相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2014年9月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/052,452的權(quán)益，以其整體通過(guò)引用并入本文。

本發(fā)明大體上涉及病毒基因轉(zhuǎn)移，更具體而言，涉及病毒基因轉(zhuǎn)移至諸如造血干細(xì)胞(hsc)等細(xì)胞及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

將基因轉(zhuǎn)移至造血干細(xì)胞(hsc)仍然是治療多種遺傳病癥的有吸引力的方法?；虔煼I(lǐng)域的最新進(jìn)展進(jìn)一步提高了患有諸如β地中海貧血和鐮狀細(xì)胞性貧血等血紅蛋白病患者受益于新治療方法的希望。用攜帶β-珠蛋白基因的慢病毒載體修飾的造血細(xì)胞(hc)的移植已導(dǎo)致幾種血紅蛋白病癥小鼠模型的長(zhǎng)期校正(imren等，procnatlacadsciusa.2002；99：14380-14385；malik等，annnyacadsci.2005；1054：238-249；may等，nature.2000；406：82-86；pawliuk等，science.2001；294：2368-2371)，但僅在一個(gè)β地中海貧血患者中導(dǎo)致輸血獨(dú)立性(cavazzana-calvo等，nature.2010；467：318-322)。

然而，這種治療的安全性和效用受限于難以獲得足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)導(dǎo)hsc，這要么是由于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞較差的產(chǎn)率，要么是其較差的功能。已經(jīng)報(bào)道了使用不同試劑來(lái)增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移，例如纖連蛋白(us5686278，chonoh等，jbiochem.2011年3月；149(3)：285-92；leehj，leeys等，biologicals.2009年8月；37(4)：203-9)，hivtat(nappif等，jgenemed.2009年11月；11(11)：955-65)，vectofusin-1(fenardd等，molthernucleicacids.2013年5月7日；2：e90)，脫氧核苷(ravote等，jgenemed.2002年3月至4月；4(2)：161-9)，和細(xì)胞因子(géronimif等，stemcells.2003；21(4)：472-80；kiemhp等，blood.1998年9月15日；92(6)：1878-86)。

因此，需要用于增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)移至hsc的新化合物和方法，特別是用于治療或預(yù)防造血功能障礙的基因療法的方法。

本說(shuō)明書(shū)涉及多個(gè)文獻(xiàn)，將其內(nèi)容以其整體通過(guò)引用并入本文。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及以下條款[1]～[37]：

[1].一種將病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與通式i的化合物或其鹽或前藥接觸；和用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞，

其中：

每個(gè)y獨(dú)立地選自n和ch；

z是

1)-cn

2)-c(o)or1，

3)-c(o)n(r1)r3，

4)-c(o)r1，或

5)-雜芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基，

其中，當(dāng)(r1)和r3連接到氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

w是

1)-cn，

2)-n(r1)r3，

3)-c(o)or1，

4)-c(o)n(r1)r3，

5)-nr1c(o)r1，

6)-nr1c(o)or1，

7)-oc(o)n(r1)r3，

8)-oc(o)r1，

9)-c(o)r1，

10)-nr1c(o)n(r1)r3，

11)-nr1s(o)2r1，

12)-芐基，可選地，其取代有1、2或3個(gè)ra或r1取代基，

13)-x-l-(x-l)n-n(r1)r3，

14)-x-l-(x-l)n-雜芳基，可選地，其取代有連接在l和雜芳基基團(tuán)之一或兩者上的一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基，

15)-x-l-(x-l)n-雜環(huán)基，可選地，其取代有連接在l和雜環(huán)基基團(tuán)之一或兩者上的一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基，

16)-x-l-(x-l)n-芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基。

17)-x-l-(x-l)n-nr1ra，或者

18)-(n(r1)-l)n-n+r1r3r5r6"

其中，n是等于0、1、2、3、4或5的整數(shù)，

并且其中，當(dāng)r1和r3連接到氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

每個(gè)x獨(dú)立地選自o、s和nr1；

每個(gè)l獨(dú)立地是

1)-c1-6亞烷基，

2)-c2-6亞烯基，

3)-c2-6亞炔基，

4)-c3-7亞環(huán)烷基，可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，或者

5)-c3-7亞環(huán)烯基，可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子

其中，亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞環(huán)烷基和亞環(huán)烯基各自獨(dú)立地可選地取代有一個(gè)或兩個(gè)r4或ra取代基；

r1各自獨(dú)立地是

1)-h，

2)-c1-6烷基，

3)-c2-6烯基，

4)-c2-6炔基，

5)-c3-7環(huán)烷基，

6)-c3-7環(huán)烯基，

7)-全氟化c1-5，

8)-雜環(huán)基，

9)-芳基，

10)-雜芳基，或

11)-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r2是

1)-h，

2)-c1-6烷基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra取代基

3)-c(o)r4，

4)-l-雜芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基

5)-l-雜環(huán)基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4，或者

6)-l-芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基；

r3各自獨(dú)立地是

1)-h，

2)-c1-6烷基，

3)-c2-6烯基，

4)-c2-6炔基，

5)-c3-7環(huán)烷基，

6)-c3-7環(huán)烯基，

7)-全氟化c1-5，

8)-雜環(huán)基，

9)-芳基，

10)-雜芳基，或

11)-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r4各自獨(dú)立地是

1)-h，

2)-c1-6烷基，

3)-c2-6烯基，

4)-c2-6炔基，

5)-c3-7環(huán)烷基，

6)-c3-7環(huán)烯基，

7)-全氟化c1-5，

8)-雜環(huán)基，

9)-芳基，

10)-雜芳基，或

11)-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r5各自獨(dú)立地是

1)-c1-6烷基，

2)-c1-6亞烷基-c2-6烯基，可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子

3)-c1-6亞烷基-c2-6炔基，可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子

4)-l-芳基，可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基

5)-l-雜芳基，可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基

6)-c1-6亞烷基-c(o)o-

7)-c1-6亞烷基-c(o)or1

8)-c1-6亞烷基-cn

9)-c1-6亞烷基-c(o)nr1r3，其中，可選地，r1和r3與氮原子一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子；或者

10)-c1-6亞烷基-oh；

r6是

1)鹵素

2)oc(o)cf3，或者

3)oc(o)r1；

ra各自獨(dú)立地是

1)-鹵素，

2)-cf3，

3)-or1，

4)-l-or1，

6)-sr1，

7)-cn，

8)-no2，

9)-nr1r3，

10)-l-nr1r1，

11)-c(o)or1，

12)s(o)2r4

13)-c(o)n(r1)r3，

14)-nr1c(o)r1，

15)-nr1c(o)or1，

16)-oc(o)n(r1)r3，

17)-oc(o)r1，

18)-c(o)r4，

19)-nhc(o)n(r1)r3，

20)-nr1c(o)n(r1)r3，或者

21)-n3；及

rd各自獨(dú)立地是

1)-h，

2)-c1-6烷基，

3)-c2-6烯基，

4)-c2-6炔基，

5)-c3-7環(huán)烷基，

6)-c3-7環(huán)烯基，

7)-全氟化c1-5

8)-芐基，或

9)-雜環(huán)基。

[2].如條款1所述的方法，其中，所述化合物具有式ia

或其鹽或前藥，

其中，w、y、z和r2各自如條款1中所定義。

[3].如條款2所述的方法，其中，

每個(gè)y獨(dú)立地選自n和ch；

z是-cn、-c(o)or1、-c(o)n(r1)r3或-雜芳基，可選地，雜芳基取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基，

w是-cn、-n(r1)r3、-芐基(可選地，其取代有1、2或3個(gè)ra或r1取代基)、-x-l-(x-l)n-n(r1)r3、-x-l-(x-l)n-nr1ra或-(n(r1)-l)n-n⁺r1r3r5r6^-

其中，n是等于0、1、2或3的整數(shù)

并且其中，當(dāng)r1和r3連接到氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

每個(gè)x獨(dú)立地是o、s或nr1，

l各自獨(dú)立地是-c1-6亞烷基、-c2-6亞烯基、-c2-6亞炔基、-c3-7亞環(huán)烷基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子)，或者-c3-7亞環(huán)烯基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子)，

其中，亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞環(huán)烷基和亞環(huán)烯基各自獨(dú)立地、可選地取代有一個(gè)或兩個(gè)r4或ra取代基；

r1各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-雜環(huán)基、-雜芳基或-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r2是-h、-c1-6烷基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra取代基)、-c(o)r4、-l-雜芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)、-l-雜環(huán)基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4)、或者-l-芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；

r3各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基或-全氟化c1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r4各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-雜環(huán)基、-芳基、-雜芳基或-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r5各自獨(dú)立地是-c1-6烷基、-l-芳基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)、-l-雜芳基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)、-c1-6亞烷基-c(o)o-、-c1-6亞烷基-c(o)or1、-c1-6亞烷基-cn、-c1-6亞烷基-c(o)nr1r3，或-c1-6亞烷基-oh；

r6是鹵素、-oc(o)cf3或oc(o)r1；

ra各自獨(dú)立地是-鹵素、-cf3、-or1、-l-or1、-ocf3、-sr1、-cn、-no2、-nr1r3、-l-nr1r1、-c(o)or1、s(o)2r4、-c(o)n(r1)r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-oc(o)n(r1)r3、-oc(o)r1、-c(o)r4、-nhc(o)n(r1)r3、-nr1c(o)n(r1)r3或-n3；

rd各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-芐基或-雜環(huán)基。

[4].如條款1所述的方法，其中，所述化合物具有式iia：

iia

或其鹽或前藥，

其中，z、w和r2各自如條款1所定義。

[5].如條款4所述的方法，其中

z是-cn、-c(o)o-c1-6烷基、-c(o)nh-c1-6烷基或-雜芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)，

w是-n(r1)r3、-nr1-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-o-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-s-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-nr1-c1-6亞烷基-nr1ra、-nr1-c1-6亞烷基-(nr1-c1-6亞烷基)n-nr1r3或-nr1-c1-6亞烷基-(nr1-c1-6亞烷基)n-nr1ra；

其中，n是等于0、1、2或3的整數(shù)

并且其中，當(dāng)r1和r3連接到氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

r1各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-雜環(huán)基、-雜芳基或-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r2是-h、-c1-6烷基、-c(o)r4、-c1-6亞烷基-雜芳基(可選地，其在亞烷基或雜芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)、-c1-6亞烷基-雜環(huán)基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4)或-c1-6亞烷基-芳基(可選地，其在亞烷基或雜芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；

r3各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基或-全氟化c1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r4各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-雜環(huán)基、-芳基、-雜芳基或-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

ra各自獨(dú)立地是-鹵素、-cf3、-or1、-l-or1、-ocf3、-sr1、-cn、-no2、-nr1r3、-l-nr1r1、-c(o)or1、s(o)2r4、-c(o)n(r1)r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-oc(o)n(r1)r3、-oc(o)r1、-c(o)r4、-nhc(o)n(r1)r3、-nr1c(o)n(r1)r3或-n3；

rd各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-芐基或-雜環(huán)基。

[6].如權(quán)利要求5所述的方法，其中：

z是co2me或2-甲基-2h-四唑-5-基；

r2是芐基或h；及

w是nh-l-n(r1)r3，其中，l是c2-4亞烷基或c3-7亞環(huán)烷基，r1和r3是c1-4烷基或h；或者r1和r3與它們所連接的氮原子結(jié)合在一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4。

[7].如條款6所述的方法，其中，w是

[8].如條款1所述的方法，其中，所述化合物具有式iia

或其鹽，

其中，

z是-c(o)o-c1-4烷基、或者-雜芳基，優(yōu)選為包含2～4個(gè)選自n和o的雜原子的5元環(huán)雜芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基，

w是-n(r1)r3、-nr1-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-o-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-s-c1-6亞烷基-n(r1)r3或-nr1-c1-6亞烷基-(nr1-c1-6亞烷基)n-nr1r3，其中，n是等于0、1、2或3的整數(shù)，并且其中，當(dāng)r1和r3連接到相同的氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子一起形成5～6元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n和o的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

r1各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c3-7環(huán)烷基或-雜環(huán)基，

其中，烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r2是-h、-c1-6烷基、-c1-6亞烷基-雜芳基(可選地，其在亞烷基或雜芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；或-c1-6亞烷基-芳基(可選地，其在亞烷基或芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；

r3各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、其中，可選地，所述烷基取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r4各自獨(dú)立地是h、-c1-6烷基，其中，可選地，所述烷基取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

ra各自獨(dú)立地是-鹵素、-cf3、-or1、-ocf3、-sr1、-cn、-no2、-nr1r3、-c(o)or1、s(o)2r4、-c(o)n(r1)r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-oc(o)n(r1)r3、-oc(o)r1、-c(o)r4、-nhc(o)n(r1)r3或-nr1c(o)n(r1)r3，及

rd各自獨(dú)立地是-h或-c1-6烷基。

[9].如條款1所述的方法，其中，所述化合物是：

或者它們的鹽。

[10].如條款1～9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞包括干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞。

[11].如條款10所述的方法，其中，所述干細(xì)胞包括原始造血細(xì)胞。

[12].如條款11所述的方法，其中，所述原始造血細(xì)胞源自臍帶血、骨髓或外周血。

[13].如條款1～12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述病毒載體是整合缺陷型病毒載體。

[14].如條款1～13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述病毒載體是慢病毒載體。

[15].如條款14所述的方法，其中，所述慢病毒載體是假型慢病毒載體。

[16].如條款15所述的方法，其中，所述慢病毒載體被水泡性口炎病毒g-蛋白(vsv-g)或rad114包膜蛋白假型化。

[17].如條款1～16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞在所述轉(zhuǎn)導(dǎo)之前與所述化合物接觸。

[18].如條款1～16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞在所述轉(zhuǎn)導(dǎo)之前和轉(zhuǎn)導(dǎo)期間與所述化合物接觸。

[19].如條款1～18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞與所述化合物接觸約2小時(shí)～約22小時(shí)的時(shí)間。

[20].一種組合物，其包含：(i)條款1和10～12中任一項(xiàng)所定義的細(xì)胞，(ii)至少一種條款1～9中任一項(xiàng)所定義的化合物；及(iii)條款1和13～16中任一項(xiàng)所定義的病毒載體。

[21].如條款20所述的組合物，其進(jìn)一步包含(iv)適于細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)基。

[22].如條款20或21所述的組合物，其中，所述細(xì)胞包括干細(xì)胞。

[23].如條款22所述的組合物，其中，所述干細(xì)胞包括原始造血細(xì)胞。

[24].如條款23所述的組合物，其中，所述原始造血細(xì)胞源自臍帶血、骨髓或外周血。

[25].通過(guò)如條款1～19中任一項(xiàng)所述的方法獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的群體。

[26].一種藥物組合物，其包含如條款25所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的群體。

[27].一種治療需要用細(xì)胞基因療法進(jìn)行治療的受試者的方法，所述方法包括對(duì)所述受試者施用有效量的如條款25所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的群體或如條款26所述的藥物組合物。

[28].如條款27所述的方法，其中，所述方法包括：(i)在條款1～9中任一項(xiàng)所定義的通式i的化合物存在下，將病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入來(lái)自所述受試者的細(xì)胞，從而獲得包含轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的群體；和(ii)對(duì)所述受試者施用有效量的(i)中所得的包含轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的群體，或含有所述包含轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的群體的藥物組合物。

[29].如條款28所述的方法，其中，所述細(xì)胞如條款22～24中任一項(xiàng)所定義。

[30].如條款27～29中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試者患有血液學(xué)或溶酶體貯積疾病。

[31].如條款30所述的方法，其中，所述血液學(xué)或溶酶體貯積疾病是威斯科特-奧爾德里奇綜合癥(was)、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(mld)、白細(xì)胞粘附缺陷、x連鎖cgd、范可尼貧血、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、粘多糖病mia、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(scid)或腺苷脫氨酶(ada)缺乏。

[32].條款25所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群體或如條款26所述的藥物組合物用于治療需要用細(xì)胞基因療法進(jìn)行治療的受試者的用途。

[33].條款25所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群體或如條款26所述的藥物組合物用于制造用于治療需要用細(xì)胞基因療法進(jìn)行治療的受試者的藥物的用途。

[34].如條款32或33所述的用途，所述受試者患有血液學(xué)或溶酶體貯積疾病。

[35].如條款34所述的用途，其中，所述血液學(xué)疾病或溶酶體貯積疾病是威斯科特-奧爾德里奇綜合癥(was)、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(mld)、白細(xì)胞粘附缺陷、x連鎖cgd、范可尼貧血、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、粘多糖病ima、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(scid)或腺苷脫氨酶(ada)缺乏。

[36].一種用于在細(xì)胞中表達(dá)感興趣的基因的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與條款1～9中任一項(xiàng)所定義的通式i的化合物接觸；和用包含編碼所述感興趣的基因的核酸的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞。

[37].如條款36所述的方法，其中，所述病毒載體如條款1和13～16中任一項(xiàng)所定義。

參照附圖，通過(guò)閱讀以下具體實(shí)施方式的非限制性描述，本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點(diǎn)和特征將變得更加明顯，所述具體實(shí)施方式僅作為實(shí)例提供。

附圖說(shuō)明

在附圖中：

圖1顯示用化合物1(cmpd1)和sr1擴(kuò)增的人cd34⁺臍帶血(cb)細(xì)胞比未操作的細(xì)胞更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)。將新鮮的或8天的cmpd1(35nm)和sr1(500nm)擴(kuò)增的cd34⁺cb細(xì)胞預(yù)刺激24小時(shí)，并分別用moi10的編碼gfp的vsv-g慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)16小時(shí)。沖洗細(xì)胞并用抗人cd34和cd45ra抗體染色，以用于在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時(shí)進(jìn)行facs分析。示出在兩種條件下(新鮮的和利用cmpd1+sr1培養(yǎng)8天)gfp-轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在總(左側(cè)條)、cd34⁺(中間條)和cd34⁺cd45ra^-(右側(cè)條)群體中的百分比。

圖2顯示與dmso對(duì)照相比，cmpd1處理的細(xì)胞顯示更高百分比的gfp轉(zhuǎn)導(dǎo)的cd34⁺和cd34⁺cd45ra^-細(xì)胞。將cd34⁺cb細(xì)胞預(yù)刺激48小時(shí)，并分別在載體(dmso)或cmpd1(35nm)的存在下用編碼gfp(moi：50或100)的vsv-g或rdt114慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)12小時(shí)。然后沖洗細(xì)胞，并在dmso或cmpd1中再次培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天和10天后進(jìn)行流式細(xì)胞分析以測(cè)定所示群體內(nèi)的gfp陽(yáng)性細(xì)胞(深灰色)。

圖3a和3b顯示與對(duì)照相比，gfp轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增的cmpd1-cd34⁺cb細(xì)胞顯示出更好的人cd45植入的植入潛力。將用cmpd1(三角形)或dmso(圓形)對(duì)照(圖2中描述的)轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增10天的1000個(gè)cd34⁺cb細(xì)胞的后代移植到亞致死性照射的(275cgy)雌性nsg小鼠中。在移植后30周后進(jìn)行nsg骨髓細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。圖3a：人cd45+細(xì)胞在總nsgbm細(xì)胞中的百分比。圖3b：顯示人cd45細(xì)胞內(nèi)的gfp+細(xì)胞。

圖4顯示用rd114和vsv-g假型慢病毒載體移植后30周的體內(nèi)數(shù)據(jù)的總結(jié)。

圖5a顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。通過(guò)facs分離的20,000個(gè)cd34+臍帶血細(xì)胞在100微升的加入人生長(zhǎng)因子(100ng/mlscf、100ng/mlflt3l、20ng/mlil-3、20ng/mlil-6和20ng/mlg-csf)的無(wú)血清培養(yǎng)基[補(bǔ)充有胎牛血清白蛋白、胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白(bit，stemcelltechnologies)、10μg/ml的低密度脂蛋白(ldl，stemcelltechnologies)、10^-4m2-巰基乙醇(sigma-aldrich)、10^-4mglutamax500(stemcelltechnologies)、青霉素鏈霉素)的iscove's培養(yǎng)基]中在存在或不存在cmpd1(35nm)和/或sr1(0.75μμ)的情況下預(yù)刺激16小時(shí)。然后在相同培養(yǎng)基中將細(xì)胞暴露于gfp慢病毒載體(10⁶iu/ml)6小時(shí)。(圖5c中提供了慢病毒載體的細(xì)節(jié)和所用的病毒原液的產(chǎn)生和滴定)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)期結(jié)束時(shí)，沖洗細(xì)胞并在補(bǔ)充有dmso、sr1(0.75μμ)、cmpd1(35nm)或sr1+cmpd1的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)。在培養(yǎng)基的末端，收獲細(xì)胞，對(duì)cd34染色并通過(guò)流式細(xì)胞分析。

