本申請(qǐng)涉及使用原代肝細(xì)胞生成的成人肝臟祖細(xì)胞并且其用于肝臟疾病的醫(yī)療管理或用于篩選具有醫(yī)療興趣的化合物。發(fā)明背景肝臟是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡的關(guān)鍵器官并且是多種至關(guān)重要的代謝途徑的位點(diǎn)。在復(fù)雜的代謝途徑中僅一種蛋白受損就將是非常有害的。大量存在的重要肝酶實(shí)質(zhì)上會(huì)增加發(fā)生不同肝臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)?？傊?，肝臟代謝存在的200種不同的先天性缺陷影響2500分之一的兒童活產(chǎn)。目前的治療和長(zhǎng)期管理并不是足夠有效的。原位肝臟移植(OLT)是高度侵入性的、不可逆的，其受到供體移植物短缺的限制并且要求最尖端的手術(shù)。由于肝細(xì)胞制備物質(zhì)量的影響，肝細(xì)胞移植(LCT)可能僅具有短期至中期的療效。對(duì)細(xì)胞凍存的耐受性、永久性植入和注入細(xì)胞高功能性的進(jìn)一步改進(jìn)將是一個(gè)重要突破(SokalEM,2011；RussoFP和ParolaM,2012；AllamehA和KazemnejadS,2012；ParveenN等,2011)。通過使用干細(xì)胞或祖細(xì)胞將帶來(lái)這種改進(jìn)，特別是使用來(lái)源于不同生物體的肝臟組織以及胎兒或成人肝臟組織的在文獻(xiàn)中已被鑒定的肝臟祖細(xì)胞(SchmelzerE等,2007；SahinMB等,2008；AzumaH等,2003；HerreraMB等,2006；NajimiM等,2007；DarwicheH和PetersenBE,2010；ShiojiriN和NitouM,2012；TanakaM和MiyajimaA,2012)。在體外暴露于肝源性刺激和/或體內(nèi)施用后，此類細(xì)胞能夠提供通常具有與肝分化如I/II相酶促活性相關(guān)的形態(tài)和功能特征的細(xì)胞?？梢詫钠渲挟a(chǎn)生的這些肝臟祖細(xì)胞或肝細(xì)胞樣細(xì)胞用于細(xì)胞移植以及用于新藥研發(fā)中的藥物檢測(cè)，因?yàn)槠浯砹嗽谒幬锎x和在體外藥理學(xué)或毒理學(xué)篩選中原代人肝細(xì)胞的替代物(DanYY,2012；HookLA,2012)。然而，目前尚無(wú)法確定到目前為止已鑒定的哪種肝臟祖細(xì)胞是針對(duì)給定疾病或用途的最佳療法。這主要是由于表征細(xì)胞及其分化能力使用的方法存在較大差異，移植模型存在差異以及確定體內(nèi)細(xì)胞移植作用采用不一致的方法。肝細(xì)胞球體或肝類器官，其是直徑大于50μm的球形、多細(xì)胞的肝細(xì)胞聚集物，可以提供用于細(xì)胞移植和生物人工肝臟的有用的三維組織構(gòu)建體。已將若干方法，如在用于自組裝的非粘附性塑料表面上的肝細(xì)胞培養(yǎng)和通過旋轉(zhuǎn)燒瓶的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，用于從哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞形成球狀體(LuY等,2012；SaitoR等,2011；Soto-GutierrezA等,2010；MitakaT和OoeH,2010；TostoesRM等,2012)。這些結(jié)構(gòu)可以通過對(duì)細(xì)胞的三維生長(zhǎng)提供足夠的支持產(chǎn)生，特別是通過模擬其與肝臟微環(huán)境之間的相互作用和特別是與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間的。來(lái)自體內(nèi)研究的大量證據(jù)表明基質(zhì)蛋白影響成人肝臟祖細(xì)胞的活化、擴(kuò)增、遷移和分化，但是特定ECM蛋白在體內(nèi)和體外活性中所具有的作用的信息仍是有限的(ZhuC等,2013)。已發(fā)表了ECM蛋白在肝臟祖細(xì)胞中表達(dá)(NajimiM等,2007；MiyazakiM等,2007)或者已經(jīng)發(fā)表了其在間充質(zhì)干細(xì)胞以及特別是在肝臟祖細(xì)胞中的免疫學(xué)性質(zhì)(BusserH等,2015；Najar等,2012；NajarM等,2013；RaicevicG等,2015)的一些證據(jù)。然而，尚無(wú)證據(jù)顯示如何能夠在細(xì)胞培養(yǎng)基中生產(chǎn)存在肝臟標(biāo)記物、間充質(zhì)標(biāo)記物、肝臟特異性代謝活性的特定組合的肝臟祖細(xì)胞或其他肝臟來(lái)源的低分化細(xì)胞并且形成三維細(xì)胞簇，而無(wú)需使用不適宜的和/或復(fù)雜的涉及胚胎或多能干細(xì)胞、重組DNA技術(shù)或化學(xué)物質(zhì)的技術(shù)方案。此外，供臨床使用的肝臟祖細(xì)胞的工業(yè)生產(chǎn)需要確定附加的、可靠的標(biāo)準(zhǔn)，以表征其在整個(gè)生產(chǎn)、制劑和/或患者選擇過程中的質(zhì)量，以及最后表征其藥物制劑和用途的效果。發(fā)明概述本發(fā)明是基于特定細(xì)胞培養(yǎng)條件能夠獲得具有特異性表達(dá)性質(zhì)和改善的生物活性的新型成人肝臟祖細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，所述新型成人肝臟祖細(xì)胞能夠用于生產(chǎn)基于細(xì)胞的能夠用于治療肝臟疾病的藥物組合物，或者能夠用于鑒定化合物的效能、代謝和/或毒性的代謝性和具有肝臟活性的細(xì)胞。這些稱為H2干細(xì)胞的細(xì)胞代表具有不同于在此前描述的成人肝臟祖細(xì)胞中已鑒定的那些的形態(tài)和功能性性質(zhì)的細(xì)胞群，所述細(xì)胞由人源供體分離或者生產(chǎn)，特別地具有較高水平的提供肝臟特異性代謝活性的蛋白(例如CYP3A4活性)以及至少一種間充質(zhì)標(biāo)記物(例如，選自波形蛋白、CD90、CD73、CD29、CD44、α平滑肌肌動(dòng)蛋白)和至少一種肝臟標(biāo)記物(例如，選自白蛋、HNF-3b、HNF-4)的表達(dá)。此外，在一些實(shí)施方式中還可以提供與表征H2干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物，如顯著存在表達(dá)細(xì)胞角蛋白19的細(xì)胞。在一些進(jìn)一步的實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)表面標(biāo)記物能夠提供用于表征在其生產(chǎn)過程中肝臟祖細(xì)胞(特別是H2干細(xì)胞，但也可以是在文獻(xiàn)中鑒定的其他細(xì)胞如ADHLSC細(xì)胞，參見NajimiM等,2007,KhuuDN等,2011；ScheersI等,2012)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，以生產(chǎn)具有改善的活力、增殖、儲(chǔ)存和/功能性質(zhì)的此類細(xì)胞的藥物制劑。當(dāng)將確定這些一種或多種細(xì)胞表面標(biāo)記物與確定表征此類細(xì)胞的標(biāo)記物組合時(shí)，可能有助于指導(dǎo)用于特定藥物制劑和用途的生產(chǎn)、制劑和/或醫(yī)療條件的改進(jìn)。將采用本發(fā)明的方法已獲得或可獲得的H2干細(xì)胞定義為至少一種間充質(zhì)標(biāo)記物(任選地選自ASMA、波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29)陽(yáng)性、至少一種肝臟標(biāo)記物(任選地選自HNF-4、HNF-3B和白蛋白)陽(yáng)性和至少一種肝臟特異性代謝活性(任選地選自尿素分泌、膽紅素綴合和CYP3A4活性)陽(yáng)性的細(xì)胞群。此外，H2干細(xì)胞還可以包含一種或多種下述附加性質(zhì)：包含至少20％、20％至90％或者20％至40％的細(xì)胞角蛋白19陽(yáng)性細(xì)胞(當(dāng)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)時(shí))，含有Sushi結(jié)構(gòu)域2的蛋白的標(biāo)記物為陽(yáng)性，存在立方形的間皮-上皮形態(tài)(即，與來(lái)源于中胚層的上皮細(xì)胞具有相似的形態(tài))，至少一種進(jìn)一步的標(biāo)記物為陽(yáng)性(選自CD49b、CD51和表2或表4中列出的那些)和/或能夠形成具有肝臟特異性代謝活性的三維細(xì)胞簇。本發(fā)明的一個(gè)主要實(shí)施方式包括成人肝臟祖細(xì)胞，所述成人肝臟祖細(xì)胞針對(duì)下述生物活性和能夠在其表面上、細(xì)胞內(nèi)鑒定的和/或分泌的標(biāo)記物的組合檢測(cè)為陽(yáng)性：(a)至少一種選自白蛋白、HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的肝臟標(biāo)記物；(b)至少一種選自波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29的間充質(zhì)標(biāo)記物；(c)至少一種選自尿素分泌、膽紅素綴合、α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性的肝臟特異性活性；(d)含有Sushi結(jié)構(gòu)域的蛋白2(Sushidomaincontainingprotein2,SUSD2)；(e)至少一種選自CD49b和CD51的進(jìn)一步的標(biāo)記物；和(f)細(xì)胞角蛋白-19(CK-19)。在一些實(shí)施方式中，可以利用一系列陰性標(biāo)記物進(jìn)一步表征所述成人肝臟祖細(xì)胞，特別是H2干細(xì)胞可以針對(duì)CD140b、CD45、CD117、CD31、CD133和CD326中的一種或多種檢測(cè)為陰性。其他候選的陰性標(biāo)記物是表3和表5中列出的那些。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，H2干細(xì)胞還可以針對(duì)下述活性和標(biāo)記物中的一種或多種檢測(cè)為陽(yáng)性：細(xì)胞角蛋白-18(CK-18)；α平滑肌肌動(dòng)蛋白(ASMA)；一種或多種凝血相關(guān)分泌蛋白(如纖維蛋白原α、纖維蛋白原β、纖維蛋白原γ、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI和因子XIII)；一種或多種其他肝臟特異性活性(如磺基轉(zhuǎn)移酶活性、色氨酸-2,3-雙加氧酶活性、肝臟羧化酶活性、氨代謝和糖原貯存)。上文所列的生物活性、標(biāo)記物和形態(tài)/功能特征可以在多種不同組合中存在于H2干細(xì)胞中。在一些實(shí)施方式中，H2干細(xì)胞檢測(cè)為：(a)針對(duì)白蛋白、波連蛋白、CD90、CD73、尿素分泌、膽紅素綴合、α-1-抗胰蛋白酶分泌、CYP3A4活性、含有Sushi結(jié)構(gòu)域的蛋白2、細(xì)胞角蛋白-19和肝羧化酶活性為陽(yáng)性；并且還有(b)針對(duì)CD140b和CD271為陰性。針對(duì)上述實(shí)施方式的H2干細(xì)胞還可以確定的其他標(biāo)準(zhǔn)為以任意功能性和技術(shù)組合的例如下述檢測(cè)為陽(yáng)性：-至少一種選自HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的其他肝臟標(biāo)記物；-至少一種選自CD44和CD29的其他間充質(zhì)標(biāo)記物；-至少一種選自磺基轉(zhuǎn)移酶活性、色氨酸-2,3-雙加氧酶活性、氨代謝和糖原貯存的其他肝臟特異性活性；-細(xì)胞角蛋白-18(CK-18)和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(ASMA)的至少一種；-ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP、CD46和CD81的至少一種；-HP、CP、RBP4、APOB、LBP、ORM1、CD24、CPM和APOC1的至少一種；和/或-至少一種選自纖維蛋白原α、纖維蛋白原β、纖維蛋白原γ、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI和因子XIII的凝血相關(guān)分泌蛋白。在一些上述的實(shí)施方式中，H2干細(xì)胞還可以檢測(cè)為針對(duì)表6或表7中列出的一種或多種酶促活性為陽(yáng)性。在上述實(shí)施方式的一些中，H2干細(xì)胞可以針對(duì)至少一種選自CD45、CD117、CD31、CD133和CD326的其他標(biāo)記物檢測(cè)為陰性。H2干細(xì)胞還可以檢測(cè)為針對(duì)一種或多種下述標(biāo)記物為陰性：ITGAM、ITGAX、IL1R2、CDH5和NCAM1。此外，H2干細(xì)胞還可以檢測(cè)為針對(duì)一種或多種下述標(biāo)記物為陰性：MMP1、ITGA11、FMOD、KCND2、CCL11、ASPN、KCNK2和HMCN1。在又一個(gè)實(shí)施方式中，H2干細(xì)胞存在特定的形態(tài)和/或功能特征。特別地，上述實(shí)施方式的H2干細(xì)胞可以是貼壁的并且可以存在立方形的間皮-上皮形態(tài)。而且，上述實(shí)施方式的H2干細(xì)胞還能夠在懸液中形成三維細(xì)胞簇(稱為H3干細(xì)胞)。如圖1中所述的，H2干細(xì)胞和H3干細(xì)胞能夠分化成存在較強(qiáng)肝臟特異性活性的細(xì)胞，所述細(xì)胞是貼壁細(xì)胞(稱為H2篩選細(xì)胞)和在懸液中的三維細(xì)胞簇(稱為H3篩選細(xì)胞)。事實(shí)上，任意上述實(shí)施方式的H2干細(xì)胞能夠用于提供附加的、分離的細(xì)胞群，其共同地在稱為H2干細(xì)胞子代的分組中，包含如上文所定義的將其在細(xì)胞培養(yǎng)條件中傳代獲得的H2干細(xì)胞。特別地，H2干細(xì)胞子代是H2干細(xì)胞根據(jù)所需用途的需要在細(xì)胞培養(yǎng)條件中(或者植入動(dòng)物模型中以后)維持、增殖和/或分化的結(jié)果，并且特別是作為三維細(xì)胞簇(三維H2干細(xì)胞子代)。這些三維結(jié)構(gòu)不僅存在改善的肝臟特異性代謝活性和維持特定細(xì)胞標(biāo)記物的組合，而且以特別適于制備用于治療用途和高通量篩選制劑的形式提供H2干細(xì)胞后代。因此，上述細(xì)胞群的實(shí)施方式包括分離的H2干細(xì)胞子代，所述分離的H2干細(xì)胞子代包含大多數(shù)(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％)存在上文所列的生物活性、標(biāo)記物、形態(tài)和/或功能特征的細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，H2干細(xì)胞群包含至少60％、或60％至99％或70％至90％的細(xì)胞檢測(cè)為：(a)針對(duì)白蛋白、波形蛋白、CD90、CD73、尿素分泌、膽紅素綴合、α-1-抗胰蛋白酶分泌、CYP3A4活化、含有Sushi結(jié)構(gòu)域的蛋白2、細(xì)胞角蛋白-19、CD49b、CD51和肝羧化酶活性為陽(yáng)性；和(b)針對(duì)CD140b和CD271為陰性。此外，可以將H2干細(xì)胞子代提供為貼壁細(xì)胞或在懸液中形成三維細(xì)胞簇，其作為貼壁細(xì)胞或作為三維細(xì)胞簇在培養(yǎng)物中傳代不超過2次、不超過3次、不超過4次或不超過5次。還可以將此類H2干細(xì)胞子代提供為貼壁細(xì)胞或在懸液中形成三維細(xì)胞簇，優(yōu)選地其還存在可誘導(dǎo)的I相CYP依賴性活性和攝取?；悄懰猁}、雌酮-3-硫酸酯或1-甲基-4-苯基吡啶。而且，此類細(xì)胞群還能夠在體外和體內(nèi)分化成存在肝臟特異性活性的細(xì)胞。還可以針對(duì)需要適宜地加入或消除此類細(xì)胞的任意性質(zhì)的任意體內(nèi)或體外用途，利用一種或多種化學(xué)試劑、細(xì)胞培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子和/或核酸載體修飾H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代。在又一個(gè)主要的實(shí)施方式中，本發(fā)明能夠利用獲得成人肝臟祖細(xì)胞的方法生產(chǎn)H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代，所述方法包括：(a)解離成人肝臟或其一部分以形成原代肝細(xì)胞群；(b)產(chǎn)生(a)的原代肝細(xì)胞制備物；(c)在支持物上培養(yǎng)(b)制備物中包含的細(xì)胞，以使得其中的細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)并且出現(xiàn)具有立方形間皮-上皮形態(tài)的細(xì)胞群；(d)將(c)的細(xì)胞傳代至少一次；和(e)分離步驟(d)傳代后獲得的細(xì)胞群，所述細(xì)胞群針對(duì)至少一種肝臟標(biāo)記物和至少一種間充質(zhì)標(biāo)記物為陽(yáng)性，并且所述細(xì)胞群具有至少一種肝臟特異性活性，并且維持立方形間皮-上皮形態(tài)。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于獲得成人肝臟祖細(xì)胞的方法，所述方法包括：(a)解離成人肝臟或其一部分以形成原代肝細(xì)胞群；(b)產(chǎn)生(a)的原代肝細(xì)胞制備物；(c)在支持物上培養(yǎng)(b)制備物中包含的細(xì)胞，以使得其中的細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)并且出現(xiàn)具有立方形間皮-上皮形態(tài)的細(xì)胞群；(d)將(c)的細(xì)胞傳代至少一次；和(e)分離步驟(d)傳代后獲得的細(xì)胞群，所述細(xì)胞群維持立方形的間皮-上皮形態(tài)，所述細(xì)胞群針對(duì)至少一種肝臟標(biāo)記物和至少一種間充質(zhì)標(biāo)記物為陽(yáng)性，并且所述細(xì)胞群具有至少一種肝臟特異性活性，其中步驟(e)細(xì)胞群的至少一部分，其可能的范圍為占步驟(e)的總細(xì)胞群的至少20％或20％至40％，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)針對(duì)細(xì)胞角蛋白-19為陽(yáng)性。本發(fā)明的方法涉及在適宜的細(xì)胞培養(yǎng)條件中維持后，分離能夠提供H2干細(xì)胞(并且接下來(lái)還提供H2干細(xì)胞子代)的肝細(xì)胞。這些方法適于從新鮮人源的原代肝細(xì)胞和/或從凍存的原代肝細(xì)胞制備物開始。在所述方法的一些實(shí)施方式中，這些方法還涉及檢測(cè)在步驟(e)和/或在步驟(c)中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物為陽(yáng)性。例如，步驟(c)的細(xì)胞和/或步驟(e)的細(xì)胞群可以針對(duì)至少一個(gè)選自細(xì)胞角蛋白19、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶分泌、含有Sushi結(jié)構(gòu)域的蛋白2和CYP3A4的標(biāo)記物或活性為陽(yáng)性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(c)的細(xì)胞和/或步驟(e)的細(xì)胞群針對(duì)下述檢測(cè)為陽(yáng)性：(i)至少一種選自波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29的間充質(zhì)標(biāo)記物；(ii)至少一種選自α-1-抗胰蛋白酶、HNF-3B、HNF-4、白蛋白、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1的肝臟標(biāo)記物；(iii)至少一種選自尿素分泌、膽紅素綴合、α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性的肝臟特異性代謝活性；(iv)含有Sushi結(jié)構(gòu)域的蛋白2；(v)ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP、CD46和CD81的至少一種；(vi)HP、CP、RBP4、APOB、LBP、ORM1、CD24、CPM和APOC1的至少一種；和/或(vii)細(xì)胞角蛋白-19(CK-19)。步驟(c)的細(xì)胞和/或步驟(e)的細(xì)胞群還可以檢測(cè)為針對(duì)細(xì)胞角蛋白-18(CK-18)和/或α平滑肌肌動(dòng)蛋白(ASMA)為陽(yáng)性，和可以檢測(cè)為針對(duì)CD140b和CD271為陰性。在一些上述的實(shí)施方式中，H2干細(xì)胞還可以檢測(cè)為針對(duì)表6或表7中列出的一種或多種酶促活性為陽(yáng)性。在所述方法的一些實(shí)施方式中，如果在所述群中確定至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％、或60％至99％、或70％至90％的細(xì)胞針對(duì)某一標(biāo)記物為陽(yáng)性，則步驟(c)的細(xì)胞和/或步驟(e)的細(xì)胞群檢測(cè)為針對(duì)該標(biāo)記物為陽(yáng)性。在上述實(shí)施方式的一些中，如果在所述群中確定低于20％或低于10％的細(xì)胞針對(duì)某一標(biāo)記物為陰性，則步驟(c)的細(xì)胞和/或步驟(e)的細(xì)胞群檢測(cè)為針對(duì)該標(biāo)記物為陰性。在上述實(shí)施方式的一些中，步驟(e)的細(xì)胞群包括粘附細(xì)胞或在懸液中形成三維細(xì)胞簇，而在其他上述實(shí)施方式中，步驟(e)的細(xì)胞群存在可誘導(dǎo)的1相CYP依賴性活性并且攝取?；悄懰猁}、雌酮-3-硫酸酯或1-甲基-4-苯基吡啶的至少一種。還可以根據(jù)表6和表7中的結(jié)果針對(duì)任意適宜的后續(xù)在體內(nèi)或體外的用途，利用化學(xué)試劑、細(xì)胞培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子和/或核酸載體對(duì)步驟(c)的細(xì)胞和/或步驟(e)的細(xì)胞群進(jìn)行修飾。因而，上述方法能夠用于獲得上述實(shí)施方式的H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代。在所述方法的一些實(shí)施方式中，可以在支持物上培養(yǎng)步驟(c)的細(xì)胞和/或步驟(e)的細(xì)胞群，所述支持物可以包被膠原或其他適宜的肽或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，可以通過測(cè)定至少針對(duì)肝臟標(biāo)記物、間充質(zhì)標(biāo)記物和肝臟特異性代謝活性的特定組合為陽(yáng)性對(duì)其進(jìn)行分離。然后，根據(jù)H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的所需用途，可以在能夠使其作為貼壁細(xì)胞、細(xì)胞懸液增殖的細(xì)胞培養(yǎng)條件中維持利用這種方法已獲得或可獲得的細(xì)胞，或者應(yīng)用用于維持其作為肝細(xì)胞樣或肝活性細(xì)胞的特定條件。特別地，三維細(xì)胞簇(三維H2干細(xì)胞子代)能夠以特別有效的方式使用市售的低粘附容器(以板或U形孔形式)或在生物反應(yīng)器形成并且根據(jù)其功能、維度、形態(tài)和/或抗原性質(zhì)鑒定。本發(fā)明的方法還包括步驟(f)，其中步驟(e)的細(xì)胞群為此在細(xì)胞培養(yǎng)條件中以便將其分化成具有肝臟特異性活性的細(xì)胞。H2干細(xì)胞子代是采用本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞群并且包括大多數(shù)(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％)具有上文所列的生物活性、標(biāo)記物、形態(tài)和/或功能特征的細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用本發(fā)明的方法獲得的H2干細(xì)胞群包含60％至99％或70％至90％具有上述步驟(e)所列特征的細(xì)胞。本發(fā)明的方法還提供了貼壁細(xì)胞或在懸液中形成三維細(xì)胞簇形式的H2干細(xì)胞子代，其優(yōu)選地還存在可誘導(dǎo)的I相CYP依賴性活性和攝取?；悄懰猁}、雌酮-3-硫酸酯和1-甲基-4-苯基吡啶中的至少一種。而且，此類細(xì)胞群還能夠分化成具有肝臟特異性活性的細(xì)胞。還可以針對(duì)任意適宜的體內(nèi)或體外用途利用化學(xué)試劑、細(xì)胞培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子和/或核酸載體修飾由本發(fā)明的方法獲得的H2干細(xì)胞群。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明生成H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代時(shí)獲得的生物材料可以進(jìn)一步用于鑒定可能具有特定用途(特別是獨(dú)特的醫(yī)療應(yīng)用)的生物實(shí)體。這些生物材料不僅包括具有特定性質(zhì)(例如基于蛋白或核酸的標(biāo)記物、生物活性和/或形態(tài))的H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞后代(或其亞群、細(xì)胞系和組分)，而且還包括當(dāng)從原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代制備物時(shí)獲得的任意其他實(shí)體。本發(fā)明的生物材料包括例如條件細(xì)胞培養(yǎng)基(例如細(xì)胞培養(yǎng)物上清液形式)和這些培養(yǎng)基的組分，其可以含有蛋白、代謝物、膜囊泡、抗原和/或核酸，以及含有或不含表征細(xì)胞本身(例如細(xì)胞表面抗原或酶活性)的其他特征，可以對(duì)其進(jìn)行鑒定和用作檢測(cè)醫(yī)學(xué)上感興趣的細(xì)胞的標(biāo)記物或作為具有醫(yī)學(xué)上感興趣的(特別是與肝臟疾病相關(guān)的)活性或分布的化合物。事實(shí)上，對(duì)從H2干細(xì)胞獲得的蛋白提取物進(jìn)行對(duì)比分析已使得將鑒定含有Sushi結(jié)構(gòu)域的蛋白2作為H2干細(xì)胞陽(yáng)性的其他標(biāo)記物成為可能并且可以將其用于表征H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代。H2干細(xì)胞、H2干細(xì)胞子代、當(dāng)生成H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代時(shí)獲得的生物材料以及包含此類細(xì)胞或生物材料的組合物(統(tǒng)稱為“H2干細(xì)胞產(chǎn)物”)對(duì)于大量的體內(nèi)或體外的方法和應(yīng)用可能是有用的。特別地，H2干細(xì)胞產(chǎn)物能夠用于治療疾病(例如肝臟疾病)和用于建立方法和生物檢測(cè)，其要求一旦在體內(nèi)或體外分化，細(xì)胞盡可能在所需時(shí)間段具有與在原代肝細(xì)胞中觀察到的那些相似的特征(如代謝或酶活性，或抗原性質(zhì))。優(yōu)選的H2干細(xì)胞產(chǎn)物是H2干細(xì)胞子代，當(dāng)生成H2干細(xì)胞子代時(shí)獲得的生物材料和包含H2干細(xì)胞子代或此類生物材料的組合物。更優(yōu)選地，H2干細(xì)胞產(chǎn)物是H2干細(xì)胞子代或包含H2干細(xì)胞子代的組合物。特別地，H2干細(xì)胞產(chǎn)物能夠用于體內(nèi)施用(在人或在動(dòng)物中，如在動(dòng)物模型中)，例如以包含此類細(xì)胞的藥物組合物的形式，用于治療肝臟疾病(如肝臟代謝的出生缺陷、遺傳性凝血癥、1/2/3型進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體缺陷、卟啉癥、脂肪肝或其他纖維化肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、肝臟退行性疾病或者急性或慢性肝衰竭)。還可以將H2干細(xì)胞用于包含此類細(xì)胞的藥物組合物形式中，用于治療與表6或表7中列出的任意酶促活性缺乏或失活相關(guān)的疾病。可以將這些藥物組合物以H2干細(xì)胞(或給定H2干細(xì)胞子代)與支持物(例如基質(zhì)、膠囊、支架或裝置)和/或溶液(例如細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液)組合的H2干細(xì)胞產(chǎn)物的形式提供，其適于所需的治療、施用和/或貯存方法，以及在優(yōu)選的方法中，用于提供此類藥物組合物(例如在試劑盒中)。也可以將提供任意其他有益作用的其他生物(例如抗體或生長(zhǎng)因子)或化學(xué)來(lái)源(例如藥物、防腐或標(biāo)記化合物)的試劑組合在此類組合物中。一種預(yù)防和/或治療疾病的方法，所述方法包括向需要其的對(duì)象施用H2干細(xì)胞產(chǎn)物，如H2干細(xì)胞或給定的H2干細(xì)胞子代和優(yōu)選地在組合物中。特別地，一種在需要其的患者中治療疾病(例如肝臟疾病)的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的H2干細(xì)胞產(chǎn)物。H2干細(xì)胞產(chǎn)物的施用或治療用途可以包括另一種產(chǎn)品(其可以是例如藥物、治療劑、另一種細(xì)胞類型或其他生物材料)的施用或用途。可以將H2干細(xì)胞產(chǎn)品用于(或使用在)本申請(qǐng)所述的治療方法中，其中患者還施用此類另一種產(chǎn)品作為該方法的一部分?？梢詫⑵渌a(chǎn)品與H2干細(xì)胞產(chǎn)物聯(lián)合施用，例如作為同一組合物的一部分，或者將其分別、同時(shí)或順序(以任意順序)施用。其他產(chǎn)品可以與H2干細(xì)胞產(chǎn)物(如H2干細(xì)胞子代或由H2干細(xì)胞子代獲得的條件細(xì)胞培養(yǎng)基)的效果(特別是治療效果)具有相容的或者甚至是協(xié)同的效果。