輕鏈可變域以形成與第二抗原特異性結(jié)合的第三抗原結(jié)合位點(diǎn)。為了促進(jìn)兩條修飾的重鏈異二聚化，提出根據(jù)杵入臼技術(shù)修飾ch3結(jié)構(gòu)域。也已經(jīng)開發(fā)了能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的幾種其他抗體樣式；如雙體抗體、三體抗體或四體抗體、微型抗體和幾種單鏈樣式(scfv、雙scfv)，其中不再保留抗體核心結(jié)構(gòu)(iga、igd、ige、igg或igm)(holliger,p.等人,naturebiotech23(2005)1126-1136；fischer,n.和léger,o.,pathobiology74(2007)3-14；shen,j.等人,j.immunol.methods318(2007)65-74；wu,c.等人,naturebiotech.25(2007)1290-1297)。全部這類樣式均使用接頭以使抗體核心(iga、igd、ige、igg或igm)與又一種結(jié)合蛋白(例如scfv)融合或以使例如兩個(gè)fab片段或scfv融合(fischer,n.和léger,o.,pathobiology74(2007)3-14)。wo94/09131公開多特異性抗體，其中由抗體片段(例如fab片段)形成的第一和第二結(jié)合區(qū)通過能夠彼此結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域彼此結(jié)合。根據(jù)wo94/09131，結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如分別是vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域)與每一個(gè)fab片段融合，從而第一和第二結(jié)合區(qū)合并以提供包含兩種結(jié)合特異性的單一蛋白。與全尺寸單克隆抗體相比，抗體片段作為治療藥同時(shí)具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)：一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它們更小并且更快地進(jìn)入組織和腫瘤。此外，已經(jīng)提出小尺寸的片段允許與全尺寸單克隆抗體不可及的表位結(jié)合。缺點(diǎn)在于，片段在人類中顯示短循環(huán)半壽期，這可能歸因于腎清除。半壽期較短可能妨礙治療藥在靶向的部位充分積累。抗體片段的產(chǎn)生并不繁瑣，因?yàn)槠慰赡苄纬删奂锊⑶铱赡鼙热叽鐔慰寺】贵w更不穩(wěn)定。此外，非同源重鏈和輕鏈的不想要配對(duì)導(dǎo)致形成無活性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和/或其他無功能的不想要的副產(chǎn)物，這是抗體片段的臨床規(guī)模生產(chǎn)及其治療性應(yīng)用中的主要問題。這些缺點(diǎn)用本發(fā)明的抗體樣式克服。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及一種包含至少三個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的多特異性抗體，其中兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)由第一抗原結(jié)合部分和第二抗原結(jié)合部分形成，其中a)第三抗原結(jié)合位點(diǎn)由重鏈可變域(vh3)和輕鏈可變域(vl3)形成，其中-vh3結(jié)構(gòu)域的n末端與第一抗原結(jié)合部分借助第一肽接頭連接，并且-vl3結(jié)構(gòu)域的n末端與第二抗原結(jié)合部分借助第二肽接頭連接，b)多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化i)在ch3結(jié)構(gòu)域之一中通過用具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生突出部分，并且在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中通過用具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生空穴，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之一中產(chǎn)生的突出部分可布置在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生的空穴中；或?qū)h3結(jié)構(gòu)域之一中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶正電荷的氨基酸置換，并且將另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶負(fù)電荷的氨基酸置換；ii)在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成，或iii)i)和ii)的修飾物；c)第三抗原結(jié)合位點(diǎn)的vh3結(jié)構(gòu)域的c末端與一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接，并且第三抗原結(jié)合位點(diǎn)的vl3結(jié)構(gòu)域的c末端與另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接，并且d)多特異性抗體缺少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2(ch2)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗原結(jié)合部分是第一fab片段并且第二抗原結(jié)合部分是第二fab片段。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種多特異性抗體，其中i)通過以下方式改變ch3結(jié)構(gòu)域：在ch3結(jié)構(gòu)域之一中通過用具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生突出部分，并且在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中通過用具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生空穴，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之一中產(chǎn)生的突出部分可布置在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生的空穴中；或?qū)h3結(jié)構(gòu)域之一中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶正電荷的氨基酸置換，并且將另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶負(fù)電荷的氨基酸置換；ii)通過以下方式改變ch3結(jié)構(gòu)域：在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成；并且其中通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))形成二硫鍵，第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh3位置44處，和vl3位置100處；-vh3位置105處，和vl3位置43處；或-vh3位置101處，和vl3位置100處。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種多特異性抗體，其中i)通過以下方式改變ch3結(jié)構(gòu)域：在ch3結(jié)構(gòu)域之一中通過用具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生突出部分，并且在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中通過用具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生空穴，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之一中產(chǎn)生的突出部分可布置在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生的空穴中；或?qū)h3結(jié)構(gòu)域之一中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶正電荷的氨基酸置換，并且將另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶負(fù)電荷的氨基酸置換；ii)通過以下方式改變ch3結(jié)構(gòu)域：在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成；并且其中通過在vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和在vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種多特異性抗體，其中第一肽接頭和第二肽接頭是至少15個(gè)氨基酸的肽。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種多特異性抗體，其中第一肽接頭和第二肽接頭是15–70個(gè)氨基酸的肽。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種多特異性抗體，其中第一肽接頭和第二肽接頭是由甘氨酸殘基和絲氨酸殘基組成的肽。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種多特異性抗體，其中vh3結(jié)構(gòu)域的c末端直接與ch3結(jié)構(gòu)域之一連接，并且vl3結(jié)構(gòu)域的c末端直接與另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種三價(jià)多特異性抗體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種三價(jià)雙特異性多特異性抗體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種三價(jià)雙特異性多特異性抗體，其中第一和第二抗原結(jié)合部分與第一抗原特異性結(jié)合，并且其中第三結(jié)合位點(diǎn)與異于第一抗原的第二抗原特異性結(jié)合。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種三價(jià)三特異性多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種復(fù)合物，其包含(i)本發(fā)明的多特異性抗體，其中抗體至少與半抗原和靶蛋白特異性結(jié)合，和(ii)由多特異性抗體結(jié)合的半抗原，其中半抗原與治療藥或診斷藥綴合。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種用于制備本發(fā)明多特異性抗體的方法，所述方法包括步驟-用包含編碼多特異性抗體的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，-在允許合成所述多特異性抗體的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并且-從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物回收所述多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是編碼本發(fā)明多特異性抗體的核酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含本發(fā)明核酸的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含與至少一種可藥用載體組合的本發(fā)明多特異性抗體的藥物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含本發(fā)明多特異性抗體的免疫綴合物。在一方面，本發(fā)明的多特異性抗體顯示因其與不同抗原結(jié)合所致的新特性，并且在另一方面因其穩(wěn)定性、低聚集作用和藥代動(dòng)力學(xué)和生物學(xué)特性(例如，因具有與全長igg大致相同的分子量所致的低腎清除率；因避免fcrn結(jié)合所致的中等血清半壽期)而適于生產(chǎn)和藥物配制。錯(cuò)配的副產(chǎn)物因使用非對(duì)稱異二聚化策略而避免。歸因于相對(duì)彼此的至少三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的獨(dú)有布局，本發(fā)明的抗體是特別適于結(jié)合單個(gè)細(xì)胞的表面上存在的多個(gè)抗原或結(jié)合一種抗原上的不同表位。由于本發(fā)明的抗體中不存在ch2結(jié)構(gòu)域，因而取消了抗體的效應(yīng)子功能介導(dǎo)作用。附圖簡述圖1：本發(fā)明多特異性抗體的設(shè)計(jì)。圖1a：本發(fā)明雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)?？贵w包含形成第一和第二結(jié)合位點(diǎn)的兩條結(jié)合臂。第三抗原結(jié)合位點(diǎn)由vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域形成，所述結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)ch3結(jié)構(gòu)域的n末端融合。肽接頭將vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域的n末端分別與第一和第二抗原結(jié)合部分連接。通過至少一種二硫鍵穩(wěn)定方法改變ch3結(jié)構(gòu)域和通過杵入臼技術(shù)(全部圖中均稱為“kih工程化”)或通過在相應(yīng)的ch3/ch3界面位置中引入電荷相反的氨基酸(全部圖中均稱為“(+/-)工程化“)令ch3工程化，促進(jìn)包含vh3結(jié)構(gòu)域或vl3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈的異二聚化。此外，可以在vh3/vl3界面中應(yīng)用二硫鍵穩(wěn)定作用(未顯示)。圖1b：本發(fā)明雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)，其中第一和第二抗原結(jié)合部分是fv片段。在本圖中，fv片段與相同的表位結(jié)合。然而，可以通過使用與不同表位結(jié)合的兩個(gè)fv片段，產(chǎn)生本發(fā)明的三特異性抗體。圖1c：本發(fā)明雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)，其中第一和第二抗原結(jié)合部分是fab片段。在本圖中，fab片段與相同的表位結(jié)合。然而，可以通過使用與不同表位結(jié)合的兩個(gè)fab片段，產(chǎn)生本發(fā)明的三特異性抗體。圖2：包含第一fab片段和第二fab片段的本發(fā)明多特異性抗體的設(shè)計(jì)。圖2a：與全長igg(左側(cè))相比，本發(fā)明雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)(右側(cè))。第三抗原結(jié)合位點(diǎn)由vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域形成，其替換全長igg分子的ch2結(jié)構(gòu)域。移除鉸鏈區(qū)二硫鍵以通過用vh3和vl3借助缺少鏈間二硫鍵的肽接頭連接fab片段，確保可接近抗原。通過至少一種二硫鍵穩(wěn)定方法和通過杵入臼技術(shù)或通過在相應(yīng)的ch3/ch3界面位置中引入電荷相反的氨基酸令ch3工程化而改變ch3結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)包含vh3結(jié)構(gòu)域或vl3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈的異二聚化。此外，可以在vh3/vl3界面中應(yīng)用二硫鍵穩(wěn)定作用(未顯示)。圖2b：實(shí)施例1中生成的雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)。(gly4ser)4肽接頭用來將第一和第二fab片段與vh3或vl3融合。此外，通過ch3-界面中的杵入臼修飾和二硫鍵穩(wěn)定作用以及如實(shí)施例1中詳述的vh3/vl3結(jié)合位點(diǎn)的二硫鍵穩(wěn)定作用，促進(jìn)不同多肽鏈的異二聚化。圖3：本發(fā)明的示例性多特異性抗體。圖3a：三特異性抗體，其中第二fab片段包含vh2結(jié)構(gòu)域和vl2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域互換，產(chǎn)生vl2-ch1(重鏈)、vh2-cl(輕鏈)結(jié)構(gòu)域架構(gòu)。第一fab片段不包含結(jié)構(gòu)域互換，因此保留vh1-ch1、vl1-cl的野生型結(jié)構(gòu)域架構(gòu)。圖3b：三特異性抗體，其中第二fab片段包含vh-ch1結(jié)構(gòu)域和vl-cl結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域互換，產(chǎn)生vl2-cl(重鏈)、vh2-ch1(輕鏈)結(jié)構(gòu)域架構(gòu)。第一fab片段不包含結(jié)構(gòu)域互換，因此保留vh1-ch1、vl1-cl的野生型結(jié)構(gòu)域架構(gòu)。圖3c：三特異性抗體，其中第二fab片段包含ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域互換，產(chǎn)生vh2-cl(重鏈)、vl2-ch1(輕鏈)結(jié)構(gòu)域架構(gòu)。第一fab片段不包含結(jié)構(gòu)域互換，因此保留vh1-ch1、vl1-cl的野生型結(jié)構(gòu)域架構(gòu)。圖3d：三特異性抗體，其中第二fab片段包含ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域互換，產(chǎn)生vh2-cl(重鏈)、vl2-ch1(輕鏈)結(jié)構(gòu)域架構(gòu)，并且第一fab片段包含vh1結(jié)構(gòu)域和vl1結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域互換，產(chǎn)生vl2-ch1(重鏈)、vh2-cl(輕鏈)結(jié)構(gòu)域架構(gòu)。圖3e：三特異性抗體，其中第二fab片段是單鏈fab片段。圖3f：三特異性抗體，其中第一和第二fab片段是單鏈fv片段、二硫鍵穩(wěn)定的fv片段或二硫鍵穩(wěn)定的單鏈fv片段。圖3g：三特異性抗體，其中第一和第二fab片段是單結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)或支架結(jié)合位點(diǎn)。圖3h：具有五抗原結(jié)合位點(diǎn)的多特異性抗體，其中第一和第二fab片段是單結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)或支架結(jié)合位點(diǎn)，并且其中其他單結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)或支架結(jié)合位點(diǎn)分別與第一和第二結(jié)合位點(diǎn)的n末端融合。圖4：設(shè)計(jì)fab片段和第三結(jié)合位點(diǎn)之間允許抗原接近的柔性連接。圖4a：通過足夠長的無鏈間二硫鍵的肽接頭移除鉸鏈區(qū)二硫鍵允許抗原接近第三抗原結(jié)合位點(diǎn)。為了穩(wěn)定生成的抗體樣式，需要除天然vh3/vl3相互作用之外的至少一種異二聚化方法(顯示了以粗線指示的二硫鍵、ch3/ch3界面中的杵入臼修飾)。圖4b：比較了ch1、鉸鏈區(qū)和ch2之間的野生型igg1連接位點(diǎn)與根據(jù)實(shí)施例1所生成抗體的ch1、肽接頭、vh3結(jié)構(gòu)域的融合位點(diǎn)。圖5：在第三結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域與其相應(yīng)的ch3結(jié)構(gòu)域之間設(shè)計(jì)穩(wěn)定化界面。圖5a：包含vh3和vl3的fv片段以及ch3/ch3界面的二硫鍵穩(wěn)定作用導(dǎo)致人工引入的半胱氨酸殘基(a)彼此緊鄰及(b)緊鄰于相應(yīng)可變結(jié)構(gòu)域或恒定結(jié)構(gòu)域中形成鏈內(nèi)二硫鍵的天然半胱氨酸出現(xiàn)。由于有利于形成所需二硫鍵的該半胱氨酸殘基的緊密相鄰，其潛在錯(cuò)誤配對(duì)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和產(chǎn)率降低(如表中所示)。圖5b：如實(shí)施例1中所述的本發(fā)明雙特異性抗體中使用的vl3與ch3的示例性融合位點(diǎn)，其中第三結(jié)合位點(diǎn)與地高辛配基特異性結(jié)合。額外引入的半胱氨酸殘基在氨基酸序列內(nèi)部以粗體和加下劃線顯示(seqidno:01)。下文顯示適用于與vh3結(jié)構(gòu)域或vl3結(jié)構(gòu)域融合的ch3結(jié)構(gòu)域的備選n末端(seqidno:02、seqidno:03、seqidno:04)。圖6：純化實(shí)施例1的雙特異性抗體的結(jié)果。圖6a：(a)抗體的κ-選擇作用作用的代表性色譜圖，其中第三結(jié)合位點(diǎn)與地高辛配基特異性結(jié)合(bsabcd33-dig(ss)-cd33)。(b)-(d)bsabcd33-dig(ss)-cd33、ley-dig(ss)-ley和gpc3-dig(ss)-gpc3的κ-選擇結(jié)合級(jí)分的體積排阻色譜。加陰影的框表示含有正確折疊的抗體的級(jí)分。(e)在樣品不還原(n.r.)和樣品還原(r.)情況下的純化抗體的sds-page。圖6b：(a)-(c)bsabdig–cd33-dig、dig-ley-dig和dig-gpc3-dig的κ-選擇結(jié)合級(jí)分的體積排阻色譜。加陰影的框表示含有正確折疊的抗體的級(jí)分。(d)在樣品不還原(n.r.)和樣品還原(r.)情況下的純化抗體的sds-page。圖7：實(shí)施例1的雙特異性抗體的結(jié)合研究的結(jié)果。如使用dig-cy5作為解決(address)半抗原結(jié)合的有效負(fù)載(payload)，在表達(dá)ley的mcf7細(xì)胞、表達(dá)cd33的molm13細(xì)胞和表達(dá)gpc3的hepg2細(xì)胞上通過facs分析法所分析，實(shí)施例1中生成的抗體的抗原同時(shí)結(jié)合作用。圖8：實(shí)施例6的雙特異性抗體的結(jié)合研究的結(jié)果。如使用生物素酰化cy5作為解決(address)半抗原結(jié)合的有效負(fù)載，在表達(dá)ley的mcf7細(xì)胞和cd33陰性的mcf7細(xì)胞上通過facs分析法所分析，實(shí)施例6中生成的bsabbsabley-bio(ss)-ley的抗原同時(shí)結(jié)合作用。圖9：與作為有效負(fù)載的毒素復(fù)合的本發(fā)明雙特異性抗體的示意圖。顯示了在本發(fā)明雙特異性抗體(具有多特異性的抗體的復(fù)合物可以因此形成)與有效負(fù)載之間形成的復(fù)合物。本發(fā)明雙特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)與半抗原(例如地高辛配基，生物素)特異性結(jié)合，同時(shí)第一和第二結(jié)合位點(diǎn)與靶分子(例如腫瘤相關(guān)抗原，如ley、cd33、gpc3)結(jié)合。通過半抗原-偶聯(lián)的有效負(fù)載(例如毒素，如假單胞菌外毒素，pe)與本發(fā)明雙特異性抗體接觸，形成該復(fù)合物。該復(fù)合物可以用于定向遞送有效負(fù)載至表達(dá)靶分子的細(xì)胞。圖10:通過bsabley-dig(ss)-ley與地高辛配基化pe的復(fù)合物抑制mcf7細(xì)胞增殖。顯示了如實(shí)施例5中詳述的brdu摻入測(cè)定法的結(jié)果。y-軸表示brdu摻入正在增殖的細(xì)胞。圖11：通過bsabley-bio(ss)-ley與生物素?；痯e的復(fù)合物抑制mcf7細(xì)胞增殖。顯示了如實(shí)施例6中詳述的brdu摻入測(cè)定法的結(jié)果。y-軸表示brdu摻入正在增殖的細(xì)胞。發(fā)明詳述1.定義除非上下文另外清楚地指出，否則術(shù)語“一個(gè)(a)”、“一種(an)”和“該(the)”通常包括復(fù)數(shù)指稱。如本文所用的術(shù)語“抗原結(jié)合部分”指與靶抗原特異性結(jié)合的部分。該術(shù)語包括能夠與靶抗原特異性結(jié)合的抗體以及其他天然分子(例如受體，配體)或合成分子(例如，darpin)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合部分是抗體片段。術(shù)語“抗體”在本文中以最廣意義使用并且涵蓋多種抗體結(jié)構(gòu)物，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示出所需的抗原結(jié)合活性即可。“抗體片段”指不同于完整抗體的分子，所述分子包括完整抗體的一部分，該部分結(jié)合完整抗體所結(jié)合的抗原?？贵w片段的例子包括但不限于fv、fab、fab'、fab’-sh、f(ab')2；雙體抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scfv、scfab)；和從抗體片段形成的多特異性抗體。如本文所用，“fab片段”指包含含有輕鏈的vl結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域(cl)的輕鏈片段以及重鏈的vh結(jié)構(gòu)域和第一恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)的抗體片段。從而，在第一和第二結(jié)合部分分別是第一和第二fab片段的情況下，本發(fā)明的這種抗體的第一fab片段和第二fab片段指兩個(gè)不同fab部分，每一個(gè)包含vl和cl結(jié)構(gòu)域以及vh和ch1結(jié)構(gòu)域?！癴v片段”是含有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。這個(gè)片段由一個(gè)重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體(任選地以非共價(jià)締合方式)組成。術(shù)語“全長抗體”、“完好抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指一種抗體，所述抗體具有基本上與天然抗體結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)或具有含有如本文定義的fc區(qū)的重鏈。如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指具有單一氨基酸組成的抗體分子的制備物?！爸亟M抗體”是已經(jīng)由重組工程化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。它任選地是分離或純化的?！叭丝贵w”是這樣一種抗體，其擁有對(duì)應(yīng)于人或人細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列或從利用人抗體庫或其他編碼人抗體的序列的非人來源衍生。人抗體的這種定義特別排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。如本文所用，術(shù)語“重組人抗體”意在包括通過重組手段所制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的全部人抗體，如從宿主細(xì)胞如ns0或cho細(xì)胞或從相對(duì)于人免疫球蛋白基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的動(dòng)物(例如小鼠)中分離的抗體或使用轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體所表達(dá)的抗體。此類重組人抗體具有重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞超變。因此，重組抗體的vh和vl區(qū)的氨基酸序列是盡管源自人種系vh和vl序列并且與之相關(guān)，但可以不天然存在于體內(nèi)人抗體種系庫內(nèi)部的序列。術(shù)語“嵌合”抗體指一種抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分衍生自特定來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的剩余部分衍生自不同來源或物種?！叭嗽椿笨贵w指包含來自非人類hvr的氨基酸殘基和來自人fr的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將包含至少1個(gè)和一般2個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部和全部或基本上整個(gè)的fr區(qū)，其中可變結(jié)構(gòu)域的全部或基本上全部的hvr(例如，cdr)與非人抗體的那些hvr對(duì)應(yīng)并且全部或基本上整個(gè)的fr區(qū)與人抗體的那些fr對(duì)應(yīng)。人源化抗體任選地可以包含從人抗體衍生的抗體恒定區(qū)的至少一部分。抗體的“人源化形式”(例如，非人抗體的人源化形式)，指已經(jīng)歷過人源化的抗體?！胺蛛x的”抗體是已經(jīng)與其自然環(huán)境的組分分離的一種抗體。在一些實(shí)施方案中，將抗體純化至大于95％或99％純度，如通過例如電泳(例如，sds-page、等電聚焦(ief)、毛細(xì)管電泳法)或色譜(例如，離子交換或反相hplc)所確定。關(guān)于評(píng)估抗體純度的方法的綜述，參見，例如，flatman等人,j.chromatogr.b848:79-87(2007)。“特異性”指抗原的特定表位由抗原結(jié)合部分(例如抗體)選擇性識(shí)別。例如，天然抗體是單特異性的。如本文所用，術(shù)語“單特異性”抗體指具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗體，所述位點(diǎn)的每一個(gè)與相同抗原的相同表位結(jié)合?！岸嗵禺愋钥贵w”結(jié)合兩個(gè)或更多個(gè)不同的表位(例如，兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)不同的表位)。表位可以在相同或不同的抗原上。多特異性抗體的例子是結(jié)合兩個(gè)不同表位的“雙特異性”抗體。在抗體擁有多于一種特異性時(shí)，識(shí)別的表位可以與單一抗原或與多于一種抗原有關(guān)?？乖谋砦皇强乖杏煽贵w或抗原結(jié)合部分結(jié)合的區(qū)域。術(shù)語“表位”包括能夠與抗體或抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合的任何多肽決定簇。