圖5b顯示gfp+(*p<0.05)的cd34+細(xì)胞的百分比比例。

圖5c顯示本文所述實(shí)驗(yàn)中使用的慢病毒載體的細(xì)節(jié)和病毒原液的產(chǎn)生和滴定。在這些研究中使用pcci-c-mnduspgkgfp或pcci-c-mnduspgkyfp慢病毒載體骨架(loganac等，humangenetherapy2004)?？寺n1的4000bp的cdna或1743bp的nup98-hoxd13或1640bp的nup98-hoxa10hd融合基因以分別產(chǎn)生pcci-c-mndusmn1pgkgfp或pcci-c-mndusfnd13pgkgfp或pcci-c-mndusna10hdpgkgfp。對(duì)載體構(gòu)建體進(jìn)行序列驗(yàn)證。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的4-質(zhì)粒包裝系統(tǒng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞產(chǎn)生被水泡性口炎病毒糖蛋白-g假型化的高滴度重組病毒。通過(guò)超速離心濃縮含病毒的上清液以達(dá)到0.5×10⁹～5×10⁹感染單位/ml的滴度。通過(guò)用慢病毒載體的三個(gè)稀釋物轉(zhuǎn)導(dǎo)hela細(xì)胞來(lái)確定病毒滴度。

圖6a顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。將通過(guò)facs分離的20,000個(gè)cd34+臍帶血細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激并在圖5a所述的培養(yǎng)條件下用gfp慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。在預(yù)刺激期間或在轉(zhuǎn)導(dǎo)期期間加入cmpd1(35nm)或dmso。使用稀釋的gfp慢病毒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，以覆蓋從10⁵～10⁹病毒體/ml的最終病毒濃度范圍(圖5c中提供的病毒細(xì)節(jié))。

圖6b和6c顯示與預(yù)刺激期(圖6b)或轉(zhuǎn)導(dǎo)期(圖6c)期間暴露于cmpd1(上側(cè)條)或dmso(下側(cè)條)的細(xì)胞培養(yǎng)后，對(duì)cd34+細(xì)胞評(píng)估的基因轉(zhuǎn)移作為所用病毒濃度的函數(shù)。

圖6d和6e顯示在預(yù)刺激期(圖6d)或轉(zhuǎn)導(dǎo)期(圖6e)期間在cmpd1或dmso存在下人類(lèi)造血細(xì)胞的不同亞群的基因轉(zhuǎn)移效率。

圖6f和6g顯示在預(yù)刺激期(圖6f)或轉(zhuǎn)導(dǎo)期(圖6g)期間在cmpd1或dmso存在下人造血亞群的產(chǎn)率。圖6d～6g的數(shù)據(jù)用10⁶iu/ml病毒濃度獲得。

圖7a顯示評(píng)估cmpd1對(duì)基因轉(zhuǎn)移的影響和在體外和體內(nèi)評(píng)估的原始細(xì)胞產(chǎn)率的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；細(xì)胞用gfp或yfp轉(zhuǎn)導(dǎo)以允許在共注射到受體免疫缺陷小鼠中時(shí)在不同條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的體內(nèi)跟蹤(競(jìng)爭(zhēng)性再增殖)。使用的培養(yǎng)條件、細(xì)胞數(shù)目和病毒分別如圖5a和5c所述。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，cmpd1以35nm終濃度加入，并且gfp或yfp載體的病毒濃度為10⁶iu/ml。所有培養(yǎng)重復(fù)三次。

圖7b和7c顯示在存在或不存在cmpd1的情況下用gfp(圖7b)或yfp(圖7c)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)3天后回收的細(xì)胞中cd34和gfp或yfp表達(dá)的代表性流式細(xì)胞分析。

圖7d顯示基因轉(zhuǎn)移至用gfp載體(左，深灰色條)或yfp載體(右，淺灰色條)(n＝3；誤差條表示sd；*p<0.05)轉(zhuǎn)導(dǎo)的人cd34+cb細(xì)胞的效率。

圖7e顯示在3天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)回收的cd34+細(xì)胞和gfp標(biāo)記的cd34+細(xì)胞(左，深灰色條)或yfp標(biāo)記的cd34+細(xì)胞(右，淺灰色條)的絕對(duì)數(shù)目(n＝3；誤差條表示sd；*p<0.05)。

圖7f、7g和7h顯示在存在或不存在cmpd1的情況下轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在預(yù)刺激和轉(zhuǎn)導(dǎo)期(22小時(shí))之后，立即沖洗yfp標(biāo)記的細(xì)胞(在cmpd1存在下轉(zhuǎn)導(dǎo))和gfp標(biāo)記的細(xì)胞(在dmso存在下轉(zhuǎn)導(dǎo))的等分試樣(20000)，并注射入致死照射的nsg(n＝8)。在30周內(nèi)監(jiān)測(cè)骨髓抽吸物中的淋巴骨髓移植。圖7f：移植的nsg小鼠的骨髓中的總?cè)薱d45+細(xì)胞(上側(cè)黑色線)、yfp+(中間淺灰色線)或gfp+(下側(cè)黑灰色線)細(xì)胞的檢測(cè)。圖7g：移植的nsg小鼠的骨髓中的人cd33+(骨髓)細(xì)胞(上側(cè)黑色條)，yfp+(中間淺灰色條)或gfp+細(xì)胞(下側(cè)深灰色條)的檢測(cè)。圖7h：移植的nsg小鼠的骨髓中的人cd19/20(b淋巴樣)細(xì)胞(上側(cè)黑色條)，yfp+(中間淺灰色條)或gfp+細(xì)胞(下側(cè)深灰色條)的檢測(cè)。

圖8a～8e顯示獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)2)，其顯示基因轉(zhuǎn)移至人cd34+cb細(xì)胞(體外)和在nsg小鼠中的人hsc(體內(nèi)，n＝2)的cmpd1刺激增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖7所示，其在如圖5所述的培養(yǎng)條件下。病毒濃度和cmpd1濃度如圖7所述(分別為10⁶iu/ml和35nm)。

圖8a顯示基因轉(zhuǎn)移至用gfp載體(左側(cè)深灰色條)或yfp載體(右側(cè)淺灰色條)轉(zhuǎn)導(dǎo)的人cd34+cb細(xì)胞的效率。

圖8b顯示在3天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)回收的cd34+細(xì)胞和gfp標(biāo)記的cd34+細(xì)胞(左側(cè)深灰色條)或yfp標(biāo)記的cd34+細(xì)胞(右側(cè)淺灰色條)的絕對(duì)數(shù)目。

圖8c顯示作為移植后時(shí)間函數(shù)的移植的nsg小鼠的骨髓中的人cd45+細(xì)胞(上側(cè)黑色線)、gfp+(中間深灰色線)或yfp+(下側(cè)淺灰色線)細(xì)胞的檢測(cè)。

圖8d顯示在移植的nsg小鼠的骨髓中人cd33(骨髓樣)細(xì)胞(上側(cè)黑色線)，gfp+(中間深灰色線)或yfp+(下側(cè)淺灰色線)的檢測(cè)。

圖8e顯示在移植的nsg小鼠的骨髓中人cd19/20(b淋巴樣)細(xì)胞(上側(cè)黑色線)、gfp+(中間深灰色線)或yfp+(下側(cè)淺灰色線)細(xì)胞的檢測(cè)。

圖9a～9d顯示獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)3)，其顯示基因轉(zhuǎn)移至人cd34+cb細(xì)胞(體外)和在nsg小鼠中的人hsc的cmpd1刺激增強(qiáng)。

圖9a顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。此實(shí)驗(yàn)的獨(dú)特特征包括使用不同的臍帶血池作為cd34+細(xì)胞來(lái)源；使用不同的gfp慢病毒制劑；和在有限的稀釋下體內(nèi)評(píng)價(jià)細(xì)胞，而不是競(jìng)爭(zhēng)檢驗(yàn)。其他培養(yǎng)條件包括如前所述的病毒和cmpd1的濃度。

圖9b顯示基因轉(zhuǎn)移至人cd34+cb細(xì)胞的效率。

圖9c顯示用不同劑量的細(xì)胞(全部作為起始細(xì)胞等同物)在移植后30周時(shí)小鼠骨髓中的人cd45+細(xì)胞。

圖9d顯示用不同劑量的細(xì)胞在移植30周后在骨髓中表達(dá)gfp的人細(xì)胞的比例。

圖10a顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，其中cd34+cb細(xì)胞在預(yù)刺激或轉(zhuǎn)導(dǎo)期期間暴露于cmpd1不同的持續(xù)時(shí)間。在預(yù)刺激期開(kāi)始時(shí)或在轉(zhuǎn)導(dǎo)期的開(kāi)始或結(jié)束時(shí)，最小暴露時(shí)間為2小時(shí)。

圖10b顯示在3天擴(kuò)增培養(yǎng)(不存在cmpd1)結(jié)束時(shí)回收的細(xì)胞的代表性流式細(xì)胞分析，以評(píng)估在各種條件下的基因轉(zhuǎn)移至cd34+細(xì)胞和cd34+細(xì)胞的產(chǎn)率。

圖10c～10p總結(jié)了在預(yù)刺激的最初2小時(shí)期間(圖10c、10h和10m)，在預(yù)刺激的最后2小時(shí)期間(圖10d、10i和10n)，在16小時(shí)的預(yù)刺激期間(圖10e、10j和10o)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)的最初2小時(shí)期間(圖10f，10k和10p)或在轉(zhuǎn)導(dǎo)的最后2小時(shí)期間(圖10g、10l和10q)存在cmpd1時(shí)，至各種cd34+亞區(qū)室的基因轉(zhuǎn)移效率和產(chǎn)率。

圖11a顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，其中在存在或不存在cmpd1的情況下將細(xì)胞直接暴露于病毒而沒(méi)有預(yù)先刺激，持續(xù)所示的時(shí)間。

圖11b顯示在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)回收的細(xì)胞的代表性流式細(xì)胞分析。隨后的圖總結(jié)了在標(biāo)記為i、ii和iii的各種轉(zhuǎn)導(dǎo)條件下的基因轉(zhuǎn)移和對(duì)cd34+細(xì)胞和cd34+亞群的產(chǎn)率。

圖12a顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，其中將人骨髓cd34+細(xì)胞和人cd34+動(dòng)員的外周血預(yù)刺激24小時(shí)，并在補(bǔ)充有100ng/mlhscf、100ng/mlhflt3-l、100ng/mlhtpo和20ng/mlhll3的無(wú)血清培養(yǎng)基中在cmpd1(35nm)或dmso(0.01％)的存在下轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)。然后沖洗細(xì)胞并再培養(yǎng)3天，以評(píng)估培養(yǎng)物中cd34+細(xì)胞和cd34+亞群的基因轉(zhuǎn)移效率和產(chǎn)率。

圖12b和12c顯示來(lái)自骨髓(圖12b)和動(dòng)員的外周血(圖12c)的原始人類(lèi)造血細(xì)胞的不同亞型的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率和產(chǎn)率。

圖13a顯示使用rd114假型化慢病毒載體對(duì)人cd34+cb細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率。

圖13b顯示使用vsv-g假型化慢病毒載體對(duì)人cd34+cb細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率。

圖13c顯示通過(guò)非整合(整合酶缺陷型)慢病毒測(cè)試對(duì)人cd34+cb細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖13d顯示使用非整合型(整合酶缺陷型)慢病毒(圖b)在存在或不存在cmpd1的情況下的基因轉(zhuǎn)移至cd34+臍帶血細(xì)胞的結(jié)果。

圖14a和14b顯示在不同生長(zhǎng)因子組合下進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。將20000個(gè)cd34+cb細(xì)胞預(yù)刺激，并在補(bǔ)充有cmpd1(35nm)或dmso(0.01％)的具有5種生長(zhǎng)因子(100ng/mlscf，100ng/mlflt3l，20ng/mlil-3，20ng/mlil-6和20ng/mlg-csf)或具有3種生長(zhǎng)因子的不同混合物(100ng/mlscf、100ng/mlflt3l，50ng/mltpo)的全部先前實(shí)驗(yàn)中采用的標(biāo)準(zhǔn)條件下在sfm中轉(zhuǎn)導(dǎo)。沖洗細(xì)胞并在相同培養(yǎng)基中另外培養(yǎng)細(xì)胞3天，以評(píng)估在3種生長(zhǎng)因子(3gfs，左圖)下相對(duì)于5種生長(zhǎng)因子(5gfs，右圖)條件下的cd34+細(xì)胞和cd34+亞群的基因轉(zhuǎn)移效率和產(chǎn)率。圖14a：基因轉(zhuǎn)移效率(％gfp細(xì)胞)；圖14b：絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

圖15a～15d顯示使用慢病毒載體譜進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。將人cd34+細(xì)胞預(yù)刺激16小時(shí)，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下在存在或不存在cmpd1的情況下用不同的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)6小時(shí)，在另外72小時(shí)后，評(píng)估對(duì)cd34+細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。產(chǎn)生攜帶一系列不同插入物(分別為lgb、na10-hd、mn1、nd13，圖15a～15d)的慢病毒載體，并在指定的病毒濃度下測(cè)試。

圖16a和16b顯示用cmpd1變體進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。預(yù)刺激人cd34+cb細(xì)胞(16小時(shí))，并在存在dmso、cmpd1或cmpd1的不同變體的情況下轉(zhuǎn)導(dǎo)(6小時(shí))。然后沖洗細(xì)胞，并另外培養(yǎng)3天，通過(guò)facs分析。cmpd1和已知對(duì)人cd34+細(xì)胞的擴(kuò)增有活性的cmpd1的其他變體(cmpd3、cmpd4、cmpd5、cmpd6)而非cmpd1的無(wú)活性變體(cmpd7、cmpd8)，增加了對(duì)人cd34+cb細(xì)胞(圖16a)和不同的cd34+亞型(圖16b)的基因轉(zhuǎn)移效率。

圖17a～17c顯示在共培養(yǎng)±cmpd1、化合物2(cmpd2)和sr1后，獼猴臍帶血cd34+細(xì)胞的擴(kuò)增和植入。圖17a：實(shí)驗(yàn)示意圖。圖17b顯示移植后移植小鼠的血液中靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物cd45+細(xì)胞的檢測(cè)。圖17c顯示移植10周后的植入數(shù)據(jù)(上圖)和代表性流式細(xì)胞分析(第10周)(下圖)的總結(jié)。顯著性水平：*p<0.05。

圖18a～18g顯示cmpd1對(duì)來(lái)自獼猴骨髓的經(jīng)基因修飾的cd34+和lt-hsc樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增的影響。圖18a：實(shí)驗(yàn)示意圖。圖18b顯示用cmpd1/sr1擴(kuò)增前和擴(kuò)增后cd34+細(xì)胞的擴(kuò)增和cfc的形成。圖18c顯示cd34+細(xì)胞+/-cmpd1轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞產(chǎn)率。圖18d顯示在轉(zhuǎn)導(dǎo)1周后的動(dòng)員的骨髓cd34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后經(jīng)基因修飾的lt-hsc樣細(xì)胞擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)。圖18e顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞+/-cmpd1/sr1(上圖；左側(cè)條＝總gfp⁺；中間條＝cd34⁺gfp⁺；右側(cè)條＝lt-hsc⁺gfp⁺)的倍數(shù)擴(kuò)增和擴(kuò)增+/-cmpd1/sr1(下圖)后轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)員骨髓cd34+細(xì)胞的cfc潛力。圖18f顯示與sr1相比，組合cmpd1/sr1在動(dòng)員的cd34+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)期間保持胚細(xì)胞。圖18g顯示圖18f所示數(shù)據(jù)的代表性細(xì)胞離心涂片圖像(cytospinimages)。

圖19a～19e顯示sr1/cmpd1擴(kuò)增的轉(zhuǎn)導(dǎo)的cd34+細(xì)胞在獼猴中的植入。圖19a：實(shí)驗(yàn)示意圖。圖19b顯示用sr1(左側(cè)條)和sr1+cmpd1(右側(cè)條)轉(zhuǎn)導(dǎo)的cd34+細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移。圖19c顯示在用sr1(左側(cè)條)和sr1+cmpd1(右側(cè)條)共培養(yǎng)后，經(jīng)基因修飾的cd34+細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增。圖19d顯示在細(xì)胞移植1個(gè)月后骨髓和血液中的骨髓樣和淋巴樣細(xì)胞的檢測(cè)。圖19e顯示移植后經(jīng)基因修飾的粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的檢測(cè)(gfp+粒細(xì)胞＝淺灰色菱形；gfp+淋巴細(xì)胞＝淺灰色圓圈；mcherry+粒細(xì)胞＝深灰色菱形；mcherry+淋巴細(xì)胞＝深灰色圓圈)。

圖20a～20e顯示cmpd1和雷帕霉素之間的協(xié)同，以增強(qiáng)慢病毒基因至人類(lèi)造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率。

圖20a顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。通過(guò)facs分離的20,000個(gè)cd34+臍帶血細(xì)胞在100微升的加入人生長(zhǎng)因子(100ng/mlscf、100ng/mlflt3l、20ng/mlil-3、20ng/mlil-6和20ng/mlg-csf)的無(wú)血清培養(yǎng)基中在存在或不存在cmpd1(35nm)和/或雷帕霉素(10μg/ml)的情況下預(yù)刺激16小時(shí)。然后在相同培養(yǎng)基中將細(xì)胞暴露于gfp慢病毒載體(10⁶iu/ml)6小時(shí)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)期結(jié)束時(shí)，沖洗細(xì)胞并在具有生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，收獲細(xì)胞，對(duì)hsc表面標(biāo)記物染色，并通過(guò)流式細(xì)胞分析。

圖20b顯示基因轉(zhuǎn)移至人hsc中的效率。左側(cè)條＝dmso；第二個(gè)條＝cmpd1；第三個(gè)條＝雷帕霉素；第四個(gè)(右側(cè))條＝cmpd1+雷帕霉素(combo).