H2干細(xì)胞產(chǎn)物還能夠用于體外研究，特別是用于評(píng)估一種或多種外源性組分如生物產(chǎn)品(如蛋白、核酸、脂質(zhì)或糖)或化學(xué)化合物(有機(jī)的或無(wú)機(jī)的，包括鹽或金屬)效能、代謝、穩(wěn)定性和/或毒性的藥學(xué)研究。這種方法還可以用于研究其他細(xì)胞(如細(xì)菌或其他細(xì)胞，優(yōu)選人源的)對(duì)H2干細(xì)胞產(chǎn)物的作用，以及評(píng)估隨后可以純化或以其他方式檢測(cè)的肝臟特異性病毒(例如肝炎病毒)或寄生蟲(如瘧原蟲，與瘧疾和抗瘧藥的研究相結(jié)合)的感染和/或復(fù)制。因此，本發(fā)明還提供了在體外或在體內(nèi)評(píng)估一種或多種外源性組分的效能、代謝、穩(wěn)定性和/或毒性的方法，所述方法包括：(a)提供H2干細(xì)胞產(chǎn)物；(b)將所述H2干細(xì)胞產(chǎn)物暴露于一種或多種選自化學(xué)化合物、蛋白、核酸、脂質(zhì)、糖、金屬、鹽、病毒、細(xì)菌和細(xì)胞的外源性組分；和(c)在暴露于所述H2干細(xì)胞產(chǎn)物后檢測(cè)所述一種或多種外源性組分對(duì)所述H2干細(xì)胞產(chǎn)物的作用和/或檢測(cè)所述一種或多種外源性物質(zhì)的存在、定位或修飾情況。在一些實(shí)施方式中這種一般方法可以包括應(yīng)用于特定用途和/或技術(shù)的其他步驟和特征。例如，如上文中定義的步驟(c)可以包括檢測(cè)對(duì)H2干細(xì)胞產(chǎn)物中細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力、肝臟特異性或非特異性蛋白的上調(diào)或下調(diào)的影響，和/或?qū)Φ鞍椎慕到?、聚集、活化或抑制的影響。而且如上文所定義的步驟(c)可以包括檢測(cè)此類一種或多種外源性組分內(nèi)化進(jìn)入或與H2干細(xì)胞產(chǎn)物物理結(jié)合。還可以將所述H2干細(xì)胞產(chǎn)物在步驟(a)給予動(dòng)物，然后在步驟(b)中將一種或多種外源性組分給予所述動(dòng)物。最后，步驟(c)包括在暴露于動(dòng)物中的所述H2干細(xì)胞產(chǎn)物后在所述H2干細(xì)胞產(chǎn)物或所述動(dòng)物上檢測(cè)所述一種或多種外源性組分的作用，和/或檢測(cè)所述一種或多種外源性組分的存在、位置或修飾情況。使用H2干細(xì)胞產(chǎn)物的方法還可以包括在步驟(b)中同時(shí)或以任意順序依次將所述細(xì)胞群、組合物或生物材料暴露于：(i)對(duì)H2干細(xì)胞產(chǎn)物中細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力、肝臟特異性或非特異性蛋白的上調(diào)或下調(diào)，和/或?qū)Φ鞍椎慕到狻⒕奂?、活化或抑制具有影響的一種或多種外源性組分；和(ii)旨在阻斷或避免H2干細(xì)胞產(chǎn)物中這種作用的一種或多種外源性組分。在一些實(shí)施方式中，這種方法旨在用于任意H2干細(xì)胞產(chǎn)物，并且特別是H2干細(xì)胞子代作為肝細(xì)胞模型，以確定當(dāng)暴露于的外源性組分是致病因子時(shí)，是否作為候選藥物的特異性靶向致病因子和/或其作用的其他外源性組分具有治療性質(zhì)，因?yàn)槠漕A(yù)防或阻止致病因子的任意不利作用(例如病毒感染、凋亡、致癌性轉(zhuǎn)化、肝臟特異性活性的減少等)。特別是，上述(i)的外源性組分是致病因子，包括感染性、致瘤性、細(xì)胞毒性或基因毒性試劑，和上述(ii)的其他外源性組分是特異性靶向所述致病因子及其作用的候選藥物，包括蛋白、核酸、細(xì)胞、病毒或化學(xué)化合物。還可以在試劑盒中提供H2干細(xì)胞產(chǎn)物，例如用于上文所述的用途和應(yīng)用方法，包括將H2干細(xì)胞產(chǎn)物交給臨床機(jī)構(gòu)并且提供將其向患者施用的方法。這種試劑盒可以包括H2干細(xì)胞產(chǎn)物和任選地能夠使用和/或檢測(cè)所述H2干細(xì)胞產(chǎn)物及其活性以及能夠使用和/或檢測(cè)任意相關(guān)的其他化合物的其他組成。這種試劑盒可以包括一種或多種含有H2干細(xì)胞產(chǎn)物(例如H2干細(xì)胞產(chǎn)物或包含H2干細(xì)胞產(chǎn)物的組合物)的藥瓶和一種或多種根據(jù)特定用途選擇的下述組成：裝置、一次性材料、溶液、化學(xué)產(chǎn)品、生物產(chǎn)品和/或所述試劑盒組成的使用說(shuō)明。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式包括成人肝臟祖細(xì)胞(可以將其稱為HHALPC)，可以將其以細(xì)胞群形式提供，以及包含所述細(xì)胞的細(xì)胞制備物和藥物組合物，特別是通過藥物生產(chǎn)工藝制備的。這些細(xì)胞和細(xì)胞群存在生物活性和標(biāo)記物的組合，能夠在其表面上、細(xì)胞內(nèi)和/或分泌物中鑒定所述標(biāo)記物，所述細(xì)胞是：(a)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(ASMA)、白蛋白(ALB)和CD140b為陽(yáng)性；和(b)細(xì)胞角蛋白-19(CK-19)和SUSD2為陰性。這些細(xì)胞還可以針對(duì)下述為陽(yáng)性：(a)至少一種選自白蛋白、HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的肝臟標(biāo)記物；(b)至少一種選自波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29的間充質(zhì)標(biāo)記物；(c)至少一種選自尿素分泌、膽紅素綴合、α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性的肝臟特異性活性；(d)至少一種選自ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP、CD46和CD81的標(biāo)記物；和(e)至少一種選自MMP1、ITGA11、FMOD、KCND2、CCL11、ASPN、KCNK2和HMCN1的標(biāo)記物。HHALPC也可以針對(duì)表6中列出的一種或多種酶促活性檢測(cè)為陽(yáng)性。在一些實(shí)施方式中，也可以利用一系列陰性標(biāo)記物對(duì)這種類型的成人肝臟祖細(xì)胞進(jìn)行表征，特別是由ITGAM、ITGAX、IL1R2、CDH5和NCAM1組成的組中的一種或多種。此外，HHALPC也可以針對(duì)由HP、CP、RBP4、APOB、LBP、ORM1、CD24、CPM和APOC1組成的組中的一種或多種檢測(cè)為陰性。上述列出的生物活性、標(biāo)記物和形態(tài)/功能特征能夠以不同的標(biāo)記物組合存在于HHALPC中，如：(a)α平滑肌肌動(dòng)蛋白、白蛋白、波形蛋白、CD90、CD73、CD44、CD29、CD140b和CYP3A4的活性為陽(yáng)性；和(b)含有Sushi結(jié)構(gòu)域的蛋白2、細(xì)胞角蛋白-19和CD271為陰性。針對(duì)上述實(shí)施方式的HHALPC還能夠以任意功能和技術(shù)的組合確定進(jìn)一步的標(biāo)準(zhǔn)，例如通過測(cè)定針對(duì)至少一個(gè)選自下組的進(jìn)一步的標(biāo)記物為陽(yáng)性：ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP、CD46和CD81。在一些此類實(shí)施方式中，HHALPC能夠測(cè)定針對(duì)至少一個(gè)選自下組的進(jìn)一步的標(biāo)記物為陰性：ITGAM、ITGAX、IL1R2、CDH5和NCAM1。在一些此類實(shí)施方式中，HHALPC能夠測(cè)定針對(duì)HP、CP、RBP4、APOB、LBP、ORM1、CD24、CPM和APOC1中的至少一個(gè)為陰性?？梢愿鶕?jù)WO2007071339和針對(duì)ADHLSC細(xì)胞的其他文獻(xiàn)所公開的內(nèi)容以及與上文所述的H2干細(xì)胞相關(guān)的其他公開使用HHALPC(根據(jù)所建立HHALPC的方法、用途、試劑盒、生物材料或細(xì)胞組合物)，將其作為分離的肝活性細(xì)胞懸液而不是作為三維的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)使用。HHALPC還可以以包含此類細(xì)胞的藥物組合物形式使用，用于治療與表6中列出的任意酶促活性缺乏或失活相關(guān)的疾病?！霸敿?xì)說(shuō)明”和“實(shí)施例”部分提供了細(xì)胞、細(xì)胞群、方法、采用這些方法可獲得的細(xì)胞的其他細(xì)節(jié)，以及與所述方法、H2干細(xì)胞產(chǎn)物和HHALPC相關(guān)的“發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式”。附圖說(shuō)明圖1：比較用于獲得和使用ADHLSC細(xì)胞和H2干細(xì)胞過程的流程圖。ADHLSC細(xì)胞和H2干細(xì)胞均可以從人肝臟中(特別是從成人肝臟中)分離的原代細(xì)胞開始制備，所述原代細(xì)胞可以直接使用或者制備用于長(zhǎng)期保存的凍存的人原代肝細(xì)胞制備物。在二維(2D)或三維(3D)細(xì)胞培養(yǎng)條件下(即分別保持H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代作為貼壁細(xì)胞或者在具有較低細(xì)胞粘附性質(zhì)的培養(yǎng)瓶或其他容器中)，具有改善的肝臟特異性性質(zhì)和立方形間皮-上皮形態(tài)的H2干細(xì)胞可以用于生成適于體內(nèi)或體外應(yīng)用的H2干細(xì)胞子代。三維H2干細(xì)胞子代由采用特定標(biāo)記物和/或生物活性表征的細(xì)胞簇形成。最初，在具有或不具有中間擴(kuò)增為貼壁細(xì)胞的條件下(例如在基質(zhì)如膠原上)，可以使用H2干細(xì)胞生成H2干細(xì)胞子代，所述H2干細(xì)胞子代的特征為是分化的、貼壁的肝細(xì)胞樣細(xì)胞(H2篩選細(xì)胞)或包含肝臟祖細(xì)胞的三維簇(H3干細(xì)胞)。根據(jù)用于生成其的兩種可供選擇的方案，這兩種類型H2干細(xì)胞子代均可以進(jìn)一步用于生成包含高度代謝活性細(xì)胞的三維H2干細(xì)胞子代，將其分別定義為H3篩選-1細(xì)胞和H3篩選-2細(xì)胞。H3篩選-2細(xì)胞還可以由H2干細(xì)胞子代直接生成(即無(wú)獲得H3干細(xì)胞的步驟)，通過在三維條件下和在提供體外肝臟特異性分化的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)H2干細(xì)胞子代。根據(jù)H3篩選細(xì)胞維持在其中的細(xì)胞培養(yǎng)條件，這些細(xì)胞能夠形成在懸液中的三維細(xì)胞簇(H3篩選-2a細(xì)胞和H3篩選-1細(xì)胞)或作為貼壁細(xì)胞(H3篩選-2b細(xì)胞和H3篩選-2c細(xì)胞)的可供選擇的形式。通過凍存長(zhǎng)期保存如有需要同時(shí)適用于ADHLSC細(xì)胞和H2干細(xì)胞(即，如果不立即但是在過程的隨后進(jìn)行擴(kuò)增、分化和/或培養(yǎng)為三維H2干細(xì)胞子代)，以及適用于在給定結(jié)構(gòu)或分化狀態(tài)的特異性H2干細(xì)胞子代。圖2：當(dāng)在基質(zhì)如膠原上培養(yǎng)時(shí)，貼壁的、非分化的ADHLSC細(xì)胞或原代人肝細(xì)胞與貼壁的、非分化的H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代不同的特征。在形態(tài)上，非分化的ADHLSC細(xì)胞顯示為均一的梭形細(xì)胞群，而H2干細(xì)胞顯示為均一的立方形間皮-上皮細(xì)胞群(A)。當(dāng)使用抗-CK-19抗體通過免疫細(xì)胞化學(xué)分析時(shí)，原代人肝細(xì)胞(ADHLSC細(xì)胞)顯示出較少表達(dá)CK-19，同時(shí)H2干細(xì)胞顯示出較高的CK-19陽(yáng)性，其核被較強(qiáng)的CK-19陽(yáng)性較暗的細(xì)絲所圍繞(B)。細(xì)胞以10X(A)或40x(B)的倍率拍照。圖3：在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)原代肝細(xì)胞獲得的H2干細(xì)胞形態(tài)。使用Cell-IQ設(shè)備從第1天至第8條在培養(yǎng)板的相同位置每小時(shí)采集一次圖像并且在所示小時(shí)對(duì)圖像進(jìn)行選擇以顯示原代肝細(xì)胞向貼壁的、增殖性H2干細(xì)胞簇的形態(tài)轉(zhuǎn)化。細(xì)胞以20x倍率拍照。圖4：當(dāng)在基質(zhì)如膠原上培養(yǎng)時(shí)，貼壁的、非分化的ADHLSC細(xì)胞與貼壁的、非分化的H2篩選細(xì)胞不同的特征。在形態(tài)上，分化為貼壁細(xì)胞后，ADHLSC細(xì)胞顯示為非顆粒狀、多邊形的均一細(xì)胞群(A，左圖，早期階段)，而包含H2篩選細(xì)胞的H2干細(xì)胞子代顯示為均一的具有基質(zhì)支持的顆粒狀、立方形/多邊形細(xì)胞群，其在細(xì)胞培養(yǎng)和分化的更為晚期的階段可以形成分布在較大基質(zhì)結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞簇(A，右圖，晚期階段)。在這些后面的圖像中，白框1表示具有與肝細(xì)胞類似形態(tài)和膽小管開始出現(xiàn)的細(xì)胞區(qū)域；白框2表示具有雙核細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的區(qū)域。細(xì)胞以20x倍率拍照。根據(jù)其CYP3A4活性(B)和尿素分泌(C)表征分化的ADHLSC細(xì)胞和H2篩選細(xì)胞。基線活性水平分別為10-9pmol/小時(shí)/4h和5pg/細(xì)胞/24h。通過在較短時(shí)間段(2-6小時(shí))進(jìn)行的測(cè)定也檢測(cè)到當(dāng)與ADHLSC細(xì)胞相比時(shí)H2篩選細(xì)胞具有更高的尿素分泌水平。免疫組化(D)進(jìn)一步確證了當(dāng)與陰性對(duì)照(無(wú)一抗)比較時(shí)H2篩選細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)白蛋白和CK-19以及外排轉(zhuǎn)運(yùn)子MRP2(在細(xì)胞之間的界面處；見箭頭)表達(dá)。圖5：不同形式由三維細(xì)胞簇組成的H2干細(xì)胞子代的形態(tài)。H3干細(xì)胞最初形成具有致密細(xì)胞核的約50-100μm的簇，隨后其可以形成更大結(jié)構(gòu)(達(dá)1000μm或更大)并且包含100000個(gè)或更多此類細(xì)胞(A)。從H2篩選細(xì)胞獲得的H3篩選-1細(xì)胞顯示為周圍為支持基質(zhì)的顆粒狀立方形/多邊形肝細(xì)胞樣細(xì)胞簇(B)。H3篩選細(xì)胞也由三維的周圍為支持基質(zhì)的顆粒狀立方體/多邊形肝細(xì)胞樣細(xì)胞簇組成，其能夠由使用低結(jié)合培養(yǎng)板(C)或在U型的低結(jié)合孔中進(jìn)行體外分化獲得，在U型的低結(jié)合孔中三維H3篩選-2a細(xì)胞更加均一(D；當(dāng)使用相同方法培養(yǎng)其時(shí)H3干細(xì)胞也形成類似結(jié)構(gòu))。最后，當(dāng)在基質(zhì)樣膠原上培養(yǎng)H3篩選細(xì)胞時(shí)，所得到的H3篩選-2b細(xì)胞顯示為與肝細(xì)胞相似的貼壁細(xì)胞簇并且分布在支持基質(zhì)中和具有廣泛的細(xì)胞內(nèi)顆粒狀結(jié)構(gòu)(E；圖2是圖1中白框部分的放大)。細(xì)胞以10x倍率拍照(E中的圖1)。圖6：根據(jù)不同方法不同類型的H2干細(xì)胞子代能夠提供具有均一尺寸的三維H2干細(xì)胞子代。流程圖概括了用于獲得此類細(xì)胞制備物的步驟(A)。特定H2干細(xì)胞子代用于在每個(gè)以相同頻率加入了5ml細(xì)胞培養(yǎng)基的超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)瓶中以給定的體積和濃度接種細(xì)胞。此外，可以使用超低粘附、U型/圓底96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板接種和生長(zhǎng)這些細(xì)胞以使得各孔獲得球樣結(jié)構(gòu)?？梢詫⑺玫降娜SH2干細(xì)胞子代在同一孔中使用(通過更換細(xì)胞培養(yǎng)基和/或加入試劑)或者將2、5、10或更多孔中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移和合并入適宜容器后使用。在(A)中流程圖底部文本框中的照片顯示了此類混合的H3篩選-2a細(xì)胞制備物，但是其表示使用相同方法獲得的未分化(H3干細(xì)胞)或分化(H3篩選-1細(xì)胞)的其他三維H2干細(xì)胞子代。使用超低粘附、U型/圓底微量培養(yǎng)板產(chǎn)生的包含H3干細(xì)胞或H3篩選-2a細(xì)胞的球樣結(jié)構(gòu)的形態(tài)似乎是能夠相比較的(B)。由于分化提供了更大的細(xì)胞，包哈H3篩選-2a細(xì)胞的球樣結(jié)構(gòu)大于包含相等數(shù)量H3干細(xì)胞的球樣結(jié)構(gòu)。圖7：在不同類型H2干細(xì)胞子代和在原代人肝細(xì)胞制備物中蛋白表達(dá)和肝酶活性的比較。對(duì)一段時(shí)間或4小時(shí)的CYP3A4活性進(jìn)行比較(A)。Western印跡分析(B)顯示，在提取物中存在的蛋白量相似的條件下(通過使用抗-β肌動(dòng)蛋白抗體作為對(duì)照確證)，H2干細(xì)胞中存在較低量的SULT1和UGT1A蛋白，其在H3干細(xì)胞和(特別是SULT1)在H3篩選-2a細(xì)胞中具有更高的表達(dá)。針對(duì)SULT1可見多個(gè)條帶，因?yàn)槭褂玫目贵w是市售的兔多克隆抗體制備物，其通常識(shí)別不同的人SULT1A同種型(磺基轉(zhuǎn)移酶1A1、1A2和1A3)并且與其他人源SULT家族成員具有部分交叉反應(yīng)(參見SULT1抗體H-55的說(shuō)明書，SantaCruz目錄號(hào)sc-32928)。通過檢測(cè)相應(yīng)的酶活性對(duì)蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行定性確證(C)。在此類細(xì)胞中在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)確證了H3干細(xì)胞和H3篩選-2a細(xì)胞利用其各自的轉(zhuǎn)運(yùn)子(牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽，NTCP；有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽，OATP；有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)子，OCT)攝取三種特異性化學(xué)底物(?；悄懰猁}、雌酮-3-硫酸鹽、1-甲基-4-苯基吡啶)的能力，利用攝取的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)確證了H3篩選-2b針對(duì)此類化合物是如何顯示出真正的活化過程而非簡(jiǎn)單的被動(dòng)擴(kuò)散過程的(D)。通過對(duì)H3干細(xì)胞和H3篩選-2a細(xì)胞與原代肝細(xì)胞的基礎(chǔ)和I相酶(非那西丁由CYP1A2作用；安非他酮由CYP2B6作用；雙氯芬酸由CYP2C9作用；咪達(dá)唑侖由CYP3A4作用)作用4小時(shí)后的誘導(dǎo)性藥物代謝進(jìn)行比較獲得定性比較數(shù)據(jù)。圖8：表征H2干細(xì)胞子代的其他肝臟特異性活性和標(biāo)記物。在所示時(shí)間段內(nèi)對(duì)ADHLSC細(xì)胞、對(duì)照細(xì)胞系HepG2、原代肝細(xì)胞、H2干細(xì)胞和H3干細(xì)胞的肝羧化酶活性(CES1活性)進(jìn)行了比較(A)。使用ELISA比較了ADHLSC細(xì)胞和H2干細(xì)胞之間α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的分泌(B)。圖9：可以通過主要成分分析(PCA)表征ADHLSC細(xì)胞和H2干細(xì)胞的蛋白質(zhì)組，在這些特定的成人肝臟祖細(xì)胞群中當(dāng)彼此之間進(jìn)行比較時(shí)以超過/不足表示鑒定的蛋白分組。不同細(xì)胞制備物的總蛋白質(zhì)組以圖形方式表示(不同ADHLSC細(xì)胞制備物以圓點(diǎn)表示和不同H2干細(xì)胞制備物以星號(hào)表示)。這種方法可以得出結(jié)論不同ADHLSC細(xì)胞和H2干細(xì)胞制備物仍能夠以細(xì)胞類型分組(A)。通過這種方法建立的對(duì)組合存在(或不存在)的特異性蛋白(或蛋白同種型)進(jìn)行的這種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的分析可以由基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，RT-PCR或由基于抗體的技術(shù)(如流式細(xì)胞術(shù)、Western印跡、免疫細(xì)胞化學(xué))進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。這種方法還可以用于鑒定在體內(nèi)和/或體外將H2干細(xì)胞(或一種類型的H2干細(xì)胞子代)與其他細(xì)胞群相區(qū)分的標(biāo)記物，以及用于在不同的H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代制備物中評(píng)估肝臟特異性代謝活性或H2干細(xì)胞特異性特征。圖10：可以將細(xì)胞表面蛋白作為區(qū)分H2干細(xì)胞與ADHLSC細(xì)胞的生物標(biāo)記物。當(dāng)使用抗-SUSD2抗體和(作為樣品中總蛋白量的對(duì)照)抗-β肌動(dòng)蛋白抗體通過Western印跡對(duì)H2干細(xì)胞和ADHLSC的蛋白提取物進(jìn)行比較時(shí)，稱為含有Sushi結(jié)構(gòu)域的蛋白2(SUSD2)的細(xì)胞表面蛋白具有非常強(qiáng)的表達(dá)(A)。當(dāng)利用FACS進(jìn)行分析以便將SUSD2與另一種細(xì)胞表面標(biāo)記物如CD140b的表達(dá)進(jìn)行比較并且將表達(dá)與非表達(dá)細(xì)胞之間的截止點(diǎn)設(shè)定為在強(qiáng)度上對(duì)于同種型陰性對(duì)照3％的細(xì)胞為陽(yáng)性時(shí)，SUSD2表達(dá)的差異似乎出現(xiàn)更多的減少，特別是當(dāng)比較CD140b陽(yáng)性時(shí)，其能夠在低表達(dá)的H2干細(xì)胞與高表達(dá)的ADHLSC細(xì)胞之間進(jìn)行清楚的區(qū)分(B)。然而，針對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞中特定熒光團(tuán)信號(hào)強(qiáng)度分布的細(xì)節(jié)(PE-pos)顯示表達(dá)SUSD2的那些ADHLSC細(xì)胞實(shí)際上以比H2干細(xì)胞低更多的水平表達(dá)其，而CD140b的數(shù)據(jù)顯示這種標(biāo)記物僅在大多數(shù)ADHLSC細(xì)胞中清楚地強(qiáng)烈表達(dá)。圖11：可以使用其他細(xì)胞表面蛋白作為用于表征H2干細(xì)胞和HHALPC的生物標(biāo)記物。A)針對(duì)已用于生產(chǎn)HHALPC(中圖)和H2干細(xì)胞(下圖)的原代人肝細(xì)胞(主要包含肝細(xì)胞，上圖)的初始制備物顯示了針對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞(PE-pos)中的特定熒光團(tuán)使用抗人CD49b或抗-CD51抗體的流式細(xì)胞術(shù)信號(hào)強(qiáng)度分布(在表達(dá)和非表達(dá)細(xì)胞之間均使用相同的3％截止點(diǎn)，非表達(dá)細(xì)胞是設(shè)置的同種型陰性對(duì)照)的詳情。B)采用流式細(xì)胞術(shù)使用抗人CD271抗體對(duì)相同細(xì)胞制備物進(jìn)行了類似的分析，將其與作為陽(yáng)性對(duì)照的稱為L(zhǎng)X-2的人細(xì)胞系進(jìn)行了比較(Castilho-FernandesA等，2011)。圖12：在FRG小鼠模型中注射的H2干細(xì)胞的活性和存在情況。A)肝內(nèi)或脾內(nèi)注射H2干細(xì)胞或原代人干細(xì)胞并在對(duì)照中和在注射后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定血清中人白蛋白(hAlb)的濃度(對(duì)于各次給藥顯示了小鼠M1和M2的示例性數(shù)據(jù))。B)來(lái)自FRG小鼠肝臟切片的免疫組化(IHC)，在FRG小鼠中肝內(nèi)注射H2干細(xì)胞或原代人肝細(xì)胞，使用核抗原Ku80作為在小鼠肝臟組織中(人細(xì)胞簇在由白色虛線限制的區(qū)域內(nèi))植入、分化和增殖的人源細(xì)胞的標(biāo)記物。以10x的放大倍數(shù)拍攝細(xì)胞。C)來(lái)自FRG小鼠肝臟切片的免疫組化，在FRG小鼠中肝內(nèi)注射H2干細(xì)胞，顯示了在小鼠肝臟組織中存在植入、分化、增殖和表達(dá)人精氨酸酶(ARG1)的人源細(xì)胞簇(在右圖中將在左圖中畫框的區(qū)域放大；鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和白蛋白基因得到了類似的數(shù)據(jù))。分別以1x和4x的放大倍數(shù)拍攝細(xì)胞。D)來(lái)自FRG小鼠肝臟切片的免疫組化，在FRG小鼠中肝內(nèi)注射H2干細(xì)胞，顯示了存在植入、分化和增殖，細(xì)胞角蛋白-19的表達(dá)缺失(左圖)、同時(shí)保持α-1-抗胰蛋白酶(AAT，擴(kuò)散到整個(gè)細(xì)胞簇)和細(xì)胞色素P4503A4(CYP3A4，大部分集中在每個(gè)細(xì)胞簇外部邊界的區(qū)域)的強(qiáng)表達(dá)的人源細(xì)胞簇(在白色虛線限制的區(qū)域內(nèi))。使用該動(dòng)物模型在相同的人細(xì)胞簇內(nèi)也確證了外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP2在細(xì)胞之間界面(見圖4D)的分布。以10x的放大倍數(shù)拍攝細(xì)胞。發(fā)明詳述本發(fā)明的主要實(shí)施方式包括由新型生物活性和標(biāo)記物的組合表征的H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代，所述新型生物活性和標(biāo)記物的組合能夠在其表面、細(xì)胞內(nèi)部鑒定和/或在細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌。這些特征結(jié)合形態(tài)和功能特征的確定，與用于在細(xì)胞培養(yǎng)條件中生產(chǎn)H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的方法相關(guān)聯(lián)，以定義表征此類細(xì)胞的陽(yáng)性(或陰性)標(biāo)準(zhǔn)，特別是針對(duì)包括下述的方法：(a)解離成人肝臟或其部分以形成原代肝細(xì)胞群；(b)生成(a)的原代肝細(xì)胞制備物；(c)在支持物上培養(yǎng)(b)的制備物中包含的細(xì)胞，所述支持物能夠使細(xì)胞粘附并在其上生長(zhǎng)并且出現(xiàn)具有立方形間皮-上皮形態(tài)的細(xì)胞群；(d)將(c)的細(xì)胞傳代至少一次；和(e)分離(d)傳代后獲得的細(xì)胞群，其針對(duì)至少一種肝臟標(biāo)記物和一種間充質(zhì)標(biāo)記物以及針對(duì)至少一種肝臟特異性代謝活性為陽(yáng)性，并且保持立方形間皮-上皮形態(tài)。關(guān)于該方法的步驟(a)，所述解離步驟涉及獲得成人肝臟或其部分，其中含有一定量的能夠用于生產(chǎn)H2干細(xì)胞的原代細(xì)胞以及完全分化的肝細(xì)胞所述肝臟原代細(xì)胞優(yōu)選地從能夠從成人肝臟獲得的人肝臟組織中分離。術(shù)語(yǔ)“肝臟”指肝臟器官。術(shù)語(yǔ)“肝臟的一部分”通常指來(lái)源于肝臟器官任意部分的組織樣品，對(duì)所述部分的數(shù)量或其來(lái)源的肝臟器官的區(qū)域沒有任何限制。優(yōu)選地，在肝臟器官中存在的所有細(xì)胞類型也可以存在于所述肝臟的一部分中。所述肝臟的一部分的量可以至少部分地從實(shí)際需要考慮以獲得足夠的用于合理地實(shí)施本發(fā)明方法的原代肝細(xì)胞。因此，肝臟的一部分可以以肝臟器官的百分率表示(例如至少1％、10％、20％、50％、70％、90％或更多，通常為w/w)。在其他非限制性示例中，可以以重量定義肝臟的一部分(例如至少1g、10g、100g、250g、500g或更多)。例如，肝臟的一部分可以是肝葉，例如右葉或左葉，或者在分割肝臟的操作期間或在肝臟組織活檢中切除的包含足量細(xì)胞的任意片段或組織樣品。術(shù)語(yǔ)“成人肝臟”指出生后對(duì)象的肝臟，即出生后的任意時(shí)間，優(yōu)選足月，并且可以是例如出生后至少1天、1周、1個(gè)月或者超過1個(gè)月的年齡，或者至少1、5、10年或更長(zhǎng)時(shí)間。因此，“成人肝臟”，或成熟的肝臟可以在人對(duì)象中找到，所述人對(duì)象還可以用常規(guī)術(shù)語(yǔ)“嬰兒”、“兒童”、“青少年”或“成人”描述。所述肝臟或其部分從“對(duì)象”或“供體”獲得，其互換地指脊椎動(dòng)物、優(yōu)選哺乳動(dòng)物、更優(yōu)選人。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述成人肝臟或其部分可以來(lái)自非人動(dòng)物對(duì)象、優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物對(duì)象(例如嚙齒動(dòng)物或豬)。供體可以是存活的或死亡的，由臨床上可接受的標(biāo)準(zhǔn)，如“心肺”標(biāo)準(zhǔn)(涉及循環(huán)和呼吸功能不可逆的停止)或“腦死亡”標(biāo)準(zhǔn)(涉及全腦包括腦干的所有功能不可逆的停止)。