在某些實(shí)施方案中，表位決定簇包括化學(xué)活躍的分子表面基團(tuán)，如氨基酸、聚糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；鶊F(tuán)，并且在某些實(shí)施方案中，可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)性特征，和/或特定的電荷特征。如本文所用，術(shù)語“結(jié)合”和“特異性結(jié)合”指抗體或抗原結(jié)合部分在體外測(cè)定法中，優(yōu)選地在采用純化的野生型抗原的等離子體共振測(cè)定法(ge-healthcare，烏普薩拉，瑞典)中與抗原表位結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，在抗體或抗原結(jié)合部分優(yōu)選地識(shí)別蛋白質(zhì)和/或大分子的復(fù)雜混合物中其靶抗原時(shí)，將抗體或抗原結(jié)合部分稱作特異性結(jié)合抗原?？贵w與抗原結(jié)合的親和力由術(shù)語ka(來自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的締合速率常數(shù))、kd(解離常數(shù))和kd(kd/ka)定義。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合或特異性結(jié)合意指10-8mol/l或更小的、在一個(gè)實(shí)施方案中10-8m至10-13mol/l的結(jié)合親和力(kd)。因此，本發(fā)明的多特異性抗體與相對(duì)該抗體為特異的每種抗原以10-8mol/l或更小的結(jié)合親和力(kd)，例如以10-8至10-13mol/l的結(jié)合親和力(kd)，在一個(gè)實(shí)施方案中以10-9至10-13的結(jié)合親和力(kd)特異性結(jié)合。如本文所用的術(shù)語“結(jié)合位點(diǎn)”或“抗原結(jié)合位點(diǎn)”指抗原結(jié)合分子(例如抗體)的區(qū)域，所述區(qū)域與配體(例如抗原或其抗原片段)實(shí)際結(jié)合并且優(yōu)選地衍生自抗體。在抗體的情況下，抗原結(jié)合位點(diǎn)包括抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)和/或抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)，或成對(duì)的vh/vl。本發(fā)明抗體中的第三抗原結(jié)合位點(diǎn)由一對(duì)vh/vl形成。從特異性結(jié)合所需抗原的抗體衍生的抗原結(jié)合位點(diǎn)可以衍生自a)與抗原特異性結(jié)合的已知抗體或衍生自b)通過從頭免疫接種方法、尤其使用抗原蛋白或核酸或其片段或通過噬菌體展示獲得的新抗體或抗體片段。當(dāng)衍生自抗體時(shí)，本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)可以含有不同程度有助于結(jié)合位點(diǎn)對(duì)抗原的親和力的六個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)。存在三個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr(cdrh1、cdrh2和cdrh3)和三個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域cdr(cdrl1、cdrl2和cdrl3)。通過與匯編的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫比較，確定cdr和構(gòu)架區(qū)(fr)的程度，在所述數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)根據(jù)序列之間的變異性限定這些區(qū)域。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括由更少cdr組成的功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)(即，在結(jié)合特異性由三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)cdr決定的情況下)。例如，小于整套6個(gè)cdr可以對(duì)結(jié)合而言足夠。如本文所用的術(shù)語“價(jià)態(tài)”指抗體分子中存在指定數(shù)目的結(jié)合位點(diǎn)。天然抗體例如具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)并且是雙價(jià)的。從而，術(shù)語“三價(jià)”指抗體分子中存在三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。如本文所用的“可變結(jié)構(gòu)域”或“可變區(qū)”指直接涉及抗體與抗原結(jié)合的每對(duì)輕鏈和重鏈。輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域縮寫為“vl”并且重鏈的可變結(jié)構(gòu)域縮寫為“vh”。根據(jù)前述，本文中通過使用“vh3”和“vl3”指稱第三結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域，數(shù)字3表示第三結(jié)合位點(diǎn)。人輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域具有相同的總體結(jié)構(gòu)。每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域包含四個(gè)構(gòu)架(fr)區(qū)，其序列充分保守。fr由3個(gè)“高變區(qū)”(或“互補(bǔ)決定區(qū)”、cdr)連接。每條鏈上的cdr由這類構(gòu)架氨基酸分隔。因此，抗體的輕鏈和重鏈從n端至c端方向包含結(jié)構(gòu)域fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。fr采用β-折疊構(gòu)象并且cdr可以形成連接β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的cdr由fr以其三維結(jié)構(gòu)固定并且與來自另一條鏈的cdr一起形成“抗原結(jié)合位點(diǎn)”。特別地，重鏈的cdr3是對(duì)抗原結(jié)合作用貢獻(xiàn)最大。根據(jù)kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義確定cdr區(qū)和fr區(qū)。在天然抗體中，vl結(jié)構(gòu)域和vh結(jié)構(gòu)域分別在輕鏈和重鏈末端布置，這允許抗原接近，因此確?？乖Y(jié)合。在本發(fā)明的抗體內(nèi)部，當(dāng)抗原結(jié)合部分是fab片段時(shí)，第三結(jié)合位點(diǎn)的vl3結(jié)構(gòu)域和vh3結(jié)構(gòu)域可以布置在兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域之間。盡管通過恒定結(jié)構(gòu)域嵌入，但令人驚訝地觀察到第三結(jié)合位點(diǎn)的特異性結(jié)合。如本申請(qǐng)內(nèi)部所用的術(shù)語“恒定結(jié)構(gòu)域”或“恒定區(qū)”指抗體中除可變區(qū)之外的結(jié)構(gòu)域的總和。恒定區(qū)不直接涉及抗原的結(jié)合，但是顯示各種效應(yīng)子功能。取決于其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，將抗體以“類”劃分：iga、igd、ige、igg和igm，并且這些類別中的幾種可以進(jìn)一步劃分成亞類，如，igg1、igg2、igg3和igg4、iga1以及iga2。對(duì)應(yīng)于不同抗體類的重鏈恒定區(qū)分別稱作α、δ、ε、γ和μ。可以在全部五個(gè)抗體類中找到的輕鏈恒定區(qū)(cl)稱作κ和λ。如本文所用的“恒定結(jié)構(gòu)域”來自人源，其來自igg1、igg2、igg3或igg4亞類人抗體的重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈κ或λ恒定區(qū)。這類恒定結(jié)構(gòu)域和區(qū)域是現(xiàn)有技術(shù)熟知的并且例如由kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)描述?！般q鏈區(qū)”通常定義為從人igg1的約glu216或約cys226延伸至其約pro230(burton,molec.immunol.22:161-206(1985))。本發(fā)明的抗體缺少鉸鏈區(qū)二硫鍵。來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體的“輕鏈”可以基于其恒定域的氨基酸序列劃分成兩個(gè)不同類型(稱作κ(κ)和λ(λ))之一。野生型輕鏈一般含有兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，通常一個(gè)對(duì)結(jié)合抗原重要的可變結(jié)構(gòu)域(vl)和一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(cl)。存在確定抗體類或同種型的幾種不同類型的“重鏈”。野生型重鏈含有一系列的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，通常其中一個(gè)對(duì)結(jié)合抗原重要的可變結(jié)構(gòu)域(vh)和幾個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(ch1、ch2、ch3等)。術(shù)語“fc區(qū)”在本文中用來限定含有至少一部分恒定區(qū)的免疫球蛋白重鏈的c端區(qū)域。該定義包括天然序列fc區(qū)和變體fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人igg重鏈fc區(qū)從cys226或從pro230延伸至重鏈的羧基端。除非本文中另外說明，否則fc區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號(hào)根據(jù)如kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinteres,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中所述的eu編號(hào)體系，也稱作euindex?！靶?yīng)子功能”指隨抗體同種型變動(dòng)的歸因于抗體fc區(qū)的那些生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)子功能的例子包括：c1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(cdc)；fc受體結(jié)合作用；抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(adcc)；吞噬；下調(diào)細(xì)胞表面受體(例如，b細(xì)胞受體)；和b細(xì)胞活化。歸因于本發(fā)明抗體的結(jié)構(gòu)，尤其歸因于缺少ch2結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明抗體的fc介導(dǎo)的效應(yīng)子功能被消除?！翱贵w依賴的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性”或“adcc”指一種形式的細(xì)胞毒性，其中結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，nk細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的fc受體(fcr)上的分泌型免疫球蛋白(ig)使得這些細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞與攜帶抗原的靶細(xì)胞特異性結(jié)合并隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞。用于介導(dǎo)adcc的主要細(xì)胞即nk細(xì)胞僅表達(dá)fc-γriii，而單核細(xì)胞表達(dá)fc-γri、fc-γrii和fc-γriii。ravetch和kinet,annu.rev.immunol9:457-92(1991)的第464頁上的表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的fcr表達(dá)。為了評(píng)估目的分子的adcc活性，可以進(jìn)行體外adcc測(cè)定法，如美國專利號(hào)5,500,362或5,821,337或美國專利號(hào)6,737,056(presta)中描述的那種測(cè)定法。用于此類測(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞括pbmc和nk細(xì)胞。備選或另外，可以在體內(nèi)，例如，在動(dòng)物模型中，如在clynes等人,pnas(usa)95:652-656(1998)中公開的那種動(dòng)物模型中評(píng)估目的分子的adcc活性?！把a(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性”或“cdc”指在補(bǔ)體存在下靶細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的活化因補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(c1q)與(適宜亞類的)結(jié)合至其同族抗原的抗體結(jié)合而啟動(dòng)。為評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行cdc測(cè)定法，例如，如gazzano-santoro等人,j.immunol.methods202:163(1996)中所述。例如在美國專利號(hào)6,194,551b1和wo1999/51642中描述了具有改變的fc區(qū)氨基酸序列(具有變異fc區(qū)的多肽)和c1q結(jié)合能力增加或減少的多肽變體。還參見，例如，idusogie等人，j.immunol.164:4178-4184(2000)。人iggfc區(qū)的“ch2結(jié)構(gòu)域”通常從約位置231處的氨基酸殘基延伸至約位置340處的氨基酸殘基。多特異性抗體缺少ch2結(jié)構(gòu)域?！叭鄙賑h2結(jié)構(gòu)域”意指本發(fā)明的抗體不包含ch2結(jié)構(gòu)域?！癱h3結(jié)構(gòu)域”包含一段在fc區(qū)中從ch2結(jié)構(gòu)域至c末端的殘基(即從igg的約位置341處的氨基酸殘基延伸至約位置447處的氨基酸殘基)。在本發(fā)明的抗體內(nèi)部，一個(gè)相應(yīng)的ch3結(jié)構(gòu)域設(shè)置在第三結(jié)合位點(diǎn)的vl3結(jié)構(gòu)域和vh3結(jié)構(gòu)域的c末端。本文中的“ch3結(jié)構(gòu)域”是變異ch3結(jié)構(gòu)域，其中天然ch3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列經(jīng)歷至少一次不同的氨基酸置換(即ch3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列修飾)以促進(jìn)多特異性抗體內(nèi)部彼此面對(duì)的兩個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域二聚化。幾種用于修飾ch3以支持異二聚化的方案已經(jīng)例如在下述文獻(xiàn)中描述：wo96/27011、wo98/050431、ep1870459、wo2007/110205、wo2007/147901、wo2009/089004、wo2010/129304、wo2011/90754、wo2011/143545、wo2012/058768、wo2013/157954、wo2013/096291，所述文獻(xiàn)通過參考方式并入本文。一般，在本領(lǐng)域已知的異二聚化方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域均以互補(bǔ)方式工程化，從而包含一個(gè)工程化的ch3結(jié)構(gòu)域的重鏈不再可以與結(jié)構(gòu)相同的另一條重鏈同型二聚化。因而，強(qiáng)迫包含一個(gè)工程化的ch3結(jié)構(gòu)域的重鏈與包含以互補(bǔ)方式工程化的ch3結(jié)構(gòu)域的另一條重鏈異二聚化。本領(lǐng)域已知的一個(gè)異二聚化方案是所謂的“杵入臼”技術(shù)，所述技術(shù)以例如wo96/027011、ridgway,j.b.等人,proteineng.9(1996)617-621；和merchant,a.m.等人,nat.biotechnol.16(1998)677-681；以及wo98/050431中提供的幾個(gè)例子詳述，所述文獻(xiàn)通過引用的方式并入。在“杵入臼”技術(shù)中，在抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)中兩個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域之間形成的界面內(nèi)部，每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域上的特定氨基酸經(jīng)工程化，以分別在ch3結(jié)構(gòu)域之一中產(chǎn)生突出部分(“杵”)并在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生空穴(“臼”)。在多特異性抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入的突出部分可布置在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入的空穴中。用于修飾多特異性抗體的重鏈ch3結(jié)構(gòu)域以強(qiáng)迫異二聚化的其他技術(shù)(除“杵入臼技術(shù)”外)是本領(lǐng)域已知的。將這些技術(shù)，尤其在wo96/27011、wo98/050431、ep1870459、wo2007/110205、wo2007/147901、wo2009/089004、wo2010/129304、wo2011/90754、wo2011/143545、wo2012/058768、wo2013/157954和wo2013/096291中所述的那些，在本文構(gòu)思作為與本發(fā)明的多特異性抗體組合的“杵入臼技術(shù)”的備選物。包含這些修飾之一以支持異二聚化的多特異性抗體在本文中進(jìn)一步稱作“ch3-工程化的”多特異性抗體。根據(jù)ep1870459中描述的方法，ch3結(jié)構(gòu)域的異二聚化基于第一重鏈和第二重鏈之間的ch3/ch3結(jié)構(gòu)域界面中特定氨基酸位置處引入帶相反電荷的帶電荷氨基酸(本文中進(jìn)一步稱作“ch3(+/-)-工程化多特異性抗體”)。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，wo2013/157953中所述的方法用來支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異二聚化。在本發(fā)明的所述ch3-工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置366(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸t(yī)由k置換；并且另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置351(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸l由d置換。在本發(fā)明的所述ch3-工程化多特異性抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置366(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸t(yī)由k置換并且位置351(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸l由k置換；并且另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置351(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸l由d置換。在本發(fā)明的所述ch3-工程化多特異性抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置366(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸t(yī)由k置換并且位置351(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸l由k置換；并且另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置351(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸l由d置換。另外，另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中包含至少一個(gè)以下置換：位置349(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸y由e置換，位置349(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸y由d置換并且位置368(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸l由e置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，位置368(根據(jù)kabateuindex編號(hào))處的氨基酸l由e置換。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，wo2012/058768中所述的方法用來支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異二聚化。在本發(fā)明的所述ch3-工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置351(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸l由y置換并且位置407(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸y由a置換；并且另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置366(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸t(yī)由a置換并且位置409(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸k由f置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除前述置換之外，置換另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中下述位置處的至少一個(gè)氨基酸：411(原始為t)、399(原始為d)、400(原始為s)、405(原始為f)、390(原始為n)和392(原始為k)。優(yōu)選的置換是：-將位置411(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸t(yī)置換為選自n、r、q、k、d、e和w的氨基酸；-將位置399(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸d置換為選自r、w、y和k的氨基酸；-將位置400(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸s置換為選自ed、r和k的氨基酸；-將位置405(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸f置換為選自i、m、t、s、v和w的氨基酸；-將位置390(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸n置換為選自r、k和d的氨基酸；和-將位置392(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸k置換為選自v、m、r、l、f和e的氨基酸。在本發(fā)明的所述ch3-工程化多特異性抗體(根據(jù)wo2012/058768工程化)的另一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置351(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸l由y置換并且位置407(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸y由a置換；并且另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置366(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸t(yī)由v置換并且位置409(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸k由f置換。在本發(fā)明的所述ch3-工程化多特異性抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置407(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸y由a置換；并且另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置366(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸t(yī)由a置換并且位置409(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸k由f置換。在所述的最后前述實(shí)施方案中，所述其他重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置392(根據(jù)kabateuindex編號(hào))處的氨基酸k由e置換，位置411(根據(jù)kabateuindex編號(hào))處的氨基酸t(yī)由e置換，位置399(根據(jù)kabateuindex編號(hào))處的氨基酸d由r置換及位置400(根據(jù)kabateuindex編號(hào))處的氨基酸s由r置換。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，wo2011/143545中所述的方法用來支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異二聚化。在本發(fā)明的所述ch3-工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，將兩條重鏈中ch3結(jié)構(gòu)域的氨基酸修飾在位置368和/或409處引入。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，wo2011/090762中所述的方法用來支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異二聚化。wo2011/090762涉及根據(jù)“杵入臼”技術(shù)的氨基酸修飾。在本發(fā)明的所述ch3(kih)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置366(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸t(yī)由w置換；并且另一條重鏈的ch3域中位置407(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸y由a置換。在本發(fā)明的所述ch3(kih)工程化多特異性抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置366(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸t(yī)由y置換；并且另一條重鏈的ch3域中位置407(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸y由t置換。在本發(fā)明多特異性抗體(其為igg2同種型)的一個(gè)實(shí)施方案中，wo2011/090762中所述的方法用來支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異二聚化。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，wo2009/089004中所述的方法用來支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異二聚化。在本發(fā)明的所述ch3-工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置392(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸k或n由帶負(fù)電荷的氨基酸置換(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由e或d置換，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由d置換)；并且另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置399處的氨基酸d、位置356處的氨基酸e或d或位置357處的氨基酸e(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))由帶正電荷的氨基酸置換(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由k或r置換，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由k置換，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中位置399或356處的氨基酸由k置換)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，除前述置換之外，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置409(根據(jù)kabateuindex編號(hào))處的氨基酸k或r由帶負(fù)電荷的氨基酸置換(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由e或d置換，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由d置換)。