圖20c顯示在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)回收的總細(xì)胞數(shù)。左側(cè)條＝dmso；第二個(gè)條＝cmpd1；第三個(gè)條＝雷帕霉素；第四個(gè)(右側(cè))條＝cmpd1+雷帕霉素(combo)。

圖20d顯示培養(yǎng)物中產(chǎn)生的hsc的絕對(duì)數(shù)目。左側(cè)條＝dmso；第二個(gè)條＝cmpd1；第三個(gè)條＝雷帕霉素；第四個(gè)(右側(cè))條＝cmpd1+雷帕霉素(combo)。

圖20e顯示在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)回收的細(xì)胞的代表性流式細(xì)胞分析。

具體實(shí)施方式

在本文所述的研究中，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)顯示，人類(lèi)造血細(xì)胞對(duì)某些嘧啶并[4,5-b]吲哚衍生物的短期暴露(例如約2小時(shí)～22小時(shí))(其顯示在延長(zhǎng)培養(yǎng)(12天)后刺激人類(lèi)造血細(xì)胞的擴(kuò)增)，顯著增強(qiáng)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。用已知刺激原始人類(lèi)造血細(xì)胞擴(kuò)增的另一個(gè)小分子stemregenin1(sr1)沒(méi)有觀察到這種增強(qiáng)慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移能力。在不同來(lái)源(包括臍帶血、成體骨髓和成體動(dòng)員的外周血)和不同表型(大量cd34+以及高度純化的cd34+亞型(其包括干細(xì)胞高度富集的亞型))的原始造血細(xì)胞中，和不同類(lèi)型的病毒(不同的慢病毒，其包括整合缺陷型慢病毒和不同的假型慢病毒)測(cè)量這種增強(qiáng)，表明這些化合物可以廣泛應(yīng)用于增強(qiáng)諸如造血細(xì)胞等細(xì)胞中的病毒基因轉(zhuǎn)移。

因此，第一方面，本發(fā)明提供了用于將病毒載體(例如慢病毒載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞(例如，諸如干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞等原代細(xì)胞)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與如本文所定義的通式i的化合物或其鹽或前藥接觸；和用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞，

其中：

每個(gè)y獨(dú)立地選自n和ch；

z是-cn；-c(o)or1；-c(o)n(r1)r3；-c(o)r1；或-雜芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)，其中，當(dāng)(r1)和r3連接到氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

w是-cn；-n(r1)r3；-c(o)or1；-c(o)n(r1)r3；-nr1c(o)r1；-nr1c(o)or1；-oc(o)n(r1)r3；-oc(o)r1；-c(o)r1；-nr1c(o)n(r1)r3；-nr1s(o)2r1；-芐基(可選地，其取代有1、2或3個(gè)ra或r1取代基)；-x-l-(x-l)n；-n(r1)r3；-x-l-(x-l)n-雜芳基(可選地，其取代有連接在l和雜芳基的任一個(gè)或兩個(gè)上的一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基；-x-l-(x-l)n-雜環(huán)基(可選地，其取代有連接在l和雜環(huán)基的任一個(gè)或兩個(gè)上的一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基；-x-l-(x-l)n-芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；-x-l-(x-l)n-nr1ra或-(n(r1)-l)n-n⁺r1r3r5r6^-，其中，n是等于0、1、2、3、4或5的整數(shù)，

并且其中，當(dāng)r1和r3連接到氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

每個(gè)x獨(dú)立地選自o、s、和nr1；

l各自獨(dú)立地是-c1-6亞烷基；-c2-6亞烯基；-c2-6亞炔基；-c3-7亞環(huán)烷基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子)；或-c3-7亞環(huán)烯基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子)，其中，亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞環(huán)烷基和亞環(huán)烯基各自獨(dú)立地、可選地取代有一個(gè)或兩個(gè)r4或ra取代基；

r1各自獨(dú)立地是-h；-c1-6烷基；-c2-6烯基；-c2-6炔基；-c3-7環(huán)烷基；-c3-7環(huán)烯基；-全氟化c1-5；-雜環(huán)基；-芳基；-雜芳基；或-芐基，其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r2是-h；-c1-6烷基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra取代基)；-c(o)r4；-l-雜芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；-l-雜環(huán)基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4)；或-l-芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；

r3各自獨(dú)立地是-h；-c1-6烷基；-c2-6烯基；-c2-6炔基；-c3-7環(huán)烷基；-c3-7環(huán)烯基；-全氟化c1-5；-雜環(huán)基；-芳基；-雜芳基；或-芐基，其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r4各自獨(dú)立地是-h；-c1-6烷基；-c2-6烯基；-c2-6炔基；-c3-7環(huán)烷基；-c3-7環(huán)烯基；-全氟化c1-5；-雜環(huán)基；-芳基；-雜芳基；或-芐基；其中烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r5各自獨(dú)立地是-c1-6烷基；-c1-6亞烷基-c2-6烯基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子)；-c1-6亞烷基-c2-6炔基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子)；-l-芳基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；-l-雜芳基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；-c1-6亞烷基-c(o)o-；-c1-6亞烷基-c(o)or1；-c1-6亞烷基-cn；-c1-6亞烷基-c(o)nr1r3，其中，r1和r3，可選地，它們與氮原子一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子；或-c1-6亞烷基-oh；

r6是鹵素；-oc(o)cf3；或-oc(o)r1；

ra各自獨(dú)立地是-鹵素；-cf3；-or1；-l-or1；-ocf3；-sr1；-cn；-no2；-nr1r3；-l-nr1r1；-c(o)or1；-s(o)2r4；-c(o)n(r1)r3；-nr1c(o)r1；-nr1c(o)or1；-oc(o)n(r1)r3；-oc(o)r1；-c(o)r4；-nhc(o)n(r1)r3；-nr1c(o)n(r1)r3；或-n3；及

rd各自獨(dú)立地是-h；-c1-6烷基；-c2-6烯基；-c2-6炔基；-c3-7環(huán)烷基；-c3-7環(huán)烯基；-全氟化c1-5；-芐基；或-雜環(huán)基。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式ia

或其鹽或前藥，

其中w、y、z和r2各自如本文所定義。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式i或ia，其中，

每個(gè)y獨(dú)立地選自n和ch；

z是-cn、-c(o)or1、-c(o)n(r1)r3或-雜芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基，

w是-cn、-n(r1)r3、-芐基(可選地，其取代有1、2或3個(gè)ra或r1取代基)、-x-l-(x-l)n-n(r1)r3、-x-l-(x-l)n-nr1ra或-(n(r1)-l)n-n⁺r1r3r5r6^-

其中，n是等于0、1、2或3的整數(shù)

并且其中，當(dāng)r1和r3連接到氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

x各自獨(dú)立地是o、s或nr1，

l各自獨(dú)立地是-c1-6亞烷基、-c2-6亞烯基、-c2-6亞炔基、-c3-7亞環(huán)烷基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子)或-c3-7亞環(huán)烯基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子)

其中，亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞環(huán)烷基和亞環(huán)烯基各自獨(dú)立地、可選地取代有一個(gè)或兩個(gè)r4或ra取代基；

r1各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-雜環(huán)基、-雜芳基或-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基是各自獨(dú)立，可選地，其取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r2是-h、-c1-6烷基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra取代基)、-c(o)r4、-l-雜芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)、-l-雜環(huán)基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4)或-l-芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；

r3各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基或-全氟化c1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r4各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-雜環(huán)基、-芳基、-雜芳基或-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r5各自獨(dú)立地是-c1-6烷基、-l-芳基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)、-l-雜芳基(可選地，其包括一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)、-c1-6亞烷基-c(o)o-、-c1-6亞烷基-c(o)or1、-c1-6亞烷基-cn、-c1-6亞烷基-c(o)nr1r3或-c1-6亞烷基-oh；

r6是鹵素、oc(o)cf3或oc(o)r1；

ra各自獨(dú)立地是-鹵素、-cf3、-or1、-l-or1、-ocf3、-sr1、-cn、-no2、nr1r3、-l-nr1r1、-c(o)or1、s(o)2r4、-c(o)n(r1)r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-oc(o)n(r1)r3、-oc(o)r1、-c(o)r4、-nhc(o)n(r1)r3、-nr1c(o)n(r1)r3或-n3；

rd各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-芐基或-雜環(huán)基。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式iia

或其鹽或前藥，

其中，z、w和r2各自如本文所定義。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式i、ia或iia

z是-cn；-c(o)o-c1-6烷基；-c(o)nh-c1-6烷基；或-雜芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)，

w是-n(r1)r3；-nr1-c1-6亞烷基-n(r1)r3；-o-c1-6亞烷基-n(r1)r3；-s-c1-6亞烷基-n(r1)r3；-nr1-c1-6亞烷基-nr1ra；-nr1-c1-6亞烷基-(nr1-c1-6亞烷基)n-nr1r3；或-nr1-c1-6亞烷基-(nr1-c1-6亞烷基)n-nr1ra

其中，n是等于0、1、2或3的整數(shù)

并且其中，當(dāng)r1和r3連接到氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

r1各自獨(dú)立地是-h；-c1-6烷基；-c2-6烯基；-c2-6炔基；-c3-7環(huán)烷基；-c3-7環(huán)烯基；-全氟化c1-5；-雜環(huán)基；-雜芳基；或-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r2是-h；-c1-6烷基；-c(o)r4；-c1-6亞烷基-雜芳基(可選地，其在亞烷基或雜芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；-c1-6亞烷基-雜環(huán)基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4)；或-c1-6亞烷基-芳基(可選地，其在亞烷基或雜芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)，

r3各自獨(dú)立地是-h；-c1-6烷基；-c2-6烯基；-c2-6炔基；或-全氟化c1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r4各自獨(dú)立地是-h；-c1-6烷基；-c2-6烯基；-c2-6炔基；-c3-7環(huán)烷基；-c3-7環(huán)烯基；-全氟化c1-5；-雜環(huán)基；-芳基；-雜芳基；或-芐基，其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基是各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

ra各自獨(dú)立地是-鹵素；-cf3；-or1；-l-or1；-ocf3；-sr1；-cn；-no2；-nr1r3；-l-nr1r1；-c(o)or1；s(o)2r4；-c(o)n(r1)r3，-nr1c(o)r1，-nr1c(o)or1，-oc(o)n(r1)r3，-oc(o)r1；-c(o)r4；-nhc(o)n(r1)r3；-nr1c(o)n(r1)r3；或-n3

rd各自獨(dú)立地是-h；-c1-6烷基；-c2-6烯基；-c2-6炔基；-c3-7環(huán)烷基；-c3-7環(huán)烯基；-全氟化c1-5；-芐基；或-雜環(huán)基。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本公開(kāi)提供了增強(qiáng)慢病毒基因至原始造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率的方法，所述方法包括使包含原始造血細(xì)胞的細(xì)胞群體與通式i-vi的化合物接觸；和用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞，所述化合物具有式i、ia或iia

z是cn、-c(o)o-c1-6烷基、-c(o)nh-c1-6烷基或-雜芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)

w是-n(r1)r3、-nr1-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-o-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-s-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-nr1-c1-6亞烷基-nr1ra、-nr1-c1-6亞烷基-(nr1-c1-6亞烷基)n-nr1r3或-nr1-c1-6亞烷基-(nr1-c1-6亞烷基)n-nr1ra

其中，n是等于0、1、2或3的整數(shù)

并且其中，當(dāng)r1和r3連接到氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子連接在一起以形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)其他雜原子(n、o或s)，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

r1各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-雜環(huán)基、-雜芳基或-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r2是-h、-c1-6烷基、-c(o)r4、-c1-6亞烷基-雜芳基(可選地，其在亞烷基或雜芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)、-c1-6亞烷基-雜環(huán)基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4)、或-c1-6亞烷基-芳基(可選地，其在亞烷基或雜芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；

r3各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基或-全氟化c1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r4各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-雜環(huán)基、-芳基、-雜芳基或-芐基，

其中，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、全氟化烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基和芐基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

ra各自獨(dú)立地是-鹵素、-cf3、-or1、-l-or1、-ocf3、-sr1、-cn、-no2、-nr1r3、-l-nr1r1、-c(o)or1、s(o)2r4、-c(o)n(r1)r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-oc(o)n(r1)r3、-oc(o)r1、-c(o)r4、-nhc(o)n(r1)r3、-nr1c(o)n(r1)r3或-n3

rd各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c2-6烯基、-c2-6炔基、-c3-7環(huán)烷基、-c3-7環(huán)烯基、-全氟化c1-5、-芐基或-雜環(huán)基。

在一個(gè)實(shí)施方式中，z是-c(o)or1或-雜芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r1取代基)，r2是h、-c1-6烷基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra取代基)或-l-芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)，w是-n(r1)r3，其中，r1是被ra取代的c3-7環(huán)烷基，且r3是h。

在一個(gè)實(shí)施方式中，z是-c(o)o-c1-4烷基或5元環(huán)雜芳基，所述雜芳基包含2～4個(gè)其他雜原子(n或o)，r2是h或-l-芳基(可選地，其被鹵素取代)、or1、c1-6烷基(可選地，其被ra取代)、c(o)r4、-雜環(huán)基、c(o)or4或c2-6炔基，w是-n(r1)r3，其中，r1是被ra取代的環(huán)己基，且r3是h。

在一個(gè)實(shí)施方式中，z是coome、cooet、四唑或惡二唑。

在一個(gè)實(shí)施方式中，r2是＝h或-ch2-芳基(可選地，其被鹵素取代)、or1、c1-6烷基(可選地，其被ra取代)、c(o)r4、-雜環(huán)基、c(o)or4或c2-6炔基，其中，所述芳基是苯基。

在一個(gè)實(shí)施方式中，r2是h、-c1-6亞烷基-雜芳基或-c1-6亞烷基-芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式i、ia或iia，其中，z是co2me或2-甲基-2h-四唑-5-基；

r2是芐基或h；且

w是nh-l-n(r1)r3，其中，l是c2-4亞烷基或c3-7亞環(huán)烷基，且r1和r3是c1-4烷基或h；或者r1和r3與它們所連接的氮原子結(jié)合在一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式i、ia或iia，其中，w是

在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物是

在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物是

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物是

或優(yōu)選是

或者它們的鹽，

其中，

在式i中，每個(gè)y相同或不同，并且獨(dú)立地選自n和ch

z是-c(o)o-c1-4烷基、或-雜芳基，優(yōu)選地，其包含2～4個(gè)選自n和o的雜原子的5元環(huán)雜芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基，

w是-n(r1)r3、-nr1-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-o-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-s-c1-6亞烷基-n(r1)r3、或-nr1-c1-6亞烷基-(nr1-c1-6亞烷基)n-nr1r3

其中，n是等于0、1、2或3的整數(shù)

并且其中，當(dāng)r1和r3連接到相同的氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子一起形成5～6元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n和o的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

r1各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c3-7環(huán)烷基或-雜環(huán)基，

其中，烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r2是-h、-c1-6烷基、-c1-6亞烷基-雜芳基(可選地，其在亞烷基或雜芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；或-c1-6亞烷基-芳基(可選地，其在亞烷基或芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；

r3各自獨(dú)立地是-h或-c1-6烷基，其中，可選地，烷基基團(tuán)取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r4各自獨(dú)立地是-h或-c1-6烷基，其中，可選地，烷基取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

ra各自獨(dú)立地是-鹵素、-cf3、-or1、-ocf3、-sr1、-cn、-no2、-nr1r3、-c(o)or1、s(o)2r4、-c(o)n(r1)r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1、-oc(o)n(r1)r3、-oc(o)r1、-c(o)r4、-nhc(o)n(r1)r3或-nr1c(o)n(r1)r3，且

rd各自獨(dú)立地是-h或-c1-6烷基。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物是

或其鹽，

其中，

z是-c(o)o-c1-4烷基或-雜芳基，優(yōu)選地，其是包含2～4個(gè)選自n和o的雜原子的5元環(huán)雜芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基，

w是-n(r1)r3、-nr1-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-o-c1-6亞烷基-n(r1)r3、-s-c1-6亞烷基-n(r1)r3或-nr1-c1-6亞烷基-(nr1-c1-6亞烷基)n-nr1r3

其中，n是等于0、1、2或3的整數(shù)

并且其中，當(dāng)r1和r3連接到相同的氮原子時(shí)，可選地，它們與氮原子一起形成5～6元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n和o的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4；

r1各自獨(dú)立地是-h、-c1-6烷基、-c3-7環(huán)烷基或-雜環(huán)基，

其中，烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基各自獨(dú)立地、可選地取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r2是-h、-c1-6烷基、-c1-6亞烷基-雜芳基(可選地，其在亞烷基或雜芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；或-c1-6亞烷基-芳基(可選地，其在亞烷基或芳基上取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)；

r3各自獨(dú)立地是-h或-c1-6烷基，其中，可選地，烷基基團(tuán)取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

r4各自獨(dú)立地是-h或-c1-6烷基，其中，可選地，烷基取代有1、2或3個(gè)ra或rd取代基；

ra各自獨(dú)立地是-鹵素、-or1、-nr1r3、-c(o)or1、-c(o)n(r1)r3、-nr1c(o)r1、-nr1c(o)or1或-nr1c(o)n(r1)r3，且

rd各自獨(dú)立地是-h或-c1-6烷基。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式iia

或其鹽，

其中，

z是-c(o)o-c1-4烷基或5元環(huán)雜芳基，所述雜芳基包含2～4個(gè)選自n和o的雜原子；

r2是h、-c1-6亞烷基-雜芳基或-c1-6亞烷基-芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基；

w是-x-l-n(r1)r3(其中，x獨(dú)立地選自o、s、和nr1)或優(yōu)選為-nr1-l-n(r1)r3，其中，l是c2-4亞烷基或c3-7亞環(huán)烷基，且r1和r3是c1-4烷基或h；或者r1和r3與它們所連接的氮原子結(jié)合在一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式iia

或其鹽，

其中

z是co2me、cooet、四唑或惡二唑，z優(yōu)選為co2me或2-甲基-2h-四唑-5-基；

r2是h、-c1-6亞烷基-雜芳基或-c1-6亞烷基-芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基，r2優(yōu)選為芐基或h；

w是-x-l-n(r1)r3(其中，x獨(dú)立地選自o、s、和nr1)或優(yōu)選為-nh-l-n(r1)r3，其中，l是c2-4亞烷基或c3-7亞環(huán)烷基，且r1和r3是c1-4烷基或h；或者r1和r3與它們所連接的氮原子結(jié)合在一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式iia

或其鹽，

其中

z是coome、cooet、四唑或惡二唑，z優(yōu)選為co2me或2-甲基-2h-四唑-5-基；

r2是h、-c1-6亞烷基-雜芳基(其中，雜芳基是吡啶基、嘧啶基或噻吩基)或-c1-6亞烷基-芳基，可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基，優(yōu)選的是，r2可選地取代有芐基或h；

w是

或優(yōu)選為

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式iia

或其鹽

其中，

z是co2me或2-甲基-2h-四唑-5-基；

r2是h、-ch2-雜芳基(其中，雜芳基是吡啶基、嘧啶基或噻吩基)或者可選地經(jīng)取代的芐基，或h；

w是

或優(yōu)選為

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式iia

或其鹽，

其中，

z是-c(o)or1或-雜芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r1取代基)，

r2是h、-c1-6烷基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra取代基)或者-l-芳基(可選地，其取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4取代基)。

w是x-l-n(r1)r3(其中，x獨(dú)立地選自o、s、和nr1)或者優(yōu)選為-n(r1)r3，其中，r1是被ra取代的c3-7環(huán)烷基，并且r3是h。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式iia

或其鹽，

其中，z是-c(o)o-c1-4烷基或5元環(huán)雜芳基，所述雜芳基包含2～4個(gè)選自n和o的雜原子；r2是h或-l-芳基(可選地，其被鹵素取代)、or1、c1-6烷基(可選地，其被ra取代)、c(o)r4、-雜環(huán)基、c(o)or4或c2-6炔基；w是x-l-n(r1)r3(其中，x獨(dú)立地選自o、s、和nr1)或者優(yōu)選為-n(r1)r3，其中r1是被ra取代的環(huán)己基，并且r3是h。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式iia

或其鹽，

其中，z是co2me或2-甲基-2h-四唑-5-基；r2是芐基或h；且w是x-l-n(r1)r3(其中，x獨(dú)立地選自o、s和nr1)或優(yōu)選為nh-l-n(r1)r3，其中，l是c2-4亞烷基或c3-7亞環(huán)烷基，且r1和r3是c1-4烷基或h；或者r1和r3與它們所連接的氮原子結(jié)合在一起形成3～7元環(huán)，可選地，所述環(huán)包括一個(gè)或多個(gè)選自n、o和s的其他雜原子，可選地，所述環(huán)取代有一個(gè)或多個(gè)ra或r4。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述化合物具有式iia