收集可以包括公知程序如活檢、切取或切除。從活的人供體收集肝臟組織可能需要與維持所述供體以后的生活相適應(yīng)。肝臟或其部分可以從供體，特別是人供體獲得，其具有持續(xù)的循環(huán)，例如心跳，和持續(xù)的呼吸功能，例如肺呼吸或人工通氣。根據(jù)法律和道德準(zhǔn)則的要求，通?？梢詮幕畹娜斯w中僅取出肝臟的一部分(例如通過活檢或切取)，以使得在所述供體中維持適宜的正常肝功能水平。根據(jù)道德和法律標(biāo)準(zhǔn)，所述供體可能需要或不需要腦死亡(例如取出整個(gè)肝臟或其部分，其將不需要考慮人供體以后的存活，其可以在腦死亡的人中進(jìn)行)。從此類供體收集肝臟或其部分是有利的，因?yàn)樗鼋M織不會(huì)遭受嚴(yán)重缺氧(缺乏氧化作用)，其通常由缺血引起(循環(huán)停止)。在無(wú)人工通氣的條件下，在收集所述組織時(shí)可能具有停止的循環(huán)和/或呼吸功能。盡管來(lái)自這些供體的肝臟或其部分可能遭受至少一定程度的缺氧，可以使用來(lái)自尸體供體的肝臟在細(xì)胞培養(yǎng)條件下獲得H2干細(xì)胞，例如在供體的循環(huán)停止約1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以內(nèi)?？梢詫⑷缟纤鍪占慕M織(從手術(shù)切除肝臟樣本或肝臟組織活檢)冷卻至約室溫，或至低于室溫的溫度，但是通常應(yīng)避免冷凍所述組織或其部分，特別是其中此類冷凍將導(dǎo)致晶核或冰晶生長(zhǎng)。例如，所述組織可以保持在約1℃或約4℃與室溫之間的任意溫度，并且可以有利地保持在約4℃，例如在冰上。在全部或部分缺血時(shí)間可以將述組織進(jìn)行熱缺血、冷缺血或者熱缺血與冷缺血的組合。在處理前所收集的組織可以這樣保持例如至多48小時(shí)，優(yōu)選地少于24小時(shí)，例如更優(yōu)選地少于12小時(shí)(例如少于6、3或1小時(shí))。在進(jìn)一步處理所述組織以前，所收集的組織可以有利地但不是必要的保持在例如完全或至少部分浸入適宜基質(zhì)中和/或可以但不是必要的使用所述適宜基質(zhì)灌注。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇適宜基質(zhì)，其在處理前的時(shí)間內(nèi)能夠支持所述組織的細(xì)胞存活。本發(fā)明的方法包括解離如上文所述的成分肝臟組織以形成原代細(xì)胞群。如本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“解離”通常指部分或完全地破壞組織或器官的細(xì)胞組織，即部分或完全地破壞組織或器官的細(xì)胞和細(xì)胞組分之間的結(jié)合以便從所述組織或器官獲得細(xì)胞懸液(細(xì)胞群)。所述懸液可以包含單生或單個(gè)細(xì)胞，以及物理上連接以形成兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的簇或團(tuán)塊的細(xì)胞。解離優(yōu)選地不會(huì)導(dǎo)致或?qū)е卤M可能小的細(xì)胞活力的降低。解離肝臟或其部分以獲得其中的原代細(xì)胞群(懸液)的適宜方法可以是本領(lǐng)域公知的任意方法，包括但不限于酶消化、機(jī)械分離、過濾、離心及其組合。特別地，用于解離肝臟或其部分的方法可以包括肝臟組織的酶促解離以釋放肝細(xì)胞和/或肝臟組織的機(jī)械破壞或分離以釋放肝細(xì)胞?？梢詫?lái)自肝臟組織活檢的較小、較薄的肝臟組織碎片直接用于根據(jù)下述步驟(c)的細(xì)胞培養(yǎng)，無(wú)需進(jìn)行酶促或機(jī)械破壞。文獻(xiàn)中記載的用于解離上文所述的肝臟或其部分的方法是廣泛使用兩步或多步膠原酶灌注技術(shù)，已對(duì)其進(jìn)行了不同的調(diào)整和修訂以便將其用于整個(gè)肝臟或肝臟的片段。使用在37℃下預(yù)熱的含有陽(yáng)離子螯合劑(例如EDTA或EGTA)的二價(jià)無(wú)陽(yáng)離子緩沖液灌注肝臟組織。緩沖溶液可以包括鹽溶液(例如HEPES，WilliamsE培養(yǎng)基)或任意其他平衡鹽溶液，其還可以包括鹽如NaCl和KCl等。這導(dǎo)致保持細(xì)胞在一起的橋粒結(jié)構(gòu)的破壞。然后使用含有二價(jià)陽(yáng)離子如Ca2+和Mg2+和其作用為消化所述組織的基質(zhì)降解酶的緩沖液灌注組織。通過使用溫和的機(jī)械破碎和/或按壓通過濾器釋放原代肝細(xì)胞，以機(jī)械地完成細(xì)胞的解離過程。此類過濾器可以具有允許細(xì)胞通過約0.1mm、0.25mm、0.50mm、1mm或更高的篩尺寸。使用具有逐漸減小的篩尺寸的連續(xù)濾器可以用于逐級(jí)解離所述組織和釋放細(xì)胞。使用含有蛋白酶抑制劑、血清和/或血漿的緩沖液洗滌解離的細(xì)胞以便將在灌注過程中使用的膠原酶和其他酶滅活，然后通過使用低速離心(例如10xg和500xg之間)成團(tuán)將其從混合物中分離。可以將大部分(如果不是全部)活細(xì)胞成團(tuán)，同時(shí)基本上清除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片并且隨后使用冰冷的緩沖液洗滌以純化細(xì)胞懸液。根據(jù)組織質(zhì)量、所使用的不同溶液的組成以及酶的類型和濃度不同，原代肝細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量可能是變化的。所述酶通常是膠原酶，也可以使用鏈霉蛋白酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、嗜熱菌蛋白酶及其組合。膠原酶可以由純化不佳的酶混合而成和/或顯示出蛋白酶活性，其可能導(dǎo)致影響活細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量的不良反應(yīng)，其反過來(lái)可以通過選擇純度和質(zhì)量足夠的酶制備物避免。收集原代肝細(xì)胞的其他方法可以不包括酶消化技術(shù)且可以包括使用含有蔗糖的溶液灌注肝臟隨后進(jìn)行機(jī)械破碎。關(guān)于該方法的步驟(b)，將肝臟組織解離后獲得的原代肝細(xì)胞制備物通?？赡苁钱愘|(zhì)的原代肝細(xì)胞群，其包含屬于肝臟組成的任意細(xì)胞類型的細(xì)胞，包括祖細(xì)胞或干細(xì)胞，其可能已經(jīng)存在于肝實(shí)質(zhì)或在其非實(shí)質(zhì)中。肝臟組成細(xì)胞類型的示例包括肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、枯否細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞，此外還有可能存在或來(lái)源于肝組織樣本的干細(xì)胞或祖細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“肝細(xì)胞”包括上皮細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其包括但不限于不同尺寸或倍性(例如二倍體、四倍體、八倍體)的肝細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“原代細(xì)胞”包括通過使用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)解離在此類取出的組織或器官中存在的細(xì)胞，從對(duì)象的組織或器官(例如肝臟)中獲得的細(xì)胞懸液中存在的細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)條件下獲得所需成人肝臟祖細(xì)胞的范圍內(nèi)，本發(fā)明的方法優(yōu)選地可以從代表大部分(如果不是全部)肝細(xì)胞類型的細(xì)胞群開始。根據(jù)解離肝臟和/或用于分離或富集肝細(xì)胞和/或其他細(xì)胞類型的初始制備物的方法，基于物理性質(zhì)(維度、形態(tài))、活力、細(xì)胞培養(yǎng)條件或細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，通過應(yīng)用任意適宜的技術(shù)，用于獲得H2干細(xì)胞的適宜初始細(xì)胞群可以包括不同比例的肝細(xì)胞(總細(xì)胞的0.1％、1％、10％或更多)。如本申請(qǐng)所定義的和通過解離肝臟(或其部分)獲得的原代細(xì)胞群能夠作為新鮮的原代肝細(xì)胞立即用于建立細(xì)胞培養(yǎng)物，或者優(yōu)選地使用用于其長(zhǎng)期保存的常用技術(shù)作為凍存的原代肝細(xì)胞制備物保存。事實(shí)上，使用凍存的細(xì)胞制備物似乎對(duì)使用其隨后在細(xì)胞培養(yǎng)基中生產(chǎn)的H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的效能具有積極的作用?？梢栽诩?xì)胞培養(yǎng)基或用于保存細(xì)胞或器官的溶液(例如Viaspan、Cryostor、Celsior)中冷凍在這些樣品中的細(xì)胞，所述用于保存細(xì)胞或器官的溶液補(bǔ)充了或不含其他化合物如生長(zhǎng)因子、血清、緩沖溶液、葡萄糖、白蛋白、乙二醇、蔗糖、右旋糖、DMSO或任意其他細(xì)胞保護(hù)劑。在適宜地解凍所述樣品并且如有需要使用適宜的緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌所述細(xì)胞以清除用于保存細(xì)胞或器官的殘余細(xì)胞培養(yǎng)基后，在細(xì)胞培養(yǎng)條件下生產(chǎn)和分離更高量的H2干細(xì)胞的范圍內(nèi)，每個(gè)凍存的制備物可以在每個(gè)凍存管或袋中含有至少103、104、105、106、107、108個(gè)細(xì)胞或更多的細(xì)胞。關(guān)于該方法的步驟(c)，可以直接在完全合成的支持物(例如塑料或任意聚合物)上或預(yù)先使用飼養(yǎng)細(xì)胞、蛋白提取物或生物來(lái)源的任意其他材料包被的合成支持物上培養(yǎng)原代肝細(xì)胞制備物(作為細(xì)胞懸液或作為來(lái)自肝臟組織活檢的肝臟組織碎片)，所述支持物允許類似的原代細(xì)胞粘附和增殖并且出現(xiàn)具有立方形間皮-上皮形態(tài)的成人肝臟祖細(xì)胞群。優(yōu)選地，將來(lái)自所述原代細(xì)胞群的與所述基質(zhì)粘附的細(xì)胞培養(yǎng)至少7天、優(yōu)選地至少10天或至少12天。更優(yōu)選地，將來(lái)自所述原代細(xì)胞群的細(xì)胞培養(yǎng)7至12天以獲得足夠富集以便能夠提供H2干細(xì)胞的貼壁細(xì)胞群。術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”廣義地指用于使細(xì)胞維持和/或生長(zhǎng)的條件，并且特別是在細(xì)胞培養(yǎng)中的H2干細(xì)胞和/或H2干細(xì)胞子代。如在下文中的詳細(xì)說(shuō)明和在實(shí)施例中所詳細(xì)描述的，組分如細(xì)胞培養(yǎng)和允許細(xì)胞貼壁(或者當(dāng)有需要時(shí)，允許細(xì)胞簇在懸液中生長(zhǎng))的支持物、細(xì)胞培養(yǎng)基組分、細(xì)胞接種和維持在其中的密度、O2和CO2濃度可適于培養(yǎng)H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代。術(shù)語(yǔ)“肝臟祖細(xì)胞”指非特化的并且具有增殖能力的細(xì)胞，其使用通過培養(yǎng)從肝臟中分離的細(xì)胞生產(chǎn)，并且其或者其子代能夠產(chǎn)生至少一種相對(duì)更加特化的細(xì)胞類型。肝臟祖細(xì)胞產(chǎn)生的后代能夠沿著一個(gè)或多個(gè)譜系分化以生產(chǎn)越來(lái)越特化的細(xì)胞(但是優(yōu)選肝細(xì)胞或肝活性細(xì)胞)，其中此類后代其本身可以是祖細(xì)胞，或者甚至產(chǎn)生終末分化的肝細(xì)胞(例如完全特化的細(xì)胞，特別是具有的形態(tài)和功能特征與原代人肝細(xì)胞的那些類似的細(xì)胞)。考慮到在本發(fā)明的方法中使用的肝臟組織來(lái)源于成人肝臟，可以將H2干細(xì)胞定義為具有立方形間皮-上皮形態(tài)的成人肝臟祖細(xì)胞，其具有大而透明的細(xì)胞質(zhì)、不具有突起的不規(guī)則的膜、發(fā)展中的細(xì)胞間接觸和連接以及顯示出生長(zhǎng)的接觸性抑制。在出現(xiàn)并作為貼壁的克隆或細(xì)胞簇增殖后(見圖3)，可以通過檢測(cè)已存在于在這一階段(即如在步驟(d)中所示在將細(xì)胞傳代以前)的相對(duì)標(biāo)記物的技術(shù)對(duì)H2干細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步鑒定并且在下面的步驟開始時(shí)進(jìn)行鑒定，如在下述步驟(e)所描述的，使用一個(gè)肝臟標(biāo)記物和至少一個(gè)間充質(zhì)標(biāo)記物，以及至少一個(gè)肝臟特異性活性。在鑒定此類標(biāo)記物并且檢測(cè)其為陽(yáng)性或陰性的技術(shù)中，免疫細(xì)胞化學(xué)或細(xì)胞培養(yǎng)基分析是優(yōu)選的，因?yàn)樯踔潦褂迷谠摬襟E中獲得的較低量的H2干細(xì)胞也能夠進(jìn)行標(biāo)記物檢測(cè)，而無(wú)需將細(xì)胞破壞(因?yàn)閷⑹褂肳estern印跡或流式細(xì)胞術(shù))。特別地，在這一階段可以進(jìn)行細(xì)胞角蛋白-19陽(yáng)性細(xì)胞(如圖2B中所示)，或分泌的肝臟蛋白，包括白蛋白或酶樣α-1-抗胰蛋白酶(見圖8B和圖12C)的檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行或不進(jìn)行如下文所述的其他相關(guān)標(biāo)記物的檢測(cè)，包括細(xì)胞表面蛋白(如SUSD2、CD90、CD73、CD29、CD44和/或肝臟特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體)、細(xì)胞內(nèi)蛋白(如波形蛋白或ASMA)以及肝酶及其相關(guān)活性(如肝羧化酶、酪氨酸轉(zhuǎn)移酶、色氨酸-2,3-雙加氧酶、尿素分泌、CYP3A4或任意其他I相細(xì)胞色素P450活性)。進(jìn)一步的陽(yáng)性標(biāo)記物是在實(shí)施例3(通過FACS或技術(shù)如蛋白組學(xué)或轉(zhuǎn)錄組學(xué))和/或在實(shí)施例4(通過ELISA、免疫組化或其他基于抗體的技術(shù))中鑒定的那些。特別是，可以將表2中列出的組中的一種或多種蛋白加入CD49b和CD51中，作為進(jìn)一步的陽(yáng)性表面標(biāo)記物。H2干細(xì)胞從接種于能夠使細(xì)胞在能夠促進(jìn)此類細(xì)胞存活和/或生長(zhǎng)的體外環(huán)境中貼壁的基質(zhì)上的原代肝細(xì)胞群中出現(xiàn)。這種環(huán)境可以阻止所述環(huán)境(即細(xì)胞培養(yǎng)容器)與周圍(例如通過避免實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的污染)之間不利的物質(zhì)交換，同時(shí)其能夠允許其他有用的組分在培養(yǎng)容器之間連續(xù)的或間歇性的交換(例如通過部分或全部培養(yǎng)基的間歇性交換、氣體的連續(xù)交換)。培養(yǎng)容器可以是不同形式但是顯示出與細(xì)胞貼壁具有相容性的一種或多種基質(zhì)表面的細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶、瓶、培養(yǎng)板、多盤細(xì)胞堆疊、生物反應(yīng)器和皿，以使得所接種的細(xì)胞能夠接觸維持貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物的這種基質(zhì)。在通常情況下，能夠使得細(xì)胞在其上粘附的基質(zhì)可以是任意基本上具有親水性的基質(zhì)，是通常經(jīng)過成型和處理以提供親水性基質(zhì)表面并且從而增加有效細(xì)胞粘附的可能性的玻璃或合成聚合物材料(如聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚原酸酯、聚磷腈、聚磷酸酯、聚酯、尼龍或其混合物)(如在實(shí)施例中所示的使用CellBind市售材料)。表面處理可以是表面包被的形式，或者可以涉及在聚合物表面上產(chǎn)生化學(xué)基團(tuán)，所述化學(xué)基團(tuán)對(duì)水具有一般性的親和性或者以其他方式顯示出足夠的極性以允許與另一個(gè)極性基團(tuán)穩(wěn)定的吸附。這些官能團(tuán)導(dǎo)致親水性和/或表面氧的增加并且認(rèn)為其具有增強(qiáng)在這樣修飾的基質(zhì)表面上的細(xì)胞生長(zhǎng)的性質(zhì)。此類化學(xué)基團(tuán)可以包括基團(tuán)如胺基、酰胺、羰基、羧基、酯、羥基或巰基，其還可以通過使用基于特定波長(zhǎng)頻率的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行處理引入?？梢酝ㄟ^使用適宜的基質(zhì)層包被經(jīng)處理的塑料表面促進(jìn)細(xì)胞貼壁。所述涂層可以包括適宜的聚陽(yáng)離子(例如聚鳥氨酸或聚賴氨酸)，或者優(yōu)選地一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)成分：纖維蛋白，層粘連蛋白，非/纖維狀膠原(優(yōu)選1型膠原)、糖胺聚糖(例如肝素或硫酸乙酰肝素)或蛋白如纖連蛋白、明膠、玻連蛋白、彈性蛋白、腱生蛋白、聚集蛋白聚糖、集聚蛋白、骨涎蛋白、軟骨基質(zhì)蛋白、纖維蛋白原、纖蛋白、粘蛋白、巢蛋白、骨橋蛋白、纖溶酶、節(jié)制蛋白、絲甘蛋白聚糖、骨連接蛋白、多功能蛋白聚糖、血小板反應(yīng)蛋白1或細(xì)胞粘附分子包括鈣粘蛋白、連接蛋白、選擇蛋白，其自身或在不同的組合中。優(yōu)選的示例可以包括膠原組合物，包含或不包含其他細(xì)胞外基質(zhì)?；蛘?，合成的肽，其為片段或以其他方式來(lái)源于上文所列的蛋白、凝膠、分子支架以及由合成的和/或生物材料形成的其他三維結(jié)構(gòu)均可以用于這一范圍。可以將原代細(xì)胞懸液與粘附表面接觸一段時(shí)間(例如至少2、4、6、12、24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間)，其足以使得所述原代細(xì)胞群附著于粘附基質(zhì)，隨后通過從培養(yǎng)系統(tǒng)棄去培養(yǎng)基和任選地洗滌一次或多次所述貼壁細(xì)胞，從所述培養(yǎng)系統(tǒng)(例如非存活或死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片)中除去任意非粘附材料。然后，提供含有任意適宜的培養(yǎng)基或等張緩沖液(例如PBS)的所述培養(yǎng)細(xì)胞。因而，選擇已粘附于所述表面的來(lái)自原代肝細(xì)胞群的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)并且可以對(duì)其進(jìn)行技術(shù)以評(píng)估板密度，可以將其表示為每cm2所述表面接種的細(xì)胞數(shù)(例如在10和105個(gè)細(xì)胞/cm2之間)。直接接種或洗滌所述細(xì)胞后，將原代細(xì)胞制備物維持在液體培養(yǎng)基中，所述液體培養(yǎng)基支持所述細(xì)胞的存活和/或生長(zhǎng)。培養(yǎng)基可以先于引入其中的細(xì)胞加入所述系統(tǒng)，與之一起或在其后。所述培養(yǎng)基可以是新鮮的(即此前沒有用于培養(yǎng)細(xì)胞)或者可以包含至少一種成分，其已通過此前培養(yǎng)其中肝臟來(lái)源(或任意其他來(lái)源)的細(xì)胞被條件化。特別地，所述培養(yǎng)基可以是如文獻(xiàn)中所述的用于培養(yǎng)肝臟祖細(xì)胞的任意適宜的培養(yǎng)基和可以將其規(guī)律性地更換(例如每小時(shí)、3小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間)為存在相同或不同特征(例如組成，pH或氧化狀態(tài))的新鮮培養(yǎng)基?？梢愿淖兯雠囵B(yǎng)基的總體積，或者僅改變所述培養(yǎng)基的一部分，以使得通過此前培養(yǎng)所述細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基成分保留。或者，不更換所述培養(yǎng)基直至將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個(gè)培養(yǎng)容器中，以某種方式延長(zhǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)，在這種方式中大多數(shù)不感興趣的細(xì)胞(例如肝細(xì)胞和其他肝臟來(lái)源的完全分化的細(xì)胞)被分離和死亡，并且可以將新鮮培養(yǎng)基簡(jiǎn)單規(guī)律地加入。在存在用于培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的液體培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)貼壁的原代細(xì)胞，所述培養(yǎng)基基于已定義的化學(xué)基質(zhì)并加入牛、人或其他動(dòng)物血清，其除了提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和/或生長(zhǎng)促進(jìn)劑以外，還可以促進(jìn)特定細(xì)胞類型的生長(zhǎng)/貼壁或消除/分離?？梢允褂没A(chǔ)培養(yǎng)基配方(可以從例如美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心，ATCC；或從Invitrogen,Carlsbad,California獲得)培養(yǎng)本申請(qǐng)中的原代細(xì)胞，包括單不限于Eagle最低必需培養(yǎng)基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、α改良的最低必需培養(yǎng)基(α-MEM)、基礎(chǔ)必需培養(yǎng)基(BME)、Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)、BGJb培養(yǎng)基、F-12營(yíng)養(yǎng)混合物(Ham)、LiebovitzL-15、DMEM/F-12、必需改良的Eagle培養(yǎng)基(EMEM)、RPMI-1640、培養(yǎng)基199、Waymouth、MB752/1或Williams培養(yǎng)基E以及其改良和/或組合。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成以及根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞的需要調(diào)整培養(yǎng)基的濃度和/或培養(yǎng)基添加物的標(biāo)準(zhǔn)通常是公知的。優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方可以是市售的那些中的一種如Williams培養(yǎng)基E、IMDM或DMEM，已報(bào)道其支持成人肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)，并且包括使其適宜的生長(zhǎng)、增殖、維持所需的標(biāo)記物和/或生物活性或長(zhǎng)期保存的生長(zhǎng)因子的混合物。此類基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育所必需的物質(zhì)，其本身是已知的如無(wú)機(jī)鹽(特別是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P和可能地含有Cu、Fe、Se和Zn的鹽)、生理緩沖液(例如HEPES、碳酸氫鹽)、核苷酸、核苷和/或核酸堿基、核糖、脫氧核糖、氨基酸、維生素、抗氧化劑(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸鹽)?？梢允褂闷渌砑游锵蛩黾?xì)胞提供必需的微量元素和物質(zhì)以使得生長(zhǎng)和擴(kuò)增達(dá)到最佳。此類添加物包括胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒鹽及其組合?？梢詫⑦@些組分包括在鹽溶液中如Hank平衡鹽溶液(HBSS)、Earle鹽溶液。還可以加入抗氧化劑添加劑，例如β-巰基乙醇。盡管很多基礎(chǔ)培養(yǎng)基已經(jīng)含有氨基酸，隨后還可以添加一些氨基酸，例如L-谷氨酰胺，已知當(dāng)其在溶液中時(shí)穩(wěn)定性降低。還可以在培養(yǎng)基中進(jìn)一步補(bǔ)充抗生素和/或抗真菌化合物，例如通常是青霉素和鏈霉素和/或其他化合物的混合物。最重要的是，可以使用哺乳動(dòng)物血漿或血清補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)基，其含有細(xì)胞存活和擴(kuò)增所必需的細(xì)胞因子和成分并且在某種條件下可以使用合成成分代替其。術(shù)語(yǔ)“血清”如常規(guī)所定義的是由全血樣品首先允許在所述樣品中發(fā)生凝血并且隨后通過適宜技術(shù)通常例如離心將這樣形成的凝塊和所述血液樣品的細(xì)胞成分與液體成分(血清)相分離獲得的。惰性催化劑例如玻璃珠或粉末能夠促進(jìn)凝血。有利地，可以使用血清分離管(SST)制備血清，其含有對(duì)哺乳動(dòng)物的惰性催化劑。所述血清或血漿可以購(gòu)買獲得并且來(lái)自與獲得所述原代肝細(xì)胞的物種屬于相同物種的生物體。人血清或血漿可以用于培養(yǎng)原代人肝細(xì)胞。或者，所述培養(yǎng)基包含牛血清或血漿，優(yōu)選地胎牛(小牛)血清或血漿，更優(yōu)選地胎牛(小牛)血清(FCS或FBS)。所述培養(yǎng)基包含約0.5％至約40％(v/v)的血清或血漿或者血清替代物，優(yōu)選地約5％至20％(v/v)，例如約5％至15％(v/v)，例如約10％(v/v)。用于培養(yǎng)人肝細(xì)胞的培養(yǎng)基可以包含人血漿或血清優(yōu)選人血清和牛血漿或血清優(yōu)選牛血清的混合物。在貯存或使用前，可以對(duì)血漿或血清進(jìn)行照射(例如γ照射)或熱滅活。在現(xiàn)有技術(shù)中主要使用熱滅活除去補(bǔ)體。熱滅活通常包括將所述血漿或血清在56℃下孵育30至60分鐘(例如30分鐘)，同時(shí)進(jìn)行穩(wěn)定的混合，隨后使所述血漿或血清逐漸冷卻至室溫。任選地，在貯存或使用前還可以對(duì)所述血漿或血清進(jìn)行滅菌(例如過濾通過一個(gè)或多個(gè)孔徑小于1μm的濾器，或者根據(jù)用于培養(yǎng)用于治療用途的人細(xì)胞的任意適宜的監(jiān)管政策進(jìn)行處理。在本領(lǐng)域中未將基礎(chǔ)培養(yǎng)基(加入血清或血清之前)的普通成分，例如特別是等張生理鹽水、緩沖劑、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、碳源、維生素、抗氧化劑、pH指示劑和抗生素認(rèn)為是生長(zhǎng)因子或分化因子。另一方面，血清或血漿是可能包含一種或多種此類生長(zhǎng)因子的復(fù)雜組合物。如在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)因子”指生物活性物質(zhì)，其單獨(dú)或當(dāng)被其他物質(zhì)調(diào)節(jié)時(shí)影響不同細(xì)胞類型的增殖、生長(zhǎng)、分化、存活和/或遷移，并且可以影響生物體中的發(fā)育、形態(tài)和功能改變。生長(zhǎng)因子通常作為配體與細(xì)胞中存在的受體(例如表面或細(xì)胞內(nèi)受體)結(jié)合發(fā)揮作用。本申請(qǐng)中的生長(zhǎng)因子可以特別地是包含一條或多條肽鏈的蛋白質(zhì)實(shí)體。術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)因子”包含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族成員、骨形態(tài)蛋白(BMP)家族成員、血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子(PDGF)家族成員、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)家族成員、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)家族成員、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族成員、胰島素相關(guān)生長(zhǎng)因子(IGF)家族成員、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)家族成員、白介素-6(IL-6)家族(例如抑瘤素M)成員、造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HeGF)、血小板來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF)、血管生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族成員或糖皮質(zhì)激素。當(dāng)將所述方法用于人肝臟細(xì)胞時(shí)，在本方法中使用的生長(zhǎng)因子可以是人源或重組生長(zhǎng)因子。在方法中使用人源和重組生長(zhǎng)因子是優(yōu)選的，因?yàn)轭A(yù)計(jì)此類生長(zhǎng)因子引發(fā)對(duì)細(xì)胞功能所需的作用。所述培養(yǎng)基可以包含血清或血漿與一種或多種外源性加入的如上文所述的生長(zhǎng)因子的組合，優(yōu)選地在特定的生長(zhǎng)因子能夠在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中誘導(dǎo)作用的濃度。例如，所述培養(yǎng)基可以包含EGF和胰島素，或者EGF和地塞米松，或者胰島素和地塞米松，或者EGF、胰島素和地塞米松。EGF通常可以使用的濃度為約0.1ng/ml至1μg/ml和優(yōu)選地1ng/ml至100ng/ml，例如約25ng/ml；胰島素通?？梢允褂玫臐舛葹榧s0.1μg/ml至1mg/ml和優(yōu)選地約1μg/ml至100μg/ml，例如約10μg/ml；地塞米松通?？