在一個(gè)甚至進(jìn)一步實(shí)施方案，除前述置換之外或作為其備選，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置439處的氨基酸k和/或位置370處的氨基酸k(根據(jù)kabateuindex編號(hào))彼此獨(dú)立地由帶負(fù)電荷的氨基酸置換(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由e或d置換，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由d置換)。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，wo2007/147901中所述的方法用來支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異二聚化。在本發(fā)明的所述ch3-工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置253(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸k由e置換，位置282(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸d由k置換和位置322(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸k由d置換；并且另一條重鏈的ch3域中位置239(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸d由k置換，位置240(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸e由k置換和位置292(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸k由d置換。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，wo2007/110205中所述的方法用來支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異二聚化。除上文確定的異二聚化策略工程化ch3結(jié)構(gòu)域之外或作為其備選，引入額外的鏈間二硫鍵橋使異二聚體穩(wěn)定(atwell,s.等人,j.mol.biol.270(1997)26-35；merchant,a.m.等人,naturebiotech.16(1998)677-681)。這在本文中也稱作“ch3結(jié)構(gòu)域的二硫鍵穩(wěn)定作用”。就多肽而言的“融合”和“連接”指由肽鍵直接連接或借助一個(gè)或多個(gè)肽連接體(“肽接頭”)連接的組分。如本文中互換所用的術(shù)語“肽連接體”或“肽接頭”指具有某種氨基酸序列的肽，所述肽優(yōu)選地是合成來源的。一般，肽接頭由柔性殘基如甘氨酸和絲氨酸組成，從而相鄰的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相對(duì)彼此自由移動(dòng)。因此，根據(jù)本發(fā)明使用的常見肽接頭是甘氨酸-絲氨酸接頭，即由甘氨酸殘基和絲氨酸殘基樣式組成的肽接頭。第一肽接頭和第二肽接頭用來將第一抗原結(jié)合部分與vh3結(jié)構(gòu)域融合并且將第二抗原結(jié)合部分與vl3結(jié)構(gòu)域融合。但是，vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域和其相應(yīng)的ch3結(jié)構(gòu)域之間的連接直接實(shí)現(xiàn)，即在不包含肽接頭的情況下通過直接連接所述結(jié)構(gòu)域來實(shí)現(xiàn)。因此，如本文相對(duì)于融合/連接多肽而言所用的術(shù)語“直接連接”意指連接位點(diǎn)不包含肽接頭，即融合多肽的氨基酸序列僅包含彼此融合的多肽的氨基酸序列并且缺少肽接頭的其他氨基酸殘基。實(shí)施這一點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)：(a)vh3和ch3的融合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)密切模擬衍生第三結(jié)合位點(diǎn)的原始“親本”抗體的vh和ch1的天然連接位點(diǎn)以及其ch2和ch3的天然連接位點(diǎn)；和(b)vl3和ch3的融合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)密切模擬衍生第三結(jié)合位點(diǎn)的原始“親本”抗體的vh和ch1的天然連接位點(diǎn)以及其ch2和ch3的天然連接位點(diǎn)。如本文提到的術(shù)語具有“結(jié)構(gòu)域互換”的抗體意指這些抗體，其中在衍生自抗體天然結(jié)構(gòu)域架構(gòu)的抗體結(jié)合臂中(例如在fab區(qū)內(nèi)部)，至少一個(gè)重鏈結(jié)構(gòu)域由其相應(yīng)的輕鏈結(jié)構(gòu)域置換并且反之亦然。存在三個(gè)一般類型的結(jié)構(gòu)域互換，(i)ch1和cl結(jié)構(gòu)域的互換，這導(dǎo)致具有vl-ch1結(jié)構(gòu)的輕鏈互換和包含vh-cl結(jié)構(gòu)的重鏈的互換，(ii)vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域的互換，這導(dǎo)致具有vl-cl結(jié)構(gòu)的輕鏈互換和包含vl-ch1結(jié)構(gòu)的重鏈的互換，和(iii)<vl-cl>和<vh-ch1>的互換(“fab互換”)，這導(dǎo)致具有vh-ch1結(jié)構(gòu)的輕鏈互換和包含vl-cl結(jié)構(gòu)的重鏈的互換(結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)按n末端至c端方向指示)。在本發(fā)明的術(shù)語內(nèi)，相對(duì)于相應(yīng)重鏈和輕鏈而言的“相互替換”指前述的結(jié)構(gòu)域互換策略。從而，當(dāng)ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域“相互替換”時(shí)，將這稱作項(xiàng)(i)及所得重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域架構(gòu)下提到的結(jié)構(gòu)域互換。因此，當(dāng)vh1和vl“相互替換”時(shí)，將這稱作項(xiàng)(ii)下提到的結(jié)構(gòu)域互換；并且當(dāng)ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域“相互替換”及vh1和vl結(jié)構(gòu)域“相互替換”時(shí)，將這稱作項(xiàng)(iii)下提到的結(jié)構(gòu)域互換。包含結(jié)構(gòu)域互換的雙特異性抗體例如在wo2009/080251、wo2009/080252、wo2009/080253、wo2009/080254和schaefer,w.等人,pnas,108(2011)11187-1191中公開。當(dāng)本發(fā)明的抗體包含結(jié)構(gòu)域互換時(shí)，結(jié)構(gòu)域互換是“非對(duì)稱”的，這表示(a)僅第一和第二fab片段之一包含結(jié)構(gòu)域互換，或(b)第一和第二fab片段包括在以上項(xiàng)(i)至(iii)下所示的不同結(jié)構(gòu)域互換，但是并非第一和第二fab片段二者都包含相同的結(jié)構(gòu)域互換。如本文所用的術(shù)語抗體的“三級(jí)結(jié)構(gòu)”指本發(fā)明抗體的幾何形狀。三級(jí)結(jié)構(gòu)包含含有抗體結(jié)構(gòu)域的多肽鏈主鏈，同時(shí)氨基酸側(cè)鏈相互作用并按許多方式成鍵。如本文所用的術(shù)語“氨基酸”指擁有相對(duì)于羧基位于α-位置的氨基部分的有機(jī)分子。氨基酸的例子包括：精氨酸、甘氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、脯氨酸。所用的氨基酸任選地在每種情況下均為l-形式。術(shù)語“帶正電荷的”或“帶負(fù)電荷的氨基酸”指在ph7.4時(shí)氨基酸側(cè)鏈帶電荷。氨基酸可以根據(jù)常見的側(cè)鏈特性分組：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu；ile；(2)中性親水：cys、ser、thr、asn；gln；(3)酸性：asp、glu；(4)堿性：his、lys、arg；(5)影響鏈方向的殘基：gly、pro；(6)芳族：trp、tyr、phe。表–具有特定特性的氨基酸如本文所用，重鏈和輕鏈的全部恒定區(qū)和結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置根據(jù)kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))中描述的kabat編號(hào)體系編號(hào)。特別地，對(duì)于κ和λ同種型的可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域cl，使用kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)的kabat編號(hào)體系(參見第647-660頁)并且其在本文中稱作“根據(jù)kabat編號(hào)”；對(duì)于重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(ch1、鉸鏈區(qū)、ch2和ch3)，使用kabateuindex編號(hào)體系(參見第661-723頁)并且其在本文中稱作“根據(jù)kabat的euindex編號(hào)”。通過向抗體dna引入適宜的核苷酸改變或通過核苷酸合成，制備多特異性抗體的多肽鏈內(nèi)部的氨基酸置換(或突變)。然而，這類修飾可以僅在非常有限的范圍內(nèi)進(jìn)行。例如，修飾不改變上文提到的抗體特征，如igg同種型和抗原結(jié)合作用，不過可以進(jìn)一步改善重組生產(chǎn)的產(chǎn)率、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或促進(jìn)純化。在某些實(shí)施方案中，提供具有一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸置換的抗體變體。通過重組手段產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。用于重組產(chǎn)生抗體的方法是本領(lǐng)域廣泛已知并且包括在原核宿主細(xì)胞和真核宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)，連同后續(xù)分離抗體并通常純化至可藥用的純度。為了在宿主細(xì)胞中表達(dá)如前述的抗體，通過標(biāo)準(zhǔn)方法，將編碼相應(yīng)抗體輕鏈和重鏈的核酸插入表達(dá)載體中。表達(dá)在適宜的原核或真核宿主細(xì)胞中進(jìn)行，如cho細(xì)胞、ns0細(xì)胞、sp2/0細(xì)胞、hek293細(xì)胞、cos細(xì)胞、per.c6細(xì)胞、酵母或大腸桿菌細(xì)胞，并且從細(xì)胞(上清液或裂解后的細(xì)胞)回收抗體。用于重組產(chǎn)生抗體的一般方法是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的并且例如在以下綜述文章中描述：makrides,s.c.,proteinexpr.purif.17(1999)183-202；geisse,s.等人,proteinexpr.purif.8(1996)271-282；kaufman,r.j.,mol.biotechnol.16(2000)151-161；werner,r.g.,drugres.48(1998)870-880。宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可以經(jīng)歷從重鏈的c末端翻譯后剪切去一個(gè)或多個(gè)、尤其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸。因此，由宿主細(xì)胞通過表達(dá)編碼全長重鏈的特定核酸分子產(chǎn)生的抗體可以包含全長重鏈，或它可以包括全長重鏈的剪切變體(本文也稱作剪切變體重鏈)。這可以是如下情形：重鏈的最后兩個(gè)c端氨基酸是甘氨酸(g446)和賴氨酸(k447)(根據(jù)kabateuindex編號(hào))。本發(fā)明的組合物，如本文所述的藥物組合物或診斷組合物，包含本發(fā)明抗體的群體?？贵w的群體可以包含具有全長重鏈的抗體和具有剪切變體重鏈的抗體。如本文所用的術(shù)語“純化”指這樣的多肽，所述多肽從其天然環(huán)境或從重組產(chǎn)生來源取出，或否則分離或分隔，并且至少60％(例如，至少80％)不含與它們天然結(jié)合的其他組分(例如膜和微粒體)。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(包括堿/sds處理、cscl區(qū)帶法、柱色譜、瓊脂糖凝膠電泳)和本領(lǐng)域熟知的其他技術(shù)進(jìn)行抗體的純化(從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物回收抗體)，目的在于消除細(xì)胞組分或其他雜質(zhì)(例如，其他細(xì)胞性核酸或蛋白質(zhì))。參見ausubel,f.等人編著.currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwileyinterscience,newyork(1987)。充分建立了不同的方法并且它們廣泛用于蛋白質(zhì)純化，如采用微生物蛋白的親和色譜(例如采用純化κ同種型或λ同種型輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的親和介質(zhì)，例如kappaselect或lambdaselect)、離子交換色譜(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式交換)、親硫吸附作用(例如采用β-巰基乙醇和其他sh配體)、疏水相互作用或芳族吸附色譜(例如采用苯基-瓊脂糖凝膠、親氮雜-芳烴樹脂(aza-arenophilicresin)或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合物親和色譜(例如采用ni(ii)-和cu(ii)-親和材料)、大小排阻色譜和電泳法(如凝膠電泳法、毛細(xì)管電泳法)(vijayalakshmi,m.a.,appl.biochem.biotech.75(1998)93-102)。如本文中可互換使用的“多核苷酸”或“核酸”指任何長度的核苷酸聚合物，并且包括dna和rna。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基和/或其類似物，或可以由dna或rna聚合酶或通過合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸及其類似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸組分打斷。多核苷酸可以包含合成后所做的修飾，如與標(biāo)記物綴合。其他類型的修飾例如包括“加帽”、將一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸用下述取代：類似物、核苷酸間修飾，例如具有不帶電荷的鍵(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺化物、氨基甲酸酯等)的那些和具有帶電荷的鍵(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有側(cè)掛部分例如蛋白質(zhì)(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚l-賴氨酸等)的那些、具有嵌入劑(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素、等)的那些、含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的那些、含有烷化劑的那些、具有修飾的鍵(例如，α異頭核酸等)的那些以及未修飾形式的多核苷酸修飾。另外，通常存在于糖中的任何羥基可以例如由膦酸酯基團(tuán)、磷酸酯基團(tuán)替換、受標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基保護(hù)或經(jīng)激活以為額外核苷酸準(zhǔn)備額外的鍵，或可以與固態(tài)或半固態(tài)支持物綴合。5’和3’端oh可以磷酸化或用1至20個(gè)碳原子的胺或有機(jī)加帽基團(tuán)部分取代。也可以將其他羥基衍生化成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基。多核苷酸還可以含有本領(lǐng)域通常已知的核糖或脫氧核糖的類似形式，例如包括2'-o-甲基-、2’-o-烯丙基-、2'-氟-或2’-疊氮基-核糖、碳環(huán)糖類似物、α-異頭糖、差向異構(gòu)糖如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環(huán)類似物和堿性核苷類似物如甲基核糖苷。一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵可以由備選性連接基團(tuán)替換。這些備選性連接基團(tuán)包括，但不限于這樣的實(shí)施方案，其中磷酸酯由p(o)s(“硫代酯”、p(s)s(“二硫代酯”、(o)nr2(“酰胺化物”、p(o)r、p(o)or’、co或ch2(“甲縮醛(formacetal)”)替換，其中每個(gè)r或r’獨(dú)立地是h或取代或未取代的任選含有醚鍵(-o-)的烷基(1-20c)、芳基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳醛基(araldyl)。多核苷酸中的全部鍵并不需要是相同的。前文描述適用于本文提及的全部多核苷酸，包括rna和dna。“分離的”核酸指已經(jīng)與其自然環(huán)境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括含于細(xì)胞內(nèi)的核酸分子，所述細(xì)胞通常含有該核酸分子，但是該核酸分子存在于染色體外或與其天然染色體位置不同的染色體位置處?！熬幋a抗體的分離核酸”指編碼抗體重鏈和輕鏈(或其片段)的一個(gè)或多個(gè)核酸分子，包括在單一載體或獨(dú)立載體中的這類核酸分子和在宿主細(xì)胞中一個(gè)或多個(gè)位置處存在的這類核酸分子。如本文所用，術(shù)語“載體”指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術(shù)語包括作為自我復(fù)制型核酸結(jié)構(gòu)的載體以及并入已經(jīng)將該載體引入其中的宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的載體。該術(shù)語包括主要作用在于將dna或rna插入至細(xì)胞中(例如，染色體整合)的載體、主要作用在于復(fù)制dna或rna的復(fù)制載體和主要作用在于轉(zhuǎn)錄和/或翻譯dna或rna的表達(dá)載體。還包括提供多于一種如上所述功能的載體?！氨磉_(dá)載體”是能夠指導(dǎo)與之有效連接的核酸表達(dá)的載體。將表達(dá)載體引入適宜的宿主細(xì)胞時(shí)，它可以轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽。在本發(fā)明的方法中轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí)，使用“表達(dá)載體”；因而與如本文所述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞相關(guān)使用的術(shù)語“載體”意指“表達(dá)載體”。“表達(dá)系統(tǒng)“”通常指包含表達(dá)載體的合適宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體可以發(fā)揮作用以產(chǎn)生所需的表達(dá)產(chǎn)物。如本文所用，“表達(dá)”指核酸轉(zhuǎn)錄成mrna的過程和/或指轉(zhuǎn)錄的mrna(也稱作轉(zhuǎn)錄物)隨后翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄物和編碼的多肽各自或統(tǒng)稱為基因產(chǎn)物。如果核酸衍生自基因組dna，真核細(xì)胞中的表達(dá)可以包括剪接相應(yīng)的mrna。如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指載體/核酸轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞的過程。如果使用沒有難以對(duì)付的細(xì)胞壁的細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，則轉(zhuǎn)染例如通過如graham和vandereh,virology52(1978)546ff所描述的磷酸鈣沉淀方法實(shí)施。但是，也可以使用向細(xì)胞引入dna的其他方法，如胞核注射或原生質(zhì)體融合。如果使用原核細(xì)胞或含有大量細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，例如，一種轉(zhuǎn)染方法是使用氯化鈣的鈣處理法，如cohen,f.n等人，pnas69(1972)7110etseq所描述。如本申請(qǐng)中所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”指可以經(jīng)工程化以產(chǎn)生本發(fā)明抗體的任何種類的細(xì)胞系統(tǒng)。如本文所用，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”互換使用并且全部這類名稱包括后代。因而，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代主題細(xì)胞和從中衍生的培養(yǎng)物，而無論轉(zhuǎn)移次數(shù)是多少。還應(yīng)當(dāng)理解，全部后代可以在dna含量方面不是精確地相同，原因在于有意或不經(jīng)意突變。包括具有與最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞中所篩選的相同功能或生物學(xué)活性的變體后代。在意圖不同命名的情況下，它將從上下文顯而易見。瞬時(shí)表達(dá)例如由durocher,y.等人,nucl.acids.res.30(2002)e9描述?？寺】勺兘Y(jié)構(gòu)域由orlandi,r.等人,proc.natl.acad.sci.usa86(1989)3833-3837；carter,p.等人,proc.natl.acad.sci.usa89(1992)4285-4289；和norderhaug,l.等人,j.immunol.methods204(1997)77-87描述。優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(hek293)由schlaeger,e.-j.和christensen,k.在cytotechnology30(1999)71-83中和由schlaeger,e.-j.,j.immunol.methods194(1996)191-199描述。術(shù)語“藥物組合物”指一種制備物，所述制備物處于這樣的形式，從而允許其中所含的有效成分的生物學(xué)活性有效，并且不含有對(duì)于將會(huì)施用該組合物的受試者不可接受地有毒的額外組分。本發(fā)明的藥物組合物可以是通過本領(lǐng)域已知的多種方法施用。如熟練技術(shù)人員將理解，施用的途徑和/或模式將取決于所想要的結(jié)果而變動(dòng)。為了通過某些施用途徑施用本發(fā)明的抗體，可能需要將抗體用防止其失活的材料包衣或隨這種材料共施用抗體。例如，該抗體可以在適宜的載體例如脂質(zhì)體或稀釋劑中施用至受試者。可藥用的稀釋劑包括鹽水和緩沖水溶液。藥物組合物包含有效量的本發(fā)明抗體。藥劑(例如，抗體)的“有效量”指在必要的劑量和時(shí)間段能有效實(shí)現(xiàn)所需治療性或預(yù)防性結(jié)果的量。特別地，“有效量”指本發(fā)明抗體的這種量，當(dāng)施用至受試者時(shí)，所述量(i)治療或預(yù)防特定疾病、病狀或病癥，(ii)減弱、改善或消除特定疾病、病狀或病癥的一種或多種癥狀，或(iii)阻止或延遲本文所述的特定疾病、病狀或病癥的一種或多種癥狀的發(fā)作。治療有效量將根據(jù)所用抗體分子、正在治療的疾病狀態(tài)、所治療疾病的嚴(yán)重程度、受試者的年齡和相對(duì)健康情況、施用途徑和形式、主治醫(yī)療執(zhí)業(yè)者或獸醫(yī)執(zhí)業(yè)者的判斷和其他因素變動(dòng)?！翱伤幱幂d體”指藥物制劑中除有效成分之外的對(duì)受試者無毒的成分?！翱伤幱幂d體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌藥和抗真菌藥、等滲劑和吸收延遲劑等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。本發(fā)明的藥物組合物也可以含有輔助劑如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可以通過上文的消毒方法和通過納入多種抗菌劑和抗真菌劑例如，對(duì)羥苯甲酸、氯丁醇、苯酚、山梨酸等確保防止微生物存在。還可能想要將等滲劑如糖、氯化鈉等納入所述組合物。此外，可以通過納入延遲吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明膠引起可注射藥物形式的延長吸收。如本文所用的短語“腸胃外施用“和“腸胃外方式施用”意指除了腸內(nèi)和局部施用之外的施用模式，通常通過注射施用，并且包括而不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、角皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、椎管內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。無論選擇何種施用途徑，均通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，將本發(fā)明的化合物(其可以按適宜水合形式使用)和/或本發(fā)明的藥物組合物配制成可藥用的劑型?？梢愿淖儽景l(fā)明的藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平，以獲得活性成份的這種量，所述量就具體患者、組合物和施用方式而言可以有效達(dá)到所希望的治療反應(yīng)，同時(shí)對(duì)患者無毒性。選擇的劑量水平將取決于多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括所用的本發(fā)明特定組合物的活性、施用途徑、施用時(shí)間、正在使用的化合物的排泄速率、治療的持續(xù)期、與所用特定組合物聯(lián)合使用的其他藥物、化合物和/或材料、正在治療的患者的年齡、性別、重量、狀況、總體健康和既往醫(yī)史等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的因素。組合物必須是無菌并如此程度地流動(dòng)，從而可以通過注射器輸送組合物。除水之外，在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是等滲緩沖鹽水溶液?？梢岳缤ㄟ^使用包衣如卵磷脂、在分散體情況下通過維持要求的粒度和通過使用表面活性劑，維持適宜的流動(dòng)性。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇和氯化鈉。如本文所用，名詞“治療”(和其語法變型如動(dòng)詞“治療”或分詞“治療”)指意欲改變正在接受治療的個(gè)體的天然過程的臨床介入，并且可以旨在預(yù)防或在臨床病理學(xué)過程期間實(shí)施。想要的治療效果包括，但不限于防止疾病出現(xiàn)或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、減小疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、防止轉(zhuǎn)移、降低病情進(jìn)展速率、改善或緩和疾病狀態(tài)，以及緩解或預(yù)后改善。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用來延緩疾病發(fā)展或用來減慢疾病的進(jìn)展?！皞€(gè)體”或“受試者”是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于馴化動(dòng)物(例如，奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)、兔和嚙齒類(例如，小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，個(gè)體或受試者是人。“免疫綴合物”是與一個(gè)或多個(gè)異源分子(包括但不限于細(xì)胞毒性劑)綴合的抗體。如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或造成細(xì)胞死亡或破壞的物質(zhì)。細(xì)胞毒性劑包括但不限于放射性同位素(例如，at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212和lu的放射性同位素)；化療藥或藥物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、長春堿類生物堿(長春新堿、長春堿、依托泊苷)、多柔比星、美法侖、絲裂霉素c、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如細(xì)菌源、真菌源、植物源或動(dòng)物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體；和下文公開的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。2.本發(fā)明實(shí)施方案的詳細(xì)描述i.多特異性抗體本發(fā)明涉及一種包含至少三個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的多特異性抗體，其中兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)由第一抗原結(jié)合部分和第二抗原結(jié)合部分形成，其中a)第三抗原結(jié)合位點(diǎn)由重鏈可變域(vh3)和輕鏈可變域(vl3)形成，其中-vh3結(jié)構(gòu)域的n末端與第一抗原結(jié)合部分借助第一肽接頭連接，并且-vl3結(jié)構(gòu)域的n末端與第二抗原結(jié)合部分借助第二肽接頭連接，b)多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化i)在ch3結(jié)構(gòu)域之一中通過用具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生突出部分，并且在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中通過用具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生空穴，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之一中產(chǎn)生的突出部分可布置在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生的空穴中(這對(duì)應(yīng)于通過杵入臼技術(shù)支持異二聚化)；或?qū)h3結(jié)構(gòu)域之一中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶正電荷的氨基酸置換；并且將另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶負(fù)電荷的氨基酸置換(這對(duì)應(yīng)于通過在相應(yīng)的ch3結(jié)構(gòu)域內(nèi)部引入電荷相反的氨基酸，支持異二聚化)；ii)在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成，或iii)i)和ii)的修飾物；c)第三抗原結(jié)合位點(diǎn)的vh3結(jié)構(gòu)域的c末端與b)下提到的ch3結(jié)構(gòu)域之一連接，并且第三抗原結(jié)合位點(diǎn)的vl3結(jié)構(gòu)域的c末端與b)下提到的另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接，并且d)多特異性抗體缺少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2(ch2)。