或其鹽，

其中，z是co2me或2-甲基-2h-四唑-5-基；r2是芐基或h；且w是

或優(yōu)選為

在實(shí)施方式中，所述化合物是下表1中所示化合物#1～90中的一個(gè)或多個(gè)。

本文公開(kāi)的包括其制備和表征的式i、ii和iia的化合物(包括上文所示的代表性化合物)在pct公開(kāi)號(hào)wo2013/110198中進(jìn)行描述，將其內(nèi)容以其整體通過(guò)參考并入本文，以及在下面的合成方法部分中找到。這些化合物在下文中稱(chēng)為“本文定義的化合物”。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“烷基”旨在包括具有指定數(shù)目碳原子的支鏈和直鏈飽和脂肪族烴基，例如c1-c6烷基中的c1-c6被定義為包括具有直鏈或支鏈飽和排列的1、2、3、4、5或6個(gè)碳的基團(tuán)。如上定義的c1-c6烷基的實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、戊基和己基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”意指其中具有指定數(shù)目的碳原子的單環(huán)飽和肪族烴基，例如，c3-c7環(huán)烷基中c3-c7被定義為包括具有單環(huán)飽和排列的3、4、5、6或7個(gè)碳的基團(tuán)。如上定義的c3-c7環(huán)烷基的實(shí)例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)，“烯基”意指其中具有指定數(shù)目的碳原子的且其中至少兩個(gè)碳原子通過(guò)雙鍵彼此鍵合的不飽和直鏈或支鏈烴基，并具有e或z區(qū)域化學(xué)及其組合。例如，c2-c6烯基中的c2-c6被定義為包括具有直鏈或支鏈排列的2、3、4、5或6個(gè)碳的基團(tuán)，至少兩個(gè)碳原子通過(guò)雙鍵鍵合在一起。c2-c6烯基的實(shí)例包括但不限于乙烯基(乙烯基)、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基等。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“炔基”意指其中具有指定數(shù)目的碳原子且其中至少兩個(gè)碳原子通過(guò)三鍵鍵合在一起的不飽和直鏈烴基。例如，c2-c4炔基被定義為包括在鏈中具有2、3或4個(gè)碳原子的基團(tuán)，至少兩個(gè)碳原子通過(guò)三鍵鍵合在一起。這種炔基的實(shí)例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基等。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“環(huán)烯基”意指其中具有指定數(shù)目的碳原子的單環(huán)飽和脂肪族烴基，例如，c3-c7環(huán)烯基中的c3-c7被定義為包括具有單環(huán)排列的3、4、5、6或7個(gè)碳的基團(tuán)。如上定義的c3-c7環(huán)烯基的實(shí)例包括但不限于環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基等。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“鹵素”意指氟、氯、溴或碘。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“鹵代烷基”意指如上所定義的烷基，其中每個(gè)氫原子可以相繼被鹵素原子替代。鹵代烷基的實(shí)例包括但不限于ch2f、chf2和cf3。

如本文使用的，單獨(dú)或與另一個(gè)基團(tuán)組合的術(shù)語(yǔ)“芳基”意指含有6個(gè)碳原子的碳環(huán)芳族單環(huán)基團(tuán)，其可以進(jìn)一步稠合到可以是芳族的、飽和或不飽和的第二個(gè)5或6元碳環(huán)基團(tuán)。芳基的實(shí)例包括但不限于苯基、茚滿(mǎn)基、1-萘基、2-萘基、四氫萘基等。芳基可以在環(huán)烷基環(huán)或芳環(huán)上的合適位置連接到另一個(gè)基團(tuán)。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“雜芳基”意指至多10個(gè)原子的單環(huán)或雙環(huán)系統(tǒng)，其中，至少一個(gè)環(huán)是芳族的，并且含有1～4個(gè)選自由o、n和s組成的組的雜原子。雜芳基可以經(jīng)由環(huán)碳原子或雜原子中的一個(gè)連接。雜芳基的實(shí)例包括但不限于噻吩基、苯并咪唑基、苯并[b]噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡喃基、異苯并呋喃基、色烯基、呫噸基、2h-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基，噠嗪基、吲嗪基、異吲哚基、3h-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4h-喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、異噻唑基、異色滿(mǎn)基、苯并二氫吡喃基、異惡唑基、呋咱基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、噻唑并[4,5-b]吡啶、四唑基、惡二唑基、噻二唑基、噻吩基、嘧啶并-吲哚基、吡啶并-吲哚基、吡啶并-吡咯并-嘧啶基、吡咯并-二吡啶基和熒光素衍生物。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)”、“雜環(huán)的”或“雜環(huán)基”意指含有1～4個(gè)選自o、n和s組成的組的雜原子的3、4、5、6或7元非芳族環(huán)系統(tǒng)。雜環(huán)的實(shí)例包括但不限于吡咯烷基、四氫呋喃基、哌啶基、3,5-二甲基哌啶基、吡咯啉基、哌嗪基、咪唑烷基、嗎啉基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、四氫-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-2(3h)-酮、二嗪基等，其中與環(huán)的連接可以在該環(huán)的氮原子或碳原子上，如下文所述：

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“可選地取代有一個(gè)或多個(gè)取代基”或其等同術(shù)語(yǔ)“可選地取代有至少一個(gè)取代基”意指隨后描述的情況事件可以發(fā)生或可以不發(fā)生，并且該描述包括事件或情況發(fā)生的情況和不發(fā)生的情況。該定義意指0～5個(gè)取代基。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”或“患者”意指人和非人哺乳動(dòng)物，諸如靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、貓、狗、豬、牛、綿羊、山羊、馬、兔、大鼠、小鼠等。

如果取代基自身與本文所述的合成方法不相容，則可以用對(duì)這些方法中使用的反應(yīng)條件穩(wěn)定的適合的保護(hù)基團(tuán)(pg)保護(hù)取代基。保護(hù)基團(tuán)可以在該方法的反應(yīng)順序中的適合的點(diǎn)除去，以提供所需的中間體或靶標(biāo)化合物。適合的保護(hù)基團(tuán)和使用所述適合的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)和去保護(hù)不同取代基的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的；其實(shí)例可以在t.greene和p.wuts，“protectinggroupsinchemicalsynthesis”(第4版)，johnwiley&sons，ny(2007)中找到，以其整體通過(guò)引用并入本文。自始自終使用的保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于fmoc、bn、boc、cbz和cocf3。在某些情況下，可以特異性地選擇取代基以使其在本文所述的方法中使用的反應(yīng)條件下具有反應(yīng)性。在這些情況下，反應(yīng)條件將所選擇的取代基轉(zhuǎn)化為另一種取代基，另一種取代基可用于本文所述方法中的中間體化合物中或是靶標(biāo)化合物中的所需取代基。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”意指酸和堿的加成鹽。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的酸加成鹽”意指保留游離堿的生物學(xué)有效性和性質(zhì)的那些鹽，它們不是生物學(xué)上或其他方面不期望的，并且其是與諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等無(wú)機(jī)酸，以及諸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、馬來(lái)酸、丙二酸、丁二酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對(duì)甲苯磺酸、水楊酸等有機(jī)酸形成的鹽。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的堿加成鹽”意指保留游離酸的生物學(xué)有效性和性質(zhì)的那些鹽，它們不是生物學(xué)上或其他方面不期望的。這些鹽是通過(guò)將無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿加入到游離酸中制備的。源自無(wú)機(jī)堿的鹽包括但不限于鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁的鹽等。源自有機(jī)堿的鹽包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的鹽，包括天然存在的取代胺的取代胺的鹽、環(huán)胺和堿性離子交換樹(shù)脂的鹽，例如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二環(huán)己基胺、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、海巴明、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、甲基葡萄糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚胺樹(shù)脂等的鹽。

根據(jù)本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽可以包含一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱(chēng)中心、手性軸和手性平面，并且因此可以產(chǎn)生對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體和其他立體異構(gòu)形式，并且可以根據(jù)絕對(duì)立體化學(xué)來(lái)定義，諸如(r)-或(s)-，或者對(duì)于氨基酸而言(d)-或(l)-。本發(fā)明意在包括所有這些可能的異構(gòu)體，及它們的外消旋和光學(xué)純的形式。光學(xué)活性(+)和(-)、(r)-和(s)-、或者(d)-和(l)-異構(gòu)體可以使用手性合成子或手性試劑制備，或者使用諸如反相hplc等常規(guī)技術(shù)進(jìn)行拆分?？梢灾苽渫庀旌衔?，然后分離成單獨(dú)的光學(xué)異構(gòu)體，或者這些光學(xué)異構(gòu)體可以通過(guò)手性合成制備。對(duì)映體可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法拆分，例如通過(guò)形成非對(duì)映異構(gòu)體鹽，然后可以通過(guò)結(jié)晶，氣-液或液相色譜(對(duì)映體與對(duì)映體特異性試劑的選擇性反應(yīng))來(lái)分離。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，當(dāng)通過(guò)分離技術(shù)將所需的對(duì)映體轉(zhuǎn)化成另一種化學(xué)實(shí)體時(shí)，則需要另外的步驟來(lái)形成所需的對(duì)映體形式。作為另一種選擇，可以通過(guò)使用光學(xué)活性試劑、底物、催化劑或溶劑的不對(duì)稱(chēng)合成，或者通過(guò)不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)化將一種對(duì)映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化為另一種來(lái)合成特定的對(duì)映體。

根據(jù)本發(fā)明的某些化合物可以作為差向異構(gòu)體的混合物存在。差向異構(gòu)體是指在相應(yīng)化合物中存在的兩個(gè)以上的立體中心中僅一個(gè)具有相反構(gòu)型的非對(duì)映異構(gòu)體。

根據(jù)本發(fā)明的化合物可以以?xún)尚噪x子形式存在，并且本發(fā)明包括這些化合物及其混合物的兩性離子形式。

此外，本發(fā)明的化合物還可以以水合和無(wú)水形式存在。本發(fā)明包括本文所述的任何式的化合物的水合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本文所述的任何式的化合物是一水合物。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，本文所述的化合物包含約10重量％以下、約9重量％以下、約8重量％以下、約7重量％以下、約6重量％以下、約5重量％以下、約4重量％以下、約3重量％以下、約2重量％以下、約1重量％以下、約0.5重量％以下、約0.1重量％以下的水。在其他實(shí)施方式中，本文所述的化合物包含約0.1重量％以上、約0.5重量％以上、約1重量％以上、約2重量％以上、約3重量％以上、約4重量％以上、約5重量％以上或約6重量％以上的水。

制備、純化和/或處理前藥形式的化合物可能是方便或需要的。因此，如本文使用的術(shù)語(yǔ)“前藥”涉及當(dāng)代謝(例如，體內(nèi))時(shí)產(chǎn)生所需活性化合物的化合物。通常，前藥是無(wú)活性的，或是比所需的活性化合物更低的活性，但可以提供有利的處理、施用或代謝性質(zhì)。除非另有說(shuō)明，提及特定化合物也包括其前藥。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“ec50”意指與載體培養(yǎng)物(dmso)相比，導(dǎo)致cd34+cd45ra-細(xì)胞計(jì)數(shù)增加50％的濃度。

另一方面，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)病毒基因至細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率的方法，所述方法包括使細(xì)胞群與如本文定義的通式i、ia或iia的化合物接觸；和用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞。

另一方面，本發(fā)明還提供了用于增加用病毒載體培養(yǎng)的細(xì)胞群體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，所述方法包括：在包含至少一種本文所定義的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞群體和病毒載體，持續(xù)足以增加所述轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的時(shí)間。在某些方面，使用本文所述的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)至少約30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的細(xì)胞群體。

另一方面，本發(fā)明提供了用于將感興趣的基因(或感興趣的多肽)表達(dá)到細(xì)胞中的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與至少一種本文所定義的化合物接觸；和用包含編碼所述感興趣的基因(或感興趣的多肽)的核酸的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“感興趣的基因”意指編碼蛋白質(zhì)(天然或突變的)或其活性片段(即感興趣的多肽)的任何基因。感興趣的基因可以例如是在給定疾病中不存在或缺陷的基因。

在一個(gè)實(shí)施方式中，在本文所述的方法和組合物中使用本文所定義的化合物的組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本文所定義的化合物可以與已知增加造血細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的其他試劑或方法組合使用，例如纖連蛋白或纖連蛋白片段(ch-296)、重組人纖粘連蛋白(retronectin)、hivtat、vectofusin-1、脫氧核苷、細(xì)胞因子(例如il-6、scf、flt-3配體)、諸如pge2等調(diào)節(jié)前列腺素信號(hào)傳導(dǎo)的化合物(參見(jiàn)wo2014/026110)和/或mtor抑制劑(例如雷帕霉素)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是原代細(xì)胞，例如腦/神經(jīng)細(xì)胞、外周血細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞)、臍帶血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、心臟細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞或肺細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞或臍帶血細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是干細(xì)胞。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”是指具有使它們分化為功能性成熟細(xì)胞的多能性的細(xì)胞。它包括原始造血細(xì)胞、祖細(xì)胞、以及在人體各種組織中發(fā)現(xiàn)的未分化的細(xì)胞的成體干細(xì)胞，它們能自我更新并產(chǎn)生特化細(xì)胞類(lèi)型和組織的細(xì)胞來(lái)源(例如，肌肉干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、腦或神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、肺干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是原始造血細(xì)胞。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“原始造血細(xì)胞”用來(lái)指具有使它們能夠分化為功能性成熟血細(xì)胞的多能性的細(xì)胞，所述成熟血細(xì)胞諸如為粒細(xì)胞(例如，早幼粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞)、紅細(xì)胞(例如，網(wǎng)織紅細(xì)胞、紅細(xì)胞)、血小板(例如，成巨核細(xì)胞、血小板生成巨核細(xì)胞、血小板)、和單核細(xì)胞(例如，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)，其在維持其多能性的同時(shí)其可以能夠或不能夠再生(自我更新)。它包括“造血干細(xì)胞”或“hsc”，其是同時(shí)具有使它們能夠分化為諸如粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、單核細(xì)胞等功能性成熟細(xì)胞的多能性，及保持其多能性的同時(shí)能夠再生(自我更新)的細(xì)胞，以及不具有自我更新能力的多能造血細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體包含hsc。hsc可以獲自身體或含有造血起源的細(xì)胞的身體器官。這些來(lái)源包括未分級(jí)骨髓(來(lái)自股骨、髖關(guān)節(jié)、肋骨、胸骨、和其他骨頭)、臍帶血、外周血、肝臟、胸腺、淋巴結(jié)和脾。所有上述粗制或未分級(jí)血液制品可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式富集具有hsc特征的細(xì)胞。hsc通過(guò)其小尺寸、缺乏譜系(lin)標(biāo)志物、用諸如羅丹明123(羅丹明^dull，也稱(chēng)為rho¹⁰)或hoechst33342等活性染料低染色(側(cè)群體)、及在其表面存在/不存在各種抗標(biāo)志物(許多屬于分化系列的簇，例如：cd34、cd38、cd90、cd133、cd105、cd45和c-kit)進(jìn)行表型鑒定。

在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞群體包括造血干細(xì)胞(hsc)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人類(lèi)細(xì)胞。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“病毒載體”是指能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞并將其遺傳物質(zhì)引入細(xì)胞的重組病毒?？捎糜诨虔煼ǖ牟《据d體的實(shí)例包括逆轉(zhuǎn)錄病毒(慢病毒)、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、皰疹病毒(單純皰疹病毒)、甲病毒和牛痘病毒(痘病毒)。在一個(gè)實(shí)施方式中，病毒載體是慢病毒載體。

術(shù)語(yǔ)“慢病毒載體”是指包含主要來(lái)源于慢病毒的ltr外部的結(jié)構(gòu)和功能遺傳元件的載體。慢病毒載體能夠在體外和體內(nèi)提供轉(zhuǎn)基因到非分裂細(xì)胞中的有效遞送、整合和長(zhǎng)期表達(dá)。多種慢病毒載體是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)naldini等(1996a，1996b和1998)；zufferey等，(1997)；dull等，1998，美國(guó)專(zhuān)利6,013,516號(hào)和5,994,136號(hào)，其中任意一個(gè)可以適于產(chǎn)生用于本發(fā)明的方法和組合物中的適合的轉(zhuǎn)移載體。示例性的慢病毒包括但不限于：hiv(人類(lèi)免疫缺陷病毒；包括1型hiv和2型hiv)；維斯那-梅迪病毒(vmv)；山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(caev)；馬感染性貧血病毒(eiav)；貓免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。在一方面，基于hiv的載體骨架是優(yōu)選的。在一個(gè)實(shí)施方式中，慢病毒載體是復(fù)制缺陷型慢病毒。

如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，術(shù)語(yǔ)“慢病毒載體”用于指介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)移的慢病毒顆粒。慢病毒顆粒通常會(huì)包括除核酸以外的各種病毒組分，有時(shí)還包括宿主細(xì)胞組分。在特定方面，術(shù)語(yǔ)“慢病毒載體”、“慢病毒表達(dá)載體”用于指慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和/或感染性慢病毒顆粒。

在一個(gè)實(shí)施方式中，慢病毒載體是假型慢病毒載體。假型慢病毒載體由攜帶來(lái)自其他包膜病毒的包膜蛋白(糖蛋白，gp)的載體顆粒組成。這樣的顆粒具有包膜蛋白來(lái)源的病毒的向性。由于所得假型的非常廣泛的向性和穩(wěn)定性，用于假型慢病毒載體的廣泛使用的糖蛋白之一是水泡性口炎病毒gp(vsv-g)。假型慢病毒載體是本領(lǐng)域眾所周知的，幾個(gè)實(shí)例例如描述于cronin等，curr.genether.5(4)：387-398。它包括用以下病毒假型化的病毒：狂犬病病毒gp、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lcmv)gp、甲病毒屬gp(例如，rossriver病毒(rrv)、塞姆利基森林病毒(sfv)和辛德畢斯病毒gp)、絲狀病毒gp(例如馬爾堡病毒和埃博拉扎伊爾病毒gp)、伽馬逆轉(zhuǎn)錄病毒gp(例如親嗜性mlv、雙嗜性4070amlv、10a1mlv、異嗜性nzbmlv、貂細(xì)胞聚集形成病毒、長(zhǎng)臂猿白血病(galv)病毒、rd114gp)和桿狀病毒gp(gp64)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，病毒載體是整合缺陷型病毒載體，諸如非整合型腺病毒載體或整合酶缺陷型慢病毒(idlv)。idlv可以通過(guò)使用使原病毒整合最小化的整合酶蛋白中的突變產(chǎn)生。所得idlv在轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶標(biāo)細(xì)胞中產(chǎn)生環(huán)狀載體附加體，其通過(guò)在分裂細(xì)胞中稀釋而逐漸丟失(瞬時(shí)表達(dá))，但在靜止細(xì)胞中穩(wěn)定。與整合慢病毒相比，idlv固有地具有大大降低的導(dǎo)致插入誘變的風(fēng)險(xiǎn)。因此，idlv在需要瞬時(shí)表達(dá)的應(yīng)用或用于諸如在靜止細(xì)胞中的持續(xù)附加型表達(dá)(例如用于接種、癌癥療法、定點(diǎn)基因插入、基因破壞策略和細(xì)胞重編程)是特別有用的。idlv的設(shè)計(jì)和應(yīng)用例如描述于shaw和cornetta，biomedicines2014，2，14-35中。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于將感興趣的基因瞬時(shí)表達(dá)到細(xì)胞中的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與至少一種本文所定義的化合物接觸；和用包含編碼所述感興趣的基因的核酸的非整合型病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞。

在另一方面，本發(fā)明提供了慢病毒載體，其包含指導(dǎo)在特定細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞譜系中表達(dá)感興趣的多核苷酸的表達(dá)控制序列。細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞譜系表達(dá)控制序列的使用提供了在單個(gè)譜系中將多核苷酸表達(dá)限制到期望的細(xì)胞分化階段的安全優(yōu)勢(shì)；因此，本發(fā)明的載體緩解了涉及不期望的細(xì)胞類(lèi)型中多肽的異位表達(dá)的關(guān)注。

在一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)控制序列可以是指導(dǎo)造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、血小板生成譜系、肥大細(xì)胞、紅細(xì)胞生成譜系細(xì)胞、粒細(xì)胞生成譜系細(xì)胞、和單核細(xì)胞生成譜系細(xì)胞中的感興趣的多核苷酸表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞譜系特異性表達(dá)控制序列。一方面，載體包含可操作地連接到感興趣的基因的造血細(xì)胞啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。

感染性病毒顆粒和病毒原液(stocksolution)的產(chǎn)生可以使用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。制備病毒原液的方法是本領(lǐng)域已知的，例如通過(guò)以下所示，y.soneoka等.(1995)nucl.acidsres.23：628-633，和n.r.landau等.(1992)j.virol.66：5110-5113。