梢允褂玫臐舛葹榧s0.1nM至1μM，優(yōu)選地約1nM至100nM，例如約10nM。在細(xì)胞培養(yǎng)中也可以使用激素，例如D-醛固酮、己烯雌酚(DES)、地塞米松、胰島素、雌二醇、氫化可的松、催乳素、孕酮、促甲狀腺素、甲狀腺素、L-甲腺氨酸。肝細(xì)胞也能夠從使用三碘甲狀腺氨酸、α-生育酚醋酸酯，胰高血糖素的培養(yǎng)中獲益。脂質(zhì)和脂質(zhì)載體也可以用于補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)基。此類脂質(zhì)和載體可以包括但不限于環(huán)糊精、膽固醇、與白蛋白綴合的亞油酸、與白蛋白綴合的亞油酸和油酸、未綴合的亞油酸、與白蛋白綴合的亞油酸-油酸-花生四烯酸、未綴合的和與白蛋白綴合的油酸等。類似地可以將白蛋白用于無(wú)脂肪酸配方中。在實(shí)施例中描述的H2干細(xì)胞的形態(tài)和表型特征可以允許不僅當(dāng)凍存的原代肝細(xì)胞制備物具有較低貼壁效能時(shí)，而且還通過選擇和組合不同技術(shù)、條件和/或材料(例如合成聚合物材料、細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)箱中氧氣和/或CO2的量、洗滌緩沖液等)通過檢測(cè)和/或調(diào)整用于從原代細(xì)胞的異質(zhì)制備物中制備貼壁細(xì)胞的已知技術(shù)獲得此類細(xì)胞。特別地，可以應(yīng)用在缺氧條件下培養(yǎng)(通過加入毫摩或更低濃度的抗氧劑化合物獲得)以及一種或多種這些其他因素的組合以便獲得更大量的和/或更加迅速地從細(xì)胞培養(yǎng)中獲得H2干細(xì)胞。培養(yǎng)如上文所定義的原代肝細(xì)胞的這個(gè)步驟導(dǎo)致H2干細(xì)胞在培養(yǎng)基中出現(xiàn)和增殖并且其能夠持續(xù)直至H2干細(xì)胞已充分增殖。例如，所述培養(yǎng)能夠持續(xù)直至所述細(xì)胞群達(dá)到一定程度的融合(例如至少50％、70％或至少90％或更多融合)。如本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“融合”指培養(yǎng)細(xì)胞的密度，其中所述細(xì)胞彼此之間接觸，覆蓋基本上全部用于生長(zhǎng)的表面(即完全融合)。關(guān)于該方法的步驟(d)，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的原代細(xì)胞逐步富含H2干細(xì)胞，所述原代細(xì)胞持續(xù)貼壁并且出現(xiàn)均一細(xì)胞群的增殖，隨后至少傳代一次?？梢詫?duì)H2干細(xì)胞進(jìn)行迅速擴(kuò)增以產(chǎn)生用于獲得具有所需性質(zhì)的H2干細(xì)胞子代的足量細(xì)胞(例如在給定密度和/或分化狀態(tài)的二維貼壁細(xì)胞或三維細(xì)胞簇)，其可以在48-72小時(shí)內(nèi)獲得細(xì)胞倍增并且在至少2、3、4、5或更多代保持具有所需性質(zhì)的H2干細(xì)胞子代。當(dāng)傳代時(shí)，將所培養(yǎng)的細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)分離和彼此之間解離?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域公知的方法將細(xì)胞分離和解離，例如通過使用蛋白水解酶的酶促處理(例如選擇胰酶、膠原酶，例如I、II、III或IV型、分散酶、鏈霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、使用二價(jià)離子螯合劑處理(例如EDTA或EGTA)或機(jī)械處理(例如使用小口徑吸管或槍頭反復(fù)吹打)或者這些處理的任意組合。細(xì)胞分離和分散的適宜方法應(yīng)確保所需程度的細(xì)胞分離和分散，同時(shí)保持大多數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，培養(yǎng)細(xì)胞的分離和解離將產(chǎn)生大量作為單個(gè)的活細(xì)胞的細(xì)胞比例(例如至少50％、70％、90％或更多細(xì)胞)。剩余細(xì)胞可以存在于細(xì)胞簇中，其均含有相對(duì)少量的細(xì)胞數(shù)(例如平均1至100個(gè)細(xì)胞)。接下來(lái)，可以將這樣分離和解離的細(xì)胞(通常是在等張緩沖液或培養(yǎng)基中作為細(xì)胞懸液)重新接種于允許細(xì)胞粘附于其上的基質(zhì)上，并且隨后在如上文所述的使H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞的子代持續(xù)進(jìn)一步增殖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后通過以密度10至105個(gè)細(xì)胞/cm2，和分配比率約1/16至1/2，優(yōu)選地約1/8至1/2，更優(yōu)選地約1/4至1/2重新接種培養(yǎng)這些細(xì)胞。所述分配比率表示接種至與從中獲得所述細(xì)胞的培養(yǎng)容器具有相同表面的空培養(yǎng)容器(通常是新的)的傳代細(xì)胞的分?jǐn)?shù)。培養(yǎng)容器以及允許細(xì)胞粘附于所述培養(yǎng)容器上的表面和細(xì)胞培養(yǎng)基可以與初始使用的和如上文所述的相同或者可以不同。優(yōu)選地，將細(xì)胞保持在CellBind上或使用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如膠原，和優(yōu)選地I型膠原)或合成肽包被的任意其他適宜支持物上。關(guān)于上述步驟(e)，將H2干細(xì)胞群的分離應(yīng)用于具有保持了立方形間皮-上皮形態(tài)的細(xì)胞，其針對(duì)至少一個(gè)肝臟標(biāo)記物和至少一個(gè)間充質(zhì)標(biāo)記物為陽(yáng)性，并且具有至少一種肝臟特異性活性，其進(jìn)一步驗(yàn)證了初始在上述步驟(c)中鑒定H2干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，但是考慮到傳代后可以獲得更大量的細(xì)胞其可以更加容易地建立。術(shù)語(yǔ)“分離(isolating)”或“分離(isolation)”指從細(xì)胞培養(yǎng)物或生物樣品物理鑒定和分離細(xì)胞群，其可以通過基于細(xì)胞培養(yǎng)物檢驗(yàn)和對(duì)應(yīng)于一定標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞表征(和當(dāng)可能和需要時(shí)的物理分離)，或基于根據(jù)存在/缺乏抗原和/或細(xì)胞尺寸進(jìn)行的自動(dòng)細(xì)胞分選(如通過FACS)應(yīng)用適宜的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所述術(shù)語(yǔ)“分離(isolating)”或“分離(isolation)可以包含進(jìn)一步的細(xì)胞的物理分離和/或定量步驟，特別是通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞群”和“細(xì)胞的群”通常指一組細(xì)胞。除非另有明示，所述術(shù)語(yǔ)指基本上由或包含如本申請(qǐng)所定義的細(xì)胞的細(xì)胞組。細(xì)胞群可以基本上由具有共同表型的細(xì)胞組成或者可以包含至少一部分具有共同表型的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞的一種或多種顯而易見的特征基本上相似或相同時(shí)，將其稱為具有共同的表型，包括但不限于在體外培養(yǎng)時(shí)(例如貼壁或單層生長(zhǎng))的形態(tài)外觀、特定細(xì)胞組分或產(chǎn)物的表達(dá)水平(例如RNA或蛋白)、某些生化通路的活性、增殖能力和/或動(dòng)力學(xué)、分化潛能和/或?qū)Ψ只盘?hào)或行為的應(yīng)答。因此，可以將此類顯而易見的特征定義為細(xì)胞群或其部分。如果基本上大部分細(xì)胞具有共同表型，則細(xì)胞群可以是“基本上均質(zhì)的”?！盎旧暇|(zhì)的”細(xì)胞群可以包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或者甚至至少99％的具有共同表型的細(xì)胞，如特定地稱為H2干細(xì)胞(或H2干細(xì)胞子代)的表型。而且，細(xì)胞群可以基本上由具有共同表型的細(xì)胞組成，如H2干細(xì)胞表型(即H2干細(xì)胞子代)，如果在所述群中存在的任意其他細(xì)胞不改變或具有影響所述細(xì)胞群總體性質(zhì)的物質(zhì)，并且因此可以將其定義為細(xì)胞系。在通常情況下，在文獻(xiàn)中發(fā)表的用于鑒定和表征特定細(xì)胞類型(例如間充質(zhì)、肝臟、造血系統(tǒng)、上皮、內(nèi)皮標(biāo)記物)或具有特定定位(例如細(xì)胞內(nèi)、在細(xì)胞表面上或分泌的)的細(xì)胞標(biāo)記物的任意技術(shù)均可以被認(rèn)為適于鑒定H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代?？梢詫⒋祟惣夹g(shù)分為兩類：在分析期間允許保持細(xì)胞完整性的那些，和基于使用此類細(xì)胞產(chǎn)生的提取物(包含蛋白、核酸、膜等)的那些。實(shí)施例中含有此類技術(shù)是如何用于鑒定H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的數(shù)據(jù)，例如在進(jìn)行更加詳細(xì)的和與其他肝臟祖細(xì)胞或成人肝臟原代細(xì)胞進(jìn)行比較分析以評(píng)估其獨(dú)特的性質(zhì)和生物活性之前對(duì)細(xì)胞表面存在的抗原進(jìn)行分析。在蛋白水平，可以使用技術(shù)如流式細(xì)胞術(shù)、FACS或免疫細(xì)胞化學(xué)通過使用抗體或其他蛋白特異性試劑確定在H2干細(xì)胞中表面或細(xì)胞內(nèi)蛋白的存在/缺乏情況。流式細(xì)胞術(shù)是根據(jù)組合的存在/缺乏表面或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物通過由單一或多重染色技術(shù)和/或尺寸和粒度評(píng)估確定的用于鑒定細(xì)胞群的優(yōu)選技術(shù)。免疫細(xì)胞化學(xué)還提供了關(guān)于與組合的存在/缺乏表面的、細(xì)胞骨架和/或其他細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物相關(guān)的形態(tài)特征的相關(guān)信息。事實(shí)上，在一些實(shí)施方式中，在H2干細(xì)胞制備物中顯著的細(xì)胞百分率針對(duì)細(xì)胞角蛋白-19(CK-19)為陽(yáng)性，其為細(xì)胞骨架和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物。當(dāng)使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)時(shí)，可以將該百分率評(píng)估為至少20％或20至40％，但是當(dāng)通過免疫細(xì)胞化學(xué)對(duì)CK-19進(jìn)行檢測(cè)時(shí)其可以高得更多(即達(dá)90％或更高)(見圖2B)。這個(gè)進(jìn)一步的特征(即針對(duì)CK-19陽(yáng)性)能夠建立和鑒定由培養(yǎng)原代肝細(xì)胞產(chǎn)生的作為H2干細(xì)胞的細(xì)胞群。特別地，應(yīng)通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)或能夠評(píng)估存在該受體的細(xì)胞百分率的任意其他技術(shù)(通過使用抗體、凝集素或其他蛋白并且不需要提取蛋白或核酸)測(cè)定至少一種間充質(zhì)標(biāo)記物(特別地選自ASMA、波形蛋白、CD90、CD73和CD29)和至少一種肝臟標(biāo)記物的存在情況?？梢灶愃频販y(cè)定針對(duì)嚴(yán)格與肝臟或間充質(zhì)特征相關(guān)的那些以外的其他細(xì)胞表面標(biāo)記物(如CD140b、CD49b、CD51或在實(shí)施例3的表2、表4、表6和表7中提及的任意其他陽(yáng)性標(biāo)記物)的陽(yáng)性。在此處將流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)陽(yáng)性定義為當(dāng)至少60％的細(xì)胞存在所需標(biāo)記物或受體時(shí)(如在實(shí)施例中所示)。類似地，在此處將流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)陰性定義為當(dāng)少于20％的細(xì)胞存在給定標(biāo)記物或受體時(shí)(如在實(shí)施例中所示)。在一些實(shí)施方式中，如在CD140b(見圖10B)或CD271(見圖11B)的情況下，少于10％的細(xì)胞存在給定的陰性標(biāo)記物。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)測(cè)定給定的標(biāo)記物時(shí)，用于檢測(cè)如上文所定義的標(biāo)記物或細(xì)胞表面蛋白的試劑被固定于固相上(例如小珠、板或生物材料)、標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記)和/或被另一種標(biāo)記化合物所識(shí)別(例如二抗)。存在多種方法，通過其所述標(biāo)記能夠產(chǎn)生由外部方法可檢測(cè)的信號(hào)，例如理想地通過目測(cè)檢查或通過電磁輻射、加熱和化學(xué)試劑。使用本領(lǐng)域公知的任意方法，如化學(xué)交聯(lián)連接或使用生物素-鏈霉親和系統(tǒng)，標(biāo)記或其他信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的成分也能夠與特定的結(jié)合配體、另一種分子或與支持物如小珠結(jié)合。所述標(biāo)記能夠直接產(chǎn)生信號(hào)，因此不需要附加成分以產(chǎn)生信號(hào)。多種有機(jī)分子，例如熒光染料(如FITC、PE、PC5、PC7、APC或任意其他已知與流式細(xì)胞術(shù)相容的)，吸收紫外和可見光。直接產(chǎn)生信號(hào)的其他類型的標(biāo)記，如具有放射活性的同位素和染料。或者，所述標(biāo)記可能需要其他成分以產(chǎn)生信號(hào)，并且然后所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)將包括產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)所需要的所有成分，其可以包括底物、輔酶、金屬離子或與酶促產(chǎn)物反應(yīng)的底物(例如辣根過氧化物酶的化學(xué)發(fā)光檢測(cè))。H2干細(xì)胞的肝臟特異性代謝活性包括通常與肝臟細(xì)胞(特別是與肝細(xì)胞)相關(guān)的生物活性并且其將肝臟細(xì)胞與在其他組織中存在的細(xì)胞相區(qū)分，其特別地包含如在文獻(xiàn)中和在實(shí)施例中所描述的參與蛋白或其他底物的結(jié)合、活化和/或降解的活性。根據(jù)檢測(cè)肝臟特異性代謝活性確立這些生物活性，其可以是蛋白/藥物結(jié)合活性，更優(yōu)選地是對(duì)給定底物的酶促活性或與肝臟特異性分子結(jié)合，通過印跡技術(shù)(Western或Northern印跡)、測(cè)序、等電聚焦、ELISA或者對(duì)已知特異性地在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的合成或天然化合物的內(nèi)化進(jìn)行檢測(cè)。能夠類似地測(cè)定與肝臟特征嚴(yán)格相關(guān)的那些以外的其他相關(guān)酶促活性(如在實(shí)施例3中提及的那些)并且與使用在文獻(xiàn)中描述的技術(shù)在肝細(xì)胞或其他細(xì)胞類型中檢測(cè)的那些進(jìn)行比較。在核酸水平，可以使用全基因組測(cè)序、PCR或RT-qPCR對(duì)H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代進(jìn)行表征。從而，基于循環(huán)數(shù)和將其歸一化至從1個(gè)或更多個(gè)內(nèi)源性對(duì)照獲得的循環(huán)可以使用實(shí)時(shí)PCR對(duì)所研究基因的表達(dá)進(jìn)行定量。特別地，可以使用H2干細(xì)胞以及適宜的引物和緩沖液進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，但是獲得信號(hào)的循環(huán)數(shù)不應(yīng)超過25、30或35個(gè)循環(huán)。在活性水平，可以通過能夠評(píng)估肝臟特異性酶的存在和/或活性水平的任意適宜的技術(shù)測(cè)定肝臟特異性代謝活性的存在情況，但是優(yōu)選地應(yīng)允許在體外使用針對(duì)測(cè)定CYP450活性、解毒、糖原貯存、α1-抗胰蛋白酶或白蛋白的分泌、膽汁產(chǎn)生、血小板生成素產(chǎn)生、血管緊張素原產(chǎn)生、氨轉(zhuǎn)化為尿素、膽固醇合成、糖原分解、糖異生和脂肪合成的特異性產(chǎn)物給定的檢測(cè)限(因?yàn)槭褂梦墨I(xiàn)的支持和市售產(chǎn)品其能夠容易地建立)對(duì)實(shí)際的酶促活性進(jìn)行定量。特別地，在此處將針對(duì)至少一種肝臟特異性代謝活性為陽(yáng)性定義為當(dāng)對(duì)活性進(jìn)行檢測(cè)時(shí)其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上優(yōu)于終產(chǎn)物的檢測(cè)限(是檢測(cè)限的至少2倍、5倍或10倍)或接近原代肝細(xì)胞的活性水平(優(yōu)于、相同或低10％、25％、50％、75％或90％)。文獻(xiàn)中提供了對(duì)在體外評(píng)估人肝細(xì)胞中細(xì)胞色素P450活性的技術(shù)進(jìn)行了廣泛的描述，特別是關(guān)于特異性誘導(dǎo)酶活性的化合物以及能夠用于進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)的形式(BaudoinR等2012；GeretsHH等，2012；Gomez-LechonMJ等，2012；HalladayJS等，2012；HoffmannSA等，2012；LubberstedtM等，2011；SmithCM等，2012)。在這些不同的誘導(dǎo)劑中，可以使用咪達(dá)唑侖、乙氧基試鹵靈、苯甲酰氧基試鹵靈、安非他酮、非那西丁、雙氯芬酸、甲苯磺丁脲、苯巴比妥、利福平、咖啡因、β-萘黃酮、奧美拉唑、右美沙芬、3-甲基膽蒽、瑞格列奈或文獻(xiàn)中列出的(BaleS等，2014)其他已知的細(xì)胞/肝毒性化合物作為探針評(píng)估在這些細(xì)胞中的藥物代謝。代謝檢測(cè)和定量可以與特定化合物上的肝酶活性相關(guān)聯(lián)如CYP1A2(通過檢測(cè)副黃嘌呤或?qū)σ阴０被?、CYP3A4(通過檢測(cè)1-OH-咪達(dá)唑侖或奧美拉唑砜)、CYP2C6(通過檢測(cè)HO-安非他酮)、CYP2C8(通過檢測(cè)羥基-瑞格列奈)、CYP2C9(通過檢測(cè)4’HO-雙氯芬酸)、CYP2C19(通過檢測(cè)羥基-奧美拉唑或HO-美芬妥英)、CYP2D6(通過檢測(cè)右啡烷)、CYP2E1(通過檢測(cè)6-OH-氯唑沙宗)，以及針對(duì)其他主要的細(xì)胞色素P450活性如CYP1A2、CYP2A6、CYP1B1、CYP2B6、CYP3A5、CYP3A7或CYP7A1(單獨(dú)或在適宜的組合中)。其表達(dá)或(優(yōu)選地)活性可以在H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代中確立的其他酶是UDP-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(如UGT1A1、UGT2B4、UGT2B7)、磺基轉(zhuǎn)移酶(催化若干藥學(xué)上重要內(nèi)源性分子和外源性物質(zhì)的硫酸綴合)、酪氨酸轉(zhuǎn)移酶、色氨酸-2,3-雙加氧酶(TDO2或TDO)、吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO1或IDO2)、賴氨酰氧化酶(LOX)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(例如GSTα)、多藥耐藥蛋白(MDR或MRP-1/-2/-3)、肝臟特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體(如OATP1B1)和其他I/II/III相生物轉(zhuǎn)化酶。而且，還可以應(yīng)用已建立好的方案觀察和比較白蛋白/尿素的產(chǎn)生和分泌、氨的代謝、糖原貯存、膽汁產(chǎn)生、血小板生成素/血管緊張素產(chǎn)生和半乳糖/山梨糖醇消除速率。當(dāng)采用本發(fā)明的方法獲得H2干細(xì)胞制備物時(shí)，可以在允許其生長(zhǎng)和倍增但不會(huì)分化的條件下維持和/或增殖該細(xì)胞群。優(yōu)選地，H2干細(xì)胞作為非分化的貼壁細(xì)胞(或者如上文所示的稱為H3干細(xì)胞的三維細(xì)胞簇)在培養(yǎng)物中傳代不超過2次、不超過3次、不超過4次或不超過5次，從而可以評(píng)估細(xì)胞倍增次數(shù)以建立用于進(jìn)一步體內(nèi)或體外應(yīng)用的最適條件。在這種狀態(tài)下一次或多次傳代后，誘導(dǎo)其分化成肝細(xì)胞樣或肝臟活性細(xì)胞(見圖1、圖4A和圖5B-E)。在這兩種情況下，所得到的細(xì)胞是代表H2干細(xì)胞子代。在第一種情況下，用于維持H2干細(xì)胞作為非分化的H2干細(xì)胞子代的條件可以與出于增加可用細(xì)胞數(shù)量的目的用于獲得原始H2干細(xì)胞群或者如實(shí)施例中所示產(chǎn)生三維細(xì)胞簇(H3干細(xì)胞)的條件相同。在第二種情況下，可以應(yīng)用已建立好的用于將成人肝臟祖細(xì)胞分化成具有分化成肝細(xì)胞的細(xì)胞的典型形態(tài)、生物學(xué)、功能特征的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件。在本發(fā)明方法的步驟(e)之后，任選地進(jìn)一步的步驟(f)可以包含將H2干細(xì)胞維持在允許分化成具有肝臟特異性活性的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，例如肝細(xì)胞樣或肝臟活性細(xì)胞(也就是說(shuō)，成人肝臟祖細(xì)胞喪失其對(duì)大部分(如果不是全部)間充質(zhì)標(biāo)記物的陽(yáng)性并且對(duì)大部分(如果不是全部)的肝細(xì)胞的形態(tài)、生物學(xué)和功能特征為陽(yáng)性)。實(shí)施例提供了如何產(chǎn)生貼壁細(xì)胞(作為H3篩選-2b、H3篩選-2c或H2篩選細(xì)胞)或能夠容易地維持在懸液中的三維細(xì)胞簇(作為H3篩選-1細(xì)胞或作為H3篩選-2a細(xì)胞)形式的作為H2干細(xì)胞子代的此類肝細(xì)胞樣或肝臟活性細(xì)胞的細(xì)節(jié)。在這個(gè)后面的方面，實(shí)施例顯示了超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)板或瓶和甚至更適宜地超低粘附、U型/圓底微量培養(yǎng)板提供了三維H2干細(xì)胞子代作為在懸液中的細(xì)胞簇，其顯示出表征肝細(xì)胞并且通常是肝臟活性細(xì)胞的改善的功能和結(jié)構(gòu)特征。包含96孔或384孔的所述U型/圓底微量培養(yǎng)板(或者在任意其他可利用的形式中，其含有不同數(shù)量的具有U型底的孔并且能夠?qū)⒓?xì)胞培養(yǎng)物維持在低于0.5ml或者甚至更好地低于0.25ml的細(xì)胞培養(yǎng)基體積中)提供了三維H2干細(xì)胞子代作為在懸液中的細(xì)胞簇，其具有更規(guī)則的尺寸和形狀，這使其更適于體外和體內(nèi)用途。因此，在一些實(shí)施方式中，將上述步驟(e)中產(chǎn)生和分離的所述細(xì)胞群維持在允許形成代表特定三維H2干細(xì)胞子代的細(xì)胞簇的細(xì)胞培養(yǎng)條件中?？梢詫⑺龇椒ǖ倪@個(gè)步驟作為進(jìn)一步的步驟(g)(例如用于從H2篩選細(xì)胞獲得H3篩選-1細(xì)胞)、作為替代步驟(f1)(例如用于從H2干細(xì)胞獲得H3干細(xì)胞)或者作為進(jìn)一步的替代步驟(f2)，其是體外分化和形成三維H2干細(xì)胞子代的組合(例如用于直接從H2干細(xì)胞獲得H2篩選-2a細(xì)胞)。在基本上與如上文所述的第一次傳代的那些相同或類似的或者包括修訂的條件下，可以進(jìn)行附加的傳代(例如將細(xì)胞分離和分散，再接種等)和培養(yǎng)(例如在融合后加入或更換培養(yǎng)基等)，所述修訂是文獻(xiàn)中建議的和/或特別地針對(duì)H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代使用的，特別是在三維細(xì)胞簇的形式中(三維H2干細(xì)胞子代)。因此，可以根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步優(yōu)化在細(xì)胞培養(yǎng)基中維持和/或分化H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代的條件，如定時(shí)/用于分化成干細(xì)胞樣或肝臟活性細(xì)胞的培養(yǎng)基、用于維持三維細(xì)胞培養(yǎng)物作為細(xì)胞懸液的系統(tǒng)、使用特異性的基質(zhì)或支架、缺氧、在細(xì)胞培養(yǎng)基中聯(lián)合或依次加入生長(zhǎng)因子和化學(xué)物質(zhì)或者細(xì)胞密度。本發(fā)明的方法提供了H2干細(xì)胞，其具有的形態(tài)、蛋白表達(dá)和功能特征不同于在此前描述的成人肝臟祖細(xì)胞中鑒定的那些。因此，已獲得的或由上文所定義的方法可獲得的H2干細(xì)胞代表了本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式。這些方法能夠提供包含較高比例特異性細(xì)胞(至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的細(xì)胞群，甚至產(chǎn)生基本上均一的細(xì)胞群，因?yàn)榭梢杂扇我膺m宜的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，例如通過流式細(xì)胞術(shù)或任意其他的免疫染色方法。將在給定H2干細(xì)胞子代中的間質(zhì)成分，特別是在肝臟活性細(xì)胞和三維細(xì)胞簇中的(見圖4A和圖5)，認(rèn)為是此類子代的一部分，并且不將其認(rèn)為是污染此類細(xì)胞簇的成分而是其組成成分?？梢詫2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代用于建立用于任意立即應(yīng)用或作為凍存制備物貯存的均含有至少103、106、109個(gè)細(xì)胞或更多細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其旨在在將所述制備物適宜地復(fù)蘇后產(chǎn)生或使用更高的量的H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代，并且如有需要以工業(yè)級(jí)規(guī)模生產(chǎn)H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代(例如使用生物反應(yīng)器、膜、微球、微流體或任意其他用于改進(jìn)生物過程和細(xì)胞擴(kuò)增同時(shí)保持所需的細(xì)胞性質(zhì)的技術(shù)方案)可以將與任意H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代對(duì)應(yīng)的細(xì)胞群樣品在含有血清或無(wú)血清的保存培養(yǎng)基中(例如市售的凍存配方)和/或在存在凍存保護(hù)劑(例如適宜濃度的二甲亞砜)的條件下凍存。關(guān)于微流體，H2干細(xì)胞子代(也為H3干細(xì)胞的形式，其保持為三維結(jié)構(gòu))能夠與市售系統(tǒng)兼容，所述市售系統(tǒng)開發(fā)為在安全性檢測(cè)、病理生理研究以及其他用于藥物研發(fā)和毒理學(xué)的基于細(xì)胞的肝臟模型方面的器官在芯片上(organ-on-a-chip)的應(yīng)用(AlépéeN等,2014；LinC等，2015)。特別地，可以在一個(gè)或多個(gè)藥瓶中提供包含預(yù)先確定細(xì)胞數(shù)量(例如5000、100000、500000、1百萬(wàn)、1千萬(wàn)、1億、10億個(gè)或更多的細(xì)胞)或均具有大致相似的細(xì)胞數(shù)的三維細(xì)胞簇?cái)?shù)量(如圖6中的那些所示1、10、100、1000個(gè)或更多的球團(tuán))的H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代制備物，然后可以將其納入包含能夠然后包括在包含此類藥瓶、容器、微流體裝置的試劑盒中的此類藥瓶(或其他適宜藥瓶或容器，如用于微流體應(yīng)用的那些)和任意其他適宜裝置、一次性材料(例如濾器、注射器)、溶液(例如PBS、細(xì)胞培養(yǎng)基、稀釋劑)、化學(xué)藥品(例如酶底物、熒光染料、藥物)、生物制品(例如生長(zhǎng)因子、抗體、引物)和/或此類試劑盒的組分的使用說(shuō)明書的試劑盒中，可以將其適當(dāng)?shù)匕b并發(fā)送至隨后在體內(nèi)(例如用于向患者或動(dòng)物施用)或體外(例如用于檢測(cè)作為候選藥物的化合物的毒性或效能)使用H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的客戶?？梢愿鶕?jù)所需用途的要求在細(xì)胞培養(yǎng)條件中(或隨后植入動(dòng)物模型或患者中)進(jìn)行H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的維持、增殖和/或分化。