本發(fā)明涉及一種圍繞發(fā)光鑭系核具有取代的4-(苯乙炔基)吡啶發(fā)色團(tuán)的氮雜大環(huán)鑭系螯合物設(shè)計(jì)。帶有鑭系離子的發(fā)色團(tuán)具有高摩爾吸光系數(shù)和高發(fā)光值。本發(fā)明還涉及制備螯合物的配體、連接到生物特異性反應(yīng)物的螯合物及其在各種測(cè)定法中的用途。
背景技術(shù)：
：wo2013/011236公開(kāi)了具有連接到三氮雜大環(huán)核的三個(gè)4-(苯乙炔基)吡啶發(fā)色基團(tuán)的發(fā)光鑭系螯合物。苯環(huán)對(duì)位處的4-(苯乙炔基)吡啶發(fā)色基團(tuán)被供電子基團(tuán)取代?？茖W(xué)文獻(xiàn)(tetrahedronletters,55,2014,1357-1361(《四面體通訊》，第55卷，2014年，第1357-1361頁(yè))確認(rèn)在wo2013/011236中所公開(kāi)的類(lèi)型的三氮雜大環(huán)配體具有相對(duì)較差的水溶性。通過(guò)將peg基團(tuán)附接到供電子對(duì)位取代基來(lái)改善水溶性的嘗試只取得有限的成功。wo2013/092992公開(kāi)了具有連接到無(wú)環(huán)核的三個(gè)4-(苯乙炔基)吡啶發(fā)色基團(tuán)的發(fā)光鑭系螯合物。在一些實(shí)施例中，一個(gè)發(fā)色基團(tuán)包含反應(yīng)性基團(tuán)，另外兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)包含處于鄰位和/或?qū)ξ坏膬蓚€(gè)或三個(gè)–och2co2h基團(tuán)。wo2014/147288公開(kāi)了用作標(biāo)記試劑的基于三氮雜環(huán)壬烷的鑭系螯合物復(fù)合物。所公開(kāi)的螯合物具有三個(gè)4-(苯乙炔基)吡啶發(fā)色基團(tuán)，其中一個(gè)發(fā)色基團(tuán)包含反應(yīng)性基團(tuán)；另外兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)具有(i)處于苯環(huán)間位和對(duì)位的兩個(gè)羧基(-co2h)取代基，或(ii)處于苯環(huán)間位的兩個(gè)–och2co2h基團(tuán)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一方面涉及一種由式(i)表示的發(fā)光鑭系螯合物或者其鹽或溶劑化物：其中a、b和c獨(dú)立地選自0和1；并且ln3+選自eu3+、tb3+、dy3+和sm3+；并且chrom1、chrom2和chrom3由式(ii)表示：其中che為獨(dú)立地選自–co2h、-po3h2、-po(oh)r2、-ch2po3h2和–conr3r4的螯合基團(tuán)，r2選自苯基、芐基、甲基、乙基、丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基，r3和r4獨(dú)立地選自氫和-l1-z1，其中l(wèi)1為直接鍵或間隔基團(tuán)，z1為使得螯合物連接到生物特異性反應(yīng)物的反應(yīng)性基團(tuán)；并且d為1、2、3、4或5；r1為獨(dú)立地選自下列任一基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)取代基：(i)氫，(ii)選自–x-r5的供電子增溶基團(tuán)，其中x為氧原子、硫原子或–n(r6)co-，r6為氫或-c1-6烷基，并且r5選自氫、-c1-6烷基、-(ch2)1-6oh、-(ch2)1-6oc1-6烷基、-(ch2)1-6co2h、-(ch2)1-6conr7r8、-(ch2)1-6so3h、-(ch2)1-6nh2、-(ch2)1-6n(ch3)2、-(ch2)1-6n(ch3)2+-(ch2)1-6so3-和聚乙二醇，其中r7和r8各自獨(dú)立地選自氫、c1-6烷基、-(ch2)1-6oh、-ch(ch2oh)2和-ch(ch2oh)3，(iii)選自c1-6烷基、-(ch2)1-6oh、-(ch2)1-6och3、-(ch2)1-6sch3的基團(tuán)，(iv)–l2-z2，其中l(wèi)2為直接鍵或間隔基團(tuán)，并且z2為使得螯合劑連接到待標(biāo)記分子上的反應(yīng)性基團(tuán)，其中基團(tuán)chrom1、chrom2和chrom3中的至少一者具有相對(duì)于乙炔基團(tuán)處于對(duì)位和鄰位的兩個(gè)或更多個(gè)選自基團(tuán)(ii)的r1取代基；并且前提條件是由式(i)表示的螯合物具有不超過(guò)一個(gè)選自z1和z2的反應(yīng)性基團(tuán)。本發(fā)明的第二方面涉及一種可檢測(cè)的分子，其包括綴合至根據(jù)本發(fā)明第一方面的發(fā)光鑭系螯合物的生物特異性結(jié)合劑。本發(fā)明的第三方面涉及用于制備本發(fā)明第一方面的螯合物的鑭系螯合配體。本發(fā)明的第四方面涉及一種執(zhí)行生物特異性結(jié)合測(cè)定法的方法，所述方法包括下列步驟：a)在被分析物與用根據(jù)本發(fā)明第一方面的發(fā)光鑭系螯合物標(biāo)記的生物特異性結(jié)合反應(yīng)物之間形成生物復(fù)合物；b)用具有激發(fā)波長(zhǎng)的輻射激發(fā)所述生物復(fù)合物，從而形成激發(fā)的生物復(fù)合物；以及c)檢測(cè)由所述激發(fā)的生物復(fù)合物發(fā)出的發(fā)射輻射。本發(fā)明的第五方面涉及根據(jù)本發(fā)明第二方面的可檢測(cè)分子在基于特異性生物親和力的結(jié)合測(cè)定法中的用途，該結(jié)合測(cè)定法利用特異性發(fā)光的特異性發(fā)光分辨熒光測(cè)定的時(shí)間分辨熒光測(cè)定。本發(fā)明的第六方面涉及一種與根據(jù)本發(fā)明第一方面的發(fā)光鑭系螯合物或根據(jù)本發(fā)明第三方面的鑭系螯合配體綴合的固體載體材料。本發(fā)明的鑭系螯合物和可檢測(cè)分子有利地具有高水溶性。具有高水溶性的可檢測(cè)分子可用于例如受益于高濃度可檢測(cè)分子的生物測(cè)定法中。更高濃度的可檢測(cè)分子使得更靈敏的測(cè)定法成為可能，并且所需分析培養(yǎng)基的體積減小。還有利的是因?yàn)榭蓹z測(cè)分子在需要分析的水性樣品(例如，血液血漿、唾液、其他體液及它們的制劑)中具有高溶解度。本發(fā)明的鑭系螯合物和可檢測(cè)分子有利地具有高發(fā)光產(chǎn)額即亮度(εφ)，尤其是在干燥時(shí)。