在特定方面中，可以通過(guò)在生產(chǎn)細(xì)胞中共表達(dá)病毒粒子包裝元件和轉(zhuǎn)移載體來(lái)產(chǎn)生基于hiv-1的病毒顆粒。這些細(xì)胞可以用一些質(zhì)粒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。通常使用3～4個(gè)質(zhì)粒，但是根據(jù)慢病毒組分分解為單獨(dú)單元的程度，該數(shù)目可以更大。例如，一種質(zhì)?？梢跃幋a來(lái)自hiv-1的病毒粒子的核和酶組分。該質(zhì)粒稱(chēng)為包裝質(zhì)粒。另一種質(zhì)粒通常編碼包膜蛋白，最常見(jiàn)的是水泡性口炎病毒(vsv-g)的g蛋白，因?yàn)槠涓叻€(wěn)定性和廣泛的向性。該質(zhì)?？梢苑Q(chēng)為包膜表達(dá)質(zhì)粒。另一種質(zhì)粒編碼待轉(zhuǎn)移到靶標(biāo)細(xì)胞的基因組，即載體本身，并稱(chēng)為轉(zhuǎn)移載體。包裝質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔的已知技術(shù)引入人類(lèi)細(xì)胞系。可以通過(guò)該技術(shù)及其變體產(chǎn)生具有幾百萬(wàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(或感染單位，iu)/毫升(tu/ml)的滴度的重組病毒。在超速離心后，可以獲得約10⁸tu/ml、10⁹tu/ml、10¹⁰tu/ml、10¹¹tu/ml、10¹²tu/ml或約10¹³tu/ml的濃縮原液。

可以使用常規(guī)技術(shù)從包裝的細(xì)胞收集感染病毒顆粒。例如，如本領(lǐng)域已知的，可以通過(guò)細(xì)胞裂解或收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液來(lái)收集感染顆粒。可選地，如果需要，可以純化收集的病毒顆粒。適合的純化技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是指遺傳物質(zhì)從病毒顆粒(例如，慢病毒)到細(xì)胞基因組(例如，原始造血細(xì)胞基因組)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)移。它還包括將非整合的病毒載體引入細(xì)胞中，其導(dǎo)致存在于病毒載體中的感興趣的基因的瞬時(shí)或附加表達(dá)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“足以增加轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的時(shí)間”是指這樣的時(shí)間段，與不存在本文所定義的化合物的情況下，類(lèi)似的細(xì)胞群體與類(lèi)似的病毒載體接觸相比，細(xì)胞群體可以與本文所定義的化合物一起培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞群體與病毒載體接觸時(shí)，使得用病毒載體以更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，其被定義為用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的百分比。在具體的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的增加表示與用單獨(dú)的病毒載體處理的未處理細(xì)胞相比，用本文所定義的化合物處理的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞富集至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。

使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，病毒可以用于在體內(nèi)、離體或體外感染細(xì)胞。例如，當(dāng)細(xì)胞(例如cd34+細(xì)胞或干細(xì)胞)離體轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，使用通常為1～100或1～50的感染復(fù)數(shù)(moi)的劑量，載體顆?？梢耘c細(xì)胞一起溫育，所述劑量也對(duì)應(yīng)于1×10⁵～100或50×10⁵個(gè)病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/10⁵個(gè)細(xì)胞。當(dāng)然，其包括對(duì)應(yīng)于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、和50moi的載體量。

在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞(例如，原始造血細(xì)胞)，可以在用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)之前和/或在轉(zhuǎn)導(dǎo)期間與本文所定義的化合物接觸(預(yù)刺激)。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞(例如，原始造血細(xì)胞)，可以在用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)之前與本文所定義的化合物接觸(預(yù)刺激)。在特定方面中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)前將細(xì)胞與本文所定義的化合物一起培養(yǎng)至少約1小時(shí)或2小時(shí)。在其他方面中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)前將細(xì)胞與本文所定義的化合物一起培養(yǎng)至少約2小時(shí)、3小時(shí)或4小時(shí)。在實(shí)施方式中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)前將細(xì)胞與本文所定義的化合物一起培養(yǎng)約1小時(shí)～約24小時(shí)、約2小時(shí)～約24小時(shí)或約2小時(shí)～約22小時(shí)的時(shí)間。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)前將細(xì)胞與本文所定義的化合物一起培養(yǎng)約2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)、13小時(shí)、14小時(shí)、15小時(shí)、16小時(shí)、17小時(shí)、18小時(shí)、19小時(shí)、20小時(shí)、21小時(shí)或22小時(shí)。

在其他方面中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)(共刺激)期間，在本文所定義的化合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞。在一方面，在轉(zhuǎn)導(dǎo)期間(共刺激)，在本文所定義的化合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞至少1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)、14小時(shí)、16小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)或24小時(shí)。在某些其他方面中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)的最初24小時(shí)期間，或在轉(zhuǎn)導(dǎo)的最初36小時(shí)或48小時(shí)期間，在本文所定義的化合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞?？梢栽谵D(zhuǎn)導(dǎo)期間的任何時(shí)間，例如在最初幾小時(shí)(即最初2小時(shí)、3小時(shí)或4小時(shí))期間，在轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)束時(shí)(在最后2小時(shí)、3小時(shí)或4小時(shí)期間)，和/或在轉(zhuǎn)導(dǎo)期的中間，在本文所定義的化合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞。

在另一方面，可以在轉(zhuǎn)導(dǎo)之前(預(yù)刺激)和轉(zhuǎn)導(dǎo)期間(共刺激)，在本文所定義的化合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞。在特定方面中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后，可沖洗或另外處理細(xì)胞群體以去除某些或全部本文所定義的化合物。

可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，基于諸如cd34、cd38和/或cd45ra等某些細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)富集起始細(xì)胞群體(即與本文所定義的化合物接觸和轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞群體)。因此，起始細(xì)胞群體可以例如富含cd34⁺細(xì)胞、cd34⁺cd45ra^-細(xì)胞或cd34⁺cd38^-細(xì)胞。此外，起始細(xì)胞群體可以直接使用或者冷凍并儲(chǔ)存以便在稍后的時(shí)間點(diǎn)使用。

因此，可以首先對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行富集或純化步驟，其包括基于特異性細(xì)胞標(biāo)志物(cd34、cd38和/或cd45ra)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行陰性和/或陽(yáng)性選擇，以提供起始細(xì)胞群體，例如提供富含hsc的起始細(xì)胞群體?；谔禺愋约?xì)胞標(biāo)志物分離所述起始細(xì)胞群體的方法可以使用熒光激活細(xì)胞分選(facs)技術(shù)或與特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物相互作用的抗體或配體結(jié)合的固體或不溶性底物。例如，可以使細(xì)胞與含有抗體的固體支撐物(例如，珠的柱、燒瓶、磁性顆粒)接觸，并除去任何未結(jié)合的細(xì)胞。當(dāng)使用包含磁性或順磁性珠的固體支撐物時(shí)，可以通過(guò)磁性分離器(磁性細(xì)胞分選，)容易地地分離與珠結(jié)合的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，起始細(xì)胞群體富含cd34⁺細(xì)胞。用于使血液細(xì)胞群體富含cd34⁺細(xì)胞的方法包括由miltenyi(cd34⁺direct試劑盒，miltenyibergisch，gladbach，德國(guó))或通過(guò)(3000)市售的試劑盒。用于從骨髓或血液富集人類(lèi)造血祖細(xì)胞的試劑盒也可商業(yè)可得的是(例如，stemsep^tm人類(lèi)造血祖細(xì)胞富集試劑盒)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，起始細(xì)胞群體源自已富含cd34+細(xì)胞的新生兒臍帶血細(xì)胞。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所述起始細(xì)胞群體源自一個(gè)或兩個(gè)臍帶血單位。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，起始細(xì)胞群體源自已富含cd34⁺細(xì)胞的人動(dòng)員的外周血細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，起始細(xì)胞群體可以?xún)?yōu)選包含至少50％的cd34⁺細(xì)胞，在某些實(shí)施方式中，大于60％、70％、80％、90％或95％的cd34⁺細(xì)胞。

在轉(zhuǎn)導(dǎo)之前、期間和/或之后，可以在適合于細(xì)胞的維持、生長(zhǎng)或增殖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞群體的培養(yǎng)條件將根據(jù)不同的因素，特別是起始細(xì)胞群體而變化。適合的培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域眾所周知的。就組合物而言，本發(fā)明的方法可以在天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基中進(jìn)行，就形狀而言，可以在固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，用于hsc和/或造血祖細(xì)胞培養(yǎng)的任何營(yíng)養(yǎng)物培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有一種或多種上述因子。這樣的培養(yǎng)基通常包含鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、氨基酸、維生素、細(xì)胞因子、激素、抗生素、血清、脂肪酸、糖類(lèi)等。在培養(yǎng)中，其他化學(xué)組分或生物組分可以根據(jù)需要單獨(dú)或組合摻入。摻入培養(yǎng)基中的這些組分可以是胎牛血清、人血清、馬血清、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、一硫代甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種氨基酸、瓊脂、瓊脂糖、膠原蛋白、甲基纖維素、各種細(xì)胞因子、各種生長(zhǎng)因子等。適合于擴(kuò)增hsc的方法的所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)例包括但不限于stemspan^tm無(wú)血清擴(kuò)增培養(yǎng)基(sfem)(stemcellvancouver，加拿大)、stemspan^tmh3000-定義培養(yǎng)基(stemcellvancouver，加拿大)、cellgro^tm、scgm(cellgenix^tm，freiburg，德國(guó))、stempro^tm-34sfmdulbecco's改良的eagles's培養(yǎng)基(dmem)、ham's營(yíng)養(yǎng)物混合物h12混合物f12、mccoy's5a培養(yǎng)基、eagles's最小必需培養(yǎng)基(emem)、αmem培養(yǎng)基(α改良的eagles's最小必需培養(yǎng)基)、rpmi1640培養(yǎng)基、isocove's改良的dulbecco's培養(yǎng)基(imdm)、stempro34^tmx-vivo^tm10x-vivo^tm15和stemline^tmii

轉(zhuǎn)導(dǎo)后，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可在適于其維持、生長(zhǎng)和/或增殖的條件下培養(yǎng)。在特定方面中，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在移植前培養(yǎng)約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。

用于保持和/或擴(kuò)增諸如hsc等原始造血細(xì)胞的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域眾所周知的。通常，培養(yǎng)條件包括使用本領(lǐng)域通常已知的用于hsc擴(kuò)增的因子，例如細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。這樣的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子可以是生物制劑或小分子，它們包括但不限于il-1、il-3、il-6、il-11、g-csf、gm-csf、scf、fit3-l、血小板生成素(tpo)、促紅細(xì)胞生成素及其類(lèi)似物。如本文使用的，“類(lèi)似物”包括具有作為天然存在形式的生物活性的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的任何結(jié)構(gòu)變體，其包括但不限于具有比天然存在形式或細(xì)胞因子受體激動(dòng)劑(諸如針對(duì)tpo受體的激動(dòng)劑)抗體增強(qiáng)或降低的生物活性的變體(例如專(zhuān)利公開(kāi)wo2007/145227中詳述的vb22bsc(fv)2等)。選擇細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的組合以維持/擴(kuò)增hsc和祖細(xì)胞，同時(shí)限制終末分化的細(xì)胞的產(chǎn)生。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，一種或多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子選自由scf、flt3-l和tpo組成的組。培養(yǎng)基可以補(bǔ)充促進(jìn)hsc擴(kuò)增的因子，包括sr1。此外，考慮到本文所定義的化合物已經(jīng)顯示促進(jìn)hsc擴(kuò)增的事實(shí)(參見(jiàn)wo2013/110198)，可以在擴(kuò)增期期間將該化合物進(jìn)一步加入培養(yǎng)基中。

人il-6或白介素-6(也稱(chēng)為b細(xì)胞刺激因子2)已通過(guò)(kishimoto，ann.reviewof1mm.23:12005)進(jìn)行描述并且是可商業(yè)可得的。人scf或干細(xì)胞因子(也稱(chēng)為c-kit配體，肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子或青灰因子)描述于(smith，ma等，actahaematologica，105，3：143，2001)并且是可商業(yè)可得的。flt3-l或flt-3配體(也稱(chēng)為fl)是結(jié)合flt3受體的因子。其描述于(hannumc，nature368(6472)：643-8)，并且是可商業(yè)可得的。tpo或血小板生成素(也稱(chēng)為巨核細(xì)胞生長(zhǎng)因子(mgdf)或c-mpl配體)描述于(kaushanskyk(2006).n.engl.j.med.354(19)：2034-45)，并且是可商業(yè)可得的。

上述化學(xué)組分和生物組分不僅可以通過(guò)將它們加入到培養(yǎng)基中，而且可以通過(guò)將其固定在用于培養(yǎng)的基底或支持物的表面上來(lái)使用，具體而言，通過(guò)將所用的組分溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲校盟萌芤和扛不谆蛑С治?，然后洗去多余的組分?？梢詫⒋玫拇祟?lèi)組分加入到預(yù)先用結(jié)合到該組分上的物質(zhì)涂覆的基底或支持物上。

諸如hsc等原始造血細(xì)胞可以在通常用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，例如陪替氏培養(yǎng)皿、燒瓶、塑料袋、teflon^tm袋，可選地，其在用細(xì)胞外基質(zhì)或細(xì)胞粘附分子的預(yù)先涂覆之后進(jìn)行。這種涂覆材料可以是i～xix型膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白1～12、氮、腱生蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、血管性血友病因子、骨皮質(zhì)素、纖維蛋白原、各種彈性蛋白、各種蛋白聚糖、各種鈣粘蛋白、橋粒芯蛋白(desmocolin)、橋粒核心糖蛋白(desmoglein)、各種整聯(lián)蛋白、e-選擇蛋白、p-選擇蛋白、l-選擇蛋白、免疫球蛋白超家族、聚-d-賴(lài)氨酸、聚-l-賴(lài)氨酸、殼多糖、殼聚糖、藻酸凝膠、水凝膠或其片段。這種涂覆材料可以是具有人工修飾的氨基酸序列的重組材料。諸如hsc等原始造血細(xì)胞可以通過(guò)使用生物反應(yīng)器來(lái)培養(yǎng)，所述生物反應(yīng)器可以機(jī)械控制培養(yǎng)基組成、ph等并獲得高密度培養(yǎng)物(chwartzrm，proc.natl.acad.sci.u.s.a.，88：6760，1991；kollermr，bonemarrowtransplant，21：653，1998；koller，mr，blood，82：378，1993；astorig，bonemarrowtransplant，35：1101，2005)。

然后可以沖洗細(xì)胞群體以去除本發(fā)明的化合物或組合物和/或細(xì)胞培養(yǎng)物的任何其他組分，并重懸浮于適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸浮培養(yǎng)基中，以用于短期使用或用在長(zhǎng)期存儲(chǔ)的培養(yǎng)基中，例如適合于冷凍保存的培養(yǎng)基，例如具有40％fcs和10％dmso的dmem。用于制備培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍原液的其他方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是可得的。

本發(fā)明還提供通過(guò)本文所述的方法獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群體。本發(fā)明還提供了包含通過(guò)本文所述的方法獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞群體。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞群體包含至少約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，即其包含病毒載體和/或表達(dá)在病毒載體中存在的感興趣的基因。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含在培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物的基于細(xì)胞的組合物，所述培養(yǎng)基包含病毒載體和至少一種本文所定義的化合物。如本文通篇所述，在特定方面中，本發(fā)明組合物和方法對(duì)于離體和體內(nèi)基于細(xì)胞的基因療法是有用的。在某些方面中，細(xì)胞培養(yǎng)基是藥學(xué)上可接受的細(xì)胞培養(yǎng)基。

本發(fā)明的制劑和組合物可以包含配制在藥學(xué)上可接受的或生理學(xué)上可接受的溶液(例如，培養(yǎng)基)中的轉(zhuǎn)導(dǎo)或非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或其組合、病毒載體、多肽、多核苷酸、和一種或多種化合物(例如本文所定義的化合物)的任何數(shù)量的組合，其用于單獨(dú)或與一種或多種其他治療形式組合施用于細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物。

本發(fā)明進(jìn)一步包括藥物組合物，其包含根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載劑。在其他方面中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含病毒載體和一種或多種本文所定義的化合物。

短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)施用于人時(shí)不產(chǎn)生過(guò)敏或類(lèi)似的不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。含有蛋白質(zhì)作為活性成分的水性組合物的制備在本領(lǐng)域是眾所周知的。通常，將這樣的組合物制備為可注射的液體溶液或懸浮液；也可以制備適于在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式。制劑也可以是乳化的。

如本文使用的，“載劑”包括任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、載體、涂料、稀釋劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖液、載劑溶液、懸浮液、膠體等。此類(lèi)介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域眾所周知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性成分不相容，否則考慮其在治療組合物中的用途。也可以將補(bǔ)充的活性成分摻入組合物中。

如本文使用的“藥學(xué)上可接受的載劑”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、涂料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等，其包括藥學(xué)上可接受的細(xì)胞培養(yǎng)基。在一方面，包含載劑的組合物適合于腸外施用，例如血管內(nèi)(靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi))、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)施用。藥學(xué)上可接受的載劑包括無(wú)菌水溶液或分散液和用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。所述介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域眾所周知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞不相容，否則考慮其在本發(fā)明的藥物組合物中的用途。

本發(fā)明的組合物可以包含配制在藥學(xué)上可接受的或生理學(xué)上可接受的溶液中的一種或多種多肽、多核苷酸、包含其的載體、化合物和轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞等，以用于單獨(dú)或與一種或多種其他治療方式組合施用于細(xì)胞或動(dòng)物。還應(yīng)理解的是，如果需要，本發(fā)明的組合物也可以與其他試劑組合施用，例如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素、小分子或各種藥學(xué)活性劑。

在特定方面中，用本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或靶標(biāo)細(xì)胞表達(dá)治療性多肽，并施用于受試者以治療和/或預(yù)防疾病、紊亂或病癥。

轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和相應(yīng)的病毒載體提供改善的基因療法。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“基因療法”是指將基因引入細(xì)胞的基因組中。在各個(gè)方面中，本發(fā)明的病毒載體包含表達(dá)編碼多肽的治療性轉(zhuǎn)基因的造血表達(dá)控制序列，所述治療性轉(zhuǎn)基因?yàn)樵\斷為或懷疑患有單基因疾病、紊亂或疾病，或者的適于造血干細(xì)胞治療的疾病、紊亂或病癥的受試者提供治療性、預(yù)防性或改善益處。

本發(fā)明考慮本發(fā)明的載體、病毒顆粒和轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞用于在受試者中治療、預(yù)防和/或改善造血系統(tǒng)的單基因疾病、紊亂或病癥或者造血系統(tǒng)的疾病、紊亂或病癥，例如血紅蛋白病。血紅蛋白病是指涉及血液中存在異常血紅蛋白分子的病癥。血紅蛋白病的實(shí)例包括但不限于血紅蛋白c病、血紅蛋白鐮狀細(xì)胞病(scd)、鐮狀細(xì)胞性貧血、和地中海貧血。還考慮治療、預(yù)防和/或改善適于基于hsc的基因療法的其他疾病，其包括某些血液學(xué)和溶酶體貯積疾病(諸如威斯科特-奧爾德里奇綜合癥(was)(aiuti等，science341(6148))、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(mld)(biffi等，science341(6148))、白細(xì)胞粘附缺陷、x連鎖cgd、范可尼貧血、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、粘多糖病iiia)，免疫缺陷(諸如嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(scid)和腺苷脫氨酶(ada)缺乏)，和感染性疾病(諸如hiv(watts等，cytotherapy13(10)：1164-71))。對(duì)于這樣的治療，病毒載體包含編碼一種或多種在疾病中有缺陷的蛋白質(zhì)的核酸。病毒載體(例如整合缺陷型病毒載體)還可以例如包含編碼抗原或免疫原(用于疫苗接種)或一種或多種分化因子(用于細(xì)胞重編程)的核酸。