文獻(xiàn)提供了若干用于維持肝臟祖細(xì)胞和/或從其產(chǎn)生肝細(xì)胞樣或肝臟活性細(xì)胞的方案。實(shí)施例提供了用于在細(xì)胞培養(yǎng)條件下獲得H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的方法，以及用于將其分化成具有肝臟特異性活性的貼壁細(xì)胞或三維細(xì)胞簇形式的細(xì)胞的方法。在這個(gè)后面的例子中，針對(duì)所需用途可以將H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代作為與肝臟球狀體或類器官類似的三維細(xì)胞簇提供，其根據(jù)文獻(xiàn)當(dāng)肝內(nèi)或肝外施用時(shí)可以提供活力和功能性具有顯著改善的細(xì)胞，用于檢測(cè)化合物的肝毒性，作為凍存的制備物保持，在生物反應(yīng)器或多盤堆疊中擴(kuò)增用于放大的生產(chǎn)工藝，或者在肝臟輔助裝置中使用(LuY等，2012；SaitoR等，2011；MassieI等，2011；Soto-GutierrezA等，2010；MitakaT和OoeH,2010；MengQ,2010；TostoesRM等，2012)。除了在實(shí)施例中描述的方法以外，還可以通過在合成的或生物基質(zhì)中包封所述細(xì)胞獲得H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的三維生長(zhǎng)。特別地，可以將肝臟去細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)作為培養(yǎng)一種或多種細(xì)胞類型的支架，作為用于產(chǎn)生肝臟類器官的二維基質(zhì)涂層和三維可注射水凝膠平臺(tái)(LeeJ等，2014；CaraltM等，2014)?？梢允褂冕槍?duì)不同來(lái)源干細(xì)胞、祖細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞的本領(lǐng)域公知的技術(shù)方案通過調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)條件改善H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的維持、增殖和/或分化。例如，非細(xì)胞損壞低氧環(huán)境的離體方案和用于適應(yīng)體外微環(huán)境的其他方案可以促進(jìn)此類細(xì)胞的存活、遺傳穩(wěn)定性、增殖、移植后分化、歸巢和在肝臟中的重建、旁分泌因子的分泌和總體治療潛能(MuscariC等，2013；CigogniniD等，2013)。除此之外，對(duì)人血液來(lái)源的成分如臍帶血血清和血小板裂解物進(jìn)行檢測(cè)并開發(fā)為細(xì)胞培養(yǎng)成分，其非外源性地替代了胎牛血清并且仍符合良好的生產(chǎn)管理規(guī)范(GMP)指導(dǎo)原則，以生產(chǎn)臨床相關(guān)的細(xì)胞劑量同時(shí)不存在與血清相關(guān)的公知問題如質(zhì)量的變異性、污染風(fēng)險(xiǎn)和不利的免疫作用(BiebackK,2013；GriffithsS等，2013)。在施用或者以其他方式使用之前，可以通過將所述細(xì)胞暴露于異源性生物或化學(xué)試劑，或者通過將所述試劑引入所述細(xì)胞瞬時(shí)或穩(wěn)定地修飾H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代。特別地，可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)中(例如在其分化之后和/或之前)使用生長(zhǎng)因子處理細(xì)胞和/或引入影響所述細(xì)胞總體表達(dá)性質(zhì)的核酸對(duì)H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代進(jìn)行修飾(或進(jìn)行工程化改造，隨后使用適宜的載體對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化)，優(yōu)選地針對(duì)特定的肝臟性質(zhì)或有助于細(xì)胞培養(yǎng)的性質(zhì)(例如通過使用微RNA或使用表達(dá)重組蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，如生長(zhǎng)因子，或已知影響肝分化或朝向任意其他細(xì)胞類型分化的轉(zhuǎn)錄因子，和/或產(chǎn)生具有治療興趣的特定蛋白，或熒光蛋白)。特別地，在其分化成具有全方位的肝臟特異性活性的細(xì)胞之后和/或之前，H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代可以因此存在改進(jìn)的和/或附加的體內(nèi)和/或體外生物活性。優(yōu)選地，在分化之前將H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代進(jìn)行工程改造，這樣就能持續(xù)對(duì)此類細(xì)胞的任意子代進(jìn)行修飾以使其具有改進(jìn)的生物活性，而不依賴于任何隨后的體外分化或體內(nèi)使用(其可能意味著或者不是肝臟或其他類型的分化)。使用已知誘導(dǎo)其他已知的肝臟祖細(xì)胞/干細(xì)胞分化成其他非肝臟細(xì)胞類型(例如骨細(xì)胞、胰島素生成β細(xì)胞或骨髓細(xì)胞)的化學(xué)試劑、細(xì)胞培養(yǎng)基和/或核酸載體處理H2干細(xì)胞子代可以同樣地提供此類非肝細(xì)胞類型。通過向H2干細(xì)胞(或任意特異性的H2干細(xì)胞子代類型)應(yīng)用這些在文獻(xiàn)中已知的技術(shù)獲得的非肝細(xì)胞群是不同于實(shí)施例(通過使用誘導(dǎo)肝分化的細(xì)胞培養(yǎng)基獲得)中所描述的其他的H2干細(xì)胞子代類型，根據(jù)作為此類處理后果的H2干細(xì)胞子代喪失的和/或獲得的生物活性其可以在體外和/或體內(nèi)(特別是用于治療用途)使用(例如產(chǎn)生和分泌胰島素的分化的H2干細(xì)胞子代可以用于治療糖尿病)。可以將適用于肝臟祖細(xì)胞的常規(guī)基因轉(zhuǎn)移方法用于將核酸引入H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代，包括微注射、電穿孔、與磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)體或病毒轉(zhuǎn)染。在使用適宜載體對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代可以表達(dá)重組蛋白或含有核酸，其使得所述細(xì)胞在其分化成肝細(xì)胞樣或肝臟活性細(xì)胞之后和/或之前具有改善的和/或附加的體內(nèi)和/或體外生物活性(例如，在建立基于肝臟祖細(xì)胞的用于基因治療的模型的范圍)。當(dāng)所述載體是病毒載體(例如慢病毒載體)時(shí)，將通過確定其滴度以選擇最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)效率條件和增殖速率并且分析其表達(dá)性質(zhì)以及其安全性對(duì)其進(jìn)行表征。肝臟以這樣一種方式在解剖學(xué)上與循環(huán)系統(tǒng)連接，其允許多種蛋白有效釋放進(jìn)入血液循環(huán)。因此，可以將編碼具有全身作用的蛋白的基因插入H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代(特別是在培養(yǎng)以獲得三維細(xì)胞簇以前)，用于當(dāng)體內(nèi)施用時(shí)進(jìn)一步改善其效能(特別是當(dāng)全身施用時(shí)，例如通過注射、肌內(nèi)或腹腔內(nèi)施用)，以及其移植和維持。如通過使用相關(guān)小鼠模型的實(shí)施例4中所示，H2干細(xì)胞存在較高水平的植入、歸巢和肝分化成肝組織，因此可能提供了施用外源性蛋白的有效方法。例如，可以將編碼激素或抗體的多種基因插入本發(fā)明的肝細(xì)胞中用于將其基因產(chǎn)物分泌進(jìn)入循環(huán)。特別地，可以將H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代修飾為組成型或瞬時(shí)過表達(dá)正常地由肝細(xì)胞表達(dá)(并且可能已經(jīng)由此類細(xì)胞表達(dá))，但是患者中缺陷或缺乏的蛋白(這種缺陷是患者病理狀態(tài)的基礎(chǔ)，如肝臟代謝的先天性缺陷)并且?guī)椭謴?fù)生產(chǎn)所述蛋白，從而輔助所述患者的治療。此類蛋白的示例是代謝蛋白如鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、氨甲酰磷酸合成酶、N-乙酰谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、糖原合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、堿性磷酸酶、琥珀酸脫氫酶、葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫氫酶、鐵蛋白、低密度脂蛋白(LDL)受體、細(xì)胞色素P450酶、醛脫氫酶和/或醇脫氫酶。或者，可以通過引入編碼分泌的血漿蛋白的DNA修飾H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代，如白蛋白、生長(zhǎng)因子或激素、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體蛋白(如補(bǔ)體C3)、成分C3、α2-巨球蛋白、纖維蛋白原α/β/γ鏈、凝血因子(因子V、因子VII、因子VIII、因子XI、因子XIII、因子IX)、α1-抗胰蛋白酶等。當(dāng)產(chǎn)生H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代時(shí)獲得的生物材料可以進(jìn)一步用于鑒定可以具有特定用途特別是獨(dú)特的藥物用途的生物實(shí)體。這些生物材料不僅包括存在特定標(biāo)記物、活性和/或形態(tài)的H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代的亞群(或細(xì)胞系)(如在實(shí)施例3和4中確定的)，而且還包括作為中間體或終產(chǎn)物獲得的任意其他生物實(shí)體，如條件細(xì)胞培養(yǎng)基和這些細(xì)胞的成分和包含蛋白、代謝物、細(xì)胞囊泡和/或核酸的培養(yǎng)基，可以將其作為檢測(cè)具有醫(yī)療興趣的細(xì)胞的標(biāo)記物或者作為存在具有醫(yī)療興趣的活性或分布的化合物。即使盡管可以使用目標(biāo)細(xì)胞直接探究此類方法，但是還可以通過測(cè)定所述條件細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)容物(例如以細(xì)胞培養(yǎng)物上清的形式)確定附加信息，其能夠提供分泌組的相關(guān)信息并且特別地為H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的旁分泌作用?？梢酝ㄟ^使用技術(shù)對(duì)H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代的相關(guān)生物學(xué)特征進(jìn)行鑒定，如流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)、質(zhì)譜、凝膠電泳、免疫測(cè)定(例如免疫印跡、Western印跡、免疫沉淀、ELISA)、核酸擴(kuò)增、酶活性、組學(xué)技術(shù)(蛋白質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué))和/或其他生物學(xué)活性。特別地，技術(shù)如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、脂類組學(xué)、糖組學(xué)等可以提供用于使用針對(duì)干細(xì)胞或祖細(xì)胞并且特別是肝臟祖細(xì)胞已發(fā)表的數(shù)據(jù)庫(kù)和其他數(shù)據(jù)集比較H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代的附加方法(YuJ等，2012；SantamariaE等，2012；SlanyA等，2010；Sison-YoungR等，2015)。在這個(gè)方法中，可以將蛋白如SUSD2鑒定為標(biāo)記物，其顯著更高的存在于H2干細(xì)胞中，這將其與具有相似來(lái)源的細(xì)胞如ADHLSC細(xì)胞相區(qū)分(或者在相反的方向，缺乏CD140b的表達(dá)將H2干細(xì)胞與ADHLSC細(xì)胞相區(qū)分，如圖10所示)?？梢栽贖2干細(xì)胞子代制備的初始步驟或隨后(例如用于比較和驗(yàn)證H2干細(xì)胞子代的工業(yè)生產(chǎn)批次或用于評(píng)估藥物用途的適用性)使用的附加標(biāo)記物是CD49b、CD51，使用或使用下表2列出的組中的一種或多種蛋白。這些方法可以提供用于在體內(nèi)或體外定義與成人肝臟祖細(xì)胞相關(guān)的新型生物標(biāo)記物的方法(例如在其制備和使用之前、期間和之后用于建立細(xì)胞群的數(shù)量、質(zhì)量和均質(zhì)性)。特別地，在通常情況下可以通過在生物樣品或在細(xì)胞培養(yǎng)物中給定細(xì)胞群(H2干細(xì)胞和/或H2干細(xì)胞子代)的濃度或者與存在特定蛋白、脂質(zhì)、酶、磷脂和/或聚糖的細(xì)胞濃度的組合對(duì)生物標(biāo)記物進(jìn)行定義。此類生物標(biāo)記物可以對(duì)應(yīng)于肽、蛋白、磷脂、脂質(zhì)、核酸、聚糖或此類元素組成的任意組合。所述生物標(biāo)記物可以特異性地用于評(píng)估H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代的細(xì)胞群用于給定用途的適宜性(例如治療特定的肝臟疾病，在體外分化或使用化學(xué)試劑和/或核酸載體修飾后獲得肝活性細(xì)胞類型、評(píng)估特定化合物的代謝)，特別是當(dāng)對(duì)來(lái)自不同供體和/或通過應(yīng)用不同生產(chǎn)工藝獲得的H2干細(xì)胞子代進(jìn)行比較時(shí)?；蛘撸绻o定的肝臟組織(或新鮮或凍存肝細(xì)胞的樣品)適于更有效地獲得H2干細(xì)胞(例如通過篩選肝臟組織銀行和其他肝臟來(lái)源的生物樣品庫(kù)如蛋白提取物和cDNA文庫(kù)以確立可以選擇的供體和/或樣品)，則可以對(duì)所述生物標(biāo)記物進(jìn)行評(píng)估。術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)記物”或“標(biāo)記物”指作為表征H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的客觀測(cè)定和評(píng)估的分子、參數(shù)、特征或?qū)嶓w。對(duì)與特定樣品(如組織或生物液體)中的H2干細(xì)胞和/或干細(xì)胞子代相關(guān)的生物標(biāo)記物的定量評(píng)估可能與對(duì)總細(xì)胞的定量評(píng)估，與H2干細(xì)胞和/或H2干細(xì)胞子代可以生產(chǎn)和分離的效率、特定的體外技術(shù)或者患者的特定醫(yī)療用途或狀況相關(guān)?？梢詫2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代用于再生醫(yī)學(xué)和生物測(cè)定中，其要求一旦在體內(nèi)或體外分化，或者甚至在誘導(dǎo)完全分化成具有更大數(shù)量和/或更強(qiáng)的肝臟特異性活性(即肝活性細(xì)胞)的細(xì)胞之前，所述細(xì)胞具有的生物特征(如代謝或酶活性、抗原性質(zhì)或其他表型)盡可能地與在所需時(shí)間段的原代肝細(xì)胞中所觀察到的那些類似。還可以將H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代用于體外應(yīng)用，如藥理學(xué)或毒理學(xué)研究(例如篩選和表征生物或化學(xué)試劑)。H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代能夠用于建立毒理學(xué)、藥理學(xué)和遺傳藥理學(xué)(作為對(duì)來(lái)源于不同來(lái)源的祖細(xì)胞或干細(xì)胞的原代肝細(xì)胞和肝細(xì)胞樣細(xì)胞的充分描述)的體外和動(dòng)物模型或者鑒定用于鑒定具有醫(yī)學(xué)興趣的體內(nèi)和/或體外細(xì)胞群的生物標(biāo)記物，特別是與肝臟疾病的診斷、預(yù)防和/或治療相關(guān)的。如在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“體外”表示動(dòng)物或人身體的外面或外部。如應(yīng)將在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“體外”理解為包括“離體”。術(shù)語(yǔ)“離體”通常指將組織或器官?gòu)膭?dòng)物或人體內(nèi)取出并且在所述機(jī)體外維持或范圍，例如在培養(yǎng)容器或在生物反應(yīng)器中。如果可以優(yōu)選地將H2干細(xì)胞和H3干細(xì)胞用于體內(nèi)應(yīng)用，則可以優(yōu)選地將對(duì)應(yīng)于H2篩選細(xì)胞、H3篩選-1細(xì)胞和不同分類的H3篩選-2細(xì)胞的H2干細(xì)胞子代用作用于藥物發(fā)現(xiàn)/驗(yàn)證的分化的肝細(xì)胞樣或肝活性細(xì)胞。可以在包含其的組合物中提供H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代(或者當(dāng)產(chǎn)生其時(shí)獲得的相應(yīng)的生物材料)，并且特別地作為可以用于體內(nèi)施用的治療方法(在人或動(dòng)物模型中)的藥物組合物或者以包含作為新鮮細(xì)胞或適于長(zhǎng)期保存的細(xì)胞(例如凍存細(xì)胞)的此類細(xì)胞的組合物的形式體外應(yīng)用。優(yōu)選地，包含H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代的組合物可以含有至少103、106、109或更多的細(xì)胞。此類基于細(xì)胞的組合物還可以包括其他生物(例如抗體或生長(zhǎng)因子)或化學(xué)來(lái)源(例如藥物、細(xì)胞保護(hù)或標(biāo)記化合物)的試劑，其可以提供進(jìn)一步的治療、診斷或任意其他有用的作用。文獻(xiàn)中提供了與基于細(xì)胞的藥物組合物具有相容性的任選地添加劑、賦形劑、溶劑和/或載體的若干示例，所述藥物組合物還可以包括特定的緩沖劑、生長(zhǎng)因子或助劑，其中對(duì)所述組合物中各組分的量(以微克/毫克、體積或百分率表示)以及將其與H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代組合的方式進(jìn)行了定義?？梢詫2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞以組合物的形式施用，根據(jù)所選擇的施用方法，其可以是細(xì)胞懸液、海綿或其他三維結(jié)構(gòu)，在其中細(xì)胞可以在體外和/或體內(nèi)生長(zhǎng)和分化，包括生物人工肝臟裝置、天然或合成的基質(zhì)或者允許細(xì)胞移植和具有功能性的其他系統(tǒng)。特別地，可以通過注射(還包括導(dǎo)管施用)或植入給予H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代，例如局部注射、全身注射、脾內(nèi)注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、門靜脈內(nèi)注射、肝臟泵注射，例如肝包膜下、胃腸外施用或者宮內(nèi)注射至胚胎或胎兒。當(dāng)全身而不是局部注射時(shí)，H2干細(xì)胞產(chǎn)品可能在遠(yuǎn)距離位置具有作用，因?yàn)榇祟怘2干細(xì)胞在血液中移動(dòng)并且植入遠(yuǎn)距離位置(如內(nèi)臟或關(guān)節(jié))，或者因?yàn)镠2干細(xì)胞分泌的蛋白由于血液到達(dá)特定的細(xì)胞類型。而且，可以將H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代作為解毒裝置的生物成分如將H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代(像其他干細(xì)胞、原代人細(xì)胞如分化的肝細(xì)胞或來(lái)源于干細(xì)胞的細(xì)胞類型)接種于其中的具有剛性的、塑料外殼和中空半透膜纖維的肝臟灌注或肝臟輔助裝置。根據(jù)公知的程序可以將體液灌注通過解毒裝置，然后再返回患者?？梢詫2干細(xì)胞、H2干細(xì)胞子代或含有其的組合物用于經(jīng)肝內(nèi)或肝外位置的肝細(xì)胞移植(LCT)的組織工程和細(xì)胞療法(包括用于調(diào)節(jié)肝臟或其他器官和組織移植之前或之后的免疫應(yīng)答)。使用這種方法，還可以通過將人源的H2干細(xì)胞、人源的H2干細(xì)胞子代或含有其的組合物移植入動(dòng)物中獲得人肝臟疾病的動(dòng)物模型，其中在所述動(dòng)物模型中能夠更加有效地評(píng)估和區(qū)分化合物對(duì)人肝細(xì)胞的作用。當(dāng)施用包含H2干細(xì)胞或特定H2干細(xì)胞子代的治療組合物時(shí)，通?？梢詫⑵渲瞥蓡挝粍┬?。在任何情況下，包括試劑和/或調(diào)整已知的用于將細(xì)胞向患者施用的方法以確保H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代存活可能是所需要的，例如通過將所述細(xì)胞摻入生物聚合物或合成聚合物。適宜的生物聚合物的示例包括但不限于纖連蛋白、纖維蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、膠原、蛋白聚糖層粘連蛋白、粘附分子、蛋白聚糖、透明質(zhì)酸、糖胺聚糖鏈、殼聚糖、藻酸鹽、來(lái)源于此類蛋白的天然的或合成的經(jīng)修飾的肽以及合成的、生物可降解的和生物相容性的聚合物。這些組合物可以使用或不使用包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子生產(chǎn)，并且作為懸液或作為具有包埋入其中的所述細(xì)胞的三維凝膠施用。本發(fā)明的方法不僅涉及使用任意供體的肝臟組織產(chǎn)生H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代，而且涉及使用患者自身的肝臟組織生產(chǎn)和分離H2干細(xì)胞并產(chǎn)生H2干細(xì)胞子代或含有其的組合物。此類細(xì)胞將是所述患者自體的并且能夠容易地給予所述患者。此外，還可以從不是患者自身的組織生產(chǎn)和分離H2干細(xì)胞。當(dāng)涉及向患者施用此類細(xì)胞時(shí)，至少在可能的限度內(nèi)選擇如使所述患者和所施用細(xì)胞的組織相容性最大化的用于本發(fā)明的方法以獲得H2干細(xì)胞的肝臟組織，從而降低所施用的細(xì)胞倍患者的免疫系統(tǒng)排斥的機(jī)會(huì)(例如移植物抗宿主排斥反應(yīng))。關(guān)于H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代治療用途的一個(gè)問題是達(dá)到最佳效果所必需的細(xì)胞量。施用劑量是可以改變的，可以包括初始施用接著后續(xù)施用；并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開的教導(dǎo)確定。典型地，所述施用劑量將提供治療有效量的細(xì)胞并且其可能要求所施用的細(xì)胞量最佳化。因此，針對(duì)待治療的對(duì)象所施用的細(xì)胞量將是變化的(例如在一個(gè)療程中的每次治療或針對(duì)整個(gè)療程102至1010個(gè)細(xì)胞)。因此，可以基于每名患者的個(gè)體因素精確確定治療有效劑量，包括體型、年齡、組織損傷大小和從損傷出現(xiàn)開始的時(shí)間量。優(yōu)選地，包含H2干細(xì)胞或特定H2干細(xì)胞子代的組合物應(yīng)含有基本上同源的如上文所定義的細(xì)胞群并且隨后可以對(duì)各劑量中的細(xì)胞量進(jìn)行調(diào)整。特別地，當(dāng)包含H3干細(xì)胞或任意其他H2干細(xì)胞子代的組合物形成三維細(xì)胞簇時(shí)，不僅可以根據(jù)細(xì)胞(或細(xì)胞簇)總數(shù)而且根據(jù)其維度通過選擇具有的直徑在給定范圍內(nèi)(例如50μm至200μm之間或50μm至100μm之間)或低于/高于給定尺寸(例如100μm、200μm、500μm或1000μm)和/或包含給定細(xì)胞數(shù)(例如至少10000、20000、50000、100000或更多)的待施用的細(xì)胞簇制備此類組合物?？梢栽谌藢?duì)象或在動(dòng)物模型中(優(yōu)選嚙齒動(dòng)物)確定其施用或植入后H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代的分布、分化和/或增殖(以及在不同的治療劑施用前/后其活性)。例如，脾臟內(nèi)移植H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代的SCID小鼠的肝臟分析可以顯示通過檢測(cè)人源標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞能夠植入肝臟和重建該器官并且通過檢測(cè)人白蛋白或任意其他典型的人肝臟特異性標(biāo)記物(或者此前在所施用的H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代中轉(zhuǎn)染的重組基因)發(fā)現(xiàn)其分化成具有活性的、成熟的肝細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種用于預(yù)防和/或治療肝臟疾病的方法，所述方法包括向需要其的對(duì)象中施用H2干細(xì)胞、H2干細(xì)胞子代或含有其的組合物。H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代能夠用于治療肝臟疾病，特別是需要在對(duì)象中永久性(或有時(shí)間限制的)重建肝功能的那些，根據(jù)文獻(xiàn)，觀察到的和可以分成不同分類的，考慮到肝臟重量和/或功能的喪失其需要肝臟移植、肝細(xì)胞移植或肝臟再生。一種用于治療肝臟疾病的方法，所述方法包括向需要其的對(duì)象施用H2干細(xì)胞產(chǎn)物，如H2干細(xì)胞或給定的H2干細(xì)胞子代，和優(yōu)選地在組合物中。特別地，一種在需要其的患者中治療疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的H2干細(xì)胞產(chǎn)物，所述疾病優(yōu)選地是肝臟疾病如肝臟代謝的先天性缺陷、遺傳性凝血癥、1/2/3型進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體缺陷、卟啉癥、脂肪肝或其他纖維化肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、肝臟退行性疾病或者急性或慢性肝衰竭。第一類肝臟疾病以肝臟代謝的先天性缺陷為代表，可以將其進(jìn)一步區(qū)分為氨基酸代謝缺陷(如楓糖尿癥、苯丙酮尿癥、酪氨酸血癥、丙酸血癥、有機(jī)酸尿癥和尿素循環(huán)障礙，包括精氨基琥珀酸尿癥、氨甲酰磷酸合成酶I缺乏、瓜氨酸血癥、高精氨酸血癥和鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏)，金屬代謝缺陷(如威爾森氏癥或血色素沉著癥)和碳水化合物代謝缺陷(如I/II型糖原貯積癥、果糖血癥或半乳糖血癥)、溶酶體病(如沃爾曼病、尼曼皮克病)、過氧化物酶體病(如雷弗素姆病)、家族性高膽固醇血癥和其他脂質(zhì)代謝障礙、線粒體病(如丙酮酸羧化酶缺乏)和高膽紅素血癥(如克里格勒-納賈爾綜合征、吉爾伯特綜合征或杜賓-約翰遜綜合征)。第二類以遺傳性凝血癥為代表，如因子V缺乏、因子VII缺乏、因子VIII缺乏、因子IX缺乏、因子XI缺乏、因子XIII缺乏和由于其他凝血相關(guān)因子的量不足(包括其他凝血因子和纖維蛋白原α/β/γ鏈)或由肝臟特異性表達(dá)和分泌進(jìn)入血液循環(huán)的其他蛋白(如白蛋白)導(dǎo)致的其他缺乏。第三類以不直接與凝血或代謝缺陷相關(guān)的其他肝臟疾病為代表并且包括1/2/3型進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、卡羅利病、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體缺陷、卟啉癥(如急性間歇性卟啉癥)、脂肪肝和其他纖維化肝病(NASH/NAFLD)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、肝臟退行性疾病或者急性或慢性肝衰竭(例如肝切除術(shù)后、爆發(fā)性、病毒誘導(dǎo)的、慢加急性肝衰竭)。如上文所討論的，可以將H2干細(xì)胞產(chǎn)物與另一種產(chǎn)品(如藥物、治療劑、另一種細(xì)胞類型或其他生物材料)聯(lián)合施用或使用。這適用于本申請(qǐng)所述的任何施用和治療用途。特別地，其他治療產(chǎn)品可以與H2干細(xì)胞產(chǎn)物在基本上相同的時(shí)間(在同一藥物組合物中或在不同藥物組合物中)或在不同的時(shí)間(在不同藥物組合物中并且以任意順序或頻率)施用。無(wú)論其他治療產(chǎn)品是否與H2干細(xì)胞產(chǎn)物分別施用，所得到的效果可以是協(xié)同的，即效果優(yōu)于預(yù)期的附加效果，此類組分之一的負(fù)面作用減輕或消失和/或通過以更低的量或更少的頻率施用獲得此類組分之一的正面作用。當(dāng)H2干細(xì)胞產(chǎn)物是H2干細(xì)胞子代時(shí)，這些細(xì)胞可以與另一種細(xì)胞類型(例如原代人肝細(xì)胞、ADHLSC細(xì)胞、或者另一種人細(xì)胞類型或群，其是原代細(xì)胞、干細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，如在WO2006126219中所描述的、或者肝臟來(lái)源的其他祖細(xì)胞或干細(xì)胞)或細(xì)胞培養(yǎng)物上清形式的其相應(yīng)的條件細(xì)胞培養(yǎng)基聯(lián)合施用。