用受權(quán)利要求書(shū)保護(hù)的螯合物(參見(jiàn)實(shí)例18和19)標(biāo)記的抗體的示例在干燥時(shí)具有高達(dá)69500m-1cm-1的極高發(fā)光產(chǎn)額。這一高發(fā)光值使得非常靈敏的測(cè)定法成為可能，因?yàn)檫@種明亮的生物分子-可檢測(cè)分子綴合物很容易被檢測(cè)到。與相同可檢測(cè)分子的水溶液相比，干燥可檢測(cè)分子的發(fā)光值令人驚訝地提高了80-100倍，這使得技術(shù)人員僅通過(guò)增加干燥步驟就能顯著提高測(cè)定法的靈敏度。受權(quán)利要求書(shū)保護(hù)的本發(fā)明的配體與鑭系離子形成十分穩(wěn)定的復(fù)合物。因此，受權(quán)利要求書(shū)保護(hù)的發(fā)光鑭系螯合物和可檢測(cè)分子具有有利的高穩(wěn)定性。所謂“高穩(wěn)定性”意指復(fù)合的鑭系離子脫離配體或與替代離子交換的趨勢(shì)降低。高穩(wěn)定性是有利的，因?yàn)榕潴w中鑭系離子的丟失會(huì)導(dǎo)致可檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度減弱，并因此導(dǎo)致本發(fā)明的測(cè)定法的實(shí)用性降低。在存在高濃度替代金屬離子和/或其他螯合物的條件下使用螯合物或可檢測(cè)分子時(shí)，高穩(wěn)定性是特別有用的。例如，當(dāng)在免疫測(cè)定法或dna雜交測(cè)定法中使用兩種或更多種不同的探針時(shí)，高穩(wěn)定性使得本發(fā)明的螯合物能夠與其他標(biāo)記的螯合物一起使用。高穩(wěn)定性是有利的，因?yàn)槭軝?quán)利要求書(shū)保護(hù)的螯合物和可檢測(cè)分子可以在需要高溫的條件(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)試驗(yàn))下使用，尤其在倍增循環(huán)期間。此外，本發(fā)明的螯合物和可檢測(cè)分子在另外金屬離子的存在下和/或在高溫下可經(jīng)受長(zhǎng)時(shí)間溫育。具體實(shí)施方式本發(fā)明的目的是提供手段來(lái)獲得改進(jìn)的鑭系螯合物標(biāo)記物以用于基于特異性生物親和力的結(jié)合測(cè)定法中，諸如免疫測(cè)定法(均相免疫測(cè)定法和非均相免疫測(cè)定法)、核酸雜交測(cè)定法、受體結(jié)合測(cè)定法、酶測(cè)定法、免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定法、免疫組織化學(xué)測(cè)定法以及利用基于單光子或雙光子激發(fā)的特異性發(fā)光的熒光測(cè)定或時(shí)間分辨熒光測(cè)定的基于細(xì)胞的測(cè)定法。本發(fā)明的螯合物提供了獲得改進(jìn)的基于生物親和力的結(jié)合測(cè)定法(甚至是在大于340nm的波長(zhǎng)下)的手段。本發(fā)明提供了新型配體、螯合物和可檢測(cè)分子，在其他離子和螯合物的存在下，它們具有例如改善的溶解度、改善的分析靈敏度、改善的高溫穩(wěn)定性以及改善的穩(wěn)定性。發(fā)光鑭系螯合物本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種由式(i)表示的發(fā)光鑭系螯合物或者其鹽：在本發(fā)明的三氮雜大環(huán)中，單元a、b和c獨(dú)立地選自0和1。在一個(gè)實(shí)施例中，a＝b＝c＝0。ln3+為選自銪(iii)(eu3+)、鋱(iii)(tb3+)、鏑(iii)(dy3+)和釤(iii)(sm3+)的三價(jià)鑭系離子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，ln3+為eu3+。本發(fā)明的螯合物具有三個(gè)由式(ii)表示的發(fā)色基團(tuán)，即chrom1、chrom2和chrom3?；鶊F(tuán)che為獨(dú)立地選自–co2h、-po3h2、-po(oh)r2、-ch2po3h2和–conr3r4如–conh2的螯合基團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，基團(tuán)che為–co2h。在其中che是可電離的(例如其中che＝co2h)實(shí)施例中，che基團(tuán)可以電離(例如，–co2-)或非電離(co2h)形式存在?；鶊F(tuán)r2選自苯基、芐基、甲基、乙基、丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。r3和r4獨(dú)立地選自氫和-l1-z1，其中l(wèi)1為直接鍵或間隔基團(tuán)，并且z1為使得螯合物連接到分子生物特異性反應(yīng)物的反應(yīng)性基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施例中，基團(tuán)r3和r4均為氫。發(fā)色基團(tuán)chrom1、chrom2和chrom3的苯環(huán)各自被1、2、3、4或5個(gè)r1基團(tuán)取代。所述1、2、3、4或5個(gè)r1基團(tuán)各自單獨(dú)地選自下述任一基團(tuán)：(i)氫，(ii)選自–x-r5的供電子增溶基團(tuán)，其中x為氧原子、硫原子或–n(r6)co-，r6為氫或c1-6烷基(例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)，并且r5選自氫、-c1-6烷基(例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)、-(ch2)1-6oh(例如，–ch2oh或-(ch2)2oh)、-(ch2)1-6oc1-6烷基(例如，-(ch2)och3或-(ch2)2och3)、-(ch2)1-6co2h(例如，–ch2co2h或-(ch2)2co2h)、-(ch2)1-6conr7r8(例如，–ch2conh2)、-(ch2)1-6so3h、-(ch2)1-6nh2、-(ch2)1-6n(ch3)2、-(ch2)1-6n(ch3)2+-(ch2)1-6so3-以及聚乙二醇(例如，-(ch2ch2o)1-4och2ch2oh或-(ch2ch2o)1-4och2ch2och3)；其中r7和r8各自獨(dú)立地選自氫、c1-6烷基(例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)、-(ch2)1-6oh(例如，–ch2oh或-(ch2)2oh)