本發(fā)明還提供了治療需要用細(xì)胞基因療法進(jìn)行治療的受試者的方法，所述方法包括對(duì)所述受試者施用有效量的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群體或包含本文所定義的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群體的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括：(i)在本文所定義的通式i化合物存在下將病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入來(lái)自所述受試者的細(xì)胞中，從而獲得包含轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的群體；和(ii)對(duì)所述受試者施用有效量的(i)中獲得的包含轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的群體，或包含所述含轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群體的藥物組合物。

本發(fā)明還提供了包含通過(guò)本文所定義的方法獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(或包含其的藥物組合物)群體用于治療需要用細(xì)胞基因療法進(jìn)行治療的受試者的用途。本發(fā)明還提供了包含通過(guò)本文所定義的方法(或包含其的藥物組合物)獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群體在制備用于治療需要用細(xì)胞基因療法進(jìn)行治療的受試者的藥物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述用途包括：(i)進(jìn)行將病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入本文所定義的細(xì)胞中以獲得包含轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的群體的方法，和(ii)使用(i)中獲得的包含轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的群體(或包含其的藥物組合物)以治療需要用細(xì)胞基因療法進(jìn)行治療的受試者。

包含轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的藥物組合物以用于本文所述方法的任何常規(guī)方式配制。通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知有效的任何途徑進(jìn)行施用。例如，組合物經(jīng)口、腸胃外(例如靜脈內(nèi))、通過(guò)肌內(nèi)注射、通過(guò)腹膜內(nèi)注射、經(jīng)皮、體外、鼻內(nèi)或局部施用。

優(yōu)選的施用方法是靜脈內(nèi)輸注。輸入的細(xì)胞數(shù)量將考慮諸如性別、年齡、體重、疾病或病癥的類(lèi)型、病癥的階段、細(xì)胞群體中所需細(xì)胞的百分比和產(chǎn)生治療益處所需細(xì)胞的量等因素。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物通過(guò)靜脈內(nèi)輸注施用，并且對(duì)于臍帶血包含至少≥0.3×10⁵個(gè)cd34⁺細(xì)胞/kg或>2×10⁶個(gè)cd34⁺細(xì)胞，對(duì)于骨髓或動(dòng)員外周血細(xì)胞包含2.5×10⁵個(gè)cd34⁺細(xì)胞/kg以上。

本文還提供了試劑盒，其包含填充有一種或多種本文所述組分的一個(gè)或多個(gè)容器?？蛇x地，所述試劑盒包含需要或期望的溶液和緩沖液?？蛇x地，試劑盒包含通過(guò)上述方法制備的細(xì)胞群體，例如干細(xì)胞，或者可以包含用于制備hsc群體的容器或組合物。特別是，本發(fā)明提供了用于離體轉(zhuǎn)導(dǎo)諸如原始造血細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞)等細(xì)胞的試劑盒，其包含本文所定義的化合物，及在細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)方法中使用這種化合物的說(shuō)明書(shū)，及可選地，一種或多種細(xì)胞因子，或用于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，特別是用于如上所述的hsc生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。試劑盒可以進(jìn)一步包含用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的病毒載體，例如包含感興趣的基因的病毒載體。試劑盒可以進(jìn)一步包含用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，例如抗cd34、抗cd38和/或抗cd45ra抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，這樣的試劑盒進(jìn)一步包含選自由il6、flt3-l、scf和tpo組成的組中的一種或多種細(xì)胞擴(kuò)增因子。

本發(fā)明的方法和組合物可用于其中高基因轉(zhuǎn)移是有利條件的各種應(yīng)用，包括體外研究(例如，基因的功能研究、具有特定功能的基因的篩選、基因表達(dá)分析、基因編輯)，體內(nèi)研究(例如，功能性研究、基因療法途徑的評(píng)估)。

不希望受任何特定理論的束縛，預(yù)期本發(fā)明的組合物和方法可用于以顯著更少的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著更多的細(xì)胞，從而使治療性細(xì)胞的基因組中原癌基因的基因組改變和/或插入激活的風(fēng)險(xiǎn)最小化。最小化原癌基因的插入激活和治療性細(xì)胞中其他基因組改變的風(fēng)險(xiǎn)是設(shè)計(jì)合適的基因療法方案的重要考慮因素，因?yàn)槠涫拱犹卣鞯霓D(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞在體內(nèi)克隆擴(kuò)增并產(chǎn)生癌癥、腫瘤或涉及異常細(xì)胞增殖的其他疾病的機(jī)會(huì)最小化。此外，本領(lǐng)域已經(jīng)注意到，使用大量病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)通常對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。因此，本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)一步增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的存活性。因此，本發(fā)明提供了更安全和更有效的基因療法。

除非本文中另有說(shuō)明，否則本文中數(shù)值范圍的列舉僅旨在用作單獨(dú)涉及落在該范圍內(nèi)的每個(gè)單獨(dú)值的速記方法，并且將每個(gè)單獨(dú)值如同其在本文中單獨(dú)列舉一樣并入本說(shuō)明書(shū)中。該范圍內(nèi)的值的所有子集也如同它們?cè)诒疚闹袉为?dú)列舉一樣并入本說(shuō)明書(shū)中。

類(lèi)似地，本文中具有各種取代基和針對(duì)這些取代基列舉的各種殘基的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)旨在用作分別指通過(guò)任何取代基的任何殘基的組合獲得的每個(gè)和每種分子用于任何取代基的簡(jiǎn)化方法。每個(gè)單獨(dú)的分子如同其在本文中被單獨(dú)引用一樣并入本說(shuō)明書(shū)中。此外，一般化學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)的分子的所有子集也如同它們?cè)诒疚闹袉为?dú)引用一樣并入本說(shuō)明書(shū)中。

本文中，術(shù)語(yǔ)“約”具有其通常的含義。術(shù)語(yǔ)“約”用于表示包括用于確定該值的裝置或方法的誤差的固有變化的值，或包括接近所述值的值，例如在所述值(或值的范圍)的10％或5％內(nèi)。

執(zhí)行本發(fā)明的方式

本發(fā)明通過(guò)以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

與實(shí)施例1相關(guān)的材料和方法(圖1～4)

人cd34⁺臍帶血細(xì)胞收集

使用rosettesep^tmcd34預(yù)富集混合物分離人cd34⁺臍帶血(cb)細(xì)胞，然后使用easysep^tm(stemcelltechnologies)進(jìn)行cd34陽(yáng)性選擇。

cd34⁺細(xì)胞培養(yǎng)

將人cd34⁺細(xì)胞在由stemspansfem(stemcelltechnologies)組成的hsc擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有人100ng/ml干細(xì)胞因子(scf，r&dsystems)、100ng/mlfms樣酪氨酸激酶3配體(flt3，r&dsystems)、50ng/ml血小板生成素(tpo，r&dsystems)、和10g/ml低密度脂蛋白(stemcelltechnologies)。

化合物

cmpd1[35nm]、sr1(alichem，41864)[750nm]或者cmpd1[35nm]+sr1[500nm]的組合。

慢病毒載體制備

用以下質(zhì)粒對(duì)hek293細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染：pccl-c-mndu-egfp、pcmv-gag/pol(plp1；sigma)、prsv-rev(plp2；sigma)和pcmv-vsv/g(plp；sigma)或pcmv-rdt。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)后收集慢病毒湯狀物。通過(guò)peg-it^tm(systembiosciences)沉淀濃縮慢病毒顆粒。在hek293細(xì)胞上進(jìn)行病毒滴度測(cè)量。為了增強(qiáng)慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，根據(jù)制造商的指南將慢病毒預(yù)裝載到retronectin(takara)包被的平板中。

人cd34+cb細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)

新鮮的(24小時(shí)或48小時(shí)預(yù)刺激的)或培養(yǎng)的cd34⁺cb細(xì)胞通過(guò)moi為10、50或100的vsv或rdt包膜的gfp病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)12小時(shí)或16小時(shí)。然后沖洗細(xì)胞，并在感染后保持培養(yǎng)中3天或10天。進(jìn)行facs分析以監(jiān)測(cè)gfp轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在總的、cd34⁺或cd34⁺cd45ra^-群體的百分比。

流式細(xì)胞術(shù)

在bdlsrii細(xì)胞儀上進(jìn)行流式細(xì)胞分析。新鮮的或培養(yǎng)的gfp-轉(zhuǎn)導(dǎo)的cd34⁺cb細(xì)胞在4℃在補(bǔ)充有2％胎牛血清(fbs)的pbs中用apc-標(biāo)記的抗人cd34(bdbiosciences)和pe-標(biāo)記的抗人cd45ra(bdbiosciences)染色15分鐘。使用bdfacsdiva^tm軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

異種移植

所有使用動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)在由蒙特利爾大學(xué)的動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)的方案下進(jìn)行。通過(guò)尾靜脈注射將對(duì)于10天的載體(dmso)或cmpd1[35nm]而言經(jīng)gfp-轉(zhuǎn)導(dǎo)或未擴(kuò)增的1000個(gè)cd34⁺cb細(xì)胞的后代移植到亞致死性照射(250cgy，<移植前24小時(shí))8周～12周齡的雌性nsg(nodscidll2rγnull，jacksonlaboratory)中。在移植后30周通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)nsg骨髓(bm)中的人細(xì)胞。通過(guò)沖洗兩個(gè)股骨、脛骨和髖部收集nsgbm細(xì)胞。然后用1×紅細(xì)胞裂解緩沖液(stemcelltechnologies)處理細(xì)胞，并用太平洋藍(lán)標(biāo)記的抗人cd45(biolegend)、apc-efluo-標(biāo)記的780抗小鼠cd45(ebioscience)染色以監(jiān)測(cè)nsgbm細(xì)胞中的人血液重建。

實(shí)施例1～9涉及的材料和方法(圖5～20)

病毒載體和病毒生產(chǎn)

除非另有說(shuō)明，在這些研究中使用pcci-c-mnduspgkgfp或pcci-c-mnduspgkyfp慢病毒載體骨架(loganac等，humangenetherapy2004)。對(duì)載體構(gòu)建體進(jìn)行序列驗(yàn)證。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的4-質(zhì)粒包裝系統(tǒng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞產(chǎn)生用水泡性口炎病毒糖蛋白-g假型化的高滴度重組病毒。通過(guò)超速離心濃縮含病毒的上清液以達(dá)到0.5×10⁹～5×10⁹感染單位/ml的滴度。通過(guò)用慢病毒載體的三個(gè)稀釋液轉(zhuǎn)導(dǎo)hela細(xì)胞來(lái)測(cè)定病毒滴度。對(duì)于慢病毒的非整合制劑的測(cè)試，在修飾的骨髓增生性肉瘤病毒ltr(mnd-gfp-idlv)的控制下表達(dá)gfp的慢病毒載體的病毒上清液(dr.donaldkohn贈(zèng)與，微生物學(xué)、免疫學(xué)和分子遺傳學(xué)系和兒科系，加州大學(xué)洛杉磯分校)，使用催化失活的整合酶產(chǎn)生(joglekarav等，molther.2013年9月；21(9)：1705-17，pmid23857176)。

人臍帶血、動(dòng)員的外周血和成體骨髓細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

根據(jù)英屬哥倫比亞大學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的程序同意收集臍帶血(cb)和動(dòng)員的外周血(mpb)細(xì)胞。cd34⁺富集的成體骨髓細(xì)胞購(gòu)自stemcelltechnologies。使用第一rosettesep^tmcd34預(yù)富集混合物(stemcelltechnologies)將cd34⁺cb和mpb細(xì)胞富集至>90％的純度，然后使用磁珠(easysep試劑盒，stemcelltechnologies)進(jìn)行陽(yáng)性選擇。在某些情況下，通過(guò)使用influxii分選儀(bdbioscience)分選cd34⁺細(xì)胞進(jìn)行額外的富集。cd34⁺cb細(xì)胞在補(bǔ)充有100ng/mlflt3-配體(fl)、100ng/ml青灰因子(steelfactor，sf)、20ng/mlil-3、il-6和粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)(全部來(lái)自stemcelltechnologies)的無(wú)血清培養(yǎng)基(sfm；補(bǔ)充有牛血清白蛋白、胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白(bit，stemcelltechnologies)、10μg/ml低密度脂蛋白(ldl，stemcelltechnologies)、10^-4m2-巰基乙醇(sigma-aldrich)、10^-4mglutamax500(stemcelltechnologies)、青霉素和鏈霉素的iscove's培養(yǎng)基)中預(yù)刺激16小時(shí)。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，cb細(xì)胞在僅有3種生長(zhǎng)因子(100ng/mlfl、100ng/mlsf和50ng/mltpo(stemcelltechnologies))的存在下預(yù)刺激。成體bm和mpbcd34⁺細(xì)胞在補(bǔ)充有100ng/mlfl、100ng/ml青灰因子sf、100ng/mltpo和20ng/mlil-3的sfm中預(yù)刺激24小時(shí)。細(xì)胞在存在或不存在cmpd1(35nm)、sr1(0.75μμ)或dmso(不超過(guò)0.01％)時(shí)進(jìn)行預(yù)刺激。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在存在或不存在cmpd1(35nm)時(shí)，在預(yù)刺激期期間加入雷帕霉素(10μg/ml)。

人cd34⁺細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)

在預(yù)刺激結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞重懸于補(bǔ)充新鮮生長(zhǎng)因子的sfm中，所述sfm具有濃縮的慢病毒(gfp或yfp，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，還使用珠蛋白、na10hd、mn1、和nd13病毒)和5μg/ml硫酸魚(yú)精蛋白，并在1×10⁶iu/ml或1×10⁷iu/ml的病毒濃度下在37℃溫育6小時(shí)(對(duì)于)，和24小時(shí)(對(duì)于bm和mpb細(xì)胞)，并置于包被有5μg/cm²纖連蛋白(sigma-aldrich)的96孔板上。在存在或不存在cmpd1(35nm)、sr1(0.75μμ)或dmso(不超過(guò)0.01％)的情況下轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，還在存在或不存在cmpd1(35nm)的情況下在雷帕霉素(10μg/ml)的存在下轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在感染結(jié)束時(shí)，用pbs沖洗細(xì)胞幾次，并用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，并在補(bǔ)充新鮮生長(zhǎng)因子的sfm中再培養(yǎng)72小時(shí)。用以下抗人特異性抗體(全部來(lái)自ebioscience，除非另有說(shuō)明)在細(xì)胞染色后測(cè)定基因轉(zhuǎn)移至各種cd34⁺細(xì)胞亞群的效率：cd34-apc(克隆8g12，stemcelltechnologies)、cd38-pecy7(克隆hit2)、thy1-pe(克隆ebio5e10)、cd45ra-apc780(克隆hi100)和cd49f-ef450(克隆ebiogoh3)。所有流式細(xì)胞分析使用lsrii(bdbiosciences)進(jìn)行。

小鼠

nod.cg-prkdc^scidii2rγ^tm1wj1/szj(nod/scid-il-2rγc-null，nsg)(最初獲自jacksonlabs)小鼠在英屬哥倫比亞癌癥研究中心的動(dòng)物資源中心繁殖。所有小鼠實(shí)驗(yàn)程序由英屬哥倫比亞大學(xué)批準(zhǔn)根據(jù)加拿大動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)指南進(jìn)行。

異種移植和體內(nèi)跟蹤在小鼠中轉(zhuǎn)導(dǎo)的人細(xì)胞

在異種移植研究中，在移植前24小時(shí)對(duì)8周～12周齡的nsg小鼠進(jìn)行亞致死性照射(¹³⁷csγ射線的315cgy)24小時(shí)。在競(jìng)爭(zhēng)性再增殖測(cè)定中，在存在cmpd1和存在dmso時(shí)每只小鼠靜脈內(nèi)注射20,000個(gè)cd34+cb轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的后代。對(duì)于有限稀釋實(shí)驗(yàn)，在cmpd1或dmso的存在下，小鼠接受20,000個(gè)、4,000個(gè)或800個(gè)cd34+cb轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的后代。通過(guò)在移植后3周、12周、20周和25周的bm抽吸以及對(duì)表達(dá)gfp和yfp的人細(xì)胞進(jìn)行的facs分析，監(jiān)測(cè)nsg骨髓(bm)中的人淋巴-骨髓樣重建30周。在紅細(xì)胞裂解后，將bm細(xì)胞與封閉試劑(具有2％fbs、5％人血清、抗cd16/cd32抗體(2.4g2)的pbs)溫育，并用以下抗人特異性抗體染色：cd45-alexa700(克隆hi30，biolegend)、cd33-pecy7(克隆wm-53，ebioscience)、cd19-pe(克隆，hib19，biolegend)、cd20-pe(克隆l27，stemcelltechnologies)。每只小鼠分析最少200,000個(gè)bm細(xì)胞。全部流式細(xì)胞分析使用lsrii(bdbiosciences)進(jìn)行。全部流式細(xì)胞數(shù)據(jù)使用軟件(version8.8，treestar)分析。

移植和轉(zhuǎn)導(dǎo)獼猴動(dòng)員的bm細(xì)胞的體內(nèi)跟蹤

將g-csf/scf動(dòng)員的bmcd34⁺細(xì)胞分成兩部分。在sr1(1μμ)和細(xì)胞因子(青灰因子、flt3-l和tpo)的存在下，用表達(dá)mcherry的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)一部分，在sr1和cmpd1(40nm)和相同的細(xì)胞因子的存在下用表達(dá)gfp的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)第二部分。在存在或不存在cmpd1(40nm)的情況下擴(kuò)增10天后，在動(dòng)物接受清髓性預(yù)處理(1020cgy照射)后，將兩種基因修飾的細(xì)胞部分共同輸注到原始hsc獼猴供體中。

統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果顯示為平均值±sem或sd和幾何值±sd。使用在prismgraphpad上直接計(jì)算的學(xué)生t檢驗(yàn)(成對(duì)的或不成對(duì)的，選擇適當(dāng)?shù)?評(píng)估組之間的差異。*p值<0.05被認(rèn)為是顯著的。

實(shí)施例1：cmpd1增強(qiáng)慢病毒基因轉(zhuǎn)移至人類(lèi)造血細(xì)胞的效率。

圖1顯示用cmpd1和sr1擴(kuò)增的人cd34⁺臍帶血(cb)細(xì)胞比未操作的細(xì)胞更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天和10天，與dmso對(duì)照相比，cmpd1處理的細(xì)胞顯示更高百分比的gfp轉(zhuǎn)導(dǎo)的cd34⁺和cd34⁺cd45ra^-細(xì)胞(圖2)。圖3和4顯示，與dmso對(duì)照相比，gfp轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增的cmpd1-cd34⁺cb細(xì)胞顯示人cd45植入的更好的移入潛能。同時(shí)，圖5a和5b中描繪的數(shù)據(jù)表明，如對(duì)來(lái)自臍帶血的富含cd34⁺干細(xì)胞/祖細(xì)胞的細(xì)胞在感染后3天所評(píng)估得，人造血細(xì)胞對(duì)cmpd1的短期暴露可以顯著增強(qiáng)慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)約70％。這種差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，并且sr1未觀察到，sr1為另一種具有刺激原始人類(lèi)造血細(xì)胞擴(kuò)增能力的小分子。

實(shí)施例2：僅在預(yù)刺激或轉(zhuǎn)導(dǎo)期期間短期暴露于cmpd1，足以在廣泛的滴度范圍內(nèi)增強(qiáng)慢病毒介導(dǎo)的對(duì)原始人類(lèi)造血細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。

圖6a～6g中描述的結(jié)果證明cmpd1對(duì)基因轉(zhuǎn)移的刺激效在寬范圍的病毒滴度中存在。在較低的病毒濃度下，其效果強(qiáng)烈。例如，病毒濃度為10⁵的基因轉(zhuǎn)移等價(jià)于僅在不存在cmpd1時(shí)約100倍以上的病毒濃度實(shí)現(xiàn)的基因轉(zhuǎn)移。即使在使用最高病毒濃度時(shí)，當(dāng)細(xì)胞在預(yù)刺激或轉(zhuǎn)導(dǎo)期期間暴露于cmpd1時(shí)，存在增強(qiáng)的基因轉(zhuǎn)移。重要的是，該效果在高度純化的造血細(xì)胞亞群中是明顯的，其包括包含hsc的cd34⁺cd38^-和cd34⁺cd45ra^-。另外感興趣的是，即使在短期暴露于cmpd1的情況下，包括轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的各種cd34⁺亞群的產(chǎn)率也有額外的增加。