H2干細(xì)胞與另一種細(xì)胞類型的聯(lián)用能夠改善一種和/或其他細(xì)胞類型在人體內(nèi)的治療效能、植入、歸巢、重建、增殖和/或穩(wěn)定性。H2干細(xì)胞子代可以作為還包含此類另一種細(xì)胞類型的制劑的一部分施用，或者可以單獨(dú)施用，但是是與其他細(xì)胞類型聯(lián)用，如順序地或同時(shí)地(以任意順序)。兩種細(xì)胞類型可以作為細(xì)胞懸液或共培養(yǎng)物，或者在海綿或其他三維結(jié)構(gòu)中施用，在所述海綿或其他三維結(jié)構(gòu)中細(xì)胞能夠在體外和/或體內(nèi)生長(zhǎng)、增殖和分化，包括生物人工肝臟裝置以及天然的或合成的支撐這些細(xì)胞在人體內(nèi)維持的基質(zhì)。將H2干細(xì)胞與另一種細(xì)胞類型條件細(xì)胞培養(yǎng)基的組合可以提供在人體內(nèi)具有改善的治療效能、植入、增殖和/或穩(wěn)定性的H2干細(xì)胞子代，其同時(shí)具有或不具有與其他細(xì)胞類型條件細(xì)胞培養(yǎng)基的組分相關(guān)的其他有用的性質(zhì)?；蛘?，當(dāng)H2干細(xì)胞產(chǎn)物是H2干細(xì)胞子代的條件細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，這種制備物可以與另一種細(xì)胞類型(例如原代人肝細(xì)胞、ADHLSC細(xì)胞、或者另一種人細(xì)胞類型或群，其是原代細(xì)胞、干細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，如在WO2006126219中所描述的、或者肝臟來(lái)源的其他祖細(xì)胞或干細(xì)胞)或其相應(yīng)的條件細(xì)胞培養(yǎng)基聯(lián)合施用。H2干細(xì)胞子代的條件細(xì)胞培養(yǎng)基與另一種細(xì)胞類型的組合可以改善后一種細(xì)胞類型在人體內(nèi)的植入、穩(wěn)定性、歸巢、增殖、重建和/或穩(wěn)定性。而且，H2干細(xì)胞產(chǎn)物可以作為還包含此類另一種細(xì)胞類型的制劑的一部分施用，或者可以單獨(dú)施用，但是是與其他細(xì)胞類型聯(lián)用，如順序地或同時(shí)地(以任意順序)。或者，將H2干細(xì)胞子代的條件細(xì)胞培養(yǎng)基與另一種細(xì)胞類型的條件細(xì)胞培養(yǎng)基聯(lián)用可以提供具有改善的治療效能的溶液，其可能組合了本申請(qǐng)中包括的分泌蛋白的作用。加之，H2干細(xì)胞子代的條件干細(xì)胞培養(yǎng)基可以作為還包含此類另一種條件細(xì)胞培養(yǎng)基的制劑的一部分施用，或者可以單獨(dú)施用，但是是與其他培養(yǎng)基聯(lián)用，如順序地或同時(shí)地(以任意順序)。H2干細(xì)胞產(chǎn)物的施用或治療用途(與ADHLSC細(xì)胞或ADHLSC細(xì)胞的條件細(xì)胞培養(yǎng)基的施用和治療用途類似，如在WO2015001124中描述的)還可以提供預(yù)料不到的正面作用。特別是，H2干細(xì)胞子代或由H2干細(xì)胞子代獲得的條件細(xì)胞培養(yǎng)基的施用或治療用途可以與用于治療遺傳疾病所特別需要的蛋白的施用聯(lián)合，如代謝酶(例如鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶或UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1)或凝血因子(例如因子VIII、因子IX或因子XI)。此類蛋白或凝血因子可以與由H2干細(xì)胞產(chǎn)物(或由ADHLSC細(xì)胞或相應(yīng)的條件細(xì)胞培養(yǎng)基)提供的且參與相同代謝途徑或生理功能(例如凝血)的蛋白和酶一起使用，可能獲得協(xié)同作用。當(dāng)將H2干細(xì)胞產(chǎn)物與另一種產(chǎn)品聯(lián)合施用或使用時(shí)，如上文所討論的，其他產(chǎn)品可以因此是用于治療遺傳疾病的此類蛋白如代謝酶或凝血因子。而且，藥物組合物可以通過凍存高濃度(1000萬(wàn)/ml、5000萬(wàn)/ml、1億/ml或更高，在適宜地市售溶液如Cryostor中)的H2干細(xì)胞產(chǎn)物產(chǎn)生，通過使用適宜的稀釋劑直接在凍存管內(nèi)復(fù)溶藥物組合物將其解凍并給予患者(不需要分級(jí)環(huán)境并且具有較低的物流要求)。這種方法可以提供與常規(guī)用于治療酶或凝血因子缺乏的分離的重組蛋白的施用相比具有更長(zhǎng)的和/或改善的治療作用的藥物組合物。因此藥物組合物可以包含(a)如本申請(qǐng)所述的H2干細(xì)胞產(chǎn)物，如H2干細(xì)胞子代或其條件培養(yǎng)基，(b)如本申請(qǐng)所述的另一種產(chǎn)品，如藥物、治療劑、另一種細(xì)胞類型或其他生物材料，更特別地用于治療遺傳疾病的蛋白，如代謝酶(例如鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶或UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1)或凝血因子(例如因子VIII、因子IX或因子XI)以及(c)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。在此范圍內(nèi)，可以在生產(chǎn)過程中選擇特定類型的H2干細(xì)胞產(chǎn)物和ADHLSC細(xì)胞(如亞群、細(xì)胞系及其部分)，因?yàn)獒槍?duì)在給定代謝途徑或生理功能(例如凝血)中涉及的一系列蛋白存在最適生產(chǎn)水平(作為絕對(duì)值和/或作為此類蛋白之間的比值)。例如，可以選擇特定亞群的H2干細(xì)胞或ADHLSC細(xì)胞(以及相關(guān)的生產(chǎn)過程)，因?yàn)槠涮峁┝司哂卸喾N凝血因子(例如外在因子因子V、因子VII和因子X的兩種或多種和/或內(nèi)在因子因子VIII、因子XI、因子XIII、因子XII和因子IX的兩種或多種)平衡表達(dá)的細(xì)胞群(其能夠以細(xì)胞系、可保存的細(xì)胞制備物或以其他存儲(chǔ)方式保存)，其適于不同類型的凝血缺陷之一，如血友病(A型是與因子缺乏相關(guān)；B型是與因子IX缺乏相關(guān)；C型是與因子XI缺乏相關(guān)；參見KabelA2014，對(duì)于出血性病癥及其治療管理的綜述)。在通常情況下在組合物中和在治療方法中使用H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代(或特定的細(xì)胞群，如H3干細(xì)胞)能夠提供對(duì)肝臟疾病的治療作用，如上文所列的那些，但是其還能夠與原代肝細(xì)胞或肝細(xì)胞系替換的體外研究相關(guān)。特別地，H2干細(xì)胞子代能夠用于評(píng)估化合物(例如生物或化學(xué)實(shí)體)的效能(如果H2干細(xì)胞產(chǎn)物表達(dá)肝臟特異性或非特異性疾病的潛在藥物靶點(diǎn))、代謝、穩(wěn)定性和/或毒性的(早期)藥理學(xué)和毒理學(xué)方法。此類體外方法和用途應(yīng)通常包括下述步驟：(a)提供H2干細(xì)胞產(chǎn)物的制備物(例如細(xì)胞形式的H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代、細(xì)胞提取物或從H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代獲得的條件培養(yǎng)基)；(b)將所述H2干細(xì)胞產(chǎn)物暴露于一種或多種外源性化合物，所述外源性化合物選自化學(xué)化合物、蛋白、核酸、脂質(zhì)、糖、金屬、鹽、病毒、細(xì)菌或細(xì)胞；和(c)檢測(cè)暴露于H2干細(xì)胞產(chǎn)物后一種或多種外源性組分對(duì)H2干細(xì)胞產(chǎn)物的作用和/或檢測(cè)所述一種或多種外源性組分的存在、定位或改變。H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代表達(dá)較高水平的酶和其他肝臟特異性蛋白，已知其代謝大部分化學(xué)物質(zhì)，所述化學(xué)物質(zhì)是已注冊(cè)藥物、針對(duì)肝臟特異性作用仍處于研發(fā)和臨床前評(píng)估中的候選藥物或者疑似可能具有不利的(即針對(duì)肝毒性化合物)或所需的(如果已知H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代表達(dá)的酶和其他肝臟特異性蛋白本身是針對(duì)肝臟特異性或非特異性疾病如癌癥的候選藥物靶點(diǎn)并且然后可以將所述化合物認(rèn)為是此類疾病的候選藥物)肝臟特異性作用的任意其他化學(xué)物質(zhì)。在通常情況下，可以在上述步驟(c)中對(duì)細(xì)胞、細(xì)胞提取物或從H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代獲得的條件培養(yǎng)基形式的H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代進(jìn)行評(píng)估，以通過對(duì)一般特征如細(xì)胞形態(tài)或活力(例如在細(xì)胞毒性檢測(cè)中)的分析評(píng)估化學(xué)物質(zhì)、無(wú)機(jī)化合物、生物制品、細(xì)菌、病毒或細(xì)胞的代謝、消除和毒性。然而，可以包括替代或附加標(biāo)準(zhǔn)如所述H2干細(xì)胞產(chǎn)物(例如H2干細(xì)胞、H2干細(xì)胞子代、細(xì)胞提取物或者從H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代獲得的條件培養(yǎng)基)中肝臟特異性(或非特異性)蛋白的上調(diào)或下調(diào)，或者蛋白的任何改變(例如降解、聚集、活化或抑制)?；蛘?或與評(píng)估H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代及所衍生的生物材料的標(biāo)準(zhǔn)組合)，步驟(c)可以涉及對(duì)如何這些一個(gè)或多個(gè)外源性成分被內(nèi)化和/或修飾或者不通過H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代及所衍生的生物材料的分析。這些分析標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)中描述的外源性成分的類型而改變，例如降解、與其他蛋白結(jié)合、在細(xì)胞培養(yǎng)物中的持續(xù)性、聚集、感染性(對(duì)于病毒)或者分化或活力(對(duì)于細(xì)胞)。涉及細(xì)胞及所衍生產(chǎn)物(即細(xì)胞培養(yǎng)物、條件培養(yǎng)基)體外測(cè)定的文獻(xiàn)能夠?yàn)榧?xì)胞、組合物及所衍生的生物材料(即H2干細(xì)胞產(chǎn)物)形式中的H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代能夠如步驟(a)-(c)所示在體外使用提供了指導(dǎo)，例如關(guān)于濃度、時(shí)序、培養(yǎng)和測(cè)定條件以及分析技術(shù)。還可以進(jìn)行類似的測(cè)定，即在步驟(a)中將H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代引入動(dòng)物中，然后在步驟(b)中向所述動(dòng)物施用一種或多種外源性成分，以便在步驟(c)中在這些動(dòng)物中確定是否和如何所述一種多種組分修飾H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代(或相關(guān)生物材料)和/或其被H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代所修飾。特別地，可以將H2干細(xì)胞產(chǎn)物以及H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代用于體內(nèi)(即針對(duì)此類細(xì)胞的治療用途)和體外(例如針對(duì)藥理-毒理學(xué)用途)的方法，所述方法涉及在如上文所述的試劑盒中的如上文所述的化學(xué)物質(zhì)或生物制品。特別地，除了所述細(xì)胞(或所衍生的生物材料)以外，所述試劑盒還可以包含當(dāng)將其暴露于一系列化合物(結(jié)果來(lái)自于待檢測(cè)化合物結(jié)構(gòu)、代謝產(chǎn)物和/或濃度的至少一個(gè)改變)，以及將有助于比較和評(píng)估在涉及使用H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的測(cè)定中觀察到的作用的對(duì)照化合物、溶液和/或其他細(xì)胞時(shí)，能夠使用和/或檢測(cè)其及其活性的成分。在臨床前評(píng)估期間對(duì)作為藥物候選物的化學(xué)實(shí)體的表征要求進(jìn)行藥物代謝評(píng)估(除此之外還有效能、安全性或藥代動(dòng)力學(xué))以鑒定相關(guān)的代謝通路以及潛在的藥物間相互作用(使用依賴于細(xì)胞色素P450的誘導(dǎo)和抑制)。當(dāng)決定將先導(dǎo)化合物推向臨床階段的研發(fā)時(shí)，這個(gè)新鮮對(duì)于藥廠而言是必不可少的。創(chuàng)新、可靠和具有預(yù)測(cè)性的基于細(xì)胞的體外測(cè)定是早期臨床前研發(fā)所急需的，因?yàn)槿杂休^大比例的藥物候選物由于不充分的毒理學(xué)評(píng)估(特別是針對(duì)肝毒性的)在臨床研發(fā)期間失敗。截至今日，此類基于細(xì)胞的模型基于人原代肝細(xì)胞或者嚙齒動(dòng)物或人肝癌來(lái)源的細(xì)胞系(如HepaRG或HepG2細(xì)胞)。尚無(wú)可用的模型完全滿足常規(guī)的藥理學(xué)和毒理學(xué)檢測(cè)。由于定性和定量的原因人源肝細(xì)胞的使用是受到限制的，因?yàn)槠浍@取受到限制并且在建立可靠的來(lái)源和培養(yǎng)中其肝功能的長(zhǎng)期保持存在技術(shù)困難?；蛘撸趪X動(dòng)物來(lái)源細(xì)胞的基于肝細(xì)胞的模型無(wú)法最佳地代表人的肝臟代謝。然后，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)，這些細(xì)胞可能迅速分化(逐漸喪失其關(guān)鍵特征如藥物代謝酶)和具有較短的壽命(不能在體外擴(kuò)增)。人肝癌來(lái)源的的細(xì)胞系易于在體外擴(kuò)增，但是其缺乏可能在確定代謝和毒性中是重要的完全分化的表型。因此，使用可利用的基于人肝細(xì)胞的模型不能進(jìn)行可靠的高通量亞慢性和慢性毒性評(píng)估。另一方面，由于可利用的人肝細(xì)胞受限且其不能擴(kuò)增，因而急性和亞急性毒性篩選受到了較大阻礙。因此，H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代(特別是當(dāng)形成三維細(xì)胞簇時(shí))能夠提供更好的體外模型，其具有變異性有限的，連續(xù)的和易于獲得的細(xì)胞且肝細(xì)胞樣酶的類型隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化和在批與批之間穩(wěn)定，特別是在“ADMET”(給藥、分布、代謝、消除和毒理學(xué))或細(xì)胞毒性(即針對(duì)肝細(xì)胞活力和/或功能性效能)檢測(cè)中作為原代肝細(xì)胞的替代細(xì)胞。H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代(特別是當(dāng)形成三維細(xì)胞簇時(shí))能夠用于檢測(cè)治療肝細(xì)胞感染或允許(特別是感染肝臟和肝細(xì)胞的)病毒有效復(fù)制的試劑的方法中。H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代可以在暴露于所述病毒(例如肝炎病毒)之前或之后分化和/或基因修飾。然后，可以將感染的細(xì)胞群暴露于預(yù)先確定用量的用于治療所述感染的候選化合物，以觀察任何有用的作用(例如病毒復(fù)制)，用于純化病毒顆粒或用于評(píng)估病毒感染的任何潛在體內(nèi)作用，如圖所示為與丙型肝炎感染、肝纖維化或癌癥相關(guān)的其他肝臟祖細(xì)胞(WuX等，2012；WangC等，2012；TorresDM和HarrisonSA,2012)。本申請(qǐng)中所有參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)均特別地通過引用并入。現(xiàn)在將通過下述實(shí)施方式解釋本發(fā)明，其并非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1：來(lái)自原代肝臟組織的H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的制備和表征材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基和其他材料使用了下述材料：威廉姆斯E培養(yǎng)基(目錄號(hào)22551022,Invitrogen)、具有較高葡萄糖濃度()和L-谷氨酰胺的DMEM(高糖DMEM，目錄號(hào)41965047,Invitrogen)、IMDM(目錄號(hào)21980032,Invitrogen)、無(wú)酚紅IMDM(目錄號(hào)21056023,Invitrogen)、肝細(xì)胞培養(yǎng)基(HCM；目錄號(hào)CC-3198,Lonza)、胎牛血清(FBS；目錄號(hào)F7524,Sigma)、重組人表皮生長(zhǎng)因子(EGF；目錄號(hào)AF-100-15,Peprotech)、重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF；目錄號(hào)100-39,Peprotech)、重組人抑瘤素M(OSM；目錄號(hào)300-10,Peprotech)、重組人胰島素(INS；目錄號(hào)HI0219,Lilly)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-G補(bǔ)充劑(ITS；目錄號(hào)41400045,Invitrogen)、人白蛋白(50g/L，目錄號(hào)1501466Baxter)、肝素鈉(Heparin)、地塞米松(Dex；目錄號(hào)D4902,Sigma)、液態(tài)青霉素/鏈霉素(P/S；目錄號(hào)15070063,Invitrogen)、包被了大鼠尾I型膠原的T-75培養(yǎng)瓶(Biocoat，目錄號(hào)356485,BDBiosciences)、帶通風(fēng)口帽的75cm2矩形豎直安裝的頸細(xì)胞培養(yǎng)瓶(目錄號(hào)3290,Corning)。原代人肝細(xì)胞的制備用于獲得人肝細(xì)胞的程序基于此前已發(fā)表的文章(NajimiM等，2007)，進(jìn)行了較小改動(dòng)。取出后，首先使用冰冷的ViaSpan溶液(Bristol-MyersSquibbPharmaceuticals)通過與門靜脈系統(tǒng)連接的套管沖洗肝臟，然后在冷的和無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至用于進(jìn)行肝細(xì)胞分離的潔凈室。在分離過程之前、期間和之后，要嚴(yán)格控制所有的微生物污染。在潔凈室中的無(wú)菌層流條件下，使用兩步膠原酶灌注技術(shù)分離人肝細(xì)胞。第一灌注液由37℃下預(yù)熱的不含鈣和鎂的EBSS溶液組成(目錄號(hào)14155-063,LifeTech)，其中補(bǔ)充了0.5mM乙二醇-二(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA；Sigma)、2mg/L慶大霉素、100000UI/L青霉素G。這種第一灌注液能夠消除細(xì)胞外鈣離子和弱化實(shí)質(zhì)的細(xì)胞間連接。第二步包括使用在含鈣和鎂的EBSS溶液(目錄號(hào)24010-043,LifeTech.)中稀釋的0.8mg/mL膠原酶(目錄號(hào)11213857001,RocheAppliedSciences)進(jìn)行酶消化，含鈣和鎂的EBSS溶液中補(bǔ)充了5mM4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES；目錄號(hào)11344-041,LifeTech.)、0.03mg/mL胰酶抑制劑(目錄號(hào)10109878001,RocheAppliedSciences)、2mg/L慶大霉素和100000UI/L青霉素G。通過使用附加的或替代性的GMP級(jí)試劑(例如特定的酶或N-乙酰半胱氨酸)，這些緩沖劑的組分能夠適于良好的生產(chǎn)過程的實(shí)際需求。在將肝臟完全消化之前的每個(gè)灌注步驟花費(fèi)約10分鐘，然后將其機(jī)械破碎。通過使用冷的M199溶液(Lonza)洗滌已消化的實(shí)質(zhì)終止殘余的膠原酶活性，所述M199溶液含有27.5μg/mL胰酶抑制劑、0.05％人白蛋白、2.4mg/L慶大霉素、100000UI/L青霉素G。將已消化的肝細(xì)胞懸液過濾通過4.75至0.25mm孔的不銹鋼篩，然后使用M199溶液洗滌3次并在4℃下低速(例如1200rpm)離心3分鐘以除去細(xì)胞碎片和大部分非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于凍存培養(yǎng)基中，所述凍存培養(yǎng)基通過加入750mlViaSpan溶液、16mg地塞米松、40UI胰島素、0.5％HEPES、1g/L葡萄糖，15％、人白蛋白20％、10％DMSO制備，然后使用適宜的管、袋或用于長(zhǎng)期保存和保護(hù)人細(xì)胞的其他系統(tǒng)將其保持在液氮中。也是在這一階段，通過使用附加的或替代性的GMP級(jí)試劑，這些緩沖劑的組分能夠適于良好的生產(chǎn)過程的實(shí)際需求。所得到的肝細(xì)胞制備物主要由來(lái)自實(shí)質(zhì)部分的肝細(xì)胞構(gòu)成，其均含有106-109個(gè)細(xì)胞(取決于來(lái)自的制備物和/或特定人肝臟的體積)。通過在37℃下將其迅速解凍使用凍存的肝細(xì)胞懸液，然后在10x體積的人白蛋白5％洗滌兩次，其中補(bǔ)充了2.5g/L葡萄糖、0.084g/L碳酸氫鈉和5000IE/UI/ml肝素在4℃下224g離心10分鐘后，將細(xì)胞球團(tuán)在所需的細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸。ADHLSC細(xì)胞的制備采用如此前所述的方法(NajimiM等，2007；KhuuDN等，2011)獲得ADHLSC細(xì)胞，進(jìn)行或不進(jìn)行小改動(dòng)。簡(jiǎn)言之，將肝細(xì)胞制備物重懸于威廉姆斯E培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)充了10％FBS、25ng/mlEGF(如果在CellBind上進(jìn)行制備，則在細(xì)胞培養(yǎng)基中可以不存在EGF)、10μg/mlINS、1μMDEX和1％P/S。在包被了大鼠尾I型膠原的培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞并且在37℃下在含有5％CO2的充分濕潤(rùn)的環(huán)境下培養(yǎng)。24小時(shí)后，更換培養(yǎng)基以清除非貼壁細(xì)胞并且隨后一周更換兩次，每天在顯微鏡下觀察培養(yǎng)物一次。在12-16天后將培養(yǎng)基更換為補(bǔ)充了9％FBS和0.9％P/S的高糖DMEM以加速肝細(xì)胞的清除和刺激ADHLSC細(xì)胞擴(kuò)增。具有間充質(zhì)樣形態(tài)的細(xì)胞類型出現(xiàn)并增殖。當(dāng)達(dá)到70-95％融合時(shí)，使用重組胰酶(trypLE；LifeTech)和1mMEDTA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化并以1-10x103個(gè)細(xì)胞/cm2的密度重新接種。H2干細(xì)胞的制備使用凍存的肝細(xì)胞懸液在包被了大鼠尾I型膠原的T-75培養(yǎng)瓶中以5000–20000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度并在37℃下在含5％CO2的充分濕潤(rùn)的環(huán)境下制備細(xì)胞培養(yǎng)物?；蛘?，在培養(yǎng)箱中使用缺氧條件(如5％O2)或者其通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入抗氧劑(如1mM或更低濃度的N-乙酰半胱氨酸)產(chǎn)生。每周進(jìn)行兩次培養(yǎng)基更換和形態(tài)分析，在出現(xiàn)期間使用補(bǔ)充了9％FBS、0.9％P/S、1μMDex、10μg/mlINS和12,5-25ng/mlEGF的威廉姆斯E培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基。一旦H2干細(xì)胞作為在細(xì)胞培養(yǎng)物中主要的貼壁細(xì)胞簇出現(xiàn)，在不存在或存在(12.5-50ng/ml)HGF的條件下在補(bǔ)充了9％FBS、0.9％P/S、1μMDex、10μg/mlINS和12,5-25ng/mlEGF的威廉姆斯E培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。在隨后的7-12天內(nèi)，具有立方形間皮-上皮形態(tài)的H2干細(xì)胞開始成為小簇并開始擴(kuò)增。然后在接下來(lái)的2-3天內(nèi)將由此類細(xì)胞形成的簇胰酶消化(即在原代肝細(xì)胞接種后10-15天內(nèi))，然后以5000-8000個(gè)細(xì)胞/cm2在威廉姆斯E基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其在相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)若干代。胰酶消化可以從在膠原包被的板上80-90％融合的第1代上進(jìn)行。作為貼壁的肝細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞分化在相同的擴(kuò)增培養(yǎng)基中，以5000–20000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度在BDBioCoatCellware，I型膠原6-孔包被板上(目錄號(hào)356400,BDBiosciences)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。在95-100％融合時(shí)通過將培養(yǎng)基改變?yōu)楹?0ng/mlHGF、20ng/mlOSM、1μMDex、1％ITS，同時(shí)含有(針對(duì)ADHLSC細(xì)胞)或不含(針對(duì)H2干細(xì)胞)25ng/mlEGF的IMDM開始肝分化。至少在接下來(lái)的2(針對(duì)H2干細(xì)胞)或4(針對(duì)ADHLSC細(xì)胞)周將用于肝分化的這種細(xì)胞培養(yǎng)基(HepDif培養(yǎng)基)每周更換兩次。在細(xì)胞培養(yǎng)條件中的細(xì)胞形態(tài)表征利用使用奧林巴斯照相機(jī)IX50和Cellsens數(shù)字成像軟件的光學(xué)顯微鏡(相差；奧林巴斯UC30顯微鏡)或者使用活體成像設(shè)備Cell-IQ(CMtechnologies)獲取圖像，其中光學(xué)顯微鏡以固定的時(shí)間間隔獲取相同位置的再聚焦圖像。Cell-IQPC(相差)是一個(gè)完全集成的連續(xù)活細(xì)胞成像和分析平臺(tái)，其納入了相差和亮場(chǎng)成像能力，帶有對(duì)程序數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)鑒定、分析和定量的板載分析儀軟件包(MachineVisionTechnology)。使用RT-qPCR對(duì)細(xì)胞群表達(dá)基因的表征使用GenElute哺乳動(dòng)物試劑盒(目錄號(hào)RTN70,Sigma)從細(xì)胞中提取總RNA，隨后使用DNA-freeTM試劑盒(目錄號(hào)AM1906,Ambion)進(jìn)行DNAse處理。根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書，使用轉(zhuǎn)錄因子第一鏈cDNA合成試劑盒(目錄號(hào)04379012001,Roche)合成第一鏈cDNA，隨后使用無(wú)核酸酶的水(目錄號(hào)AM9938,Invitrogen)將cDNA稀釋為10ng/μl。RT-PCR擴(kuò)增混合物(20μl)含有0.2μg模板cDNA、10μl2xTaqmanMasterMix(目錄號(hào)4369514,AppliedBiosystem)和1μl20xPrimeTimeqPCR測(cè)定(IDT)。將樣品在AppliedBiosystemsViiATM7實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上或來(lái)自AppliedBiosystems的任意其他實(shí)時(shí)PCR循環(huán)儀上進(jìn)行雙復(fù)管檢測(cè)。循環(huán)條件如下：在95℃下進(jìn)行10分鐘聚合酶活化，95℃下持續(xù)15秒和60℃下持續(xù)45秒共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。來(lái)自AppliedBiosystems的基因轉(zhuǎn)錄特異性引物對(duì)序列匯總于下表1。通過針對(duì)內(nèi)源性對(duì)照轉(zhuǎn)錄本GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)或PPIA(親環(huán)素A)將信號(hào)強(qiáng)度歸一化確立基因表達(dá)的相對(duì)量。歸一化后，將數(shù)據(jù)作圖并在細(xì)胞群之間比較。