圖1中描述了所述多特異性抗體的總體結(jié)構(gòu)的示意圖。本發(fā)明多特異性抗體的兩個(gè)結(jié)合臂由可以與相同或不同抗原結(jié)合的第一和第二抗原結(jié)合部分形成。與野生型igg分子相反，在本發(fā)明多特異性抗體內(nèi)部，ch2結(jié)構(gòu)域由本文中稱作vh3/vl3的第三結(jié)合位點(diǎn)替換。由于該多特異性抗體缺少ch2結(jié)構(gòu)域，fc介導(dǎo)的效應(yīng)子功能被取消，這是幾種治療性應(yīng)用所需的。多特異性抗體特別適合結(jié)合相同靶上的不同表位抗原(例如相同生物分子上的不同表位)或相同細(xì)胞上的不同生物分子。異二聚化在多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)杵入臼技術(shù)改變ch3結(jié)構(gòu)域。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體在本文中也稱作“ch3(kih)工程化多特異性抗體”(其中縮寫“kih”代表“杵入臼技術(shù)”)。因此，根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，在ch3(kih)工程化的多特異性抗體內(nèi)部，ch3結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：在ch3結(jié)構(gòu)域之一中通過用具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生突出部分，并且在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中通過用具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生空穴，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之一中產(chǎn)生的突出部分可布置在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生的空穴中。換句話說，這個(gè)實(shí)施方案涉及一種包含第一重鏈和第二重鏈的本發(fā)明ch3(kih)工程化的多特異性抗體，其中在抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，第一重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域形成位于相應(yīng)的抗體ch3結(jié)構(gòu)域之間的界面，其中第一重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)氨基酸序列各自包含一組位于抗體三級(jí)結(jié)構(gòu)中所述界面內(nèi)部的氨基酸，-其中從位于一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中的界面內(nèi)的這組氨基酸中，將至少一個(gè)氨基酸殘基置換為具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，因而在該界面內(nèi)部產(chǎn)生突出部分，其中突出部分位于一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中，并且其中突出部分可布置在該界面內(nèi)部位于另一個(gè)重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中的空穴內(nèi)；并且-其中從位于另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中的界面內(nèi)的這組氨基酸中，將至少一個(gè)氨基酸殘基置換為具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，因而在該界面內(nèi)部產(chǎn)生空穴，其中空穴位于另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中，并且其中位于一條重鏈ch3結(jié)構(gòu)域中界面內(nèi)部的突出部分是可布置在該空穴中。在本發(fā)明的所述ch3(kih)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自r、f、y和w。在本發(fā)明的所述ch3(kih)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自a、s、t和v。在本發(fā)明的所述ch3(kih)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自r、f、y和w；并且所述具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自a、s、t和v。在本發(fā)明的所述ch3(kih)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈(包含“杵”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a和y407v突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在本發(fā)明的所述ch3(kih)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈(包含“杵”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w和g407y突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a和y407v突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在本發(fā)明的所述ch3(kih)工程化多特異性抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈(包含“杵”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w、r409d和k370e突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a、y407v、d399k和e357k突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。作為如上文定義的根據(jù)杵入臼技術(shù)的修飾的備選或與之組合，基于本領(lǐng)域已知的其他異二聚化方案，優(yōu)選地wo96/27011、wo98/050431、ep1870459、wo2007/110205、wo2007/147901、wo2009/089004、wo2010/129304、wo2011/90754、wo2011/143545、wo2012/058768、wo2013/157954和wo2013/096291中所述的那些，改變本發(fā)明多特異性抗體的ch3結(jié)構(gòu)域以促進(jìn)異二聚化。在多特異性抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中，作為根據(jù)杵入臼技術(shù)修飾的備選或與其組合，通過ch3/ch3結(jié)構(gòu)域界面中特定氨基酸位置處引入帶相反電荷的帶電荷氨基酸，改變ch3結(jié)構(gòu)域(例如，如ep1870459中所述)。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體在本文中也稱作“ch3(+/-)-工程化多特異性抗體”(其中縮寫“+/-”代表在相應(yīng)ch3結(jié)構(gòu)域中引入的帶相反電荷的氨基酸)。因此，根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，在ch3(+/-)工程化的多特異性抗體內(nèi)部，ch3結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：將ch3結(jié)構(gòu)域之一中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶正電荷的氨基酸置換；并且將另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶負(fù)電荷的氨基酸置換。換句話說，這個(gè)實(shí)施方案涉及一種包含第一重鏈和第二重鏈的本發(fā)明的ch3(+/-)工程化多特異性抗體，其中在抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，第一重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域形成位于相應(yīng)的抗體ch3結(jié)構(gòu)域之間的界面，其中第一重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)氨基酸序列各自包含一組位于抗體三級(jí)結(jié)構(gòu)中所述界面內(nèi)部的氨基酸，其中從位于一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中界面內(nèi)的這組氨基酸中，第一氨基酸由帶正電荷的氨基酸置換，并且從位于另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中界面內(nèi)的這組氨基酸中，第二氨基酸由帶負(fù)電荷的氨基酸置換。在本發(fā)明的所述ch3(+/-)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電荷的氨基酸選自k、r和h；并且?guī)ж?fù)電荷的氨基酸選自e或d。在本發(fā)明的所述ch3(+/-)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電荷的氨基酸選自k和r；并且?guī)ж?fù)電荷的氨基酸選自e或d。在本發(fā)明的所述ch3(+/-)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電荷的氨基酸是k；并且?guī)ж?fù)電荷的氨基酸是e。在本發(fā)明的所述ch3(+/-)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置409(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸r由d置換并且位置370(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸k由e置換；并且另一條重鏈的ch3域中位置399(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸d由k置換并且位置357(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸e由k置換。在多特異性抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域受到二硫鍵穩(wěn)定化。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體在本文中也稱作“ch3(s-s)工程化的多特異性抗體”(其中縮寫“s-s”代表二硫鍵穩(wěn)定作用)。因此，根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，在ch3(s-s)工程化的多特異性抗體內(nèi)部，ch3結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成。換句話說，這個(gè)實(shí)施方案涉及一種包含第一重鏈和第二重鏈的本發(fā)明的ch3(s-s)工程化多特異性抗體，其中在抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，第一重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域形成位于相應(yīng)的抗體ch3結(jié)構(gòu)域之間的界面，其中第一重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)氨基酸序列各自包含一組位于抗體三級(jí)結(jié)構(gòu)中所述界面內(nèi)部的氨基酸，從位于一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中界面內(nèi)的這組氨基酸中，第一氨基酸由半胱氨酸置換；并且從位于另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中界面內(nèi)的這組氨基酸中，第二氨基酸由半胱氨酸置換，其中第二氨基酸在界面內(nèi)部面向第一氨基酸；從而一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵可以借助引入的半胱氨酸殘基形成。在ch3(s-s)-工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在ch3(s-s)-工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的s354c突變和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在多特異性抗體的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域受到二硫鍵穩(wěn)定化并且根據(jù)杵入臼技術(shù)改變。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體在本文中也稱作“ch3(kss)工程化的多特異性抗體”(其中縮寫“k”代表杵入臼技術(shù)并且“ss”代表二硫鍵穩(wěn)定作用)。因此，根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，在ch3(kss)工程化的多特異性抗體內(nèi)部，ch3結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：在ch3結(jié)構(gòu)域之一中通過用具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生突出部分，并且在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中通過用具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生空穴，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之一中產(chǎn)生的突出部分可布置在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生的空穴中；并且在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中額外引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成二硫鍵。換句話說，這個(gè)實(shí)施方案涉及一種包含第一重鏈和第二重鏈的本發(fā)明ch3(kss)工程化的多特異性抗體，其中在抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，第一重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域形成位于相應(yīng)的抗體ch3結(jié)構(gòu)域之間的界面，其中第一重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)氨基酸序列各自包含一組位于抗體三級(jí)結(jié)構(gòu)中所述界面內(nèi)部的氨基酸，-其中從位于一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中的界面內(nèi)的這組氨基酸中，將至少一個(gè)氨基酸殘基置換為具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，因而在該界面內(nèi)部產(chǎn)生突出部分，其中突出部分位于一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中，并且其中突出部分可布置在該界面內(nèi)部位于另一個(gè)重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中的空穴內(nèi)；并且-其中從位于另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中的界面內(nèi)的這組氨基酸中，將至少一個(gè)氨基酸殘基置換為具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基，因而在該界面內(nèi)部產(chǎn)生空穴，其中空穴位于另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中，并且其中在空穴中可布置位于一條重鏈ch3結(jié)構(gòu)域中界面內(nèi)部的突出部分；并且其中-從位于一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中界面內(nèi)的這組氨基酸，第一氨基酸由半胱氨酸置換；并且從位于另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中界面內(nèi)的這組氨基酸中，第二氨基酸由半胱氨酸置換，其中第二氨基酸在界面內(nèi)部面向第一氨基酸；從而一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵可以借助引入的半胱氨酸殘基形成。在本發(fā)明的所述ch3(kss)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，在“杵”鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中引入e356c或s354c突變并且在“臼鏈”的ch3域”中引入y349c突變。在本發(fā)明的所述ch3(kss)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自r、f、y和w。在本發(fā)明的所述ch3(kss)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自a、s、t和v。在本發(fā)明的所述ch3(kss)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自r、f、y和w；并且所述具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自a、s、t和v。在本發(fā)明的所述ch3(kss)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自r、f、y和w；并且所述具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自a、s、t和v，并且ch3結(jié)構(gòu)域受到由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變(在一個(gè)實(shí)施方案中s354c突變)及另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變的二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在本發(fā)明的所述ch3(kss)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈(包含“杵”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a和y407v突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))，并且ch3結(jié)構(gòu)域受到由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變(在一個(gè)實(shí)施方案中s354c突變)和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變的二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在本發(fā)明的所述ch3(kss)工程化多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，一條重鏈(包含“杵”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w和g407y突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a和y407v突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))，并且ch3結(jié)構(gòu)域受到由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變(在一個(gè)實(shí)施方案中s354c突變)和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變的二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述ch3(kss)工程化多特異性抗體，一條重鏈(包含“杵”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w、r409d和k370e突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a、y407v、d399k和e357k突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))，并且ch3結(jié)構(gòu)域受到由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變(在一個(gè)實(shí)施方案中s354c突變)和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變的二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在多特異性抗體的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域被二硫鍵穩(wěn)定化并且通過在ch3/ch3結(jié)構(gòu)域界面中特定氨基酸位置處引入帶相反電荷的帶電荷氨基酸而改變。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體在本文中也稱作“ch3(+/-/ss)工程化的多特異性抗體”(其中縮寫“+/-”代表電荷相反的氨基酸并且“ss”代表二硫鍵穩(wěn)定作用)。因此，根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，在ch3(+/-/ss)工程化的多特異性抗體內(nèi)部，ch3結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：將ch3結(jié)構(gòu)域之一中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶正電荷的氨基酸置換；并且將另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶負(fù)電荷的氨基酸置換，并且在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中額外引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成二硫鍵。換句話說，這個(gè)實(shí)施方案涉及一種包含第一重鏈和第二重鏈的本發(fā)明ch3(+/-/ss)工程化的多特異性抗體，其中在抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，第一重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域形成位于相應(yīng)的抗體ch3結(jié)構(gòu)域之間的界面，其中第一重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)氨基酸序列各自包含一組位于抗體三級(jí)結(jié)構(gòu)中所述界面內(nèi)部的氨基酸，-其中從位于界面一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中的這組氨基酸中，第一氨基酸由帶正電荷的氨基酸置換；并且-其中從位于另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中界面內(nèi)的這組氨基酸中，第二氨基酸由帶負(fù)電荷的氨基酸置換；并且其中-從位于一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中界面內(nèi)的這組氨基酸，第一氨基酸由半胱氨酸置換；并且從位于另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中界面內(nèi)的這組氨基酸中，第二氨基酸由半胱氨酸置換，其中第二氨基酸在界面內(nèi)部面向第一氨基酸；從而一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域和另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵可以借助引入的半胱氨酸殘基形成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化。因此，通過在vh3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基和在vl3結(jié)構(gòu)域中引入一個(gè)半胱氨酸殘基改變vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域，從而二硫鍵在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間形成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵，多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh3位置44處，和vl3位置100處；-vh3位置105處，和vl3位置43處；或-vh3位置101處，和vl3位置100處。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過在vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和在vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化并且ch3結(jié)構(gòu)域受到二硫鍵穩(wěn)定化。在不受這種理論約束的情況下，在本發(fā)明多特異性抗體的已改變fc結(jié)構(gòu)域的不同結(jié)構(gòu)域中通過這種修飾形成的至少兩個(gè)二硫鍵鍵替換野生型igg鉸鏈區(qū)二硫鍵相互作用并且因而支持異二聚化，同時(shí)允許第三結(jié)合位點(diǎn)接近抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵，本發(fā)明ch3(s-s)工程化的多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh3位置44處，和vl3位置100處；-vh3位置105處，和vl3位置43處；或-vh3位置101處，和vl3位置100處。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過在vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和在vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，本發(fā)明ch3(s-s)工程化的多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過在vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和在vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，本發(fā)明ch3(s-s)工程化的多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化；并且ch3結(jié)構(gòu)域受到由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變的二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，異二聚化受到ch3結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的杵入臼修飾支持，并且此外，多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)和ch3結(jié)構(gòu)域分別受到二硫鍵穩(wěn)定化。在根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體中，杵入臼修飾的重鏈的異二聚化進(jìn)一步受到人工鏈間二硫鍵支持，與已知的杵入臼方案相反，所述的人工鏈間二硫鍵不位于ch3結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，而位于不同的結(jié)構(gòu)域中(即在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間)。在根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的抗體內(nèi)部，第三結(jié)合模塊(包含vh3-ch3和vl3-ch3多肽)的異二聚化受四種不同的相互作用促進(jìn)：(i)vh3和vl3之間的天然相互作用，(ii)vh3/vl3界面中的二硫鍵穩(wěn)定作用，(iii)ch3/ch3界面中的二硫鍵穩(wěn)定作用；和(iv)ch3/ch3界面中的杵入臼修飾。籍此，促進(jìn)異二聚體的形成而非同型二聚體形成并且抗體的穩(wěn)定性改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵，本發(fā)明ch3(kss)工程化的多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh3位置44處，和vl3位置100處；-vh3位置105處，和vl3位置43處；或-vh3位置101處，和vl3位置100處。