實(shí)施例3：對(duì)cmpd1的短期暴露(22小時(shí))增強(qiáng)了基因轉(zhuǎn)移至人類(lèi)hsc。

圖7a～7h中描述的數(shù)據(jù)顯示cmpd1增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)移至真正淋巴-骨髓樣長(zhǎng)期再增殖細(xì)胞(hsc)。通過(guò)使用競(jìng)爭(zhēng)性移植方法，在存在或不存在cmpd1的情況下轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞直接在相同接收者中針對(duì)體內(nèi)再增殖進(jìn)行評(píng)估，提供獨(dú)特的能力來(lái)解決差異。與造血亞群體的體外分析顯示的相比，cmpd1的增強(qiáng)的量度是9倍或甚至更大。這可能是由于與晚期細(xì)胞相比，cmpd1對(duì)真正hsc的基因轉(zhuǎn)移的甚至更大的影響，以及甚至在短(22小時(shí))培養(yǎng)期間hsc產(chǎn)率的可能增強(qiáng)。

實(shí)施例4：在nsg小鼠中cmpd1刺激基因轉(zhuǎn)移至人cd34⁺cb細(xì)胞(體外)和人hsc的增強(qiáng)。

圖8a～8e和圖9a～9d中描述的結(jié)果證實(shí)了cmpd1對(duì)刺激基因轉(zhuǎn)移至人臍帶血hsc的顯著影響。圖9a～9d證實(shí)了在體外和在使用不同來(lái)源的cb和病毒的移植后評(píng)估的基因轉(zhuǎn)移至cb細(xì)胞的的增強(qiáng)。不論細(xì)胞是否暴露于cmpd1，在移植接收者中觀察到等同的嵌合體總水平，因此提供了cmpd1對(duì)hsc產(chǎn)率沒(méi)有顯著影響的證據(jù)。然而，來(lái)自標(biāo)記的gfp細(xì)胞的嵌合體的評(píng)估證實(shí)當(dāng)在cmpd1存在下轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞時(shí)顯著增加。這種增加在一定范圍的移植劑量下是明顯的。在此實(shí)驗(yàn)中評(píng)估的基因轉(zhuǎn)移至hsc的總體增加為約16倍。

實(shí)施例5：短期暴露于cmpd1僅2小時(shí)增加了基因轉(zhuǎn)移至原始人類(lèi)造血細(xì)胞的效率。

圖10a～10q顯示在轉(zhuǎn)導(dǎo)期的開(kāi)始(條件iv)或結(jié)束(條件v)時(shí)，細(xì)胞暴露僅2小時(shí)，觀察到基因轉(zhuǎn)移至cd34⁺細(xì)胞和cd34⁺亞群的顯著增加。在轉(zhuǎn)導(dǎo)期結(jié)束時(shí)暴露2小時(shí)達(dá)到轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的最大基因轉(zhuǎn)移和產(chǎn)率，并且其等同于在整個(gè)預(yù)刺激(16小時(shí)，條件iii)期間暴露所達(dá)到的轉(zhuǎn)移。重要的是，高度富含hsc/祖細(xì)胞(cd34⁺cd38^-cd45ra^-cd90⁺)的大量cd34⁺細(xì)胞和亞群觀察到這些結(jié)果。同時(shí)，圖11a和11b中描述的數(shù)據(jù)顯示在無(wú)預(yù)刺激時(shí)暴露于cmpd1的所有條件下都觀察到增加的基因轉(zhuǎn)移和產(chǎn)率，其包括在轉(zhuǎn)導(dǎo)期的前2小時(shí)或最后2小時(shí)內(nèi)僅暴露2小時(shí)。

實(shí)施例6：cmpd1增加基因轉(zhuǎn)移至擴(kuò)展到成體骨髓和成體動(dòng)員的外周血來(lái)源的原始造血細(xì)胞的能力。

圖12a和12b中描繪的數(shù)據(jù)提供了cmpd1增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)移至除臍帶血中的細(xì)胞以外，包括成體骨髓和成體動(dòng)員的外周血來(lái)源的原始造血細(xì)胞的能力的證據(jù)。

實(shí)施例7：使用具有不同包膜的慢病毒載體，非整合型慢病毒，并且在不同條件下暴露于cmpd1增加了基因轉(zhuǎn)移至cd34⁺cb細(xì)胞的效率。

cmpd1增強(qiáng)了使用用vsv-g和rd114(圖13a和13b)假型化(攜帶包膜)的慢病毒的基因轉(zhuǎn)移，因此表明cmpd1可以增強(qiáng)在更寬范圍的假型病毒中的基因轉(zhuǎn)移。圖13d進(jìn)一步顯示cmpd1增強(qiáng)了使用催化失活的整合酶產(chǎn)生的慢病毒的瞬時(shí)基因轉(zhuǎn)移效率，因此使慢病毒非整合(整合缺陷型慢病毒，idlv)。圖14和14b的結(jié)果證明了cmpd1刺激基因轉(zhuǎn)移至原始人造血細(xì)胞的能力不限于特定的生長(zhǎng)因子混合物，而是出現(xiàn)在于不同生長(zhǎng)因子組合存在下培養(yǎng)的細(xì)胞中。此外，圖15a～15d中描繪的數(shù)據(jù)表明cmpd1刺激基因轉(zhuǎn)移至原始人類(lèi)造血細(xì)胞的能力擴(kuò)展至多個(gè)慢病毒載體，因此不限于獨(dú)特的載體。

實(shí)施例8：基因轉(zhuǎn)移至原始人造血細(xì)胞的增強(qiáng)與對(duì)于擴(kuò)增刺激有活性的cmpd1變體相關(guān)。

圖16a和16b顯示已知對(duì)人cd34⁺細(xì)胞(化合物3～6)的擴(kuò)增具有活性的cmpd1和cmpd1的其他變體增加了基因轉(zhuǎn)移至人cd34⁺cb細(xì)胞和不同cd34⁺亞群的效率。同時(shí)，對(duì)于cmpd1的較少活性變體(化合物7和8)沒(méi)有觀察到這種增強(qiáng)效果。

下表說(shuō)明了化合物及其在擴(kuò)增人cd34⁺細(xì)胞中的功效。這些化合物中的一些已經(jīng)在wo2013/110198和pct/ca2015/050330中說(shuō)明。

表1.實(shí)施例的結(jié)構(gòu)、分析hplc保留時(shí)間、lcms數(shù)據(jù)和生物學(xué)數(shù)據(jù)。

ec50定義為相對(duì)于載體培養(yǎng)物(dmso)，導(dǎo)致cd34⁺cd45ra^-的細(xì)胞計(jì)數(shù)增加50％時(shí)的濃度。*ec50：a>1000nm；b＝500-1000nm；c＝250-500nm；d＝100-250；e＝<100nm；f＝化合物顯示>1.3倍的擴(kuò)增。

實(shí)施例9：cmpd1增強(qiáng)來(lái)自獼猴骨髓的基因修飾的cd34+和lt-hsc樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增。

圖17a～17c顯示在cmpd1存在下，移植后移植小鼠的血液中靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物cd45⁺細(xì)胞的比例增加，這是sr1不能獲得的效果。圖18a～18g和19a～19e顯示在cmpd1存在下，轉(zhuǎn)導(dǎo)后經(jīng)標(biāo)記的猴細(xì)胞的百分比增加；當(dāng)細(xì)胞感染然后在cmpd1存在下培養(yǎng)7天時(shí)，轉(zhuǎn)導(dǎo)的cd34⁺細(xì)胞的產(chǎn)率增加；在用于cmpd1存在下體外轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增的細(xì)胞移植的猴中經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞的比例增加。

實(shí)施例10：cmpd1與雷帕霉素協(xié)同以增強(qiáng)慢病毒基因轉(zhuǎn)移至人類(lèi)造血細(xì)胞的效率。

圖20a～20e顯示在用cmpd1和雷帕霉素的組合處理的細(xì)胞中慢病毒基因轉(zhuǎn)移至cd34⁺細(xì)胞和cd34⁺亞群的增加，高于僅用cmpd1或僅用雷帕霉素處理的細(xì)胞，表明這兩種化合物協(xié)同增強(qiáng)慢病毒基因轉(zhuǎn)移至人類(lèi)造血細(xì)胞的效率。

實(shí)施例11：合成方法

化合物1～4的合成方法呈現(xiàn)于wo2013/110198。對(duì)于化合物5～8，使用以下合成方法。以下概述的合成方法涉及本發(fā)明的實(shí)施方式，其中取代基z位于嘧啶并吲哚核的7-位。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的，對(duì)于其中取代基z在不同的位置，例如在5、8或6位，特別是在6位的本發(fā)明的實(shí)施方式，可以進(jìn)行具有對(duì)于技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)變化的類(lèi)似合成方法。

方案1描述了本發(fā)明化合物的共同前體(1-vi)的合成。在第一步驟中，在諸如但不限于氫化鈉等堿的存在下，用氰基乙酸烷基酯1-ii處理芳基氟化物1-i。然后用諸如但不限于鋅粉等還原劑在乙酸中處理所得產(chǎn)物1-iii以提供氨基吲哚1-iv，其在用甲酰胺和甲酸銨處理時(shí)轉(zhuǎn)化為嘧啶1-v。用諸如磷酰氯或磷酰溴等試劑處理化合物1-v，以提供反應(yīng)性中間體1-vi，其用胺1-vii處理從而提供本發(fā)明的化合物1-viii。

base＝堿reducingagent＝還原劑acid＝酸activatingagent＝活化劑heat＝加熱

實(shí)施例

一般

報(bào)告的hplc保留時(shí)間用于使用以下條件的反相hplc(agilent，1200系列)：溶劑a：meoh:h2o:tfa(5:95:0.05)；溶劑b：meoh:h2o:tfa(95:5:0.05)；流速：3.0ml/min；梯度0～100％b，2.0分鐘；柱：zorbaxc18，3.5微米，4.6×30mm：波長(zhǎng)220nm。

使用以下lc條件在來(lái)自agilenttechnologies的6210g1969alc/msdtof光譜儀或在來(lái)自agilenttechnologies的quadrupolelc/ms(型號(hào)：g6120b)記錄質(zhì)譜：溶劑a：accn:h2o:hcooh(5:95:0.05)；溶劑b：accn:h2o:hcooh(95:5:0.05)；梯度0～100％b，2.0分鐘；流速：0.3ml/min；柱：zorbaxc18，3.5微米，2.1×30mm：波長(zhǎng)220nm。

化合物5

將4-氟芐腈(5g，41.3mmol)、二丁基氧化錫(2.055g，8.26mmol)、和三甲基甲硅烷基疊氮化物(8.22ml，61.9mmol)在甲苯(165ml)中的混合物加熱至100℃并攪拌16.5小時(shí)。冷卻至室溫后，有機(jī)層用1mnaoh(83ml)萃取，水性層用etoac(2×85ml)沖洗。將水性層用2mhcl(41.3ml)酸化至ph2。將水性混合物用etoac(200ml，然后100ml)萃取兩次，將合并的有機(jī)層用鹽水(60ml)沖洗，用無(wú)水mgso4干燥，過(guò)濾并濃縮至干燥，得到白色固體的中間體1a，(5-(4-氟苯基)-2h-四唑，6.61g，98％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm7.42-7.53(m，2h)8.04-8.14(m，2h)；msm/z165.2(m+h)⁺；hplc>99.5％，rt＝1.96分鐘。

將中間體1a(6.61g，40.3mmol)、k2co3(6.68g，48.3mmol)、和碘甲烷(3.02ml，48.3mmol)在乙腈(115ml)中的混合物加熱至回流(約82℃)1小時(shí)。冷卻后，將混合物濃縮至干燥，殘余物在水(75ml)和etoac(100ml)之間分配。分離各層，水性層用etoac(50ml)反萃取，將合并的有機(jī)層用水(50ml)和鹽水(50ml)沖洗。用無(wú)水mgso4干燥有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮，得到9.5g無(wú)色油狀物，其在放置后固化。通過(guò)快速色譜法純化殘余物，得到2種主要產(chǎn)物：作為白色固體的中間體1b(n2異構(gòu)體)：5-(4-氟苯基)-2-甲基-2h-四唑(5.09g，70.9％產(chǎn)率)：在4.42ppm處的甲基和芳族質(zhì)子之間未觀察到noe；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm4.42(s，3h)7.33-7.45(m，2h)8.03-8.14(m，2h)；msm/z179.2(m+h)⁺；hplc>99.5％，rt＝1.75分鐘。

n1異構(gòu)體：作為白色固體的5-(4-氟苯基)-1-甲基-1h-四唑(1.87g，26.1％產(chǎn)率)：在4.16ppm的甲基和7.89ppm～7.97ppm處的兩個(gè)芳族質(zhì)子之間觀察到的noe確認(rèn)了此結(jié)構(gòu)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm4.16(s，3h)7.43-7.53(m，2h)7.89-7.97(m，2h)；msm/z179.2(m+h)⁺；hplc>99.5％，rt＝1.29分鐘。

將中間體1b(1g，5.61mmol)在硫酸(16.45ml，309mmol)中的溶液冷卻至0℃，然后滴加發(fā)煙硝酸(0.288ml，6.17mmol)。2.5小時(shí)后，加入更多的發(fā)煙硝酸(0.065ml，1.403mmol)，將混合物溫?zé)嶂?0℃。5小時(shí)后，將混合物倒入2:1冰-水混合物(150ml)中，從而形成白色懸浮液。30分鐘后，過(guò)濾固體，用水沖洗(4×10ml，直到?jīng)_洗液為中性ph)，在25℃時(shí)在高真空下干燥直至恒重，得到作為米白色(offwhite)固體的5-(4-氟-3-硝基苯基)-2-甲基-2h-四唑(1.16g，93％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm4.47(s，3h)7.81(dd，j＝11.2，8.8hz，1h)8.44(ddd，j＝8.7，4.2，2.3hz，1h)8.68(dd，j＝7.2，2.2hz，1h)；msm/z224.2(m+h)⁺；hplc98.3％，rt＝1.72分鐘。

向溶解在dmf(5.67ml)中的礦物油(0.443g，11.08mmol)中的60重量％氫化鈉的冷(0℃)懸浮液加入2-氰基乙酰胺(0.888g，10.56mmol)在dmf中的溶液(注意：氫氣釋放)。將所得混合物在0℃下攪拌30分鐘。然后加入5-(4-氟-3-硝基苯基)-2-甲基-2h-四唑(1.15g，5.15mmol)在dmf(2.3ml)中的溶液，得到深紫色溶液。3小時(shí)后，將反應(yīng)混合物緩慢倒入冰-水混合物(33.0ml)和濃hcl(0.952ml)中。將所得黃色漿液攪拌30分鐘，過(guò)濾固體，用水(3×5ml)沖洗，然后用己烷(2×5ml)沖洗，在40℃時(shí)高真空干燥直至恒重，得到作為黃色固體的中間體1c(2-氰基-2-(4-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-2-硝基苯基)乙酰胺)(1.41g，95％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm4.49(s，3h)5.77(s，1h)7.77(s，1h)7.95(d，j＝8.2hz，1h)8.03(s，1h)8.51(dd，j＝8.2，1.8hz，1h)8.70(d，j＝1.8hz，1h)；msm/z288.1(m+h)+；hplc96.4％@220nm，rt＝1.31分鐘。

將三氯化鐵六水合物(2.82g，10.44mmol)和鋅(2.276g，34.8mmol)分批加入到2-氰基-2-(4-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-2-硝基苯基)乙酰胺(1g，3.48mmol)在dmf(8.71ml)和水(8.71ml)中的混合物中，得到黃色懸浮液，將其加熱至100℃持續(xù)1.25小時(shí)。然后將混合物冷卻至20℃，用meoh(50.0ml)稀釋?zhuān)?jīng)硅藻土過(guò)濾并在減壓下濃縮至約20ml(以除去大部分meoh)。然后將混合物用水(50ml)和etoac(100ml)稀釋?zhuān)瑒×覕嚢璨⑦^(guò)濾。水性層用etoac(2×50ml)萃取，合并的有機(jī)層用飽和nahco3(50ml)和鹽水(50ml)沖洗。有機(jī)層用無(wú)水mgso4干燥，過(guò)濾并濃縮，得到489mg紫色固體，將其通過(guò)快速色譜純化，得到作為紫色固體的中間體1d(2-氨基-6-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-1h-吲哚-3-甲酰胺)(356mg，39.7％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm4.38(s，3h)6.57(s，2h)7.01(s，2h)7.61-7.69(m，2h)7.81(s，1h)10.77(s，1h)；msm/z258.2(m+h)⁺；hplc約78％，rt＝1.34分鐘。

將在甲醇(3.03ml)中的中間體1d(2-氨基-6-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-1h-吲哚-3-甲酰胺，0.35g，1.361mmol)、2-苯基乙酸甲酯(0.288ml，2.041mmol)和在meoh(0.467ml)中的25重量％的甲醇鈉的混合物在微波爐中加熱至140℃持續(xù)1小時(shí)。冷卻至室溫并用水(1ml)和acoh(4ml)稀釋后，將混合物攪拌30分鐘以使其結(jié)晶。將固體過(guò)濾，用meoh(5×1ml)洗滌，并在40℃時(shí)在高真空下干燥直至恒重，得到作為棕色固體的2-芐基-7-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-醇(220mg，45.2％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm4.03(s，2h)4.43(s，3h)7.24-7.29(m，1h)7.34(t，j＝7.8hz，2h)7.37-7.43(m，2h)7.92(dd，j＝8.0，1.4hz，1h)8.04-8.10(m，2h)12.38(s，1h)12.47(s，1h)；msm/z358.2(m+h)+；hplc82.9％，rt＝1.89分鐘。

在2ml～5ml微波小瓶中加入粗產(chǎn)物2-芐基-7-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-醇(0.220g，0.616mmol)和pocl3(3.90ml，41.9mmol)，得到棕色懸浮液。將小瓶置于微波爐中并加熱至175℃持續(xù)15分鐘，然后使其冷卻。然后將反應(yīng)混合物倒入水和冰的混合物(80ml)中，通過(guò)緩慢加入50重量％的naoh(11ml)，然后加入etoac(80ml)堿化至ph8。過(guò)濾一些固體，并分離各層。水性層用etoac(80ml)萃取，有機(jī)層用無(wú)水mgso4干燥，過(guò)濾并濃縮至干，得到作為棕色固體的相應(yīng)的氯衍生物：2-芐基-4-氯-7-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚(189mg，82％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm4.31(s，2h)4.46(s，3h)7.20-7.26(m，1h)7.28-7.39(m，4h)8.09(dd，j＝8.2，1.2hz，1h)8.21-8.25(m，1h)8.39(d，j＝8.2hz，1h)12.93(s，1h)；msm/z376.2(m+h)+；hplc95.6％，rt＝2.30分鐘。

將如上所制備的2-芐基-4-氯-7-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚(0.865g，2.302mmol)和3,3'-二氨基-n-甲基二丙胺(2.60ml，16.11mmol)在meoh(17.4ml)中的混合物在微波爐中加熱30分鐘至140℃。冷卻并蒸發(fā)溶劑后，殘余物通過(guò)快速色譜純化，得到作為黃色固體的n1-(3-氨基丙基)-n3-(2-芐基-7-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)-n1-甲基丙烷-1,3-二胺(832mg，74％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm1.52(quin，j＝6.85hz，2h)1.80(quin，j＝6.85hz，2h)2.18(s，3h)2.36(t，j＝7.24hz，2h)2.41(t，j＝6.65hz，2h)2.53-2.61(m，2h)3.64(q，j＝6.52hz，2h)4.04(s，2h)4.43(s，3h)7.14-7.23(m，1h)7.28(t，j＝7.43hz，2h)7.38(d，j＝7.43hz，2h)7.49(t，j＝5.09hz，1h)7.91(d，j＝8.22hz，1h)8.08(s，1h)8.32(d，j＝8.22hz，1h)；hplc254nm處99.4％，rt1.608分鐘；hrmsm/z485.2884(m+h)⁺。