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表征收集細(xì)胞，以500-1000/μl的濃度混懸于PBS緩沖液(目錄號(hào)SH30028.03,ThermoFisher)中，并且在4℃下使用下述熒光染料標(biāo)記的特異性針對(duì)所示抗原的抗體孵育30分鐘，其以生產(chǎn)廠商所示的濃度使用：CD45-PECy7(目錄號(hào)：557748,BDBiosciences)、CD90-FITC(目錄號(hào)：555595,BDBiosciences)、CD73-PE(目錄號(hào)：550257,BDBiosciences)、CD29-APC(目錄號(hào)：559883,BDBiosciences)、CD44-FITC(目錄號(hào)：555478,BDBiosciences)、CD133-PE(目錄號(hào)：130080901,MiltenyiBiotec)、白蛋白-FITC(目錄號(hào)：CLFAG2140,Sanbio)、單克隆小鼠抗人細(xì)胞角蛋白19(CK-19)(克隆RCK108；M0888,Dako)、抗小鼠IgG–DyLight488(目錄號(hào)：715-485-150,JacksonImmunoresearch)、CD117-APC(目錄號(hào)：333233,BDBiosciences)、CD31-FITC(目錄號(hào)：555445,BDBiosciences)、CD31-PE(目錄號(hào)：340297,BDBiosciences)、CD326(目錄號(hào)：347200,BDBiosciences)。使用相應(yīng)的對(duì)照同種型抗體評(píng)估單克隆抗體的非特異性結(jié)合。然后洗滌細(xì)胞并重懸在PBS/BSA中以使用BDBiosciencesFACSCantoII流式細(xì)胞儀讀數(shù)。通過免疫熒光或免疫細(xì)胞化學(xué)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表征使用4％的多聚甲醛(目錄號(hào)：43368,AlfaAesar)在室溫下固定細(xì)胞10-15分鐘并使用PBS洗滌三次。當(dāng)需要時(shí)，使用3％的過氧化氫(目錄號(hào)：31642,Sigma)孵育10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶。接下來(lái)，使用在PBS緩沖液中的1％TritonX-100(目錄號(hào)：T8787,Sigma)透化細(xì)胞10-15分鐘。針對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)在含5％正常驢血清(目錄號(hào)：017-000-121,JacksonImmunoResearch)的PBS緩沖液中孵育1小時(shí)或針對(duì)免疫熒光在37℃下在含5％牛血清白蛋白(BSA)(目錄號(hào)：A2153,Sigma)的PBS的緩沖液中孵育1小時(shí)以阻止非特異性免疫。使用一抗的孵育在室溫下進(jìn)行1小時(shí)(或4℃下過夜)。然后將樣品在15分鐘內(nèi)洗滌三次并在室溫下使用二抗孵育30分鐘(針對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué))或1小時(shí)(針對(duì)免疫熒光)。針對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫熒光根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書使用下述抗體作為一抗：?jiǎn)慰寺⌒∈罂谷搜灏椎?目錄號(hào)：A6684,Sigma)、單克隆小鼠抗人波形蛋白(目錄號(hào)：10515,Progen)、單克隆小鼠抗人α平滑肌肌動(dòng)蛋白(ASMA，目錄號(hào)：M0851,Dako)、單克隆小鼠抗人細(xì)胞角蛋白19(CK-19)(克隆PCK108；M0888,Dako)、單克隆小鼠抗人TDO2抗體(目錄號(hào)：SAB1406519,Sigma)、單克隆小鼠抗人CK-18抗體(目錄號(hào)：SAB3300015,Sigma)、單克隆抗人UGT抗體(目錄號(hào)：ab129729,Abcam)、單克隆抗人MRP-2(目錄號(hào)：ab3373,Abcam)、抗人肝細(xì)胞核因子4(HNF-4；目錄號(hào)：sc-8987,SantaCruz)和多克隆小鼠抗人CYP3A4(目錄號(hào)：SAB1400064,Sigma)。根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書使用下述標(biāo)記的抗體作為用于免疫熒光的二抗：Alexa488-綴合的驢抗小鼠(目錄號(hào)：715-545-151,JacksonImmunoResearch)、Cy3-綴合的驢抗兔IgG(目錄號(hào)：711-165-152,JacksonImmunoResearch)。對(duì)于免疫細(xì)胞化學(xué)，使用EnvisionTM抗小鼠(Dakocytomation，目錄號(hào)：K4001,Dako)在室溫下作用30分鐘進(jìn)行檢測(cè)。在使用過氧化物酶標(biāo)記的聚合物和顯色底物(DAB，目錄號(hào)：D416,Dako)孵育5min，隨后使用PBS洗滌三次后進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)免疫熒光使用4,6-二咪基-2-苯基吲哚(+DAPI，目錄號(hào)：H-1200,ABCYS)和針對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)使用梅耶氏蘇木精(目錄號(hào)：MHS16,Sigma)對(duì)核進(jìn)行復(fù)染。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)，接下來(lái)使用偶聯(lián)照相機(jī)UC30的奧林巴斯倒置顯微鏡IX50在10、20和40x的放大倍數(shù)下進(jìn)行檢查。使用Cellsens軟件采集數(shù)字圖像。對(duì)人原代肝細(xì)胞(如上文所示獲得)進(jìn)行平行染色，作為肝臟標(biāo)記物的陽(yáng)性對(duì)照和間充質(zhì)標(biāo)記物的陰性對(duì)照。使用配有奧林巴斯照相機(jī)XC30和Cellsens軟件的熒光顯微鏡(奧林巴斯AX70)獲取圖像。通過細(xì)胞活性對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表征對(duì)于發(fā)光CYP3A4活性測(cè)定，對(duì)從ADHLSC細(xì)胞或H2干細(xì)胞獲得的分化的肝細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，以100000個(gè)細(xì)胞/孔的濃度轉(zhuǎn)移至96孔微量培養(yǎng)板(目錄號(hào)：734-1662,Costar)，并使用利用熒光素-IPA(目錄號(hào)：V9002,Promega)的P450-GloTMCYP3A4測(cè)定對(duì)活性進(jìn)行檢測(cè)。使用VictorIV發(fā)光儀(Perkin-ElmerLifeSciences)測(cè)定發(fā)光情況。對(duì)未經(jīng)處理的細(xì)胞進(jìn)行平行檢測(cè)以扣除背景噪音。將結(jié)果歸一化至CYP3A4微粒體標(biāo)準(zhǔn)品，其由人CYP3A4酶系(目錄號(hào)：V4820,Promega)提供并以皮摩/細(xì)胞計(jì)算。對(duì)于尿素分泌測(cè)定，將細(xì)胞胰酶消化并在膠原包被的48孔微量培養(yǎng)板(目錄號(hào)：356505,BDBiosciences)中在無(wú)酚紅的IMDM(目錄號(hào)：21056023,Invitrogen)中孵育。作為用于增強(qiáng)尿素分泌的底物，將1mM鳥氨酸(目錄號(hào)：O2375,Sigma)和5mMNH4Cl(目錄號(hào)：A0171,Sigma)加入培養(yǎng)基中。2-24小時(shí)后，使用比色Quantichrome尿素測(cè)定試劑盒(目錄號(hào)：DIUR-500,BioAssaySystems)檢測(cè)尿素分泌。在孵育5-20min后在520nm處讀取顏色強(qiáng)度(與樣品中的尿素濃度成正比)并且其與樣品中的尿素濃度成正比。根據(jù)生產(chǎn)廠商說(shuō)明書的推薦，在確立分泌的尿素量(以pg/細(xì)胞/2-24h計(jì))以前，使用在無(wú)酚紅的IMDM中制備的尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)基上清中的總尿素(mg/dl)。為評(píng)估在檢測(cè)實(shí)際信號(hào)中的任何干擾，在包含鳥氨酸/氯化銨和細(xì)胞對(duì)照(不使用鳥氨酸/氯化銨孵育)的培養(yǎng)基中進(jìn)行尿素分泌評(píng)估。將這些樣品作為陰性對(duì)照以確定特異性和防止假陽(yáng)性。對(duì)于膽紅素綴合測(cè)定，使用20-50μM非綴合的膽紅素(目錄號(hào)：B4126,Sigma)孵育細(xì)胞。2-24小時(shí)后，使用比色直接膽紅素測(cè)定(目錄號(hào)：DZ151A-K,Diazyme)和總膽紅素測(cè)定(目錄號(hào)：DZ150A-K,Diazyme)檢測(cè)膽紅素的綴合和總膽紅素。在這項(xiàng)檢測(cè)中，將(未)綴合的膽紅素與Diazyme的即用試劑混合，所述試劑含有去垢劑和釩酸鹽或僅含釩酸鹽(pH3)，隨后樣品中的總膽紅素或直接膽紅素分別被氧化為膽綠素。后者的氧化反應(yīng)導(dǎo)致特異性針對(duì)膽紅素的吸光度降低?？梢酝ㄟ^測(cè)定釩酸鹽氧化前后的吸光度確定樣品中的總/直接膽紅素濃度。接下來(lái)，利用根據(jù)生產(chǎn)廠商說(shuō)明書的推薦在無(wú)酚紅IMDM中制備的膽紅素校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)基上清中的直接/總膽紅素濃度(mg/dl//細(xì)胞/2-24h)。為評(píng)估任何干擾，在包含20-50μM膽紅素和細(xì)胞對(duì)照(不使用膽紅素孵育)的培養(yǎng)基中對(duì)膽紅素綴合進(jìn)行評(píng)估。將這些樣品作為陰性對(duì)照以確定特異性和防止假陽(yáng)性。結(jié)果ADHLSC細(xì)胞和H2干細(xì)胞是均能夠來(lái)源于凍存的使用正常成人肝臟生產(chǎn)的人原代肝細(xì)胞制備物的細(xì)胞群。然而，使其從原代人肝細(xì)胞制備物中出現(xiàn)的方案和隨后在細(xì)胞培養(yǎng)中的擴(kuò)增程序是不同的，特別是當(dāng)使用膠原(或其他適宜的基質(zhì))用于在細(xì)胞培養(yǎng)條件下貼壁和生長(zhǎng)時(shí)(更多細(xì)節(jié)請(qǐng)參見“材料和方法”部分)。在接種后7-12天內(nèi)，具有立方形間皮-上皮形態(tài)的細(xì)胞簇自發(fā)出現(xiàn)，存在無(wú)突起的較大且透明的胞質(zhì)，出現(xiàn)胞間連接并顯示出生長(zhǎng)的接觸抑制。具有立方形間皮-上皮形態(tài)的H2干細(xì)胞在簇或集落中增殖，并且在出現(xiàn)后約2-3天可以對(duì)其進(jìn)行胰酶消化并以5000-20000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度傳代。這些特征使H2干細(xì)胞區(qū)別于NajimiM等，2007描述的更大的、更晚出現(xiàn)的梭狀A(yù)DHLSC細(xì)胞(圖2A)。當(dāng)與在CellBind或膠原包被的支持物(例如培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶)上培養(yǎng)的ADHLSC細(xì)胞比較時(shí)，H2干細(xì)胞以更快的增殖速率生長(zhǎng)并且能夠優(yōu)先從細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增中被鑒定。ADHLSC細(xì)胞的群體倍增時(shí)間(PDT)為約72-96小時(shí)，而H2干細(xì)胞顯示出的PDT為48-72小時(shí)并且迅速擴(kuò)增至少4-5代。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)(其中將對(duì)標(biāo)記物為陽(yáng)性定義為當(dāng)至少60％的細(xì)胞存在給定的特征時(shí))、免疫細(xì)胞化學(xué)和/或RT-PCR分析的評(píng)估，與其他人肝臟祖細(xì)胞如ADHLSC細(xì)胞一致，H2干細(xì)胞對(duì)于一系列細(xì)胞表面(包括CD90、CD73、CD29、CD44)或細(xì)胞內(nèi)(如波形蛋白、ASMA)的間充質(zhì)標(biāo)記物以及對(duì)于肝臟標(biāo)記物(包括HNF-3B、白蛋白和細(xì)胞角蛋白18)是陽(yáng)性的。ADHLSC細(xì)胞和H2干細(xì)胞均表達(dá)極低水平的(即低于所檢測(cè)細(xì)胞的15％，和大部分低于10％，存在特異性染色)其他細(xì)胞譜系的(造血系統(tǒng)、上皮系統(tǒng)和/或內(nèi)皮系統(tǒng))細(xì)胞表面標(biāo)記物如CD45、CD117、CD31、CD133和CD326。然而，通過比較存在的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物，也能夠?qū)2干細(xì)胞與ADHLSC細(xì)胞相區(qū)分。例如，ADHLSC細(xì)胞和肝細(xì)胞中幾乎無(wú)法檢測(cè)到細(xì)胞骨架成分如細(xì)胞角蛋白19(CK-19；膽管上皮標(biāo)記物)(NajimiM等，2007)。在H2干細(xì)胞中(甚至在初始步驟當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)時(shí))，當(dāng)通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估時(shí)，發(fā)現(xiàn)20％至40％的H2干細(xì)胞表達(dá)CK-19，不能將該差異定義為陰性并且其在H2干細(xì)胞制備物中得到了一致性的再現(xiàn)。事實(shí)上，當(dāng)通過免疫細(xì)胞化學(xué)(檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白通常比流式細(xì)胞術(shù)更加靈敏的技術(shù))對(duì)CK-19的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估時(shí)，揭示了大多數(shù)的甚至是早期階段的H2干細(xì)胞表達(dá)CK-19(圖2B)，因此在細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)其的整個(gè)過程中提供了能夠用于區(qū)分和跟蹤H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代群的進(jìn)一步的標(biāo)記物。可以將CK-19的檢測(cè)與其他細(xì)胞內(nèi)蛋白如轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)相結(jié)合，特別是與肝功能直接(通過RT-PCT或基于抗體的方法)或間接(基于肝臟特異性基因的協(xié)同表達(dá))相關(guān)的那些。在這種方法中，已將H2干細(xì)胞鑒定為當(dāng)與ADHLSC細(xì)胞比較時(shí)其更強(qiáng)的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子如HNF-3b和HNF-4。在細(xì)胞內(nèi)水平，這些轉(zhuǎn)錄因子是用于獲得肝細(xì)胞的形態(tài)、表型和功能的成熟最重要的，例如通過活化肝血清蛋白(如白蛋白和α-1-抗胰蛋白酶)和用于(非)代謝功能的酶的表達(dá)(SnykersS等，2009)，能夠在細(xì)胞提取物中或直接在細(xì)胞培養(yǎng)物上清中檢測(cè)到其以評(píng)估H2干細(xì)胞的存在情況。在初始步驟用于獲得H2干細(xì)胞的過程中H2干細(xì)胞的出現(xiàn)也可以遵循鑒定哪種原代人肝細(xì)胞能夠作為具有不同形態(tài)的貼壁的、增殖性H2干細(xì)胞簇的起源并且可以通過免疫熒光或免疫組化對(duì)其進(jìn)行分析。在這些細(xì)胞群體外分化過程中或之后(特別是朝向貼壁的、肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化)，可以確立區(qū)分ADHLSC細(xì)胞和H2干細(xì)胞的進(jìn)一步的特征。當(dāng)將H2干細(xì)胞的分化過程與ADHLSC細(xì)胞的一種進(jìn)行比較時(shí)，后者的細(xì)胞需要更長(zhǎng)時(shí)間(1個(gè)月，對(duì)比H2干細(xì)胞為1至2周)，以及在細(xì)胞培養(yǎng)中需要EGF。而且，使用這兩種細(xì)胞類型產(chǎn)生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞的形態(tài)是不同的，其中由H2干細(xì)胞獲得的細(xì)胞(H2干細(xì)胞子代也稱為H2篩選細(xì)胞；見圖1)存在的特征與具有代謝活性的原代肝細(xì)胞的那些更加相似。H2篩選細(xì)胞獲得了具有含有指向增加的酶活性的細(xì)胞內(nèi)顆粒的單核和雙核細(xì)胞的立方形肝細(xì)胞形態(tài)(圖4A)?？梢酝ㄟ^測(cè)定化合物的降解將H2干細(xì)胞的肝臟特異性代謝活性與其他成人肝臟祖細(xì)胞(如ADHLSC細(xì)胞)的那些進(jìn)行比較，所述化合物在肝臟中累積并且如果其不能充分地被肝細(xì)胞代謝，可能具有肝毒性和與肝臟疾病相關(guān)。這項(xiàng)分析值得關(guān)注之處不僅在于能夠評(píng)估細(xì)胞用于臨床應(yīng)用的用途，而且還在于能夠用于評(píng)估其在制藥工業(yè)的藥物發(fā)現(xiàn)和研發(fā)中的用途，因?yàn)樗幬镎T導(dǎo)的肝毒性是在藥物研發(fā)的晚期階段削減候選藥物最重要的原因之一。通常在基于肝臟來(lái)源細(xì)胞的不同模型中測(cè)定暴露于不同的CYP450誘導(dǎo)劑對(duì)基因表達(dá)應(yīng)答和CYP450特異性酶促活性的影響以便在體內(nèi)施用此類化合物之前區(qū)分潛在的肝毒性和非肝毒性化合物，但是處于研究中的模型均無(wú)法滿足早期、可靠地和精確地對(duì)肝毒性化合物進(jìn)行檢測(cè)的所有標(biāo)準(zhǔn)(GeretsHH等，2012)。特別地，肝臟CYP3A4能夠代謝接近50％目前使用的藥物以及內(nèi)源性和外源性糖皮質(zhì)激素。CYP3A4酶在成人肝臟的肝細(xì)胞中具有較強(qiáng)表達(dá)并且將獲得CYP3A4的功能認(rèn)為是肝源性分化和突變的重要標(biāo)準(zhǔn)。免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR已經(jīng)顯示與ADHLSC細(xì)胞相比在H2干細(xì)胞中CYP3A4具有更高的表達(dá)(即在任何肝臟特異性分化之前已經(jīng)如此)，在活性水平也確證了這一發(fā)現(xiàn)。H2干細(xì)胞在10-8pMol/細(xì)胞/4h范圍內(nèi)顯示出這種特異性活性(已經(jīng)遠(yuǎn)高于檢測(cè)限10-9pMol/細(xì)胞)，但是在體外分化成H2篩選細(xì)胞后在10-7pMol/細(xì)胞/4h范圍內(nèi)增加，其中ADHLSC細(xì)胞僅在分化后存在高于10-8pMol/細(xì)胞/4h的活性(圖4B)?？梢允褂媚軌蚴褂檬惺墼噭┖谢蛲ㄟ^應(yīng)用文獻(xiàn)中描述的技術(shù)評(píng)估的其他代謝活性指示劑在H2干細(xì)胞和ADHLSC細(xì)胞之間對(duì)這種肝臟特異性代謝活性進(jìn)行比較(如針對(duì)CYP1A2-、CYP2C19-、CYP2C9-、CYP2E1-或CYP2D6特異性mRNA表達(dá)和/或酶活性)。特別地，在H2干細(xì)胞中觀察到CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1的表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)。當(dāng)將H2篩選細(xì)胞與分化的ADHLSC細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，確證了這些發(fā)現(xiàn)，并且其還擴(kuò)展至其他肝臟特異性酶活性基因的表達(dá)(如鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、CYP2D6或CYP2C19)。在尿素分泌的情況下(另一種主要的肝臟特異性代謝活性)，當(dāng)與分化的ADHLSC細(xì)胞比較時(shí)，H2篩選細(xì)胞顯示出在存在底物(氯化銨和鳥氨酸)的條件下能夠合成出具有基本上更高的代謝性質(zhì)的尿素。H2篩選細(xì)胞呈現(xiàn)出這種活性的改善對(duì)應(yīng)于1log以上并且顯示出在這些細(xì)胞中存在非常特異的和集成的肝臟功能性(圖4C)。免疫組化也確證了，當(dāng)與H2干細(xì)胞比較時(shí)，在H2篩選細(xì)胞中CK-19、CK-18和一些肝臟標(biāo)記物(如白蛋白、TDO2和UDP-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶)保持了較強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(如果沒有進(jìn)一步增加)，其還在細(xì)胞界面存在主要外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如MRP-2蛋白的表達(dá)，這是用于評(píng)估與轉(zhuǎn)運(yùn)多態(tài)性相關(guān)的藥物誘導(dǎo)毒性的重要特征(圖4D)。當(dāng)對(duì)分化的ADHLSC細(xì)胞與H2篩選細(xì)胞綴合膽紅素的能力進(jìn)行比較時(shí)，獲得了定性的類似證據(jù)，膽紅素是由UGT1A1基因表達(dá)導(dǎo)致的另一種肝臟特異性生物活性。H2篩選細(xì)胞顯示出高得多的活性，這可能是由于轉(zhuǎn)錄因子如HNF-3b和HNF-4具有更高的表達(dá)和/或增加的核定位。在暴露24小時(shí)后在分化的ADHLSC細(xì)胞中測(cè)得UGT1A1相關(guān)的膽紅素活性為0.05mg/dl-0.3mg/dl(預(yù)計(jì)值為0.5mg/dl)對(duì)應(yīng)于綴合5-35％(預(yù)計(jì)值為50％)。在暴露24小時(shí)后，在H2篩選細(xì)胞中測(cè)得的UGT1A1相關(guān)膽紅素活性為0.2mg/dl-0.6mg/dl或?yàn)榫Y合23-70％。而且，當(dāng)通過RT-PCR將UGT1A1的表達(dá)與人肝細(xì)胞比較時(shí)，其達(dá)到在原代肝細(xì)胞中觀察到的10％的水平，當(dāng)與通過在體外分化其他類型的肝臟祖細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞獲得細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，其具有特別高的水平。因此，當(dāng)與相同類型的其他細(xì)胞比較時(shí)(特別是通過更長(zhǎng)的、更復(fù)雜的方法生產(chǎn)的那些如ADHLSC細(xì)胞)，H2干細(xì)胞顯示出是一種新型的成人肝臟祖細(xì)胞，其針對(duì)不同特征(例如增殖、細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物或肝臟特異性酶活性)存在一些主要的、預(yù)料不到的益處，這使其在臨床應(yīng)用和藥理-毒理學(xué)研究方面受到關(guān)注。實(shí)施例2：作為三維細(xì)胞簇的不同類型H2干細(xì)胞子代的產(chǎn)生材料和方法從H2干細(xì)胞產(chǎn)生H3干細(xì)胞在超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)瓶中產(chǎn)生H3干細(xì)胞，在15ml培養(yǎng)基中將1-10x106個(gè)H2干細(xì)胞重懸，隨后將其接種于超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(75cm2；目錄號(hào)：3814；Corning)。在超低粘附96孔微量培養(yǎng)板中產(chǎn)生H3干細(xì)胞，在0.1-0.2ml培養(yǎng)基中將5000-20000個(gè)H2干細(xì)胞重懸并且將其接種于超低粘附、U型/圓底96孔微量培養(yǎng)板(目錄號(hào)：7007；Corning)的每個(gè)孔中?；蛘?，在2.0-3.0ml培養(yǎng)基中將75000-100000個(gè)H2干細(xì)胞重懸并且將其接種于超低粘附6孔培養(yǎng)板(目錄號(hào)：3471；Corning)的每個(gè)孔中。培養(yǎng)基優(yōu)選在存在或不存在(12.5-50ng/ml)HGF的添加了9％FBS、0.9％P/S、1μMDex、10μg/mlINS和12-25ng/mlEGF的威廉姆斯E培養(yǎng)基。能夠用于替代威廉姆斯E培養(yǎng)基的替代性市售細(xì)胞培養(yǎng)基是IMDM或DMEM，其添加了如上文威廉姆斯E培養(yǎng)基所示的。每周兩次分別向培養(yǎng)瓶和多孔培養(yǎng)板/微量培養(yǎng)板中加入或更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基。隨后通過相差顯微鏡觀察到形成了三維H2干細(xì)胞子代。在24小時(shí)后單個(gè)細(xì)胞開始形成這些簇并在隨后10-25天內(nèi)當(dāng)其直徑達(dá)到超過200μm時(shí)收集以測(cè)定CYP3A4活性、進(jìn)行免疫組化測(cè)定或用于產(chǎn)生H3篩選-2細(xì)胞(能夠獲得所具有的直徑達(dá)600μm的H3干細(xì)胞簇)。從H2篩選細(xì)胞產(chǎn)生H3篩選-1細(xì)胞將如實(shí)施例1中所述獲得的H2篩選細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化以獲得三維H2干細(xì)胞子代，通過將這種細(xì)胞懸液維持在用于將H2干細(xì)胞分化成H2篩選細(xì)胞的相同培養(yǎng)基中并在適宜的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中獲得。當(dāng)使用“懸滴”培養(yǎng)系統(tǒng)如96孔板GravityPlusPlate(Insphero)，通過在培養(yǎng)板的各孔中吸出20μl并加入20μl新鮮培養(yǎng)基每周將一半的培養(yǎng)基更換2-3次?；蛘?，將1-10x106個(gè)H2篩選細(xì)胞接種于超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，以相同頻率加入5ml新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基?；蛘撸褂萌缟衔乃龅某驼掣?、U型/圓底96孔微量培養(yǎng)板用于產(chǎn)生H3干細(xì)胞。對(duì)在這些細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中形成的H3篩選-1細(xì)胞的追蹤、獲得和評(píng)估與H3干細(xì)胞類似。從H3干細(xì)胞產(chǎn)生H3篩選-2細(xì)胞將根據(jù)如上文所述擴(kuò)增獲得的H3干細(xì)胞在224g離心5分鐘以除去擴(kuò)增培養(yǎng)基。然后在相同的超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)瓶中使用HepDif細(xì)胞培養(yǎng)基開始分化(見實(shí)施例1)，每周兩次加入5ml新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基。此外，使用如上文所述的超低粘附、U型/圓底96孔微量培養(yǎng)板，使用相同的細(xì)胞培養(yǎng)基用于分化。在隨后的10-20天內(nèi)在三維細(xì)胞簇中評(píng)估肝臟分化和CYP3A4活性。從H3篩選-2細(xì)胞產(chǎn)生H3篩選-2a細(xì)胞和H3篩選-2b細(xì)胞使用超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)瓶、U型/圓底96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板或“懸滴”培養(yǎng)系統(tǒng)和在HepDif培養(yǎng)基中將與H3篩選-2細(xì)胞對(duì)應(yīng)的H3篩選-2a細(xì)胞維持在懸液中(見實(shí)施例1)。將與H3篩選-2細(xì)胞對(duì)應(yīng)的H3篩選-2b細(xì)胞轉(zhuǎn)移至不同的多孔形式的BDBioCoatCellwareI型膠原包被的培養(yǎng)板中(6、24或48孔)。在這一條件下，在培養(yǎng)3-4天內(nèi)在HepDif培養(yǎng)基中觀察到多邊形和顆粒狀的肝細(xì)胞(見實(shí)施例1)。從H2干細(xì)胞產(chǎn)生H3篩選-2細(xì)胞可以從H2干細(xì)胞直接產(chǎn)生H3篩選細(xì)胞，不需要中間擴(kuò)增為H3干細(xì)胞的步驟。在這種情況下，將5000-20000個(gè)H2干細(xì)胞混懸于0.1-0.2mlHepDif培養(yǎng)基中(見實(shí)施例1)并接種于超低粘附96孔培養(yǎng)板上。或者，將75000-100000個(gè)H2干細(xì)胞混懸于2.0-3.0ml培養(yǎng)基中并接種于超低粘附6孔培養(yǎng)板的各孔中。與從H2干細(xì)胞產(chǎn)生H3干細(xì)胞相同進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞培養(yǎng)步驟，將所述細(xì)胞保持在HepDif培養(yǎng)基中并在與如H3干細(xì)胞簇所示類似的尺寸和相當(dāng)?shù)臅r(shí)間段觀察H3篩選-2細(xì)胞簇。從H3干細(xì)胞產(chǎn)生H3篩選-2c細(xì)胞將與H3干細(xì)胞對(duì)應(yīng)的H3篩選-2c細(xì)胞轉(zhuǎn)移至不同的多孔形式的BDBioCoatCellwareI型膠原包被的培養(yǎng)板中(6、24或48孔)并在HepDif培養(yǎng)基中培養(yǎng)(見實(shí)施例1)。三維H2干細(xì)胞子代的免疫細(xì)胞化學(xué)(IHC)、免疫熒光(IF)和形態(tài)表征利用使用奧林巴斯照相機(jī)IX50和Cellsens程序的光學(xué)顯微鏡(相差；奧林巴斯UC30顯微鏡)獲取三維細(xì)胞簇的尺寸和圖像。