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過在vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和在vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，本發(fā)明ch3(kss)工程化的多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過在vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和在vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，本發(fā)明ch3(kss)工程化的多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化；并且具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自r、f、y和w；并且具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自a、s、t和v，并且ch3結(jié)構(gòu)域受到由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變(在一個(gè)實(shí)施方案中s354c突變)及另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變的二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，本發(fā)明ch3(kss)工程化的多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化；并且一條重鏈(包含“杵”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a和y407v突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))，并且ch3結(jié)構(gòu)域受到由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變(在一個(gè)實(shí)施方案中s354c突變)和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變的二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，本發(fā)明ch3(kss)工程化的多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化；并且一條重鏈(包含“杵”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w和g407y突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a和y407v突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))，并且ch3結(jié)構(gòu)域受到由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變(在一個(gè)實(shí)施方案中s354c突變)和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，本發(fā)明ch3(kss)工程化的多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化；并且一條重鏈(包含“杵”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w、r409d和k370e突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a、y407v、d399k和e357k突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))，并且ch3結(jié)構(gòu)域受到由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變(在一個(gè)實(shí)施方案中s354c突變)和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，異二聚化受到ch3/ch3結(jié)構(gòu)域界面中特定氨基酸位置處引入帶相反電荷的帶電荷氨基酸支持，并且此外，多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)和ch3結(jié)構(gòu)域分別受到二硫鍵穩(wěn)定化。在根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體中，修飾的重鏈的異二聚化進(jìn)一步受到人工鏈間二硫鍵支持，所述的人工鏈間二硫鍵不位于ch3結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，而位于不同的結(jié)構(gòu)域中(即在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵，本發(fā)明ch3(+/-/ss)工程化的多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh3位置44處，和vl3位置100處；-vh3位置105處，和vl3位置43處；或-vh3位置101處，和vl3位置100處。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過在vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和在vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，本發(fā)明ch3(+/-/ss)工程化的多特異性抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化。肽接頭在本發(fā)明的多特異性抗體內(nèi)部，第三結(jié)合位點(diǎn)的vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域的n末端分別借助第一肽接頭和第二肽接頭與相應(yīng)的抗原結(jié)合部分融合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一肽接頭和第二肽接頭之間未形成鏈間二硫鍵。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一肽接頭和第二肽接頭彼此相同。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體缺少鉸鏈區(qū)。在本發(fā)明的另一個(gè)備選實(shí)施方案中，多特異性抗體包含不形成鏈間二硫鍵的天然鉸鏈區(qū)。一個(gè)例子是衍生自igg4同種型抗體的鉸鏈區(qū)肽。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一肽接頭和第二肽接頭是至少15個(gè)氨基酸的肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第一肽接頭和第二肽接頭是15–70個(gè)氨基酸的肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第一肽接頭和第二肽接頭是20-50個(gè)氨基酸的肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第一肽接頭和第二肽接頭是10-50個(gè)氨基酸的肽。例如取決于第三結(jié)合位點(diǎn)待結(jié)合的抗原的類型，較短(或甚至較長的)肽接頭也可以在本發(fā)明的抗體中適用。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，第一肽接頭和第二肽接頭大約具有天然鉸鏈區(qū)的長度(對(duì)于igg1同種型的天然抗體分子而言，該長度是約15個(gè)氨基酸，和對(duì)于igg3同種型，是約62個(gè)氨基酸)。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，其中多特異性抗體是igg1同種型的情況下，肽接頭是10–20個(gè)氨基酸的肽，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，是12–17個(gè)氨基酸的肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中多特異性抗體是igg3同種型的情況下，肽接頭是55–70個(gè)氨基酸的肽，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，是60–65個(gè)氨基酸的肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一肽接頭和第二肽接頭是甘氨酸-絲氨酸接頭。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一肽接頭和第二肽接頭是由甘氨酸殘基和絲氨酸殘基組成的肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，甘氨酸-絲氨酸接頭是結(jié)構(gòu)(gxs)n或(gxs)ngm其中g(shù)＝甘氨酸，s＝絲氨酸，x＝3或4，n＝2，3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3。在上文確定的甘氨酸-絲氨酸接頭的一個(gè)實(shí)施方案中，x＝3，n＝3、4、5或6并且m＝0、1、2或3；或x＝4，n＝2、3、4或5并且m＝0、1、2或3。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，x＝4并且n＝2或3，以及m＝0。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，x＝4并且n＝2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽接頭是(g4s)2。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一肽接頭和第二肽接頭是(g4s)2肽，并且多特異性抗體是如上文定義的ch3(kss)工程化的多特異性抗體，其中通過vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化；并且其中在多特異性抗體中，一條重鏈(包含“杵”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w和g407y突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a和y407v突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))，并且ch3結(jié)構(gòu)域受到由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變(在一個(gè)實(shí)施方案中s354c突變)和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變的二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一肽接頭和第二肽接頭是(g4s)2肽，并且多特異性抗體是如上文定義的ch3(kss)工程化的多特異性抗體，其中通過vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化；并且其中在多特異性抗體中，一條重鏈(包含“杵”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w、g407y和s354c突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a、y407v和y349c突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)ch3結(jié)構(gòu)域的融合位點(diǎn)在本發(fā)明的多特異性抗體內(nèi)部，第三結(jié)合位點(diǎn)的vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)c末端與ch3結(jié)構(gòu)域融合。當(dāng)可變結(jié)構(gòu)域vh3和vl3不借助肽接頭與相應(yīng)的ch3結(jié)構(gòu)域直接連接時(shí)，可以最佳實(shí)現(xiàn)獲得與野生型igg-fc區(qū)域相似的蛋白質(zhì)折疊。此外，甚至在第三結(jié)合位點(diǎn)和ch3/ch3界面均受到二硫鍵穩(wěn)定化的情況下，可變結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)ch3結(jié)構(gòu)域的直接連接有利地在形成所需鏈間二硫鍵時(shí)防止緊鄰存在的半胱氨酸殘基錯(cuò)誤配對(duì)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，vh3結(jié)構(gòu)域的c末端直接與ch3結(jié)構(gòu)域之一連接，并且vl3結(jié)構(gòu)域的c末端直接與另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，vh3結(jié)構(gòu)域的c末端直接與ch3結(jié)構(gòu)域之一連接，并且vl3結(jié)構(gòu)域的c末端直接與另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接，其中連接位點(diǎn)缺少額外的接頭肽。為了提供結(jié)構(gòu)上密切模擬野生型抗體分子的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域之間天然轉(zhuǎn)換位點(diǎn)的融合位點(diǎn)，可變結(jié)構(gòu)域(分別是vh3和vl3)的c末端和/或ch3結(jié)構(gòu)域(其與相應(yīng)的可變結(jié)構(gòu)域直接連接)的n末端可以通過置換不同氨基酸殘基包含突變。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，修飾ch3結(jié)構(gòu)域的n末端。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，修飾vh3結(jié)構(gòu)域的c末端。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，修飾vl3結(jié)構(gòu)域的c末端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域每者之一的n末端包含至少一個(gè)氨基酸突變，vh3結(jié)構(gòu)域的c末端包含至少一個(gè)氨基酸突變，并且vl3結(jié)構(gòu)域的c末端包含至少一個(gè)氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過置換位于ch3結(jié)構(gòu)域的位置341至350處(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))的至少一個(gè)氨基酸殘基，進(jìn)行氨基酸突變，旨在改善融合位點(diǎn)的三級(jí)結(jié)構(gòu)以模擬野生型抗體分子的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域之間的天然轉(zhuǎn)換位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，置換位于ch3結(jié)構(gòu)域的341至345位置處的至少一個(gè)氨基酸殘基(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域的n末端由根據(jù)seqidno:2的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域的n末端由根據(jù)seqidno:3或seqidno:4的氨基酸序列組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過置換vh3結(jié)構(gòu)域、vl3結(jié)構(gòu)域或vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域兩者的十個(gè)c端氨基酸殘基中至少一個(gè)氨基酸殘基，進(jìn)行氨基酸突變，旨在改善融合位點(diǎn)的三級(jí)結(jié)構(gòu)以模擬野生型抗體分子的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域之間的天然轉(zhuǎn)換位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域每者之一的n末端包含位于ch3結(jié)構(gòu)域的341至350位置處(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))的至少一個(gè)氨基酸突變，并且vh3結(jié)構(gòu)域的十個(gè)c端氨基酸殘基包含至少一個(gè)氨基酸突變，并且vl3結(jié)構(gòu)域的十個(gè)c端氨基酸殘基包含至少一個(gè)氨基酸突變。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域每者之一的n末端包含位于ch3結(jié)構(gòu)域的341至345位置處(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))的至少一個(gè)氨基酸突變，并且vh3結(jié)構(gòu)域的五個(gè)c端氨基酸殘基包含至少一個(gè)氨基酸突變，并且vl3結(jié)構(gòu)域的五個(gè)c端氨基酸殘基包含至少一個(gè)氨基酸突變?？乖Y(jié)合部分在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分是與抗原特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分選自能夠與抗原特異性結(jié)合的抗體、受體、配體和darpin。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分是抗體片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分選自fv、fab、fab'、fab’-sh、f(ab')2和單鏈抗體分子(例如scfv、scfab)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分是fv或fab片段。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分是fab片段。在本發(fā)明的又一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一抗原結(jié)合部分是第一fab片段并且第二抗原結(jié)合部分是第二fab片段。在本發(fā)明多特異性抗體的第一和第二結(jié)合部分是fab片段的情況下，本發(fā)明的多特異性抗體具有igg樣形狀并且顯示與野生型igg分子可比較的分子量。類似于野生型igg分子，本發(fā)明的這類多特異性抗體包含兩個(gè)基于fab片段的結(jié)合臂。結(jié)合臂可以具有野生型fab結(jié)構(gòu)或包含如本領(lǐng)域已知的其他修飾(例如，fab片段可以是單鏈fab、二硫鍵穩(wěn)定的fab、二硫鍵穩(wěn)定的單鏈fab或結(jié)構(gòu)域互換fab)。為了確保第三結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合作用，天然包含穩(wěn)定性二硫鍵的野生型抗體的鉸鏈區(qū)由缺少鏈間二硫鍵的肽接頭替換。歸因于移除天然鉸鏈區(qū)二硫鍵相互作用導(dǎo)致的穩(wěn)定作用缺乏，通過杵入臼修飾或引入帶相反電荷的氨基酸和/或額外的鏈間二硫鍵支持ch3/ch3異二聚化，使多特異性抗體的改變的fc樣區(qū)域穩(wěn)定。此外，因而支持正確裝配所需的抗體分子(例如避免鏈錯(cuò)誤配對(duì)，如形成重鏈同型二聚體)。因此，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包含至少三個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的多特異性抗體，其中兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)由第一fab片段和第二fab片段形成，其中a)第三抗原結(jié)合位點(diǎn)由重鏈可變域(vh3)和輕鏈可變域(vl3)形成，其中-vh3結(jié)構(gòu)域的n末端與第一fab片段借助第一肽接頭連接，并且-vl3結(jié)構(gòu)域的n末端與第二fab片段借助第二肽接頭連接，b)多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化i)在ch3結(jié)構(gòu)域之一中通過用具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生突出部分，并且在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中通過用具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生空穴，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之一中產(chǎn)生的突出部分可布置在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生的空穴中(這對(duì)應(yīng)于通過杵入臼技術(shù)支持異二聚化)；或?qū)h3結(jié)構(gòu)域之一中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶正電荷的氨基酸置換；并且將另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶負(fù)電荷的氨基酸置換(這對(duì)應(yīng)于通過相應(yīng)的ch3結(jié)構(gòu)域內(nèi)部引入電荷相反的氨基酸，支持異二聚化)；ii)在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成；或iii)i)和ii)的修飾物；c)第三抗原結(jié)合位點(diǎn)的vh3結(jié)構(gòu)域的c末端與一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接，并且第三抗原結(jié)合位點(diǎn)的vl3結(jié)構(gòu)域的c末端與另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接，并且d)多特異性抗體缺少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2(ch2)。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種包含至少三個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的多特異性抗體，其中兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)由第一fab片段和第二fab片段形成，其中a)第三抗原結(jié)合位點(diǎn)由重鏈可變域(vh3)和輕鏈可變域(vl3)形成，其中-vh3結(jié)構(gòu)域的n末端與第一fab片段的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(cl)的c末端借助第一肽接頭連接，并且-vl3結(jié)構(gòu)域的n末端與第二fab片段的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(cl)的c末端借助第二肽接頭連接，b)多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化i)在ch3結(jié)構(gòu)域之一中通過用具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生突出部分，并且在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中通過用具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生空穴，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之一中產(chǎn)生的突出部分可布置在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生的空穴中(這對(duì)應(yīng)于通過杵入臼技術(shù)支持異二聚化)；或?qū)h3結(jié)構(gòu)域之一中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶正電荷的氨基酸置換；并且將另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶負(fù)電荷的氨基酸置換(這對(duì)應(yīng)于通過相應(yīng)的ch3結(jié)構(gòu)域內(nèi)部引入電荷相反的氨基酸，支持異二聚化)；ii)在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成；或iii)i)和ii)的修飾物；c)第三抗原結(jié)合位點(diǎn)的vh3結(jié)構(gòu)域的c末端與一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接，并且第三抗原結(jié)合位點(diǎn)的vl3結(jié)構(gòu)域的c末端與另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接，并且d)多特異性抗體缺少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2(ch2)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明多特異性抗體的第一和第二結(jié)合位點(diǎn)分別由第一和第二fab片段形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二fab片段的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)棣释N型。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和/或第二fab片段的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)棣送N型。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一fab片段的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)棣释N型并且第二fab片段的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)棣送N型。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均受到二硫鍵穩(wěn)定化。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在相應(yīng)的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh位置44處，和vl位置100處；-vh位置105處，和vl位置43處；或-vh位置101處，和vl位置100處。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過其vh結(jié)構(gòu)域中位置44處和其vl結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均受到二硫鍵穩(wěn)定化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均受到二硫鍵穩(wěn)定化。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在相應(yīng)的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh位置44處，和vl位置100處；-vh位置105處，和vl位置43處；或-vh位置101處，和vl位置100處，并且通過將至少一個(gè)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基置換為另一個(gè)氨基酸殘基，消除相應(yīng)fab片段的多肽鏈之間的天然二硫鍵。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，通過其vh結(jié)構(gòu)域中位置44處和其vl結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均受到二硫鍵穩(wěn)定化；并且通過將至少一個(gè)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基置換為另一個(gè)氨基酸殘基，消除相應(yīng)fab片段的多肽鏈之間的天然二硫鍵。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，僅通過在vh位置44處和vl位置100處之間的人工二硫鍵穩(wěn)定第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均是單鏈fab片段(scfab)，即fab片段的各結(jié)構(gòu)域布置在單條多肽鏈上。當(dāng)?shù)谝缓偷诙ab片段與不同表位結(jié)合(并且因此，多特異性抗體為至少三特異性)時(shí)，這個(gè)實(shí)施方案特別有用。籍此，可以在重組表達(dá)期間減少副產(chǎn)物形成和輕鏈錯(cuò)誤配對(duì)(即輕鏈與錯(cuò)誤的重鏈配對(duì)，因而形成無功能的結(jié)合位點(diǎn))并且可以改善表達(dá)產(chǎn)率。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，僅fab片段之一(即第一fab片段或第二fab片段)是單鏈fab片段(而另一個(gè)fab片段不是單鏈fab片段，但由兩條多肽鏈構(gòu)成)。因此，在包含至少一個(gè)單鏈fab片段的多特異性抗體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多特異性抗體是至少三特異性的。在包含至少一個(gè)單鏈fab片段的多特異性抗體的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多特異性抗體是三特異性的。在包含至少一個(gè)單鏈fab片段的多特異性抗體的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多特異性抗體是三價(jià)和三特異性的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均是二硫鍵穩(wěn)定化的單鏈fab片段(dsfab)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均是單鏈fab片段，所述單鏈fab片段通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在相應(yīng)的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵而受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh位置44處，和vl位置100處；-vh位置105處，和vl位置43處；或-vh位置101處，和vl位置100處。