向2,2-二甲基-4,7,10-三氧代-3-氧雜-5,8,11-三氮雜十三烷-13-酸(0.224g，0.774mmol)在dmf(3.00ml)中的溶液中加入hatu(0.294g，0.774mmol)和dipea(0.270ml，1.548mmol)。將溶液攪拌10分鐘，然后加入n1-(3-氨基丙基)-n3-(2-芐基-7-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)-n1-甲基丙烷-1,3-二胺(0.300g，0.619mmol)。在20℃攪拌3小時(shí)。加入2,2-二甲基-4,7,10-三氧代-3-氧雜-5,8,11-三氮雜十三烷-13-酸(0.112g，0.387mmol)、hatu(0.147g，0.387mmol)和dipea(0.135ml，0.774mmol)并在20℃攪拌16小時(shí)。將反應(yīng)混合物倒入水(30ml)中。水性層用etoac(2×30ml)萃取。將合并的有機(jī)層用水(20ml)，然后用鹽水(20ml)沖洗。有機(jī)層用無(wú)水mgso4干燥，過(guò)濾并濃縮，得到764mg黃色泡沫狀物。殘余物通過(guò)快速色譜法純化，得到作為黃色固體的(16-((2-芐基-7-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)氨基)-13-甲基-2,5,8-三氧代-3,6,9,13-四氮雜十六烷基)氨基甲酸叔丁酯(380mg，81％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm1.36(s，9h)1.52-1.65(m，2h)1.73-1.86(m，2h)2.18(br.s.，3h)2.33(br.s.，2h)2.41(br.s.，2h)3.02-3.14(m，2h)3.57(d，j＝5.87hz，2h)3.65(m，j＝5.50hz，4h)3-72(d，j＝5.48hz，2h)4.05(s，2h)4.43(s，3h)7.01(t，j＝5.48hz，1h)7.15-7.22(m，1h)7.28(t，j＝7.63hz，2h)7.37(d，j＝7.43hz，2h)7.43(t，j＝5.28hz，1h)7.72(br.s.，1h)7.91(dd，j＝8.22，1.17hz，1h)8.08(s，3h)8.33(d，j＝8.22hz，1h)12.00(s，1h)；hplc254nm處98.1％，rt1.74分鐘；msm/z756.4(m+h)⁺。

向(16-((2-芐基-7-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)氨基)-13-甲基-2,5,8-三氧代-3,6,9,13-四氮雜十六烷基)氨基甲酸叔丁酯(0.380g，0.503mmol)在ch2cl2(8.00ml)中的溶液加入三氟乙酸(2.000ml，26.0mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘。加入甲苯(5ml)，將混合物濃縮至干燥，得到580mg黃色泡沫狀物。殘余物通過(guò)快速色譜法純化，得到作為黃色泡沫狀物的2-氨基-n-(2-((2-((3-((3-((2-芐基-7-(2-甲基-2h-四唑-5-基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)氨基)丙基)(甲基)氨基)丙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)乙酰胺(340mg，100％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm1.63(dt，j＝14.28，6.95hz，2h)1.87(dt，j＝13.99，6.90hz，2h)2.33(s，3h)2.52-2.56(m，2h)2.61(br.t，j＝6.70，6.70hz，2h)3.05-3.14(m，2h)3.55(s，2h)3.60-3-71(m，4h)3.83(d，j＝5.48hz，2h)4.05(s，2h)4.43(s，3h)7.15-7.23(m，1h)7.28(t，j＝7.43hz，2h)7.38(d，j＝7.43hz，2h)7.43(t，j＝5.48hz，1h)7.87(t，j＝5.67hz，1h)7.91(dd，j＝8.22，1.17hz，1h)8.08(d，j＝1.20hz，1h)8.22(t，j＝5.67hz，1h)8.35(d，j＝8.22hz，1h)8.55(t，j＝5.48hz，1h)12.02(br.s.，1h)；hplc254nm處99.4％，rt1.57分鐘；hrmsm/z656.3529(m+h)⁺。

化合物6

向1-(3-氯丙基)哌啶鹽酸鹽(0.500g，2.52mmol)在thf(14.83ml，181mmol)中的懸浮液添加三異丙基硅烷硫醇(1.092ml，5.05mmol)和四丁基碘化銨(0.093g，0.252mmol)。分批加入在礦物油(0.252g，6.31mmol)中的60重量％的氫化鈉。將所得白色懸浮液加熱至50℃并攪拌18.5小時(shí)。冷卻至20℃并用水(15ml)稀釋反應(yīng)混合物?；旌衔镉胑toac(4×15ml)萃取。將合并的有機(jī)層用水(2×15ml)，然后用鹽水(15ml)沖洗。有機(jī)層用無(wú)水mgso4干燥，過(guò)濾并濃縮，得到1.51g橙色油狀物。殘余物通過(guò)快速色譜法純化，得到作為無(wú)色油狀物中間體2a，1-(3-((三異丙基甲硅烷基)硫基)丙基)哌啶(714mg，90％產(chǎn)率)。¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm1.06(d，j＝7.0hz，18h)1.14-1.29(m，3h)1.36(m，j＝5.1hz，2h)1.46(quin，j＝5.4hz，4h)1.65(quin，j＝7.0hz，2h)2.29(m，j＝6.7hz，6h)2.53(t，j＝7.3hz，2h)；msm/z316.2(m+h)⁺；hplc>95％，rt＝2.19分鐘。

將在礦物油(3.41g，85mmol)中的60重量％的nah分批加入2-氰基乙酰胺(7.18g，85mmol)在dmf(53ml)中的冷溶液中。在室溫下30分鐘后，滴加4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(8.5g，42.7mmol)在dmf(15ml)中的溶液。3小時(shí)后，加入冰、水和12mlhcl(10％)的混合物。將所得固體過(guò)濾，用水沖洗并在高真空下干燥，得到9.1g的4-(2-氨基-1-氰基-2-氧代乙基)-3-硝基苯甲酸甲酯：¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm3.93(s，3h)5.78(s，1h)7.77(s，1h)7.91(d，j＝7.83hz，1h)8.04(s，1h)8.39(dd，j＝8.02，1.76hz，1h)8.56(d，j＝1.56hz，1h)。

將三氯化鐵六水合物(1.540g，5.70mmol)和鋅(1.242g，19.00mmol)加入上述制備的粗氰基-酰胺(0.5g，1.900mmol)在dmf(4.75ml)和水(4.75ml)中的溶液，而得到黃色懸浮液。放熱后，將混合物加熱至100℃保持45分鐘，然后緩慢冷卻至20℃并攪拌22小時(shí)。過(guò)濾固體，用dmf(3×3ml)沖洗，在0℃攪拌的同時(shí)用水(40ml)稀釋濾液。過(guò)濾固體，用水沖洗塊狀物(2×5ml)。固體含有大部分雜質(zhì)。水性層用etoac(3×50ml)萃取，將合并的有機(jī)層用水(50ml)，然后用鹽水(30ml)沖洗。有機(jī)層用無(wú)水mgso4干燥，過(guò)濾并濃縮，得到287mg棕色固體，將其用丙酮(6ml)處理，得到固體懸浮液，將其用己烷(5ml)稀釋。然后收集固體，在40℃的高真空下干燥直至恒重，得到作為米白色固體的中間體2c：2-氨基-3-氨基甲?；?1h-吲哚-6-甲酸甲酯(162mg，36.6％產(chǎn)率)：¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm3.80(s，3h)6.62(br.s.，2h)7.04-7.18(m，2h)7.53-7.63(m，2h)7.72(s，1h)10.80(s，1h)；msm/z232.2(m+h)⁺；hplc約96％，rt＝1.37分鐘。

將在甲醇(1.0ml)中的中間體2c(0.100g，0.429mmol)、2-苯基乙酸甲酯(0.302ml，2.14mmol)和在meoh中的30重量％的甲醇鈉(0.402ml，2.14mmol)的混合物置于微波爐中，并加熱至140℃保持30分鐘。冷卻后，加入acoh(0.125ml，2.19mmol)，將所得漿液在20℃攪拌1小時(shí)。過(guò)濾固體，用meoh(3×0.5ml)洗滌，在20℃高真空下干燥直至恒重，得到作為褐色固體的中間體2d(2-芐基-4-羥基-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯)(91mg，63.7％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm3.87(s，3h)4.03(s，2h)7.22-7.29(m，1h)7.29-7.42(m，4h)7.83(dd，j＝8.2，1.6hz，1h)7.98-8.04(m，2h)12.46(br.s，1h)12.50(br.s.，1h)；msm/z334.2(m+h)⁺；hplc88.5％@220nm和86.3％@254nm，rt＝1.96分鐘。

將2-芐基-4-羥基-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(0.685g，2.o5mmol)在pocl3(12.64ml，136mmol)中的混合物加熱至90℃持續(xù)16小時(shí)。冷卻后，反應(yīng)混合物濃縮至干燥。將所得固體懸浮于飽和nahco3(50ml)和etoac(75ml)。劇烈攪拌15分鐘，然后過(guò)濾混合物。分離各層。水性層用etoac(2×50ml)萃取。將合并的有機(jī)層用無(wú)水mgso4干燥。過(guò)濾并濃縮至干燥，得到作為褐色固體的2-芐基-4-氯-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(621mg，86％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm3.92(s，3h)4.31(s，2h)7.19-7.26(m，1h)7.28-7.39(m，4h)7.99(dd，j＝8.2，1.2hz，1h)8.14(d，j＝1.2hz，1h)8.34(d，j＝8.2hz，1h)12.97(s，1h)；msm/z352.2(m+h)⁺；hplc92％，rt＝2.39分鐘。

向2-芐基-4-氯-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(0.050g，0.142mmol)和1-(3-((三異丙基甲硅烷基)硫基)丙基)哌啶(0.058g，0.185mmol)在nmp(0.750ml)中的溶液加入四丁基氟化銨三水合物(0.056g，0.178mmol)并在20℃攪拌6小時(shí)。加入另外的1-(3-((三異丙基甲硅烷基)硫基)丙基)哌啶(0.033g，0.104mmol)和四丁基氟化銨三水合物(0.029g，0.092mmol)，繼續(xù)攪拌4天。將反應(yīng)混合物用ch2cl2(25ml)稀釋。用水(3×7.5ml)沖洗。有機(jī)層用無(wú)水mgso4干燥，過(guò)濾并濃縮至干燥。殘余物通過(guò)快速色譜法純化，得到為褐色固體的化合物6，2-芐基-4-((3-(哌啶-1-基)丙基)硫基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(53mg，79％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm1.30-1.44(m，2h)1.51(br.s.，4h)1.81-1.96(m，2h)2.17-2.47(m，6h)3.43(t，j＝7.2hz，2h)3.90(s，3h)4.26(s，2h)7.17-7.25(m，1h)7.30(t，j＝7.6hz，2h)7.34-7.41(m，2h)7.95(dd，j＝8.2，1.6hz，1h)8.07-8.14(m，2h)12.56(s，1h)；hplc254nm處95.1％，rt2.02分鐘；hrmsm/z475.2155(m+h)⁺。

化合物7

在0℃下在dmf(125ml)中將2-氰基乙酸乙酯(10.9ml，102mmol)緩慢加入到在礦物油中60重量％的氫化鈉懸浮液(4.10g，102mmol)中。將混合物在0℃下攪拌15分鐘，加入在dmf(125ml)中的4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(10.2g，51mmol)。將所得的深紅色混合物在0℃下攪拌30分鐘，然后在室溫下攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)混合物用1nhcl(40ml)和etoac(40ml)稀釋。將分離的水性層用etoac(3×50ml)萃取。將有機(jī)層合并，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮得到殘余物(26g)，殘余物通過(guò)快速色譜法純化，得到4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙基)-3-硝基苯甲酸甲酯(14.9g，100％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm1.19(t，j＝7.0hz，3h)3.93(s，3h)4.23(q，j＝7.0hz，2h)6.38(s，1h)7.87-7.99(m，1h)8.42(d，j＝7.8hz，1h)8.64(br.s.，1h)；lcmsm/z291.0(m-h)^-，hplc>95％，rt1.76分鐘。

向4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙基)-3-硝基苯甲酸甲酯(14.9g，51.0mmol)在乙酸(255ml)中的溶液中按比例加入鋅粉(16.7g，255mmol)超過(guò)35分鐘。將混合物加熱至100℃保持15小時(shí)。使混合物冷卻至室溫，通過(guò)硅藻土過(guò)濾并用乙酸乙酯沖洗。蒸發(fā)溶劑，得到殘余物，將其在二氯甲烷和己烷的混合物中研磨。過(guò)濾固體，用己烷(3×15ml)沖洗，并在20℃在高真空下干燥直至恒重，得到作為紫色固體的中間體3a(3-乙基6-甲基-2-氨基-1h-吲哚-3,6-二羧酸酯)(6.3g，47.1％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm1.32(t，j＝7.0hz，3h)3.81(s，3h)4.24(q，j＝7.0hz，2h)6.99(s，2h)7.55-7.64(m，2h)7.74(s，1h)10.84(s，1h)；lcmsm/z263.2(m+h)⁺，hplc70％，rt1.90分鐘。

將3-乙基6-甲基2-氨基-1h-吲哚-3,6-二羧酸酯(1.1g，4.19mmol)、甲酸銨(0.53g，8.39mmol)在甲酰胺(16.7ml，419mmol)中的懸浮液加熱至165℃持續(xù)12小時(shí)。將混合物冷卻至室溫，并加入水。將所得沉淀物過(guò)濾，空氣干燥并在高真空下干燥，得到作為灰色固體的4-羥基-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(1.1g，108％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm3.89(s，3h)7.86(dd，j＝8.2，1.6hz，1h)8.05-8.08(m，2h)8.21(d，j＝3.9hz，1h)12.36(br.s.，1h)12.51(br.s，1h)；lcmsm/z244.2(m+h)⁺；hplc71％，rt1.51分鐘。

將4-羥基-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(1.1g，4.5mmol)和三氯氧化磷(15ml，161mmol)的混合物加熱至90℃持續(xù)16小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，減壓蒸發(fā)。將殘余物懸浮于ch2cl2(20ml)中，通過(guò)硅藻土過(guò)濾。將濾液濃縮至干燥，得到作為橙色固體的4-氯-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(360mg，30.4％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm3.93(s，3h)8.02(dd，j＝8.20，1.20hz，1h)8.19(s，1h)8.40(d，j＝8.22hz，1h)8.86(s，1h)13.07(s，1h)；lcmsm/z262.0(m+h)⁺，hplc71％，rt2.02分鐘。

將4-氯-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(86mg，0.33mmol)、三乙胺(0.09ml，0.66mmol)和3-(哌啶-1-基)丙烷-1-胺(0.078ml，0.49mmol)在甲醇(2ml)中的混合物在微波反應(yīng)器中加熱至140℃持續(xù)15分鐘。將混合物冷卻至室溫，減壓蒸發(fā)。粗物質(zhì)通過(guò)快速色譜法純化，得到作為米白色固體的中間體3b(4-((3-(哌啶-1-基)丙基)氨基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯)(40mg，33.1％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm1.38(m，j＝4.70hz，2h)1.49(quin，j＝5.48hz，4h)1.82(quin，j＝7.04hz，2h)2.21-2.45(m，6h)3.64(q，j＝6.52hz，2h)3.89(s，3h)7.42(t，j＝5.67hz，1h)7.84(dd，j＝8.20，1.20hz，1h)8.04(d，j＝1.20hz，1h)8.38(s，1h)8.41(d，j＝8.22hz，1h)12.15(br.s.，1h)；lcmsm/z368.2(m+h)⁺，hplc96.8％@254nm；rt1.38分鐘。

將4-((3-(哌啶-1-基)丙基)氨基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(40mg，0.109mmol)和h2so4(87μl，1.633mmol)在丙醇(1ml)中的混合物加熱至70℃持續(xù)3天。濃縮為約0.5ml并用etoac(10ml)和水(10ml)稀釋。用固體k2co3(約100mg)中和至ph7-8。分離各層。水性層用etoac(10ml)萃取。將合并的有機(jī)層用無(wú)水mgso4干燥。過(guò)濾并濃縮至干燥，得到化合物7，作為白色固體的4-((3-(哌啶-1-基)丙基)氨基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸丙酯(17mg，40％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，甲醇-d4)δppm8.36(s，1h)，8.24(d，j＝8.2hz，1h)，8.19(s，1h)，7.97(dd，j＝8.2，1.2hz，1h)，4.33(t，j＝6.7hz，2h)，3.74(t，j＝6.8hz，2h)，2.41-2.59(m，6h)，1.93-2.05(m，2h)，1.78-1.92(m，2h)，1.56-1.68(m，4h)，1.49(br.s.，2h)，1.08(t，j＝7.4hz，3h)；hplc254nm處>95％，rt1.67分鐘；lcmsm/z396.2(m+h)⁺。

化合物8

將中間體2c(80mg，0.343mmol)和苯甲醛(70μl，0.686mmol)在乙酸(1ml)中的混合物加熱至110℃持續(xù)22小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至20℃，并用二乙醚(10ml)稀釋。將固體過(guò)濾，用et2o(3×1ml)沖洗，在20℃高真空下干燥直至恒重，得到作為褐色固體的中間體4a，4-羥基-2-苯基-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(47mg，42.9％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm3.89(s，3h)7.53-7.65(m，3h)7.87(dd，j＝8.22，1.56hz，1h)8.06-8.12(m，2h)8.18-8.24(m，2h)12.55(br.s.，2h)；lcmsm/z320.2(m+h)⁺。

將4-羥基-2-苯基-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(0.050g，0.157mmol)在pocl3(1ml，10.73mmol)中的混合物加熱至95℃持續(xù)16小時(shí)。冷卻后，將反應(yīng)混合物濃縮至干燥。將所得固體懸浮于飽和nahco3(10ml)中，并攪拌30分鐘。過(guò)濾固體，用et2o(3×1ml)沖洗，在20℃高真空下干燥直至恒重，得到作為褐色固體的4-氯-2-苯基-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(40mg，75％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm3.93(s，3h)7.51-7.64(m，3h)7.95-8.06(m，1h)8.13-8.20(m，1h)8.38(d，j＝8.22hz，1h)8.42-8.51(m，2h)13.08(s，1h)；msm/z338.2(m+h)⁺；hplc99.2％@254nm，rt＝2.48分鐘。

將4-氯-2-苯基-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(0.043g，0.127mmol)、三乙胺(35μl，0.255mmol)和3-(哌啶-1-基)丙烷-1-胺(32μl，0.191mmol)在meoh(0.6ml)中的混合物在微波爐中加熱25分鐘至140℃。冷卻至20℃并濃縮至干燥。

在制備型hplc上純化，得到作為淺黃色固體的化合物8，2-苯基-4-((3-(哌啶-1-基)丙基)氨基)-9h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯2,2,2-三氟乙酸鹽(32mg，45.0％產(chǎn)率)；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δppm1.35(br.s.，1h)1.51-1.70(m，3h)1.70-1.85(m，2h)2.08-2.28(m，2h)2.76-2.97(m，2h)3.33-3.50(m，2h)3.50-3.66(m，2h)3-79-3.98(m，5h)7.40-7.58(m，3h)7.63(br.s.，1h)7.77-7.95(m，1h)8.06(br.s.，1h)8.40-8.56(m，3h)8.89-9.24(m，1h)12.28(br.s.，1h)；hplc254nm處99.9％，rt1.82分鐘；hrmsm/z444.2435(m+h)⁺。

權(quán)利要求的范圍不應(yīng)受實(shí)施例中闡述的優(yōu)選實(shí)施方式的限制，而是應(yīng)當(dāng)給予與作為整體描述一致的最寬泛的說(shuō)明。在權(quán)利要求中，詞語(yǔ)“包括”用作開(kāi)放式術(shù)語(yǔ)，基本上等同于短語(yǔ)“包括但不限于”。除非上下文另有明確指示相反，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括相應(yīng)的復(fù)數(shù)指代。