、-ch(ch2oh)2以及-ch(ch2oh)3，在一個(gè)實(shí)施例中，選自–x-r5的供電子增溶基團(tuán)，其中x為氧原子或–n(r6)co-，r6為氫或c1-6烷基，并且r5選自氫、-(ch2)1-6oh、-(ch2)1-6co2h、-(ch2)1-6conr7r8和-(ch2)1-6so3h，其中r7和r8各自獨(dú)立地選自氫、c1-6烷基-oh、-ch(ch2oh)2以及ch(ch2oh)3，(iii)選自c1-6烷基(例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)、-(ch2)1-6oh(例如，–ch2oh或-(ch2)2oh)、-(ch2)1-6och3(例如，-(ch2)och3或-(ch2)2och3)、或者-(ch2)1-6sch3的基團(tuán)，在一個(gè)實(shí)施例中，選自c1-6烷基(如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)、-(ch2)1-6oh(例如，–ch2oh或–(ch2)2oh)的基團(tuán)；(iv)–l2-z2，其中l(wèi)2為直接鍵或間隔基團(tuán)，并且z2為使得螯合劑連接到生物特異性反應(yīng)物上的反應(yīng)性基團(tuán)?；鶊F(tuán)chrom1、chrom2和chrom3中的至少一者(即，一者、兩者或所有三者)具有相對(duì)于乙炔基團(tuán)處于對(duì)位和鄰位的兩個(gè)或更多個(gè)選自基團(tuán)(ii)的r1取代基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，基團(tuán)chrom1、chrom2和chrom3中的兩者具有相對(duì)于乙炔基團(tuán)處于對(duì)位和鄰位的兩個(gè)或三個(gè)選自基團(tuán)(ii)的r1取代基，并且第三發(fā)色基團(tuán)被–l2-z2取代。在一個(gè)實(shí)施例中，x為氧原子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，x為氧原子，并且r5為-(ch2)1-6co2h(例如，–ch2co2h)、-(ch2)1-6so3h或-(ch2)1-6n(ch3)2+-(ch2)1-6-so3-。在一個(gè)實(shí)施例中，發(fā)色基團(tuán)chrom1、chrom2和chrom3中的一者或兩者獨(dú)立地選自由式(iia)、(iib)或(iic)表示的發(fā)色基團(tuán)，其中基團(tuán)r1a、r1aa、r1aaa、r1b、r1bb、r1c和r1cc各自獨(dú)立地選自如上文所定義的r1基團(tuán)(ii)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，基團(tuán)r1a、r1aa、r1aaa、r1b、r1bb、r1c和r1cc為–och2co2h。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，由式(i)表示的螯合劑僅具有一個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，che基團(tuán)不包含反應(yīng)性基團(tuán)。相反，反應(yīng)性基團(tuán)z2經(jīng)由l2連接到選自chrom1、chrom2和chrom3的發(fā)色基團(tuán)的苯環(huán)上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，發(fā)色基團(tuán)chrom1、chrom2和chrom3中的兩者選自如上文所定義的式(iia)、(iib)或(iic)，并且第三發(fā)色基團(tuán)選自(iid)、(iie)或(iif)：其中r1a、r1aa、r1aaa、r1b、r1bb、r1c和r1cc各自獨(dú)立地選自如上文所定義的r1基團(tuán)(ii)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，l2為直接鍵，并且z2為異硫氰酸酯基(-ncs)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，包含反應(yīng)性基團(tuán)的發(fā)色基團(tuán)具有式(iig)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)c1-6烷基包括但不限于下面的烷基：甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。如本文所用，當(dāng)用于描述6元環(huán)(例如，苯基)的取代模式時(shí)，術(shù)語(yǔ)“鄰位”和“對(duì)位”意指分別在2位和4位上取代。例如，在鄰位和對(duì)位上被三個(gè)取代基取代的苯環(huán)為2,4,6取代苯環(huán)。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)本發(fā)明的配體和螯合物包含可電離基團(tuán)(如羧酸鹽、硫酸鹽等)時(shí)，該螯合物可以電離(例如，–co2-)或非電離(例如，–co2h)形式存在，并且如果以電離形式存在，則其可包括陽(yáng)離子作為反離子，例如na+、k+、ca2+等。本發(fā)明的螯合物和配體包含任選地通過(guò)間隔基(l1或l2)連接到配體或螯合物的反應(yīng)性基團(tuán)(z1或z2)。在所述實(shí)例中，反應(yīng)性基團(tuán)促進(jìn)標(biāo)記生物特異性結(jié)合反應(yīng)物，或促進(jìn)形成與固體載體材料的共價(jià)鍵。在螯合物具有聚合基團(tuán)作為反應(yīng)性基團(tuán)的情況下，那么此螯合物可在制備顆粒的同時(shí)被引入到固體載體(例如，顆粒)中。如果存在，則所述反應(yīng)性基團(tuán)通常選自疊氮基(-n3)、炔基(-c＝ch)、烯基(-ch＝ch2)、氨基(-nh2)、氨基氧基(-o-nh2)、羧基(-co2h)、醛基(-cho)、巰基(-sh)、馬來(lái)酰亞胺基、活化的馬來(lái)酰亞胺基衍生物、異氰酸酯基(-nco)、異硫氰酸酯基(-ncs)、重氮基(-n+n)、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、反應(yīng)性酯、吡啶基-2-二硫基和6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基，特別地，所述反應(yīng)性基團(tuán)包含異硫氰酸酯基(-ncs)。