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均是單鏈fab片段，所述單鏈fab片段分別通過其vh結(jié)構(gòu)域中位置44處和其vl結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基受到二硫鍵穩(wěn)定化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，僅fab片段之一(即第一fab片段或第二fab片段)是單鏈fab片段，所述單鏈fab片段通過其vh結(jié)構(gòu)域中位置44處和其vl結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基受到二硫鍵穩(wěn)定化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均是單鏈fab片段，所述單鏈fab片段通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在相應(yīng)的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵而受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh位置44處，和vl位置100處；-vh位置105處，和vl位置43處；或-vh位置101處，和vl位置100處；并且通過將至少一個(gè)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基置換為另一個(gè)氨基酸殘基，消除相應(yīng)的單鏈fab片段的多肽鏈之間的天然二硫鍵。在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均是單鏈fab片段，所述單鏈fab片段受到通過其vh結(jié)構(gòu)域中位置44處和其vl結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基的二硫鍵穩(wěn)定；并且通過將至少一個(gè)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基置換為另一個(gè)氨基酸殘基，消除相應(yīng)的單鏈fab片段的多肽鏈之間的天然二硫鍵。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均通過結(jié)構(gòu)域互換而改變，從而：a)僅ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域相互替換；b)僅vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域是相互替換；或c)ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域相互替換并且vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域是相互替換，前提是，在通過結(jié)構(gòu)域互換改變第一fab片段和第二fab片段兩者的情況下，通過不同的結(jié)構(gòu)域互換改變它們。這例如意指在兩個(gè)fab片段包含結(jié)構(gòu)域互換的情況下，當(dāng)?shù)谝籪ab片段包含在a)下限定的結(jié)構(gòu)域互換時(shí)，即ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域相互替換，則第二fab片段包含在b)下限定的結(jié)構(gòu)域互換(即替換相應(yīng)的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域)或在c)下限定的結(jié)構(gòu)域互換(即將vh-ch1用vl-cl替換)，但是第二fab片段不包含在a)下限定的結(jié)構(gòu)域互換(即僅ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域相互替換)。因此，根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體包含相對(duì)于第一和第二fab片段而言的非對(duì)稱結(jié)構(gòu)域互換，意指歸因于結(jié)構(gòu)域互換，第一fab片段和第二fab片段的輕鏈不再由相同的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)組成，反而由不同的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)組成。因而，避免第一fab片段的輕鏈與第二fab片段的重鏈配對(duì)(并且反之亦然)。當(dāng)?shù)谝缓偷诙ab片段與不同表位結(jié)合(并且因此，多特異性抗體為至少三特異性)時(shí)，這個(gè)實(shí)施方案特別有用。借助這個(gè)實(shí)施方案，可以在重組表達(dá)期間減少副產(chǎn)物形成和輕鏈錯(cuò)誤配對(duì)(即輕鏈與錯(cuò)誤的重鏈配對(duì)，因而形成無功能的結(jié)合位點(diǎn))并且可以改善抗體的表達(dá)產(chǎn)率。因此，在至少一個(gè)fab片段中包含結(jié)構(gòu)域互換的多特異性抗體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多特異性抗體是至少三特異性的。在至少一個(gè)fab片段中包含結(jié)構(gòu)域互換的多特異性抗體的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多特異性抗體是三特異性的。在至少一個(gè)fab片段中包含結(jié)構(gòu)域互換的多特異性抗體的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多特異性抗體是三價(jià)和三特異性的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，僅fab片段之一(即第一fab片段或第二fab片段，但不是兩個(gè)fab片段)通過結(jié)構(gòu)域互換改變，從而僅fab片段的ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域相互替換。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，僅fab片段之一(即第一fab片段或第二fab片段，但不是兩個(gè)fab片段)通過結(jié)構(gòu)域互換改變，從而僅fab片段的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域相互替換。在使用fab片段作為本發(fā)明多特異性抗體的結(jié)合臂的情況下，抗體顯示igg樣結(jié)構(gòu)，然而它包含替換原始ch2/ch2界面的額外結(jié)合位點(diǎn)。其他結(jié)合位點(diǎn)可以與多特異性抗體的重鏈或輕鏈的n末端或c末端融合，以提供給抗體更高的價(jià)態(tài)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多特異性抗體是三價(jià)的，因而類似于igg分子的野生型三維結(jié)構(gòu)。與不同表位結(jié)合在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體包含至少一個(gè)多表位結(jié)合位點(diǎn)(即能夠與一個(gè)生物分子上的兩個(gè)不同表位或來自不同生物分子的兩個(gè)不同表位結(jié)合，例如，如wo2008/027236a2中公開)。籍此，可以按照與野生型igg分子相似的結(jié)構(gòu)和分子量生成多于三個(gè)特異性的多特異性抗體(例如，四特異性抗體)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗原結(jié)合部分、第二抗原結(jié)合部分或第一結(jié)合部分和第二抗原結(jié)合部分均包含多表位結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第三結(jié)合位點(diǎn)包含多表位結(jié)合位點(diǎn)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的第一和第二抗原結(jié)合部分及第三結(jié)合位點(diǎn)包含多表位結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的多特異性抗體能夠與不同的表位結(jié)合。這可以是通過以下方式實(shí)現(xiàn)：組合與單一抗原特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)或，另外，包含呈現(xiàn)多表位性并因此與多于一個(gè)表位特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多表位結(jié)合位點(diǎn)與兩個(gè)不同表位結(jié)合)。因而，可以是產(chǎn)生能夠與大量的不同表位結(jié)合的三價(jià)多特異性抗體。在第一和第二抗原結(jié)合部分是相應(yīng)fab片段的情況下，多特異性抗體有利地維持igg樣形狀和分子量。多特異性抗體特別適合結(jié)合相同靶上的不同表位抗原(例如相同生物分子上的不同表位)或相同細(xì)胞上的不同生物分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性抗體包含各自與單一表位結(jié)合的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。因而，根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體可以是雙特異性或三特異性的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性抗體包含至少一個(gè)多表位結(jié)合位點(diǎn)(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多表位結(jié)合位點(diǎn)與兩個(gè)不同表位結(jié)合)。在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是三特異性抗體，其中第一和第二抗原結(jié)合部分包含兩個(gè)相同的多表位結(jié)合位點(diǎn)(各自與兩個(gè)不同表位特異性結(jié)合)并且第三結(jié)合位點(diǎn)與另一個(gè)(第三)表位特異性結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是三特異性抗體，其中第一和第二抗原結(jié)合部分與第一表位特異性結(jié)合并且第三結(jié)合位點(diǎn)是與第二和第三表位特異性結(jié)合的多表位結(jié)合位點(diǎn)。因而，根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體是至少三特異性的。當(dāng)組合各自結(jié)合兩個(gè)不同表位的三個(gè)不同多表位結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，在多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是至多六特異性的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是雙特異性的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是三價(jià)和雙特異性的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是雙特異性并且特異性結(jié)合一個(gè)細(xì)胞上的兩種不同抗原或相同抗原的兩個(gè)不同表位。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是三價(jià)和雙特異性的，并且特異性結(jié)合一個(gè)細(xì)胞上的兩種不同抗原或相同抗原的兩個(gè)不同表位。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體是雙特異性的，其中第一抗原結(jié)合部分和第二抗原結(jié)合部分與相同的表位特異性結(jié)合，并且其中第三結(jié)合位點(diǎn)與不同的表位特異性結(jié)合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體是三價(jià)和雙特異性的，其中第一抗原結(jié)合部分和第二抗原結(jié)合部分與相同的表位特異性結(jié)合，并且其中第三結(jié)合位點(diǎn)與不同的表位特異性結(jié)合。在包含fab片段形式的第一和第二抗原結(jié)合部分的根據(jù)這些實(shí)施方案的雙特異性抗體內(nèi)部，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二fab片段不包含結(jié)構(gòu)域互換。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二fab片段的輕鏈由vl結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域組成(從n端至c端方向)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是雙特異性的，其中第一抗原結(jié)合部分和第三結(jié)合位點(diǎn)與相同的表位特異性結(jié)合，并且其中第二抗原結(jié)合部分與不同的表位特異性結(jié)合。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是三價(jià)和雙特異性的，其中第一抗原結(jié)合部分和第三結(jié)合位點(diǎn)與相同的表位特異性結(jié)合，并且其中第二抗原結(jié)合部分與不同的表位特異性結(jié)合。在包含fab片段形式的第一和第二抗原結(jié)合部分的根據(jù)這些實(shí)施方案的雙特異性抗體內(nèi)部，fab片段至少之一包含結(jié)構(gòu)域互換或以單鏈fab片段的形式提供。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，fab片段至少之一包含如上文定義的結(jié)構(gòu)域互換(任選地，包括其他的結(jié)構(gòu)域互換實(shí)施方案，如向fab片段至少之一引入帶電荷的氨基酸)。因而，避免鏈錯(cuò)誤配對(duì)并且改善多特異性抗體的表達(dá)產(chǎn)率。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是三特異性的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是三價(jià)和三特異性的。在本發(fā)明的三特異性抗體的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與單一表位結(jié)合，其中第一抗原結(jié)合部分、第二抗原結(jié)合部分和第三結(jié)合位點(diǎn)分別與不同的表位特異性結(jié)合。在本發(fā)明的三特異性抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二抗原結(jié)合部分與相同的表位結(jié)合并且第三結(jié)合位點(diǎn)與兩個(gè)不同的表位結(jié)合(并且因此是多表位的)。在本發(fā)明的三特異性抗體的又一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二抗原結(jié)合部分基于相同的多表位結(jié)合位點(diǎn)(各自與兩個(gè)不同的表位結(jié)合)，并且第三結(jié)合位點(diǎn)與單一表位結(jié)合，所述的單一表位與第一和第二抗原結(jié)合部分所結(jié)合的表位不同。在全部實(shí)施方案中，其中本發(fā)明的抗體包含第一fab片段和第二fab片段作為第一和第二抗原結(jié)合部分并且其中所述第一fab片段和所述第二fab片段基于不同的結(jié)合位點(diǎn)并因此與不同表位特異性結(jié)合的情況下，fab片段優(yōu)選地專門設(shè)計(jì)成通過使用單鏈fab片段(其可以進(jìn)一步受到二硫鍵穩(wěn)定化)或通過使用結(jié)構(gòu)域互換策略在第一fab片段和第二fab片段的輕鏈中實(shí)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)域架構(gòu)，因而抑制輕鏈錯(cuò)誤配對(duì)，分別避免第一fab片段和第二fab片段的輕鏈和重鏈之間的輕鏈錯(cuò)誤配對(duì)。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，其中第一fab片段和第二fab片段與不同表位特異性結(jié)合的情況下，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均通過結(jié)構(gòu)域互換而改變，從而：a)僅ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域相互替換；b)僅vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域是相互替換；或c)ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域相互替換并且vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域是相互替換，前提是，在通過結(jié)構(gòu)域互換改變第一fab片段和第二fab片段的情況下，通過不同的結(jié)構(gòu)域互換改變它們。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，其中第一fab片段和第二fab片段與不同表位特異性結(jié)合的情況下，僅fab片段之一(即第一fab片段或第二fab片段，但不是兩個(gè)fab片段)通過結(jié)構(gòu)域互換改變，從而僅fab片段的ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域相互替換。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，其中第一fab片段和第二fab片段與不同表位特異性結(jié)合的情況下，僅fab片段之一(即第一fab片段或第二fab片段，但不是兩個(gè)fab片段)通過結(jié)構(gòu)域互換改變，從而僅fab片段的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域相互替換。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，其中第一fab片段和第二fab片段與不同表位特異性結(jié)合的情況下，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均是單鏈fab片段(scfab)。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，其中第一fab片段和第二fab片段與不同表位特異性結(jié)合的情況下，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均是二硫鍵穩(wěn)定化的單鏈fab片段(dsfab)。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，其中第一fab片段和第二fab片段與不同表位結(jié)合的情況下，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均是單鏈fab片段，所述單鏈fab片段通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在相應(yīng)的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵而受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh位置44處，和vl位置100處；-vh位置105處，和vl位置43處；或-vh位置101處，和vl位置100處。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，其中第一fab片段和第二fab片段與不同表位特異性結(jié)合的情況下，第一fab片段、第二fab片段或第一和第二fab片段兩者均是單鏈fab片段，所述單鏈fab片段分別通過其vh結(jié)構(gòu)域中位置44處和其vl結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基受到二硫鍵穩(wěn)定化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，僅fab片段之一(即第一fab片段或第二fab片段)是單鏈fab片段，所述單鏈fab片段通過其vh結(jié)構(gòu)域中位置44處和其vl結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基而受到二硫鍵穩(wěn)定化。在本發(fā)明多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，其中第一fab片段和第二fab片段與不同表位結(jié)合的情況下，第一fab片段是單鏈fab片段(在一個(gè)實(shí)施方案中，二硫鍵穩(wěn)定化的單鏈fab片段)并且第二fab片段包含如上文定義的結(jié)構(gòu)域互換。抗體同種型在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體包含一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白類別的免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫球蛋白類別包括igg、igm、iga、igd和ige同種型和在igg和iga的情況下，它們的亞型。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體具有igg型抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的恒定結(jié)構(gòu)域是人igg1或igg4亞類。在一個(gè)實(shí)施方案中，ch3結(jié)構(gòu)域衍生自人igg1抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體缺少ch4結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是人源化單克隆抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是人單克隆抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是分離的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含了含有如本文具體說明的ch3結(jié)構(gòu)域的重鏈的抗體包含額外的c末端甘氨酸-賴氨酸二肽(g446和k447，根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含了含有如本文具體說明的ch3結(jié)構(gòu)域的重鏈的抗體包含額外的c末端甘氨酸殘基(g446，根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。包含抗體和半抗原偶聯(lián)的劑供定向遞送有效負(fù)載的復(fù)合物本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種復(fù)合物，其包含(i)本發(fā)明多特異性抗體，其中抗體至少與半抗原和靶蛋白特異性結(jié)合(因而包含至少一個(gè)與半抗原特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)與靶蛋白特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn))，和(ii)由多特異性抗體結(jié)合的半抗原，其中半抗原與治療藥或診斷藥綴合。在復(fù)合物內(nèi)部，半抗原與抗體的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，所述抗體與半抗原特異性結(jié)合。因而，與治療藥或診斷藥綴合的半抗原非共價(jià)地與抗體偶聯(lián)。在復(fù)合物內(nèi)部，抗體維持其結(jié)合特異性和親和力，同時(shí)與半抗原偶聯(lián)的治療藥或診斷藥也維持其活性。半抗原結(jié)合性雙特異性抗體與半抗原化的治療藥或診斷藥的復(fù)合物通常是本領(lǐng)域已知的，例如從wo2011/1003557a1已知。本發(fā)明的復(fù)合物可以如wo2011/1003557a1中所述那樣設(shè)計(jì)和應(yīng)用，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用方式完整并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，存在于本發(fā)明復(fù)合物中的抗體是雙特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，半抗原選自地高辛配基、生物素、茶堿、熒光素、dota和dotam。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶蛋白是細(xì)胞表面抗原或胞內(nèi)抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶蛋白是細(xì)胞表面或胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶蛋白是細(xì)胞表面腫瘤相關(guān)抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶蛋白是lewisy。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶蛋白是cd33。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶蛋白是磷脂酰基醇蛋白聚糖3。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述多特異性抗體作為治療藥或診斷藥的有效負(fù)載遞送載具。治療藥或診斷藥與半抗原綴合并且因此通過本發(fā)明多特異性抗體的半抗原結(jié)合位點(diǎn)偶聯(lián)以形成本發(fā)明的復(fù)合物。這種復(fù)合物是確定的及穩(wěn)定的并且特異性遞送有效負(fù)載至靶細(xì)胞或組織。由于半抗原化的治療藥或診斷藥以非共價(jià)方式偶聯(lián)于多特異性抗體，所以有效負(fù)載在循環(huán)期間與其遞送載具穩(wěn)定結(jié)合，同時(shí)在內(nèi)化后還被有效釋放。與半抗原綴合不影響大部分治療藥或診斷性藥的活性。多特異性抗體因此不含有不常見的共價(jià)偶聯(lián)的有效負(fù)載并且因此顯示低免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。因此這種簡單的綴合程序可以用于組合種類龐大的有效負(fù)載分子與僅一種單一多特異性抗體；有效負(fù)載分子例如是肽、蛋白質(zhì)、小分子、成像試劑和核酸。半抗原化的診斷藥或治療藥與含有至少一個(gè)半抗原結(jié)合位點(diǎn)的本發(fā)明多特異性抗體的復(fù)合物可以向診斷藥或治療藥(例如向診斷用或治療用蛋白質(zhì)、肽或小分子)賦予良性的生物物理特性和改善的pk參數(shù)。另外，這類復(fù)合體能夠靶遞送有效負(fù)載至展示靶蛋白抗原的細(xì)胞，所述靶蛋白抗原由多特異性抗體的至少一個(gè)其他結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別。在一個(gè)實(shí)施方案中，與半抗原偶聯(lián)的治療藥或診斷藥選自肽、蛋白質(zhì)、小分子、放射性標(biāo)記小分子、核酸和成像劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療藥或診斷藥是肽。在半抗原化的肽與本發(fā)明多特異性抗體結(jié)合時(shí)，該肽保留其完整生物學(xué)活性。肽的非限制性例子是蜂毒肽、fam5b、inf7、fallv1和fallv2。本發(fā)明的一個(gè)方面是本發(fā)明多特異性抗體遞送毒素衍生的肽至表達(dá)靶抗原的腫瘤細(xì)胞的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療藥或診斷藥是蛋白質(zhì)。在半抗原化的蛋白質(zhì)與本發(fā)明多特異性抗體結(jié)合時(shí)，該蛋白質(zhì)保留其完整生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療藥或診斷藥是小分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，小分子是毒素或是衍生自毒素的小分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，小分子是假單胞菌外毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療藥或診斷藥是放射性標(biāo)記小分子。半抗原化的放射性同位素或與半抗原化小分子連接的放射性同位素顯示有效的組織滲透、快速清除率并且僅留在本發(fā)明復(fù)合物覆蓋的表達(dá)靶蛋白抗原的細(xì)胞上。這能夠?qū)崿F(xiàn)治療性放射性同位素的特異性靶向作用并且避免其全身性非特異性釋放。本發(fā)明的一個(gè)方面是本發(fā)明多特異性抗體遞送半抗原化的放射性同位素或與半抗原化小分子連接的放射性同位素至患病組織的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述患病組織是腫瘤并且靶蛋白是腫瘤相關(guān)抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療藥或診斷藥是核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸是雙鏈rna(dsrna)。已經(jīng)顯示雙鏈核糖核酸(dsrna)分子以稱作rna干擾(rnai)的高度保守的調(diào)節(jié)機(jī)制阻斷基因表達(dá)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是本發(fā)明多特異性抗體用于定向dsrna遞送的定向基因療法的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療藥或診斷藥是成像劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，成像劑是熒光團(tuán)。盡管被半抗原化并與本發(fā)明的抗體復(fù)合，但成像劑保留其特性。半抗原化的成像劑顯示有效的組織滲透、快速清除率并且僅留在本發(fā)明復(fù)合物覆蓋的表達(dá)靶蛋白抗原的細(xì)胞上。這能夠?qū)崿F(xiàn)有效的時(shí)間解析成像及評(píng)估腫瘤血管化或腫瘤血管化內(nèi)部的變化。本發(fā)明的一個(gè)方面是本發(fā)明多特異性抗體對(duì)患病組織成像的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是本發(fā)明多特異性抗體的體外成像(例如facs分析)的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述患病組織是腫瘤并且靶蛋白是腫瘤相關(guān)抗原。