6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基中的取代基可選自氫、鹵素、烷氧基、芳氧基、氨基、具有一至六個(gè)碳原子的烷基、取代的氨基或硫醚，并且優(yōu)選選自氯、氟、乙氧基、2-甲氧基乙氧基、2-氰基乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基、硫代苯氧基或乙氧羰基硫代甲氧基。取代的氨基或硫醚優(yōu)選為單取代的或二取代的，每個(gè)取代基優(yōu)選獨(dú)立地選自c1-6烷基、c1-6烷基-o-、苯基、羰基或羧基。因此，在與生物特異性結(jié)合反應(yīng)物發(fā)生反應(yīng)時(shí)，所述反應(yīng)性基團(tuán)與所述生物特異性結(jié)合反應(yīng)物建立例如下列類(lèi)型之一的連接：硫脲(-nh-c(＝s)-nh-)、甘氨酰胺(-nh-co-ch2-nh-)、酰胺(-nh-co-、co-nh-、-nch3-co-和–co-nch3-)、肟(-o-n＝ch-)、腙(-co-nh-nh＝ch-)以及脂族硫醚(s)、二硫化物(-s-s-)、6-取代的-1,3,5-三嗪-2,4-二胺、(其中n＝1-6)以及三唑(例如，通過(guò)所謂的“點(diǎn)擊”化學(xué)形成)。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)存在反應(yīng)性基團(tuán)(例如z1或z2)時(shí)，所述基團(tuán)可包含間隔基(例如l1或l2)，即形成間距的雙基，以便(如果必要或所需)使反應(yīng)性基團(tuán)定位在能對(duì)生物特異性結(jié)合反應(yīng)物可及而進(jìn)行反應(yīng)的位置。所述間隔基可以很容易地在合成配體或螯合物的過(guò)程中被引入。術(shù)語(yǔ)“間隔基”旨在意指在例如共軛基團(tuán)或芯結(jié)構(gòu)的吡啶部分與例如反應(yīng)性基團(tuán)之間的間隔基團(tuán)。間隔基通常在附接點(diǎn)與反應(yīng)性基團(tuán)之間具有1-20個(gè)鍵(例如，3-15個(gè)鍵或5-12個(gè)鍵)的長(zhǎng)度。所述間隔基由一至五個(gè)部分形成，每個(gè)部分選自亞苯基、含1-10個(gè)碳原子的烯基、乙炔二基(-c＝c-)、醚(-o-)、硫醚(-s-)、二硫化物(-s-s-)、酰胺(-c(＝o)-nh-、-nh-c(＝o)-、-c(＝o)-nch3-和–nch3-c(＝o)-)、硫脲(-nh-c(＝s)-nh-)以及三唑。具體實(shí)施例在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的螯合物具有式(iiia)，其中r1aa為氫或-och2co2-：在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的螯合物具有式(iiib)鑭系螯合配體本發(fā)明的另一方面涉及一種由式(iv)表示的鑭系螯合配體，其中a、b、c、chrom1、chrom2和chrom3如針對(duì)式(i)所定義?？蓹z測(cè)的分子本發(fā)明的又另一方面涉及一種可檢測(cè)的分子，其包括綴合至如上文所定義的發(fā)光鑭系螯合物的生物特異性結(jié)合反應(yīng)物。綴合通常通過(guò)所述螯合物的反應(yīng)性基團(tuán)實(shí)現(xiàn)。生物特異性結(jié)合反應(yīng)物應(yīng)當(dāng)能夠特異性結(jié)合目標(biāo)被分析物，以便對(duì)樣品中的所述被分析物進(jìn)行定量或定性分析。生物特異性結(jié)合反應(yīng)物的例子是選自下列物質(zhì)的那些：抗體、抗原、受體配體、特異性結(jié)合蛋白、dna探針、rna探針、寡肽、寡核苷酸、經(jīng)修飾的寡核苷酸(例如，經(jīng)lna修飾的寡核苷酸)、經(jīng)修飾的多核苷酸(例如，經(jīng)lna修飾的多核苷酸)、蛋白質(zhì)、低聚糖、多糖、磷脂、pna、類(lèi)固醇、半抗原、藥物、受體結(jié)合配體和凝集素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述生物特異性結(jié)合反應(yīng)物選自抗體，例如肌鈣蛋白i抗體(抗-tni)。執(zhí)行生物特異性結(jié)合測(cè)定法的方法本發(fā)明的仍另外的方面涉及一種執(zhí)行生物特異性結(jié)合測(cè)定法的方法，其中該方法包括下列步驟：a)在被分析物與用如本文所定義的鑭系螯合物標(biāo)記的生物特異性結(jié)合反應(yīng)物之間形成生物復(fù)合物；b)用具有激發(fā)波長(zhǎng)的輻射激發(fā)所述生物復(fù)合物，從而形成激發(fā)的生物復(fù)合物；以及c)檢測(cè)由所述激發(fā)的生物復(fù)合物發(fā)出的發(fā)射輻射。在步驟b)中，激發(fā)波長(zhǎng)優(yōu)選為300nm或更長(zhǎng)，例如大約320-360nm。所述方法遵循常規(guī)分析步驟，如對(duì)于技術(shù)人員而言將顯而易見(jiàn)的。因此，本發(fā)明的另一方面涉及如上文所定義的可檢測(cè)分子在基于特異性生物親和力的結(jié)合測(cè)定法中的用途，該測(cè)定法利用基于單光子或雙光子激發(fā)的特異性發(fā)光的時(shí)間分辨熒光測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施例中，基于特異性生物親和力的結(jié)合測(cè)定法是非均相免疫測(cè)定法、均相免疫測(cè)定法、dna雜交測(cè)定法、受體結(jié)合測(cè)定法、免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定法或免疫組織化學(xué)測(cè)定法。在可供選擇的實(shí)施例中，步驟a)、b)和c)中的一個(gè)或多個(gè)在高溫諸如高于40℃、高于50℃、高于60℃、高于70℃、高于80℃、高于90℃或高于100℃下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例步驟中，步驟a)(即，形成生物復(fù)合物)在如上文所定義的高溫下進(jìn)行。在可供選擇的實(shí)施例中，執(zhí)行生物特異性結(jié)合測(cè)定法的方法包括干燥生物復(fù)合物的額外步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述干燥步驟在步驟a)之后且步驟b)之前進(jìn)行。