另一個(gè)方面是用于制備本發(fā)明復(fù)合物的方法，所述方法包括步驟-提供本發(fā)明多特異性抗體，其中多特異性抗體與半抗原和靶蛋白特異性結(jié)合，-提供半抗原，所述半抗原由多特異性抗體特異性結(jié)合，其中半抗原與治療藥或診斷藥綴合，并且-使多特異性抗體與半抗原接觸，所述半抗原與治療藥或診斷藥綴合。本發(fā)明的另一個(gè)方面是本發(fā)明復(fù)合物作為藥物的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是本發(fā)明復(fù)合物用于診斷目的的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是本發(fā)明的復(fù)合物遞送治療藥或診斷藥至靶細(xì)胞或組織的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是本發(fā)明復(fù)合物用于定向癌療法的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是本發(fā)明復(fù)合物用于定向放療法的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是本發(fā)明復(fù)合物對(duì)細(xì)胞或組織成像的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含本發(fā)明復(fù)合物的組合物，所述復(fù)合物包含與半抗原和靶蛋白特異性結(jié)合的本發(fā)明多特異性抗體和與治療藥或診斷藥綴合的半抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物是診斷用組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物是藥物組合物。ii.重組方法通過重組方法制備多特異性抗體。因此，本發(fā)明還涉及一種用于制備本發(fā)明多特異性抗體的方法，所述方法包括步驟-用包含編碼多特異性抗體的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，-在允許合成所述多特異性抗體的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并且-從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物回收所述多特異性抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過親和色譜純化多特異性抗體的步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過親和色譜在κ輕鏈或λ輕鏈特異性柱上純化多特異性抗體的步驟。本發(fā)明的另一個(gè)目的是根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生多特異性抗體通過一種。本發(fā)明的另一個(gè)目的是編碼本發(fā)明多特異性抗體的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸是分離的核酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含本發(fā)明核酸的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含本發(fā)明核酸的表達(dá)載體，其中表達(dá)載體能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含本發(fā)明核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是hek293細(xì)胞或cho細(xì)胞。iii.藥物組合物本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含本發(fā)明多特異性抗體的藥物組合物。本發(fā)明的一個(gè)方面是包含與至少一種可藥用載體組合的本發(fā)明多特異性抗體的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含本發(fā)明抗體群體的組合物(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物)包含一種抗體，所述抗體包含了含有如本文具體說明的ch3結(jié)構(gòu)域的重鏈連同額外的c末端甘氨酸-賴氨酸二肽(g446和k447，根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含本發(fā)明抗體群體的組合物包含一種抗體，所述抗體包含了含有如本文具體說明的ch3結(jié)構(gòu)域的重鏈連同額外的c末端甘氨酸殘基(g446，根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種組合物包含抗體群體，所述抗體群體由下述抗體組成，包含了含有如本文具體說明的ch3結(jié)構(gòu)域的重鏈的抗體；包含了含有如本文具體說明的ch3結(jié)構(gòu)域的重鏈，連同額外的c末端甘氨酸殘基(g446，根據(jù)kabat的euindex編號(hào))的抗體；包含了含有如本文具體說明的ch3結(jié)構(gòu)域的重鏈、連同額外的c末端甘氨酸-賴氨酸二肽(g446和k447，根據(jù)kabat的euindex編號(hào))的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含本發(fā)明復(fù)合物的藥物組合物，所述的復(fù)合物包含與半抗原和靶蛋白特異性結(jié)合的本發(fā)明多特異性抗體和與治療藥或診斷藥綴合的半抗原。本發(fā)明的一個(gè)方面是包含本發(fā)明復(fù)合物的藥物組合物，所述復(fù)合物包含與至少一種可藥用載體組合的與半抗原和靶蛋白特異性結(jié)合的本發(fā)明多特異性抗體和與治療藥或診斷藥綴合的半抗原。本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的本發(fā)明多特異性抗體的免疫綴合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含免疫綴合物的藥物組合物，所述免疫綴合物包含與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的一個(gè)方面是藥物組合物，所述藥物組合物包含與至少一種可藥用載體組合的免疫綴合物，所述免疫綴合物包含與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是本發(fā)明多特異性抗體制造藥物組合物的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種用于制造包含本發(fā)明多特異性抗體的藥物組合物的方法，所述方法包括配制與至少一種可藥用載體組合的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用作藥物的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療癌癥的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療炎性疾病、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如，肌營養(yǎng)不良)、多發(fā)性硬化、慢性腎臟疾病、骨病(例如，多發(fā)性骨髓瘤中的骨變性)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎和/或血管損傷的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用作藥物的藥物組合物，所述藥物組合物包含與至少一種可藥用載體組合的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含與至少一種可藥用載體組合的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療炎性疾病、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如，肌營養(yǎng)不良)、多發(fā)性硬化、慢性腎臟疾病、骨病(例如，多發(fā)性骨髓瘤中的骨變性)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎和/或血管損傷的藥物組合物，所述藥物組合物包含與至少一種可藥用載體組合的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用作藥物的本發(fā)明復(fù)合物，所述復(fù)合物包含與半抗原和靶蛋白特異性結(jié)合的本發(fā)明多特異性抗體和與治療藥或診斷藥綴合的半抗原。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療癌癥的本發(fā)明復(fù)合物，所述復(fù)合物包含與半抗原和靶蛋白特異性結(jié)合的本發(fā)明多特異性抗體和與治療藥或診斷藥綴合的半抗原。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療炎性疾病、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如，肌營養(yǎng)不良)、多發(fā)性硬化、慢性腎臟疾病、骨病(例如，多發(fā)性骨髓瘤中的骨變性)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎和/或血管損傷的本發(fā)明復(fù)合物，所述復(fù)合物包含與半抗原和靶蛋白特異性結(jié)合的本發(fā)明多特異性抗體和與治療藥或診斷藥綴合的半抗原。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用作藥物的免疫綴合物，所述免疫綴合物包含與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療癌癥的免疫綴合物，所述免疫綴合物包含與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療炎性疾病、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如，肌營養(yǎng)不良)、多發(fā)性硬化、慢性腎臟疾病、骨病(例如，多發(fā)性骨髓瘤中的骨變性)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎和/或血管損傷的免疫綴合物，所述免疫綴合物包含與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的本發(fā)明多特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是本發(fā)明多特異性抗體制造藥物的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的是本發(fā)明多特異性抗體制造用于治療癌癥的藥物的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的是本發(fā)明多特異性抗體制造用于治療炎性疾病、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如，肌營養(yǎng)不良)、多發(fā)性硬化、慢性腎臟疾病、骨病(例如，多發(fā)性骨髓瘤中的骨變性)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎和/或血管損傷的藥物的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種通過以下方式治療患有疾病的患者的方法：施用本發(fā)明多特異性抗體至需要這類治療的患者。本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種通過以下方式治療患有癌癥的患者的方法：施用本發(fā)明多特異性抗體至需要這類治療的患者。本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種通過以下方式治療患有以下至少一種疾病的患者的方法：施用本發(fā)明多特異性抗體至需要這類治療的患者，所述疾病包括炎性疾病、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如，肌營養(yǎng)不良)、多發(fā)性硬化、慢性腎臟疾病、骨病(例如，多發(fā)性骨髓瘤中的骨變性)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎和/或血管損傷。3.本發(fā)明的具體實(shí)施方案下文中列出本發(fā)明的具體實(shí)施方案。1.多特異性抗體，包含至少三個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)由第一抗原結(jié)合部分和第二抗原結(jié)合部分形成，其中a)第三抗原結(jié)合位點(diǎn)由重鏈可變域(vh3)和輕鏈可變域(vl3)形成，其中-vh3結(jié)構(gòu)域的n末端與第一抗原結(jié)合部分借助第一肽接頭連接，并且-vl3結(jié)構(gòu)域的n末端與第二抗原結(jié)合部分借助第二肽接頭連接，b)多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化i)在ch3結(jié)構(gòu)域之一中通過用具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生突出部分，并且在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中通過用具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生空穴，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之一中產(chǎn)生的突出部分可布置在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生的空穴中；或?qū)h3結(jié)構(gòu)域之一中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶正電荷的氨基酸置換，并且將另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶負(fù)電荷的氨基酸置換；ii)在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成，或iii)i)和ii)的修飾；c)第三抗原結(jié)合位點(diǎn)的vh3結(jié)構(gòu)域的c末端與一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接，并且第三抗原結(jié)合位點(diǎn)的vl3結(jié)構(gòu)域的c末端與另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接，并且d)多特異性抗體缺少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2(ch2)。2.根據(jù)實(shí)施方案1的多特異性抗體，其中多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域通過以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：在ch3結(jié)構(gòu)域之一中通過用具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生突出部分，并且在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中通過用具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，產(chǎn)生空穴，從而在ch3結(jié)構(gòu)域之一中產(chǎn)生的突出部分可布置在另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生的空穴中。3.根據(jù)實(shí)施方案2的多特異性抗體，其中所述具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自r、f、y和w。4.根據(jù)實(shí)施方案2或3的多特異性抗體，其中所述具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自a、s、t和v。5.根據(jù)實(shí)施方案2至4中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w突變，并且另一條重鏈(包含“臼”的重鏈)的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a和407v突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。6.根據(jù)實(shí)施方案2至5中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366w和g407y突變，并且另一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域包含t366s、l368a和y407v突變(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。7.根據(jù)實(shí)施方案1的多特異性抗體，其中多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：將ch3結(jié)構(gòu)域之一中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶正電荷的氨基酸置換，并且將另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶負(fù)電荷的氨基酸置換。8.根據(jù)實(shí)施方案2至6中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：將ch3結(jié)構(gòu)域之一中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶正電荷的氨基酸置換，并且將另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)原始氨基酸殘基用帶負(fù)電荷的氨基酸置換。9.根據(jù)實(shí)施方案7或8的多特異性抗體，其中所述帶正電荷的氨基酸選自k、r和h。10.根據(jù)實(shí)施方案7至9中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中所述帶負(fù)電荷的氨基酸選自e或d。11.根據(jù)實(shí)施方案7至10中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中一條重鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中位置409(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸r由d置換并且位置370(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸k由e置換；并且另一條重鏈的ch3域中位置399(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸d由k置換并且位置357(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))處的氨基酸e由k置換。12.根據(jù)實(shí)施方案2的多特異性抗體，其中多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成。13.根據(jù)實(shí)施方案3至6中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成。14.根據(jù)實(shí)施方案7的多特異性抗體，其中多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成。15.根據(jù)實(shí)施方案8的多特異性抗體，其中多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成。16.根據(jù)實(shí)施方案9或10的多特異性抗體，其中多特異性抗體包含兩個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ch3)，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域經(jīng)以下方式改變以促進(jìn)異二聚化：在每個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中引入至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而二硫鍵在ch3結(jié)構(gòu)域之間形成。17.根據(jù)實(shí)施方案12至16中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中ch3結(jié)構(gòu)域受到由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的e356c或s354c突變和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變的二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。18.根據(jù)實(shí)施方案12至16中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中ch3結(jié)構(gòu)域由ch3結(jié)構(gòu)域之一中的s354c突變和另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域中的y349c突變受到二硫鍵穩(wěn)定化(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。19.根據(jù)實(shí)施方案1的多特異性抗體，其中通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵，第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh3位置44處，和vl3位置100處；-vh3位置105處，和vl3位置43處；或-vh3位置101處，和vl3位置100處。20.根據(jù)實(shí)施方案2的多特異性抗體，其中通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵，第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh3位置44處，和vl3位置100處；-vh3位置105處，和vl3位置43處；或-vh3位置101處，和vl3位置100處。21.根據(jù)實(shí)施方案7或8的多特異性抗體，其中通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵，第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh3位置44處，和vl3位置100處；-vh3位置105處，和vl3位置43處；或-vh3位置101處，和vl3位置100處。22.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵，第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh3位置44處，和vl3位置100處；-vh3位置105處，和vl3位置43處；或-vh3位置101處，和vl3位置100處。23.根據(jù)實(shí)施方案19至22中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中通過在vh3結(jié)構(gòu)域中位置44處和在vl3結(jié)構(gòu)域中位置100處引入半胱氨酸殘基，第三結(jié)合位點(diǎn)受到二硫鍵穩(wěn)定化。24.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中在第一肽和第二肽接頭之間未形成鏈間二硫鍵。25.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中第一肽接頭和第二肽接頭彼此相同。26.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中第一肽接頭和第二肽接頭是至少15個(gè)氨基酸的肽。27.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中第一肽接頭和第二肽接頭是15–70個(gè)氨基酸的肽。28.根據(jù)實(shí)施方案1至25中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中第一肽接頭和第二肽接頭是10–20個(gè)氨基酸的肽。29.根據(jù)實(shí)施方案1至27中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中第一肽接頭和第二肽接頭是55–70個(gè)氨基酸的肽。30.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中肽接頭是甘氨酸-絲氨酸接頭。31.根據(jù)實(shí)施方案30的多特異性抗體，其中甘氨酸-絲氨酸接頭是結(jié)構(gòu)(gxs)n或(gxs)ngm其中g(shù)＝甘氨酸，s＝絲氨酸，x＝3或4，n＝2，3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3。32.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中可變結(jié)構(gòu)域vh3和vl3不借助肽接頭與相應(yīng)的ch3結(jié)構(gòu)域直接連接。33.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多特異性抗體，其中vh3結(jié)構(gòu)域的c末端直接與ch3結(jié)構(gòu)域之一連接，并且vl3結(jié)構(gòu)域的c末端直接與另一個(gè)ch3結(jié)構(gòu)域連接，其中連接位點(diǎn)是缺少額外的接頭肽。34.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中通過置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，修飾ch3結(jié)構(gòu)域的n末端。35.根據(jù)實(shí)施方案34的多特異性抗體，其中置換位于ch3結(jié)構(gòu)域的341至350位置處的至少一個(gè)氨基酸殘基(根據(jù)kabat的euindex編號(hào))。36.根據(jù)實(shí)施方案34或35的多特異性抗體，其中ch3結(jié)構(gòu)域的n末端由根據(jù)seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4的氨基酸序列組成。37.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中通過置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，修飾vh3結(jié)構(gòu)域的c末端。38.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中通過置換至少一個(gè)原始氨基酸殘基，修飾vl3結(jié)構(gòu)域的c末端。39.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中ch3結(jié)構(gòu)域每者之一的n末端包含至少一個(gè)氨基酸突變，vh3結(jié)構(gòu)域的c末端包含至少一個(gè)氨基酸突變，并且vl3結(jié)構(gòu)域的c末端包含至少一個(gè)氨基酸突變。40.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中抗原結(jié)合部分是與抗原特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。41.根據(jù)實(shí)施方案40的多特異性抗體，其中抗原結(jié)合部分選自能夠與抗原特異性結(jié)合的抗體、受體、配體和darpin。42.根據(jù)實(shí)施方案40的多特異性抗體，其中抗原結(jié)合部分是抗體或抗體片段。43.根據(jù)實(shí)施方案42的多特異性抗體，其中第一和第二抗原結(jié)合部分至少之一是fab片段。44.根據(jù)實(shí)施方案42的多特異性抗體，其中第一和第二抗原結(jié)合部分是fab片段。45.根據(jù)實(shí)施方案44的多特異性抗體，其中第一和/或第二fab片段的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)棣释N型。46.根據(jù)實(shí)施方案44的多特異性抗體，其中第一和/或第二fab片段的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)棣送N型。47.根據(jù)實(shí)施方案44的多特異性抗體，其中第一fab片段的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)棣释N型并且第二fab片段的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)棣送N型。48.根據(jù)實(shí)施方案43或44的多特異性抗體，其中fab片段至少之一受到二硫鍵穩(wěn)定化。49.根據(jù)實(shí)施方案44的多特異性抗體，其中fab片段受到二硫鍵穩(wěn)定化。50.根據(jù)實(shí)施方案43或44的多特異性抗體，其中通過在以下位置引入半胱氨酸殘基以在相應(yīng)的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域之間(根據(jù)kabat編號(hào))形成二硫鍵，fab片段受到二硫鍵穩(wěn)定化：-vh位置44處，和vl位置100處；-vh位置105處，和vl位置43處；或-vh位置101處，和vl位置100處。51.根據(jù)實(shí)施方案48至50中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，其中通過將至少一個(gè)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基置換為另一個(gè)氨基酸殘基，消除相應(yīng)fab片段的多肽鏈之間的天然二硫鍵。52.根據(jù)實(shí)施方案43、44或48的多特異性抗體，其中fab片段至少之一是單鏈fab片段。53.根據(jù)實(shí)施方案43、44或48的多特異性抗體，其中通過結(jié)構(gòu)域互換改變fab片段至少之一，從而：a)僅ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域相互替換；b)僅vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域相互替換；或c)ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域相互替換并且vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域是相互替換，前提是，在通過結(jié)構(gòu)域互換改變第一fab片段和第二fab片段的情況下，通過不同的結(jié)構(gòu)域互換改變它們。