固體載體本發(fā)明的又另一方面涉及一種與如上文所定義的發(fā)光鑭系螯合物綴合的固體載體材料。發(fā)光鑭系螯合物通常以共價(jià)或非共價(jià)方式固定到固體載體材料上。在一些受關(guān)注的實(shí)施例中，所述固體載體材料選自納米顆粒、微粒、玻片、板和固相合成樹(shù)脂。新型鑭系螯合物配體和對(duì)應(yīng)的發(fā)光鑭系螯合物以及標(biāo)記的生物特異性結(jié)合反應(yīng)物基于環(huán)狀配體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使螯合的鑭系離子實(shí)現(xiàn)令人驚訝的高效激發(fā)。同時(shí)，可保持發(fā)光鑭系螯合物和標(biāo)記的生物特異性結(jié)合反應(yīng)物的所有重要特征，而不會(huì)有任何額外的聚集體形成和純化問(wèn)題。本發(fā)明的螯合物旨在將若干重要特征結(jié)合在單個(gè)標(biāo)記物中，諸如：(a)約350nm處的寬激發(fā)波長(zhǎng)(參見(jiàn)實(shí)例部分)使得能夠使用uvled作為激發(fā)源，這會(huì)降低儀器制造成本，并為儀器小型化提供可能性。(b)所述螯合物適用于不同的鑭系元素。(c)配體的高發(fā)光值意味著可能在不損失信號(hào)的情況下降低標(biāo)記程度。(d)更低的標(biāo)記程度可改善生物分子的親和力并降低分析過(guò)程中的非特異性結(jié)合。因此，更快的動(dòng)力學(xué)是可能的，并且觀察到更低背景，這也可改善分析靈敏度。(e)通過(guò)改善的水溶性減少發(fā)色團(tuán)部分的不期望的吸收特性，尤其是對(duì)于具有若干芳族發(fā)色團(tuán)部分的螯合物。這應(yīng)當(dāng)降低標(biāo)記抗體的非特異性結(jié)合并提供改善的分析靈敏度。(f)改善的螯合物穩(wěn)定性意味著可以采用更苛刻的分析條件，諸如高溫、長(zhǎng)時(shí)間溫育和高濃度的其他金屬離子。實(shí)驗(yàn)部分實(shí)例以下非限制性實(shí)例旨在進(jìn)一步展示本發(fā)明。所采用的結(jié)構(gòu)和合成路線(xiàn)示于方案1-5中。使用brukeravancedrx500mhz記錄1h-nmr譜圖。使用四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)參照物。使用α-氰基-4-肉桂酸基質(zhì)，采用perseptivebiosystemsvoyagerde-promaldi-tof儀器記錄質(zhì)譜。在pharmaciaultrospec3300pro上記錄紫外可見(jiàn)光譜。使用perkin-elmerwallacvictor平板熒光計(jì)測(cè)定熒光效率。通過(guò)icp-ms儀器perkinelmer6100drcplus以定量模式測(cè)量eu螯合物和標(biāo)記抗體中的eu含量。在variancaryeclipse熒光光度計(jì)上記錄激發(fā)光譜、發(fā)射光譜和衰減時(shí)間。運(yùn)行hplc純化的條件：反相hplc(rp-18色譜柱)溶劑為a：三乙基乙酸銨緩沖液(20mm，ph7)和b：50％乙腈的三乙基乙酸銨緩沖液(20mm，ph7)。以5％溶劑b開(kāi)始梯度洗脫，在30分鐘內(nèi)溶劑b的量線(xiàn)性增加到100％。使用填充有硅膠60(默克公司(merck))的色譜柱進(jìn)行柱層析。fc＝快速色譜法，rt＝室溫。實(shí)例1化合物3的合成用氬氣為化合物1(0.34g，1.60mmol；wo2011026790)和2(0.47g，2.15mmol；takalo,h.,etal.,helv.chim.acta,79(1996)789(takalo,h.等人，《瑞士化學(xué)學(xué)報(bào)》，1996年，第79卷，第789頁(yè)))在無(wú)水tea(5ml)和thf(10ml)中的混合物脫氣。在加入二(三苯基膦)二氯化鈀(ii)(19mg，27μmol)和cui(10mg，53μmol)之后，在55℃下攪拌該混合物24小時(shí)。蒸發(fā)至干，然后通過(guò)fc(硅膠，10％etoh/dcm/1％tea)純化所得產(chǎn)物(0.49g，94％)。1h-nmr(cdcl3)：8.49(1h,s),8.08(1h,s),7.66(2h,d,j＝8.7hz),7.60(1h,s,),7.59(2h,d,j＝8.7hz),4.85(2h,s),4.49(2h,q,j＝7.1hz),1.43(3h,t,j＝7.1hz)。13c-nmr(cdcl3)：164.55,160.42,155.24,154.94,154.64,154.34,147.42,136.24,133.10,132.99,125.58,125.27,120.30,119.36,118.94,116.65,114.35,112.06,94.24,87.57,64.30,62.10,14.18。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+h+)為393.18；實(shí)測(cè)值為394.16。實(shí)例2化合物4的合成將化合物3(0.47g，1.20mmol)和pbr3(0.17ml，1.80mmol)在無(wú)水chcl3(40ml)中的混合物在+55℃下攪拌18h，然后用5％nahco3溶液(20ml)中和，之后用chcl3(2×10ml)萃取水相并用na2so4干燥合并的有機(jī)相。所得產(chǎn)物(0.43g，78％)經(jīng)fc(硅膠，10％etoh/dcm)純化。1h-nmr(cdcl3)：8.25(1h,s),8.01(1h,d,j＝1.1hz),7.75(1h,d,j＝1.1hz)；7.68(2h,d,j＝8.7hz),7.65(2h,d,j＝8.7hz)；4.62(2h,s),4.50(2h,q,j＝7.1hz),1.45(3h,t,j＝7.1hz)。13c-nmr(cdcl3)：164.32,157.68,155.16,154.85,154.55,154.25,148.06,136.21,133.59,133.06,128.36,126.09,120.26,119.32,118.92,116.62,114.32,112.03,94.61,86.29,62.25,32.62,14.20。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+h+)為455.02和457.02；實(shí)測(cè)值為455.78和457.73。實(shí)例3化合物6的合成將化合物4(0.41g，0.90mmol)、5(0.14g，0.82mmol)、無(wú)水k2co3(0.23g，1.62mmol)和無(wú)水mecn(8ml)的混合物在rt下攪拌24h。過(guò)濾并用dcm洗滌固體材料之后，將濾液蒸干。所得產(chǎn)物(0.31g，53％)經(jīng)fc(硅膠，1％至3％etoh/dcm)純化。1h-nmr(d6-dmso)：11.48(1h,s),7.97(1h,s),7.78-7.85(3h,m),7.66(2h,d,j＝8.3hz),4.38(2h,q,j＝7.1hz)；3.80-3.85(2h,m),3.10-3.45(8h,m),2.65-2.75(2h,m),2.65-2.55(2h,m),1.43(3h,s),1.42(3h,s),1.40(6h,s),1.39(6h,s),1.34(3h,t,j＝7.1hz)。13c-nmr(d6-dmso)：164.09,155.78,154.96,154.80,154.70,154.56,154.37,154.08,147.22,137.51,132.74,132,54,129.33,127.03,124.69,120.85,118.97,116.69,114.39,112.62,93.89,86.35,78.71,61.44,61.29,51.42,50.18,49,69,28.03,14.02。兩種譜圖均表明，存在具有不同結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的剛性化合物。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+h+)為704.33；實(shí)測(cè)值為705.09。實(shí)例4化合物7的合成將化合物6(0.29g，0.41mmol)和tfa(2ml)的混合物在rt下攪拌2h，蒸干并與et2o(40ml)一起研磨。將所得產(chǎn)物(0.34g，89％)離心，用et2o(2×15ml)洗滌并干燥。1hnmr(d6-dmso)：11.54(1h,s),7.82(2h,d,j＝8.4hz),7.81(1h,s),7.80(1h,s),7.71(2h,d,j＝8.4hz),4.44(2h,q,j＝7.0hz),4.17(2h,s),3.69(4h,bs),3,26(4h,bs),2.97(4h,bs),1.39(3h,t,j＝7.0hz)。13cnmr(d6-dmso)：154.41,160.60,155.48,155.18,154.89,154.59,147.17,138.30,133.24,133.06,129.87,128.40,125.22,121.41,118,57,116.19,114.84,112.54,95.54,86.36,62.47,57.68,50.42,45.90,45.36,14,45。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+2h+)為505.54；實(shí)測(cè)值為505.31。實(shí)例5化合物10的合成采用類(lèi)似于實(shí)例1所述的合成方法，由化合物8(wo2013026790)和2合成化合物10。收率：76％。1h-nmr(cdcl3)：8.11(1h,d,j＝0.5hz),7.64(1h,d,j＝0.5hz),6.09(2h,s),4.84(2h,s),4.70(4h,s),4.58(2h,s),4.47(2h,q,j＝7.1hz),4.29(4h,q,j＝7.1hz),4.28(2h,q,j＝7.1hz),3.45(1h,bs),1.44(3h,t,j＝7.1hz),1.32(3h,t,j＝7.1hz),1.31(6h,t,j＝7.1hz)。13c-nmr(cdcl3)：167.97,167.89,164.70,161.04,160.22,158.87,147.21,134.13,125.42,125.17,96.17,94.27,93.80,87.78,66.21,65.42,64.29,61.86,61.61,61.49,14.20,14.08,14.06。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+h+)為588.56；實(shí)測(cè)值為589.03。實(shí)例6化合物11的合成采用類(lèi)似于實(shí)例1所述的合成方法，由化合物9(wo2013092992)和2合成化合物11。收率：80％。1h-nmr(cdcl3)：8.08(2h,s),7.60(2h,s),7.45(1h,dj＝8.5hz),6.50(1h,dd,j＝2.0and8.5hz),6.45(1h,d,j＝2.0hz),4.85(2h,s),4.71(2h,s),4.63(2h,s),4.47(2h,q,j＝7.1hz),4.30(2h,q,j＝7.1hz),4.29(2h,q,j＝7.1hz),1.44(3h,t,j＝7.1hz),1.32(3h,t,j＝7.1hz),1.31(3h,t,j＝7.1hz)。13c-nmr(cdcl3)：168.11,168.00,164.63,161.71,160.08,159.95,147.27,134.81,127.02,125.50,106.42,105.38,100.99,91.30,89.67,65.91,65.34,64.32,62.24,61.93,61.54,14.20,14.19,14.07。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+h+)為486.18；實(shí)測(cè)值為486.46。實(shí)例7化合物12的合成將化合物10(0.36g，0.61mmol)和pbr3(86μl，0.92mmol)在無(wú)水chcl3(20ml)中的混合物在rt下攪拌2.5h，然后用5％nahco3溶液(20ml)中和，之后用chcl3(20ml)萃取水相并用na2so4干燥合并的有機(jī)相。所得產(chǎn)物(0.33g，82％)經(jīng)fc(硅膠，10％etoh/dcm)純化。1h-nmr(cdcl3)：8.12(1h,d,j＝1.3hz),7.79(1h,d,j＝1.3hz),6.08(2h,s),4.71(4h,s),4.59(2h,s),4.51(2h,s),4.48(2h,q,j＝7.1hz),4.30(4h,q,j＝7.1hz),4.29(2h,q,j＝7.1hz),1.43(3h,t,j＝7.1hz),1.31(9h,t,j＝7.1hz)。13c-nmr(cdcl3)：167.92,167.79,164.52,156.29,133.27,125.98,125.08,96.09,93.92,93.76,88.21,66.22,65.59,65.43,62.04,61.62,61.51,32.96,14.22,14.07,14.03。