54.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中抗體是三價(jià)的。55.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中抗體包含至少一個(gè)多表位結(jié)合位點(diǎn)。56.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中抗體是三價(jià)的。57.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中抗體包含各自與單一表位結(jié)合的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。58.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中抗體是雙特異性或三特異性的。59.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中抗體包含至少一個(gè)與半抗原特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。60.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中抗體包含僅一個(gè)與半抗原特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。61.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中抗體包含至少一個(gè)與靶蛋白特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。62.根據(jù)實(shí)施方案61的多特異性抗體，其中靶蛋白是細(xì)胞表面或胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原。63.根據(jù)前述實(shí)施方案任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中抗體包含至少一個(gè)與半抗原特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)與靶蛋白特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。64.復(fù)合物，包含(i)根據(jù)實(shí)施方案63的多特異性抗體，其中多特異性抗體與半抗原和靶蛋白特異性結(jié)合，和(ii)半抗原，其由多特異性抗體特異性結(jié)合，其中半抗原與治療藥或診斷藥綴合。65.根據(jù)實(shí)施方案64的復(fù)合物，其中半抗原選自地高辛配基、生物素、茶堿、熒光素、dota和dotam。66.根據(jù)實(shí)施方案64或65的復(fù)合物，其中靶蛋白是細(xì)胞表面抗原或胞內(nèi)抗原。67.根據(jù)實(shí)施方案66的復(fù)合物，其中靶蛋白是細(xì)胞表面或胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原。68.根據(jù)實(shí)施方案64至67中任一個(gè)實(shí)施方案的復(fù)合物，其中與半抗原偶聯(lián)的治療藥或診斷藥選自肽、蛋白質(zhì)、小分子、放射性標(biāo)記小分子、核酸和成像劑。69.用于制備根據(jù)實(shí)施方案1至63中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體的方法，所述方法包括步驟-用包含編碼多特異性抗體的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，-在允許合成所述多特異性抗體的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并且-從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物回收所述多特異性抗體。70.根據(jù)實(shí)施方案69的方法，還包括通過親和色譜在κ輕鏈或λ輕鏈特異性柱上純化多特異性抗體的步驟。71.多特異性抗體，通過根據(jù)實(shí)施方案69或70的方法產(chǎn)生。72.用于制備復(fù)合物的方法，所述方法包括步驟-提供根據(jù)實(shí)施方案63的多特異性抗體，其中多特異性抗體與半抗原和靶蛋白特異性結(jié)合，-提供半抗原，所述半抗原由多特異性抗體特異性結(jié)合，其中半抗原與治療藥或診斷藥綴合，并且-使多特異性抗體與半抗原接觸，所述半抗原與治療藥或診斷藥綴合。73.復(fù)合物，通過根據(jù)實(shí)施方案72的方法產(chǎn)生。74.核酸，編碼根據(jù)實(shí)施方案1至63中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體。75.表達(dá)載體，包含根據(jù)實(shí)施方案73的核酸。76.宿主細(xì)胞，包含根據(jù)實(shí)施方案74的核酸。77.宿主細(xì)胞，包含根據(jù)實(shí)施方案75的表達(dá)載體。78.組合物，包含根據(jù)實(shí)施方案1至63中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體。79.藥物或診斷的組合物，包含根據(jù)實(shí)施方案1至63中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體。80.藥物組合物，包含與至少一種可藥用載體組合的根據(jù)實(shí)施方案1至63中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體。81.組合物，包含根據(jù)實(shí)施方案64至68中任一個(gè)實(shí)施方案的復(fù)合物。82.藥物組合物或診斷組合物，包含根據(jù)實(shí)施方案64至68中任一個(gè)實(shí)施方案的復(fù)合物。83.藥物組合物，包含與至少一種可藥用載體組合的根據(jù)實(shí)施方案64至68中任一個(gè)實(shí)施方案的復(fù)合物。84.診斷組合物，包含根據(jù)實(shí)施方案64至68中任一個(gè)實(shí)施方案的復(fù)合物。85.免疫綴合物，包含與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的根據(jù)實(shí)施方案1至63中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體。86.根據(jù)實(shí)施方案85的免疫綴合物，其中多特異性抗體與細(xì)胞表面腫瘤相關(guān)抗原或胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原特異性結(jié)合。87.組合物，包含根據(jù)實(shí)施方案85或86的免疫綴合物。88.藥物組合物或診斷組合物，包含根據(jù)實(shí)施方案85或86的免疫綴合物。89.藥物組合物，包含與至少一種可藥用載體組合的根據(jù)實(shí)施方案85或86的免疫綴合物。90.藥物組合物，包含與至少一種可藥用載體組合的根據(jù)實(shí)施方案62的多特異性抗體、或根據(jù)實(shí)施方案64至68中任一個(gè)實(shí)施方案的復(fù)合物、或根據(jù)實(shí)施方案86的免疫綴合物。91.根據(jù)實(shí)施方案1至63中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體，用作藥物。92.根據(jù)實(shí)施方案62的多特異性抗體，用作藥物。93.根據(jù)實(shí)施方案62的多特異性抗體，用于治療癌癥。94.根據(jù)實(shí)施方案64至68中任一個(gè)實(shí)施方案的復(fù)合物，用作藥物。95.根據(jù)實(shí)施方案64至68中任一個(gè)實(shí)施方案的復(fù)合物，用于治療癌癥。96.根據(jù)實(shí)施方案85或86的免疫綴合物，用作藥物。97.根據(jù)實(shí)施方案86的免疫綴合物，用作藥物。98.根據(jù)實(shí)施方案85或86的免疫綴合物，用于治療癌癥。99.根據(jù)實(shí)施方案1至63中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體用于診斷目的用途。100.根據(jù)實(shí)施方案99用于成像的用途。101.通過施用根據(jù)實(shí)施方案1至63中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體至需要這類治療的患者，治療患有疾病的患者的方法。102.通過施用根據(jù)實(shí)施方案62或63中任一個(gè)實(shí)施方案的多特異性抗體至需要這類治療的患者，治療患有疾病的患者的方法。103.根據(jù)實(shí)施方案102的方法，其中疾病是癌癥。104.通過施用根據(jù)實(shí)施方案64至68中任一個(gè)實(shí)施方案的復(fù)合物至需要這類治療的患者，治療患有疾病的患者的方法。105.根據(jù)實(shí)施方案104的方法，其中疾病是癌癥。106.通過施用根據(jù)實(shí)施方案85或86的免疫綴合物至需要這類治療的患者，治療患有疾病的患者的方法。107.通過施用根據(jù)實(shí)施方案86的免疫綴合物至需要這類治療的患者，治療患有疾病的患者的方法。108.根據(jù)實(shí)施方案106或107的方法，其中疾病是癌癥。109.根據(jù)實(shí)施方案101、104和106中任一個(gè)實(shí)施方案的方法，其中疾病選自炎性疾病、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病、多發(fā)性硬化、慢性腎臟疾病、骨病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎和/或血管損傷。氨基酸序列的描述實(shí)施例提供以下實(shí)施例以輔助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實(shí)范圍在所附權(quán)利要求書中闡述?？梢岳斫?，可以對(duì)所述方法作出修改而不脫離本發(fā)明的精神。實(shí)施例1：生產(chǎn)和表達(dá)與地高辛配基(dig)和細(xì)胞表面抗原lewis-y(ley)、cd33和磷脂酰基醇蛋白聚糖3(gpc3)之一特異性結(jié)合的本發(fā)明的三價(jià)雙特異性抗體包含三個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體按igg樣結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，所述igg樣結(jié)構(gòu)由作為第一和第二結(jié)合部分的兩個(gè)規(guī)范fab臂組成，所述fab臂借助柔性甘氨酸-絲氨酸肽接頭融合于大約fab大小的第三結(jié)合模塊。這個(gè)第三結(jié)合模塊替換全長抗體的原始iggfc區(qū)域并且由融合于第一ch3結(jié)構(gòu)域的重鏈可變域vh3和融合于第二ch3結(jié)構(gòu)域的輕鏈可變域vl3組成(圖2a)。圖2a和圖2b中顯示雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)(圖示在第三結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)部存在或不存在額外二硫鍵的抗體)。第三結(jié)合模塊的氨基酸序列、尤其ch3結(jié)構(gòu)域與vh3或vl3的融合位點(diǎn)的氨基酸序列以如此方式設(shè)計(jì)，從而在igg樣總體結(jié)構(gòu)上沒有應(yīng)變或空間障礙，并且保留igg樣特性。fab片段借助設(shè)計(jì)成替換全長igg的原始鉸鏈區(qū)的肽接頭與第三結(jié)合模塊融合(圖4)。肽接頭不含鏈間二硫鍵，這促進(jìn)第三結(jié)合位點(diǎn)接近抗原。然而，鉸鏈區(qū)二硫鍵丟失還使抗體衍生物去穩(wěn)定化，因?yàn)樗滈g共價(jià)連接。為了補(bǔ)償鉸鏈區(qū)二硫鍵丟失并且為了再贏得穩(wěn)定性，采用促進(jìn)第三結(jié)合模塊的結(jié)構(gòu)域異二聚化的異二聚化策略(參見圖2a)。這個(gè)實(shí)施例中生成的雙特異性抗體分子包含二硫鍵穩(wěn)定化的具有“杵”修飾(突出部分)或“臼”修飾(空穴)的ch3-結(jié)構(gòu)域(圖2a和圖2b)。在這個(gè)實(shí)施例內(nèi)部，提供了在vh3結(jié)構(gòu)域和vl3結(jié)構(gòu)域中具有或沒有二硫鍵穩(wěn)定作用的抗體(參見表2)。通過經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生根據(jù)表1的雙特異性抗體并且在hek293懸浮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)之。簡而言之，通過共轉(zhuǎn)染編碼所需抗體的輕鏈的表達(dá)載體與編碼兩條相應(yīng)“重鏈”的表達(dá)載體，產(chǎn)生抗體(即分別具有結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)vh-ch1-接頭-vh3-ch3和vh-ch1-接頭-vl3-ch3的多肽)。表達(dá)盒、質(zhì)粒特性和瞬時(shí)表達(dá)條件與metz等人proteinengineeringdesignandselection09/2012；25(10):571-8中和wo2012025525a1中所述相同，所述兩份文件通過引用的方式納入本文。在37℃增濕8％co2環(huán)境下培養(yǎng)的hek293懸浮細(xì)胞中通過cmv啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)抗體的多肽組分。轉(zhuǎn)染后7天，無菌過濾含有分泌型雙特異性抗體的培養(yǎng)上清液。表1：所示雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)雙特異性抗體包括表2中所示的特征。全部構(gòu)建體均包含κ同種型的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。此外，在全部構(gòu)建體中，在融合于vh3的ch3結(jié)構(gòu)域中引入“杵”置換并且在融合于vl3的ch3結(jié)構(gòu)域中引入“臼”置換。但是具有相同效果的情況下，可以將“杵”引入融合于vl3的ch3結(jié)構(gòu)域并且可以將“臼”引入融合于vh3的ch3結(jié)構(gòu)域。表2：所示雙特異性抗體的特征表3中顯示受檢雙特異性抗體的多肽鏈的氨基酸序列。表3：所示雙特異性抗體的多肽鏈的氨基酸序列實(shí)施例2：純化和表征本發(fā)明的三價(jià)雙特異性抗體借助hitrapkappaselect柱(gehealthcare)，通過親和色譜從上清液純化上述實(shí)施例1中表達(dá)的雙特異性抗體，由于缺少ch2結(jié)構(gòu)域，雙特異性抗體不與蛋白a結(jié)合。在第二純化步驟中，如先前對(duì)igg衍生的雙特異性抗體所描述(s.metz等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.108(2011)8194–8199)，通過在aektaavant(gehealthcare)上采用經(jīng)20mmhistidin，140mmnacl，ph6.0平衡的大小排阻色譜(sec,superdex200hiload26/60,gehealthcare)，獲得均勻的雙特異性抗體。圖6中顯示了如表1中所示的具有不同特異性的雙特異性抗體的這些純化步驟的示例性結(jié)果。圖6中還顯示了展示所生成多特異性抗體的同一性和純度的sdspage分析。雙特異性抗體可以通過所述的產(chǎn)生和純化方法產(chǎn)生，產(chǎn)率在3-20mg/l之間，如表4中詳細(xì)顯示。表4:所示雙特異性抗體的產(chǎn)率實(shí)施例3：設(shè)計(jì)促進(jìn)異二聚化的復(fù)雜二硫鍵樣式在實(shí)施例1中生成的雙特異性抗體內(nèi)部，第三結(jié)合模塊的異二聚化受四種不同的相互作用促進(jìn)：(i)vh3和vl3之間的相互作用，(ii)vh3/vl3界面中的二硫鍵穩(wěn)定作用，(iii)ch3/ch3界面中的二硫鍵穩(wěn)定作用；和(iv)ch3/ch3界面中的杵入臼修飾(這可以備選地由已知支持ch3結(jié)構(gòu)域相互作用的其他可比性異二聚化策略(例如在ch3/ch3界面內(nèi)部引入帶相反電荷的氨基酸)替換)。籍此，促進(jìn)異二聚體的形成而非同型二聚體形成。由于vh3/vl3以及ch3/ch3界面的二硫鍵穩(wěn)定作用要求引入緊鄰的額外二硫鍵，因而需要在生產(chǎn)過程期間避免導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的和無功能的分子的錯(cuò)配二硫鍵形成(圖5a)。如熟知，野生型全長igg在其每個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)部擁有一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵以及鏈間二硫鍵以借助抗體的鉸鏈區(qū)連接重鏈。鉸鏈區(qū)半胱氨酸不干擾各個(gè)抗體結(jié)構(gòu)域的折疊并且在域內(nèi)二硫鍵形成方面不相互作用。但是，在vh3/vl3界面內(nèi)部以及在ch3/ch3界面中包含二硫鍵穩(wěn)定作用的本發(fā)明抗體內(nèi)部，引入了額外的未配對(duì)半胱氨酸，為了確保正確的折疊，所述的半胱氨酸必須不與形成鏈內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸配對(duì)，反而必須形成獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域間鍵。在本發(fā)明的抗體之內(nèi)，可變結(jié)構(gòu)域與其相應(yīng)的ch3結(jié)構(gòu)域直接連接(即在不包含肽接頭的情況下，通過可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸與ch3結(jié)構(gòu)域的氨基酸之間形成肽鍵)。預(yù)計(jì)半胱氨酸殘基(包括天然和額外引入的半胱氨酸殘基)的這種序列組成和緊鄰狀態(tài)將大程度地有利于形成錯(cuò)配的二硫鍵(圖5a)。因此，在可變結(jié)構(gòu)域(vh3和vl3)和其相應(yīng)ch3結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生融合位點(diǎn)(圖5b、圖5c)，這允許正確的二硫鍵形成并且避免二硫鍵錯(cuò)誤配對(duì)。在第三結(jié)合模塊的每條多肽鏈中，對(duì)額外的二硫鍵穩(wěn)定作用必需的半胱氨酸殘基與鏈內(nèi)二硫鍵形成所要求的半胱氨酸殘基緊鄰，然而令人驚訝地不干擾鏈內(nèi)二硫鍵并且與另一條多肽鏈中正確的相應(yīng)半胱氨酸殘基配對(duì)。圖5b和圖5c描述了允許蛋白質(zhì)正確折疊的在第三結(jié)合模塊中包含這種復(fù)雜半胱氨酸樣式的融合位點(diǎn)。在可變結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域之間設(shè)計(jì)融合位點(diǎn)的另一個(gè)目的是密切模擬天然轉(zhuǎn)換位點(diǎn)(transitionsite)，所述天然轉(zhuǎn)換位點(diǎn)存在于原始親本抗體中(i)vh結(jié)構(gòu)域和ch1結(jié)構(gòu)域之間以及對(duì)融合位點(diǎn)的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域而言，存在于vh3和ch3之間；和(ii)vl結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域之間以及對(duì)融合位點(diǎn)的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域而言，存在于vl3和ch3之間。因此，在可變結(jié)構(gòu)域的c末端和ch3結(jié)構(gòu)域的n末端的不同氨基酸殘基可以由另一個(gè)氨基酸殘基置換，以提供與可變區(qū)和恒定區(qū)之間天然轉(zhuǎn)換位點(diǎn)具有迥異同源性的三級(jí)結(jié)構(gòu)的融合位點(diǎn)。圖5b中顯示了ch3結(jié)構(gòu)域的n末端的示例性備選氨基酸序列。實(shí)施例4：本發(fā)明的三價(jià)雙特異性抗體的結(jié)合研究如使用dig-cy5作為解決(address)半抗原結(jié)合的有效負(fù)載，在表達(dá)ley的mcf7細(xì)胞、表達(dá)cd33的molm13細(xì)胞和表達(dá)gpc3的hepg2細(xì)胞上通過facs分析法分析實(shí)施例1中生成的抗體的抗原同時(shí)結(jié)合作用。圖7中顯示結(jié)果。對(duì)第三結(jié)合模塊中具有dig特異性結(jié)合位點(diǎn)和在fab片段內(nèi)部具有相應(yīng)細(xì)胞表面標(biāo)記物特異的抗原結(jié)合位點(diǎn)的全部雙特異性抗體觀察到同時(shí)的半抗原結(jié)合作用和細(xì)胞表面結(jié)合作用。還對(duì)fab片段中具有dig特異性結(jié)合位點(diǎn)和在第三結(jié)合模塊中具有相應(yīng)細(xì)胞表面標(biāo)記物特異的抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體觀察到同時(shí)的半抗原結(jié)合作用和細(xì)胞表面結(jié)合作用。數(shù)據(jù)顯示，第三結(jié)合位點(diǎn)可容易地接近小抗原，例如半抗原(如地高辛配基)。第三結(jié)合位點(diǎn)還可供結(jié)合較大的抗原，如蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞表面蛋白。對(duì)于這些抗原，結(jié)合效力可能取決于表位可及性和潛在的空間位阻。如所示，細(xì)胞表面抗原cd33、gpc3或ley是本發(fā)明抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)可及的。歸因于這些特征，本發(fā)明的抗體可以用于同時(shí)對(duì)付或交聯(lián)兩種靶，例如用于成像，或用于定向遞送有效負(fù)載。實(shí)施例5：本發(fā)明的三價(jià)雙特異性抗體用于定向遞送有效負(fù)載實(shí)施例1和2中提供的本發(fā)明抗體(bsabley-dig(ss)-ley)與作為毒性有效負(fù)載的地高辛配基化截短型假單胞菌外毒素(pe)衍生物復(fù)合。圖9中顯示這種復(fù)合物的示意圖。為了評(píng)估包含本發(fā)明抗體的復(fù)合物是否能夠靶向癌細(xì)胞，因而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，使表達(dá)ley的mcf7乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞在體外與復(fù)合體接觸。根據(jù)制造商的說明，通過商業(yè)brdu測(cè)定法(cellproliferationelisa,brdu(化學(xué)發(fā)光)，目錄號(hào)11669915001,roche)評(píng)估細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)作用。平行分析以下對(duì)照：-十字孢堿(陽性對(duì)照)，-無添加物(僅培養(yǎng)基，陰性對(duì)照)-游離pe，-游離的地高辛配基化pe(pe-dig)，-不與pe-dig復(fù)合的游離抗體bsabley-dig(ss)-ley，-游離抗體bsabgpc3-dig(ss)-gpc3(不與mcf7乳腺癌細(xì)胞結(jié)合)，-bsabcd33-dig(ss)-cd33(實(shí)施例1和2中提供)與地高辛配基化pe的復(fù)合物(陰性對(duì)照，旨在評(píng)估包含本發(fā)明抗體和毒素的復(fù)合物的非特異性活性，因?yàn)閏d33不與mcf7乳腺癌細(xì)胞結(jié)合；在圖7中顯示)。平行分析以下對(duì)比實(shí)施例：由于本領(lǐng)域已知與地高辛配基和靶抗原特異性結(jié)合的雙特異性抗體與地高辛配基偶聯(lián)的小分子的復(fù)合物(wo2011/1003557a1中公開，結(jié)構(gòu)域架構(gòu)如圖17a中所示)，使用這種抗體復(fù)合物作為對(duì)比實(shí)施例。簡言之，雙特異性抗體由與ley特異性結(jié)合的全長抗體連同與融合于每條重鏈c末端的dig特異性結(jié)合的fv片段組成(稱作“bsabley-dig(2+2)”)。這種抗體的可變結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明的bsabley-dig(ss)-ley抗體相同。結(jié)果(圖10)顯示，僅本發(fā)明的bsabley-dig(ss)-ley抗體和地高辛配基化pe的復(fù)合物能夠在低納摩爾濃度有效地靶向mcf7乳腺癌細(xì)胞，從而顯示對(duì)癌細(xì)胞的特異性靶向作用。相反，對(duì)mcf7乳腺癌細(xì)胞上不存在的cd33抗原尋址的復(fù)合體幾乎不顯示任何毒性。此外，無導(dǎo)引載具的毒素或無毒性有效負(fù)載的對(duì)照抗體不顯示明顯的活性。實(shí)施例6：生產(chǎn)和分析與生物素(bio)和細(xì)胞表面抗原lewis-y(ley)、cd33和磷脂酰基醇蛋白聚糖3(gpc3)之一特異性結(jié)合的本發(fā)明的三價(jià)雙特異性抗體如對(duì)實(shí)施例1的抗體所述那樣設(shè)計(jì)包含三個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)具有與生物素和ley、或者生物素和cd33或者生物素和gpc3特異性結(jié)合的相同結(jié)構(gòu)域架構(gòu)。圖2a和圖2b中顯示雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)，表明使用fab片段作為第一和第二抗原結(jié)合位點(diǎn)。表5：所示雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)雙特異性抗體包括表5和表6中所示的特征。全部構(gòu)建體均包含κ同種型的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。此外，在全部構(gòu)建體中，在融合于vh3的ch3結(jié)構(gòu)域中引入“杵”置換并且在融合于vl3的ch3結(jié)構(gòu)域中引入“臼”置換。表6：所示雙特異性抗體的特征表7中顯示受檢雙特異性抗體的多肽鏈的氨基酸序列。表7：所示雙特異性抗體的多肽鏈的氨基酸序列將三種抗體如實(shí)施例1和2中所述那樣在hek293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)并且純化。表8：所示雙特異性抗體的產(chǎn)率分子名稱產(chǎn)率[mg/l]bsabley-bio(ss)-ley3.8bsabcd33-bio(ss)-cd338.3bsabgpc3-bio(ss)-gpc33.8為了檢驗(yàn)bsabley-bio(ss)-ley的抗原同時(shí)結(jié)合作用，使用生物素?；痗y5作為有效負(fù)載，在表達(dá)ley的mcf7細(xì)胞上通過facs分析法分析抗體。圖8中顯示facs分析的結(jié)果。對(duì)bsabley-bio(ss)-ley抗體觀察到與生物素和mcf7細(xì)胞表面的同時(shí)結(jié)合作用。作為對(duì)照，平行實(shí)驗(yàn)bsabcd33-bio(ss)-cd33與作為有效負(fù)載的生物素?；痗y5的復(fù)合物，從而顯示該復(fù)合物與癌細(xì)胞無非特異性結(jié)合作用。結(jié)果是本發(fā)明抗體的第三結(jié)合位點(diǎn)容易地可用于半抗原結(jié)合，尤其用于結(jié)合生物素和生物素偶聯(lián)的有效負(fù)載。實(shí)施例7：本發(fā)明的三價(jià)雙特異性抗體用于定向遞送有效負(fù)載使用如實(shí)施例5中所述的相同方法，評(píng)估實(shí)施例6中制備的本發(fā)明抗體在定向遞送有效負(fù)載中的適用性。為此目的，使抗體與作為毒性有效負(fù)載的生物素?；囟绦图賳伟舛舅?pe)衍生物復(fù)合。圖9中顯示這種復(fù)合物的示意圖。為了評(píng)估bsabley-bio(ss)-ley與生物素?；痯c的復(fù)合物是否能夠靶向癌細(xì)胞，因而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，使表達(dá)ley的mcf7乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞在體外與復(fù)合體接觸。根據(jù)制造商的說明，通過商業(yè)brdu測(cè)定法(cellproliferationelisa,brdu(化學(xué)發(fā)光)，目錄號(hào)11669915001,roche)評(píng)估細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)作用。平行分析以下對(duì)照：-十字孢堿(陽性對(duì)照)，-無添加物(僅培養(yǎng)基，陰性對(duì)照)-游離的生物素?；痯e(pe-bio)，-bsabcd33-bio(ss)-cd33(實(shí)施例1和2中提供)與生物素?；痯e的復(fù)合物(陰性對(duì)照，旨在評(píng)估包含本發(fā)明抗體和毒素的復(fù)合物的非特異性活性，因?yàn)閏d33不與mcf7乳腺癌細(xì)胞結(jié)合；在圖7中顯示)。結(jié)果(圖11)顯示，僅本發(fā)明的bsabley-bio(ss)-ley抗體和生物素?；痯e的復(fù)合物能夠在低納摩爾濃度有效地靶向mcf7乳腺癌細(xì)胞，從而顯示對(duì)癌細(xì)胞的特異性靶向作用。相反，對(duì)mcf7乳腺癌細(xì)胞上不存在的cd33抗原尋址的復(fù)合體幾乎不顯示任何毒性。此外，無導(dǎo)引載具的毒素或無毒性有效負(fù)載的對(duì)照抗體不顯示明顯的活性。實(shí)施例8：生產(chǎn)與細(xì)胞表面抗原lewis-y(ley)、cd33和gpc3之一組合的與生物素(bio)或地高辛配基(dig)特異性結(jié)合的本發(fā)明的三價(jià)雙特異性抗體如對(duì)實(shí)施例1的抗體所述那樣設(shè)計(jì)包含與細(xì)胞表面抗原lewis-y(ley)、cd33和gpc3之一組合的三個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)具有與生物素(bio)或地高辛配基(dig)特異性結(jié)合的相同結(jié)構(gòu)域架構(gòu)。圖2a和圖2b中顯示雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)，表明使用fab片段作為第一和第二抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙特異性抗體包括表9和表10中所示的特征。全部構(gòu)建體均包含κ同種型的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。此外，在全部構(gòu)建體中，在融合于vh3的ch3結(jié)構(gòu)域中引入“杵”置換并且在融合于vl3的ch3結(jié)構(gòu)域中引入“臼”置換。表9：所示雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)表10:所示雙特異性抗體的特征表11中顯示受檢雙特異性抗體的多肽鏈的氨基酸序列。表11：所示雙特異性抗體的多肽鏈的氨基酸序列如實(shí)施例1和2中所述那樣表達(dá)并且純化抗體。當(dāng)前第1頁12