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+h+)為650.13和652.13；實(shí)測(cè)值為651.08和653.02。實(shí)例8化合物13的合成采用類(lèi)似于實(shí)例7所述的合成方法，由化合物11合成化合物13。收率：89％。1h-nmr(cdcl3)：8.10(1h,d,j＝1.2hz),7.75(1h,d,j＝1.2hz),7.46(1h,d,j＝8.5hz),6.50(1h,dd,j＝2.3和8.5hz),6.46(1h,d,j＝2.3hz),4.72(2h,s),4.63(2h,s),4.60(2h,s),4.49(2h,q,j＝7.1hz),4.30(2h,q,j＝7.1hz),4.29(2h,q,j＝7.1hz),1.45(3h,t,j＝7.1hz),1.32(3h,t,j＝7.1hz),1.31(3h,t,j＝7.1hz)。13c-nmr(cdcl3)：168.10,167.97,164.43,160.05,160.03,157.41,147.95,134.88,127.65,126.00,106.42,105.28,100.97,91.97,89.34,65.92,65.35,62.40,62.09,61.54,61.49,32.88,14.22,14.09,14.97。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+h+)為548.09和550.09；實(shí)測(cè)值為548.83和550.80。實(shí)例9化合物14的合成將化合物7(0.12g，0.15mmol)、12(0.21g，0.32g)、dipea(0.4ml)和無(wú)水mecn(3ml)的混合物在rt下攪拌5.5h，并蒸干。所得產(chǎn)物(0.19g，79％)經(jīng)fc(硅膠，首先10％etoh/dcm至15％etoh/dcm，然后15％etoh/dcm/5％tea)純化。由于產(chǎn)物包含2-3個(gè)剛性異構(gòu)體，nmr譜圖過(guò)于復(fù)雜而難以指定異構(gòu)體。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+h+)為1642.60；實(shí)測(cè)值為1643.57。實(shí)例10化合物15的合成采用類(lèi)似于實(shí)例9所述的合成方法，由化合物13合成化合物15。所得產(chǎn)物經(jīng)fc(硅膠，從2％etoh/dcm/1％tea)純化。收率：84％。由于產(chǎn)物包含2-3個(gè)剛性異構(gòu)體，nmr譜圖過(guò)于復(fù)雜而難以指定異構(gòu)體。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+h+)為1438.54；實(shí)測(cè)值為1439.41。實(shí)例11化合物16的合成將化合物14(92mg，64μmol)和0.5mkoh在etoh(6.5ml)中的混合物在rt下攪拌1h，并加入h2o(3ml)。在rt下攪拌4小時(shí)之后，蒸發(fā)掉etoh，加入一些h2o(2ml)，并將殘余物在rt下攪拌24h。在加入以h2o(0.25ml)為溶劑的檸檬酸(41mg，0.21mmol)之后，用6mhcl調(diào)節(jié)ph至約6.5。在10分鐘內(nèi)加入以h2o(0.25ml)為溶劑的三氯化銪(iii)(26mg，71μmol)，并用1mnaoh調(diào)節(jié)ph至約9.5。將該混合物在95℃下攪拌4-6周(在分析型hplc色譜圖顯示出完整的復(fù)合物之后)，用1mhcl調(diào)節(jié)ph至約7.0，蒸干，接著溶解在20mmolteaa緩沖液(1ml)中并通過(guò)半制備型hplc純化。rf(hplc)＝16.0min。uv＝360nm。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+6h+)為1443.23；實(shí)測(cè)值為1443.96。在eu(iii)負(fù)載期間hplc中示出的配體異構(gòu)體：1)rf(hplc)＝18.5min，uv＝345nm；2)rf(hplc)＝20.4min，uv＝347nm；3)rf(hplc)＝21.7min，uv＝347nm。所有這些峰最終在rf＝16.0min和uv＝360nm下得到產(chǎn)物峰。eu復(fù)合物的形成導(dǎo)致觀察到紫外吸收出現(xiàn)13-15nm的紅移。這分別通過(guò)對(duì)配體異構(gòu)體進(jìn)行額外的hplc純化并將eu(iii)離子負(fù)載到各個(gè)異構(gòu)體進(jìn)一步確認(rèn)。所有這些負(fù)載最終在rf(hplc)＝16.0min處得到相同產(chǎn)物。在此應(yīng)注意，有關(guān)類(lèi)似大環(huán)配體的文獻(xiàn)、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)中所公開(kāi)的一般eu負(fù)載方法未得到期望的螯合物，只得到非復(fù)合配體。在進(jìn)行大量的試驗(yàn)之后確定，eu負(fù)載需要高ph(>9)、約80-90℃的高溫和長(zhǎng)達(dá)約兩周的溫育時(shí)間。難以負(fù)載eu表明，螯合物一旦形成，便具有高螯合穩(wěn)定性。實(shí)例12化合物17的合成采用類(lèi)似于實(shí)例11所述的合成方法，由化合物15合成化合物17。rf(hplc)＝19.2min。uv＝350nm。malditof-ms質(zhì)量：計(jì)算值(m+4h+)為1295.23；實(shí)測(cè)值為1295.85。在eu(iii)負(fù)載期間hplc中示出的配體異構(gòu)體：1)rf(hplc)＝21.7min，uv＝347nm；2)rf(hplc)＝22.3min，uv＝339nm；3)rf(hplc)＝23.6min，uv＝343nm。實(shí)例13化合物18的合成在5min內(nèi)將以h2o(1ml)為溶劑的化合物16(43mg，21μmol)加入cscl2(22μl，0.29mmol)、nahco3(28mg，0.33mmol)和chcl3(1ml)的混合物中。在rt下攪拌40min之后，用chcl3(3×1ml)洗滌水相。用丙酮使所得產(chǎn)物沉淀，然后離心，并用丙酮洗滌。實(shí)例14化合物19的合成采用類(lèi)似于實(shí)例13所述的合成方法，由化合物17合成化合物19。實(shí)例15化合物20的合成將化合物18(2mg)和?；撬?2mg)在50mmna2co3緩沖液(300μl，ph9.8)中的混合物在rt下攪拌過(guò)夜。使用半制備型hplc純化所得產(chǎn)物。rf(hplc)＝15.2min。uv＝354nm。使產(chǎn)物級(jí)分蒸發(fā)之后，將殘余物溶于50mmtris緩沖液(1ml)中。通過(guò)icp-ms測(cè)量eu濃度。分析參數(shù)為：跳峰模式，20次掃描/讀數(shù)，重復(fù)7次，駐留時(shí)間和積分時(shí)間分別為50ms和1000ms。使用銠作為內(nèi)標(biāo)物，經(jīng)測(cè)量銪質(zhì)量為152.929。使用從ultrascientific公司商購(gòu)獲得的混標(biāo)ims–101，icp-ms校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品1進(jìn)行校準(zhǔn)。使用消解方法即購(gòu)自安東帕公司(antonpaar)的微波消解系統(tǒng)，微波樣品預(yù)處理系統(tǒng)multiwave3000進(jìn)行icp-ms的樣品預(yù)處理。在suprapur酸、hno3(5ml)和h2o2(1ml)的混合物中，通過(guò)微波消解50mmtris緩沖液中的eu螯合物。然后用去離子水(100ml)稀釋該樣品。實(shí)例16化合物21的合成采用類(lèi)似于實(shí)例15所述的合成方法，由化合物19合成化合物21。rf(hplc)＝17.2min。uv＝348nm。使產(chǎn)物級(jí)分蒸發(fā)之后，將殘余物溶于50mmtris緩沖液(1ml)中。采用類(lèi)似于實(shí)例15中的方法，通過(guò)ipc-ms測(cè)量eu濃度。實(shí)例17用標(biāo)記試劑18和19標(biāo)記抗體使用過(guò)量300倍的標(biāo)記試劑18或19，按照vonlodep.etal.,anal.chem.,2003,75,3193-3201(vonlodep.等人，《分析化學(xué)》，2003年，第75卷，第3193-3201頁(yè))中所述進(jìn)行tni抗體的標(biāo)記。在rt下反應(yīng)過(guò)夜。通過(guò)使用含疊氮鈉的tris緩沖液鹽水(tris50mm，nacl0.9％，ph7.75)作為洗脫液，在superdex200hr10/30凝膠過(guò)濾柱(通用醫(yī)療公司(gehealthcare))上使標(biāo)記抗體與過(guò)量螯合物分離。收集包含抗體的級(jí)分，通過(guò)紫外光度計(jì)測(cè)量eu濃度，并按照實(shí)例15中所述通過(guò)ipc-ms確認(rèn)。實(shí)例18肌鈣蛋白i免疫測(cè)定法采用心肌肌鈣蛋白i的夾心免疫測(cè)定法測(cè)試用螯合物18或19標(biāo)記的tni抗體。使用α-gal-9-deu(vonlodep.etal.,anal.chem.,2003,75,3193-3201(vonlodep.等人，《分析化學(xué)》，2003年，第75卷，第3193-3201頁(yè)))標(biāo)記的tni抗體作為參照化合物。用移液管移取10μl稀釋的示蹤物抗體(5ng/μl)和20μltni標(biāo)準(zhǔn)溶液到預(yù)涂覆測(cè)定孔(96孔板中的單個(gè)孔，用鏈霉親和素和抗tni的生物素?；东@抗體涂覆孔，innotracdiagnostics公司)中。在攪拌條件下，將反應(yīng)混合物在36℃下溫育20min。將這些孔洗滌6次，并在用victortm平板熒光計(jì)測(cè)量之前進(jìn)行干燥。根據(jù)vonlodep.etal.,anal.chem.,2003,75,3193-3201(vonlodep.等人，《分析化學(xué)》，2003年，第75卷，第3193-3201頁(yè))中所述制備常規(guī)9-齒α-半乳糖eu螯合物(表1中的參照物)。結(jié)果匯總于表1中。a和b標(biāo)準(zhǔn)品均重復(fù)測(cè)定12次，其他標(biāo)準(zhǔn)品c-f重復(fù)測(cè)定6次。表1實(shí)例19綴合至牛磺酸的新型螯合物(螯合物20和21)和用螯合物18和19標(biāo)記的ctni抗體的光物理特性。新型螯合物(20和21)以及用螯合物18和19標(biāo)記的ctni抗體在50mmtris緩沖液(ph7.75)中所測(cè)得的光物理特性激發(fā)波長(zhǎng)(λ激發(fā))、發(fā)光衰減時(shí)間(τ)、摩爾吸光系數(shù)(ε)、估計(jì)的發(fā)光產(chǎn)額(εφ)示于表2中。干燥測(cè)量過(guò)程(18(干燥)和19(干燥))表示在完成如實(shí)例18所述的干燥免疫測(cè)定法之后基于信號(hào)測(cè)量值的估計(jì)發(fā)光產(chǎn)額。表2化合物λ激發(fā)/nmτ/msε/m-1cm-1εφ/m-1cm-1203450.4877000700213410.588900060018a)3480.42104000100018a)(干燥)6950019a)3460.519900050019a)(干燥)40200a連接到蛋白質(zhì)如可從表2的結(jié)果中看出，當(dāng)在緩沖水溶液中測(cè)量時(shí)，?；撬嵫苌锖蜆?biāo)記的igg具有相當(dāng)?shù)偷陌l(fā)光值(低于1000m-1cm-1)，但是在干燥形式下信號(hào)顯著增強(qiáng)，例如亮度增加大約80-100倍。在干燥形式下發(fā)光值這種令人驚訝的提高意味著在有必要的情況下，技術(shù)人員可通過(guò)簡(jiǎn)單增加干燥步驟來(lái)顯著提高分析靈敏度。不希望受理論的束縛，假設(shè)緩沖水溶液的低發(fā)光強(qiáng)度可能是由于配體處于低能ct態(tài)造成的，如已經(jīng)針對(duì)相似類(lèi)型的吡啶二羧酸所公布的那樣(參見(jiàn)：andraud,c.,etal.ineur.j.inorg.chem2009,4357(andraud,c.等人，《歐洲無(wú)機(jī)化學(xué)雜志》，2009年，第4357頁(yè))；inorg.chem.2011,4987(《無(wú)機(jī)化學(xué)》，2011年，第4987頁(yè))；以及takalo,h.等人在the1stinternationalconferenceonluminescenceoflanthanidesodessa,ukraine(2010年烏克蘭敖德薩市召開(kāi)的第一屆鑭系元素發(fā)光國(guó)際會(huì)議)上所作報(bào)展的結(jié)果。此外，此前未曾報(bào)道在干燥測(cè)量形式下會(huì)如此顯著地增強(qiáng)這種低發(fā)光值。方案1方案2方案3方案4方案5。當(dāng)前第1頁(yè)12