收集不同類型的三維H2干細(xì)胞子代，然后在4℃下在4％的多聚甲醛(目錄號(hào)：43368,AlfaAesar)中固定過夜，隨后在65℃下包埋于2％的瓊脂糖(目錄號(hào)16500,Invitrogen)中，然后包埋于石蠟中。將5μm厚的切片脫臘并咋一系列乙醇中逐級(jí)水化。在進(jìn)行免疫組化以前，將切片在檸檬酸一水合物溶液(pH6.0)中在97℃下孵育90分鐘。通過將切片在3％的過氧化氫甲醇溶液中孵育15分鐘阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。通過將切片在室溫下在含1％牛血清白蛋白(BSA，目錄號(hào)：A2153-50G,Sigma)的PBS緩沖液中孵育1小時(shí)阻止非特異性免疫染色。然后根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書將切片與在0.1％BSA中稀釋的下述一抗之一在4℃下孵育過夜：?jiǎn)慰寺〉男∈罂谷搜灏椎鞍?目錄號(hào)：A6684,Sigma；用于IHC)、單克隆的小鼠抗人CYP3A4(目錄號(hào)：SAB1400064,Sigma；用于IHC)、多克隆的兔抗人鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶(目錄號(hào)：HPA000570,Sigma；用于IHC)、多克隆的兔抗人UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1(目錄號(hào)：sc-27415,SantaCruz；用于IHC)、MRP-2(目錄號(hào)：ab3373,Abcam；用于IHC)、單克隆的小鼠抗人細(xì)胞角蛋白19(CK-19)(克隆RCK108；M0888,Dako；用于IHC)、單克隆的抗-CK19(目錄號(hào)：SAB3300018,SIGMA，用于IF)、單克隆的抗-CK18(目錄號(hào)：SAB3300015,SIGMA；用于IF)、單克隆的小鼠抗人波形蛋白(目錄號(hào)：10515,Progen；用于IHC)、單克隆的抗波形蛋白(目錄號(hào)：V6630,SIGMA；用于IF)、抗人肝細(xì)胞核因子4(HNF-4)(目錄號(hào)：sc-8987,SantaCruz；用于IHC)、單克隆的抗-HNF4(目錄號(hào)：SAB4501409,SIGMA；用于IF)、單克隆的抗-HNF3B(目錄號(hào)：SAB2500409,SIGMA；用于IF)。根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書將下述標(biāo)記的抗體作為用于免疫熒光(IF)的二抗：Alexa488-綴合的驢抗小鼠IgG(目錄號(hào)：715-545-151,JacksonImmunoResearch)、Cy3-綴合的驢抗兔IgG(目錄號(hào)：711-165-152,JacksonImmunoResearch)。對(duì)于免疫組化而言，使用基于辣根過氧化物酶(HRP)的染色用于檢測(cè)一抗：預(yù)計(jì)使用抗小鼠(目錄號(hào)：K4001,Dakocytomatio)、抗兔(目錄號(hào)：K4003,Dakocytomation)或抗山羊的IgG-HRP(目錄號(hào)：sc-2020,SantaCruz)和SIGMAFASTTM3,3′-二氨基聯(lián)苯胺片(目錄號(hào)：D4168,Sigma)作為顯色底物。針對(duì)免疫熒光和免疫組化分別使用4,6-二咪基-2-苯基吲哚(+DAPI，目錄號(hào)：H-1200,ABCYS)和梅耶氏蘇木精(目錄號(hào)：MHS16,Sigma)對(duì)核進(jìn)行復(fù)染。使用與照相機(jī)UC30偶聯(lián)的奧林巴斯倒置顯微鏡IX50進(jìn)行分析。使用Cellsens軟件采集數(shù)字圖像。利用Western印跡分析對(duì)三維的H2干細(xì)胞子代進(jìn)行表征將細(xì)胞(濃度為每毫升5x106個(gè)細(xì)胞)在緩沖液中裂解，所述緩沖液含有10mMHEPESpH7.4、80mMKCl、2mMEDTA、15mMβ-巰基乙醇、0,1％TritonX-100和1％PIC(蛋白酶抑制劑混合物)。將蛋白提取物在4℃攪拌條件下孵育30分鐘，然后使用PotterDounce(10A.R.)在冰上勻漿。然后將細(xì)胞裂解物在4000g下離心10分鐘以便將細(xì)胞碎片成團(tuán)。接下來(lái)根據(jù)經(jīng)典的Bradford法使用市售試劑盒(Bio-Rad)確定所得到的上清液中的蛋白濃度。利用使用SDS-PAGE的電泳分離蛋白提取物，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Amersham,UK)。然后在室溫下的含有脫脂奶粉(5％(W/v)；Merck)的TBS-t緩沖液(Tris緩沖的生理鹽水-吐溫：Tris/HCl50mM、NaCl150mM、200,1％)中將所述膜孵育2小時(shí)。根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書，然后在4℃下在相同的但是含有一抗的TBS-t/奶粉5％中在攪拌條件下將膜孵育過夜。在使用TBS-t緩沖液在15分鐘內(nèi)洗滌3次后，使用在TBS-t/5％奶粉緩沖液中的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下將所述膜孵育2小時(shí)。在使用TBS-t緩沖液在15分鐘內(nèi)洗滌三次，通過化學(xué)發(fā)光(試劑盒ECL，AmershamPharmaciaBiotech.)顯示了蛋白信號(hào)。根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書將下述抗體作為一抗：多克隆的兔抗人CYP3A4(目錄號(hào)：AB1254,Chemicon)、多克隆的抗兔抗UGT1A1(目錄號(hào)：4371,CellSignalingTechnology)和抗SULT1(目錄號(hào)：sc-32928,SantaCruz)。使用RT-qPCR對(duì)三維H2干細(xì)胞子代表達(dá)的基因進(jìn)行鑒定從6孔培養(yǎng)板的一個(gè)孔中(或從96孔微量培養(yǎng)板的1-10個(gè)孔中)將三維H2干細(xì)胞子代收集至1.5ml的試管中并使用1mlPBS洗滌，待在重力作用下細(xì)胞簇降至管底部，隨后除去PBS。使用350μlRLT緩沖液裂解細(xì)胞簇，另外將管渦旋30秒并使用帶有無(wú)RNase活塞(目錄號(hào)：W5290W,FisherScientific)的電動(dòng)系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)活塞(目錄號(hào)：W14044,FisherScientific)通過機(jī)械作用破壞球狀體。使用Plus微量試劑盒(目錄號(hào)：74134QIAGEN)從細(xì)胞中提取總RNA，隨后使用DNA-freeTM試劑盒(目錄號(hào)：AM1906,Ambion)處理DNAse。使用轉(zhuǎn)錄因子第一鏈cDNA合成試劑盒(目錄號(hào)：04379012001,Roche)根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書合成第一鏈cDNA，并且隨后使用無(wú)核酸酶水(目錄號(hào)：AM9938,Invitrogen)將cDNA稀釋為10ng/μl。RT-PCR擴(kuò)增混合物(20μl)含有0.2μg模板cDNA、10μl2xTaqmanMasterMix(目錄號(hào)：4369514,AppliedBiosystem和1μl20xPrimeTimeqPCR測(cè)定(IDT)。在AppliedBiosystemsViiATM7實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)或AppliedBiosystems的任意其他實(shí)時(shí)PCR循環(huán)儀上以雙復(fù)管的形式測(cè)定樣品。循環(huán)條件如下：95℃下聚合酶活化10min，95℃保持15sec和60℃保持45sec進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。從AppliedBiosystems獲得的基因轉(zhuǎn)錄特異性引物對(duì)如實(shí)施例1所述。通過生物活性對(duì)三維H2干細(xì)胞子代進(jìn)行表征可以使用與針對(duì)貼壁細(xì)胞類似的程序(見實(shí)施例1)的發(fā)光測(cè)定對(duì)三維H2干細(xì)胞子代的CYP3A4活性進(jìn)行檢測(cè)。使用PBS緩沖液洗滌至多5個(gè)三維細(xì)胞簇(每個(gè)含有約20000個(gè)細(xì)胞)以除去殘余培養(yǎng)基，然后將其轉(zhuǎn)移至BDBioCoatTM膠原的48孔培養(yǎng)板(目錄號(hào)：356505,BDBiosciences)中。使用200μL含0.2μL熒光素-IPA(目錄號(hào)：V9002,Promega)的IMDM(目錄號(hào)：21980032,Invitrogen)孵育4小時(shí)后，將細(xì)胞懸液(100μl培養(yǎng)基)轉(zhuǎn)移至96孔板(目錄號(hào)：734-1662,Costar)中并且如實(shí)施例1所述進(jìn)行分析。將未與三維細(xì)胞簇孵育的細(xì)胞培養(yǎng)基作為背景噪音的對(duì)照。使用分別含有約100000個(gè)細(xì)胞的三維細(xì)胞簇(相當(dāng)于H3干細(xì)胞或H3篩選-2a細(xì)胞的5個(gè)球)進(jìn)行用于檢測(cè)肝臟特異性代謝活性的尿素分泌和膽紅素綴合測(cè)定，將其與如上文實(shí)施例1中所述的適宜試劑孵育。使用對(duì)乙酰氨基酚作為反應(yīng)底物聯(lián)合UGT1A(即包括UGT1A1和其他UGT1A亞型)對(duì)SULT的活性進(jìn)行檢測(cè)。如(LauG和CrichleyJ,1994)所述利用HPLC對(duì)對(duì)乙酰氨基酚的葡糖醛酸化和硫酸綴合的產(chǎn)物進(jìn)行定量。簡(jiǎn)言之，使用5mM對(duì)乙酰氨基酚(目錄號(hào)：A7302,Sigma)孵育細(xì)胞24小時(shí)。孵育后，將培養(yǎng)基上清離心、過濾并利用UV-HPLC在254nm分析。加入2-乙酰氨基酚作為內(nèi)標(biāo)。用于定量的特異性標(biāo)準(zhǔn)品是對(duì)乙酰氨基酚-硫酸鹽(目錄號(hào)：UC448,Sigma)和P-乙酰胺基苯基-β-D-葡糖甘酸(目錄號(hào)：A4438,Sigma)。使用Nova-PakC18Radial-Pak柱，4μm,8.0mmX100mm(Waters)作為固定相。固相由0.1MKH2PO4、0.1％乙酸&0.75％丙-2-醇，pH3.8組成(1.5ml/min)。結(jié)果以每分鐘和每mg蛋白產(chǎn)生的pmol葡糖醛酸基或磺基代謝產(chǎn)物表示。根據(jù)經(jīng)典的Bradford法使用Bio-Rad試劑盒評(píng)估蛋白濃度。在將細(xì)胞與底物混合物(10mM非那西丁、100mM安非他酮的、10mM雙氯芬酸和3mM咪達(dá)唑侖)孵育后通過LC/MS/MS確定CYP依賴性酶促活性。為評(píng)估轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能性，在37℃下(或者對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)為4℃)將細(xì)胞在含有10μM[14C]轉(zhuǎn)運(yùn)體標(biāo)記底物的500μLHBSS中孵育(0.5μCi/mL)。使用下述底物：?；悄懰?TC)、雌酮-3-硫酸鹽(E3S)和1-甲基-4-苯基吡啶(MPP)。在孵育結(jié)束時(shí)，除去上清液并使用冷的PBS洗滌單層3次。然后，將300μLNaOH0.1N加入至各孔中以裂解細(xì)胞。取一份(100μL)與2mLUltimaGold閃爍液混合用于使用TriCarb計(jì)數(shù)器評(píng)估細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記底物的濃度。使用利福平(10μM)(CYP3A4、CYP2C9、CYP2B6)和β-萘黃酮(25μM)(CYP1A2)共同處理3天以驗(yàn)證誘導(dǎo)性I相CYP依賴性活性。使用從H2干細(xì)胞、H3干細(xì)胞、ADHLSC的細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得的蛋白使用ELISA試劑盒(目錄號(hào)：ab109717,Abcam)測(cè)定羧酸酯酶-1(CES-1)的酶促活性，使用原代人干細(xì)胞和HepG2作為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書使用該方案。根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書使用ELISA試劑盒(目錄號(hào)：ab108799,Abcam)對(duì)從H2干細(xì)胞和ADHLSC細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中分泌的α-抗胰蛋白酶進(jìn)行定量。結(jié)果作為將H2干細(xì)胞和H2篩選細(xì)胞與未分化的和分化的ADHLSC細(xì)胞(或其他人肝臟祖細(xì)胞)相區(qū)分的進(jìn)一步的特征，實(shí)施例1中所述的這些新的細(xì)胞群提供了不同類型三維細(xì)胞簇(即三維H2干細(xì)胞子代)的懸液，其包含肝臟祖細(xì)胞或肝細(xì)胞樣細(xì)胞，其取決于細(xì)胞培養(yǎng)條件。當(dāng)將H2干細(xì)胞或H2篩選細(xì)胞保持在懸滴培養(yǎng)系統(tǒng)或低粘附培養(yǎng)板中時(shí)，在最初的2-4天內(nèi)迅速形成直接為50-100μm的三維細(xì)胞簇，在15-25天后尺寸達(dá)到超過300μm并且甚至達(dá)到600μm(圖5和6)。在細(xì)胞之間存在一些支持性基質(zhì)的這些細(xì)胞簇可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中維持至少1至2個(gè)月。而相反的是，ADHLSC細(xì)胞(在相同條件下培養(yǎng)的非分化的或分化的)，提供最多20μm-尺寸的，基本上是二維的聚集物，其不存在在形成三維細(xì)胞簇的H2干細(xì)胞子代中所觀察到的較強(qiáng)的肝臟特異性代謝活性。包含非分化的(H3干細(xì)胞)或分化的(H3篩選細(xì)胞)細(xì)胞的三維H2干細(xì)胞子代能夠在懸滴培養(yǎng)系統(tǒng)、超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或具有U型/圓底孔的微量培養(yǎng)板上產(chǎn)生。開發(fā)這些容器用于在懸液中培養(yǎng)胚狀體或其他球形細(xì)胞。暴露于細(xì)胞培養(yǎng)基的表面被共價(jià)鍵合的水凝膠層覆蓋，其是親水性的、電中性的和抑制細(xì)胞固化的(SalehF.等，2012)。根據(jù)進(jìn)一步的用途，可以分別使用或檢測(cè)相同孔中的單一孔、培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶的內(nèi)容物(或者微量培養(yǎng)板中孔的內(nèi)容物的混合物以獲得5、10或更多個(gè)三維H2干細(xì)胞子代的球)或者各球樣簇，或者對(duì)于給定的三維H2干細(xì)胞子代能夠平行地以其他標(biāo)準(zhǔn)(如酶促活性或基因/蛋白表達(dá))高通量地評(píng)估化合物或細(xì)胞培養(yǎng)條件的作用。H3干細(xì)胞是主要由肝臟祖細(xì)胞構(gòu)成的三維H2干細(xì)胞子代并且其可以由培養(yǎng)H2干細(xì)胞獲得。三維H2干細(xì)胞子代在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中孵育后(如在H3篩選-1細(xì)胞和H3篩選-2細(xì)胞的情況下)含有肝臟活性細(xì)胞。特別地，H3篩選細(xì)胞可以作為粘附的(在H3篩選-2b細(xì)胞和H3篩選-2c細(xì)胞的情況下)或混懸的(在H3篩選-2a細(xì)胞和H3篩選-1細(xì)胞的情況下)三維H2干細(xì)胞子代維持，其取決于細(xì)胞培養(yǎng)條件，即如果將用于產(chǎn)生這些不同類型三維H2干細(xì)胞子代的條件以特定順序或同時(shí)應(yīng)用。在形態(tài)和表型水平，三維H2干細(xì)胞子代類似于由支持性基質(zhì)支架和內(nèi)部的肝細(xì)胞團(tuán)組成的微型肝臟支架(圖5)。使用U型/圓底96孔微量培養(yǎng)板得到更加標(biāo)準(zhǔn)化的三維H2干細(xì)胞子代，其具有更加均一的尺寸和在各孔中更加可控地產(chǎn)生細(xì)胞簇。事實(shí)上，轉(zhuǎn)移至此類細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的H2干細(xì)胞子代迅速聚集成單一的球樣細(xì)胞簇，其可以含有超過100000個(gè)細(xì)胞(圖5D和6)。三維H2干細(xì)胞子代仍表達(dá)在H2干細(xì)胞中鑒定的標(biāo)記物如間充質(zhì)標(biāo)記物如波形蛋白和肝臟標(biāo)記物如白蛋白。而且，當(dāng)與不僅是ADHLSC細(xì)胞而且是H2干細(xì)胞和H2篩選細(xì)胞比較時(shí)，三維H2干細(xì)胞子代通常存在更高表達(dá)水平的直接(如CYP3A4、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2E1、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶和UGT1A1)或間接地(轉(zhuǎn)錄因子如HNF-3b和HNF-4)主要肝臟特異性代謝活性。這些觀察結(jié)果表面三維H2干細(xì)胞子代不僅能夠更好地重現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的三維組織而且還能夠重現(xiàn)體內(nèi)存在的干細(xì)胞的功能。當(dāng)通過免疫組化分析時(shí)，H3篩選-1細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的白蛋白、CYP3A4、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC；尿素循環(huán)的酶)和UDP-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1；用于膽紅素綴合的酶)，以及較強(qiáng)的CK-19和CK-18表達(dá)。在酶促活性水平，在包含肝細(xì)胞樣細(xì)胞的三維H2干細(xì)胞子代中測(cè)得的CYP3A4活性在原代肝細(xì)胞和H2干細(xì)胞和H2篩選細(xì)胞之間具有可比性。當(dāng)對(duì)絕對(duì)值進(jìn)行比較時(shí)(圖7A)，H2干細(xì)胞已顯示出顯著升高的CYP3A4活性，當(dāng)與分化前后的ADHLSC細(xì)胞比較時(shí)(見實(shí)施例1和圖4)，H3干細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到和在H3篩選細(xì)胞中進(jìn)一步增加，如H3篩選-2a細(xì)胞。當(dāng)根據(jù)細(xì)胞數(shù)定義時(shí)，這些值表明H3篩選-2a細(xì)胞的CYP3A4活性在10-2-10-3pmol/細(xì)胞簇范圍內(nèi)，對(duì)應(yīng)于10-5-10-6pmol/細(xì)胞的范圍(其取決于細(xì)胞總數(shù)和密度)，因而當(dāng)與H2篩選細(xì)胞比較時(shí)獲得了至少進(jìn)一步一個(gè)對(duì)數(shù)的改善。此類值遠(yuǎn)高于在分化的ADHLSC細(xì)胞中測(cè)定的CYP3A4活性水平，并且達(dá)到了在原代干細(xì)胞中測(cè)定的水平。可以對(duì)不同類型H3篩選細(xì)胞的肝臟特異性代謝活性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，其與針對(duì)H2干細(xì)胞和H2篩選細(xì)胞的實(shí)施例1中的描述類似，如尿素分泌(見圖4)?；蛘?，可以使用市售試劑盒或應(yīng)用在文獻(xiàn)中描述的用于確定相關(guān)標(biāo)記物和/或酶促活性(例如結(jié)合化合物的CYP1A2-、CYP2C19-、CYP2C9-或CYP2D6-特異性代謝)。而且，在使用利福平和β-萘黃酮誘導(dǎo)后當(dāng)與H2干細(xì)胞或H2篩選細(xì)胞比較時(shí)(用于評(píng)估可檢測(cè)的藥物間相互作用的檢測(cè))，在H3篩選細(xì)胞(和特別地H3篩選-2a和-2b細(xì)胞)中檢測(cè)到了顯著更高的酶促活性，結(jié)果針對(duì)CYP1A2的活性為36.22x倍的誘導(dǎo)、針對(duì)CYP2B6的活性為93.71x倍的誘導(dǎo)、針對(duì)CYP2C9的活性為2.13x倍的誘導(dǎo)和針對(duì)CYP3A4的活性為31.23x倍的誘導(dǎo)。H3干細(xì)胞和H3篩選細(xì)胞也顯示出大量的UGT1A和SULT蛋白的表達(dá)和活性(圖7B和C)，在這種情況下也達(dá)到了在原代肝細(xì)胞中測(cè)定的水平，即10％至可達(dá)幾乎100％。這種廣泛的葡糖醛酸化能力不僅在開放毒理學(xué)篩選模型中是非常重要的，而且揭示了這些新型細(xì)胞針對(duì)例如克里格勒-納賈爾綜合征臨床應(yīng)用的潛能。而且，在存在底物(氯化銨和鳥氨酸)的條件下，H3篩選細(xì)胞能夠合成尿素，隨著時(shí)間的推移尿素產(chǎn)生大量增加或累積，這確證了其廣泛的代謝能力。通過測(cè)定牛磺膽酸鹽、雌酮-3-硫酸酯或MPP的攝取對(duì)攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(OATP，如OATP1B1及OATP1B3)和有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)(OCTS(OCT1和2)的功能。在15-60分鐘內(nèi)H3干細(xì)胞和H3篩選-2a細(xì)胞均顯示出對(duì)此類化合物的攝取增加(圖7D)。而且，H3干細(xì)胞和H2干細(xì)胞均存在肝臟特異性活性如CES1(肝臟羧化酶)，其不僅優(yōu)于ADHLSC細(xì)胞或常用的細(xì)胞系如HepG2，而且還接近在體外對(duì)原代人肝細(xì)胞的檢測(cè)水平(圖8A)。類似地，認(rèn)為H2干細(xì)胞對(duì)α-1-抗胰蛋白酶的分泌優(yōu)于針對(duì)ADHLSC細(xì)胞所觀察到的結(jié)果(圖8B)，其為能夠進(jìn)一步在H3干細(xì)胞和H3篩選細(xì)胞中評(píng)估的進(jìn)一步的特征。這些證據(jù)確證了在H3干細(xì)胞和H3篩選細(xì)胞中特異性化合物所存在的活性攝取和代謝能夠探索性地用于測(cè)試候選藥物。因此，H2干細(xì)胞能夠用于提供H2干細(xì)胞子代，其能夠作為包含肝臟祖細(xì)胞或肝活性細(xì)胞的三維細(xì)胞簇(三維H2干細(xì)胞子代)維持，有效地在細(xì)胞培養(yǎng)條件生長(zhǎng)，并且用于提供代謝活性和/或增殖細(xì)胞。可以將代謝和增殖相關(guān)性質(zhì)與其他性質(zhì)(如存在/不存在細(xì)胞類型或活性特異性表面標(biāo)記物、直徑、基質(zhì)結(jié)構(gòu)類型或其他生物活性)組合用于確定如上文所定義的哪種類型的三維H2干細(xì)胞子代(或能夠在功能上或形態(tài)上確定的進(jìn)一步的亞類)針對(duì)給定用途具有更適宜的功能、形態(tài)或抗原性質(zhì)。例如，當(dāng)所述三維H2干細(xì)胞子代旨在用于體內(nèi)施用(例如通過門靜脈注射或肝內(nèi)/肝外植入，伴有或不伴有任何使用胰酶的初步治療，在或不在裝置或生物相容性基質(zhì)中)時(shí)，特定的直徑范圍(對(duì)應(yīng)于平均細(xì)胞數(shù)和蛋白/DNA量)、結(jié)合或不結(jié)合體外分化的過程(見圖1和6)、使用表達(dá)重組蛋白的載體轉(zhuǎn)化和/或特異性抗原性質(zhì)可能是優(yōu)選的?；蛘?，在來(lái)自H2篩選細(xì)胞(H3篩選-1細(xì)胞)或H3干細(xì)胞(H3篩選-2a細(xì)胞或H3篩選-2b細(xì)胞)的懸液中產(chǎn)生的更大的三維H2干細(xì)胞子代可能更適于體外應(yīng)用，所述體外應(yīng)用涉及暴露于肝靶向病毒、使用用于表達(dá)重組蛋白的載體轉(zhuǎn)化和/或暴露于一系列化合物。這些實(shí)驗(yàn)可以提供此類模型如何容許病毒或人蛋白有效表達(dá)，或者評(píng)估治療性作用、代謝、穩(wěn)定性和/或化合物對(duì)肝臟代謝的毒性的相關(guān)信息，特別是用于藥理學(xué)或毒理學(xué)的臨床前篩選和測(cè)試。實(shí)施例3：表征H2干細(xì)胞的分子特征材料和方法ADHLSC細(xì)胞和H2干細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析如此前的描述(VanheelA等，2012_ENREF_35_ENREF_29)加之一些較小調(diào)整使用EttanTMDIGE系統(tǒng)(2D-DIGE；GEHealthcareLifeSciences)在二維(2D)凝膠中進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。簡(jiǎn)言之，通過在95％融合的培養(yǎng)物中收集細(xì)胞、計(jì)數(shù)和4℃下300g離心5分鐘制備細(xì)胞球團(tuán)。使用10ml(每5x106個(gè)細(xì)胞)冰冷的洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞，所述緩沖液使用45ml磷酸鹽緩沖液(PBS)、5mlEDTA溶液(50mM；目錄號(hào)：17-1324-01,GEHealthcare)和1片蛋白酶抑制劑混合物(cOmplete；目錄號(hào)：11873580001,RocheAppliedSciences)制備。勻化后，以5x106個(gè)細(xì)胞每1ml冰冷的洗滌緩沖液，將細(xì)胞洗滌和離心兩次。最后，除去上清并將細(xì)胞球團(tuán)在液氮中速凍和在-80℃下保存。在確定細(xì)胞提取物的蛋白濃度后，如生產(chǎn)廠商所述使用N-羥基琥珀酰亞胺酯染料Cy2、Cy3和Cy5(GEHealthcareLifeSciences)進(jìn)行最小標(biāo)記。在EttanDIGE成像儀(GEHealthcareLifeSciences)上對(duì)CyDye-標(biāo)記的2D-DIGE凝膠進(jìn)行掃描。將來(lái)自全部三種CyDyes的凝膠圖像載入DeCyder7.0軟件(GEHealthcareLifeSciences)并進(jìn)行分析。主要成分分析(PCA)使用Studentt檢驗(yàn)和方差分析(ANOVA)計(jì)算組內(nèi)豐度差異和組間變化程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？紤]將在70％的凝膠圖像中存在的并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的ANOVA(p≤0.05)的點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分析。使用DeCyder過站數(shù)據(jù)分析(EDA)模塊(GEHealthcare)進(jìn)行主要成分分析(PCA)。將各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度歸一化至這一內(nèi)標(biāo)，在可能的凝膠之間進(jìn)行比較。使用DeCyder軟件(GEHealthcare)進(jìn)行這一過程?；诘鞍椎募?xì)胞檢測(cè)在選定的潛在表面生物標(biāo)記物上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)或Western印跡分析，所述潛在的表面生物標(biāo)記物通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定得到。使用FACSCANTO流式細(xì)胞儀和FACSDiva軟件(BDbiosciences)。在分析前，使用一抗PE小鼠抗人CD140b(BDPharmingen；目錄號(hào)：558821)和PE抗人SUSD2(W5C5和W3D5抗原，目錄號(hào)：327406和327506,BioLegend)固定后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育。使用7AAD(目錄號(hào)：BDbiosciences)測(cè)定活力。對(duì)于Western印跡分析，根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書使用市售的抗β肌動(dòng)蛋白抗體作為對(duì)照。在流式細(xì)胞術(shù)中使用的其他抗體包括CD49b-PE(BDBiosciences，克隆12F1；目錄號(hào)：555669)，CD51-PE(Biolegend，克隆NKI-M9，目錄號(hào)：327909)和CD271-PE(Miltenyi，克隆ME20.4-1.H4；目錄號(hào)：130-098-111)，根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書使用。對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)，使用適宜對(duì)照同種型3％陽(yáng)性對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行歸一化。結(jié)果實(shí)施例1和2顯示的是關(guān)于第一個(gè)分子的或者酶的特性的系列的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。這個(gè)特性是允許使用可以商業(yè)化購(gòu)買得到的產(chǎn)品(抗體、PCR引物和/或試劑盒)來(lái)區(qū)分H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代。但是，一種更加定性和定量的表征H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的方法是通過綜合運(yùn)用不同的技術(shù)來(lái)廣泛的分析這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組、脂質(zhì)組、代謝組和/或蛋白質(zhì)組等。然后，通過比較這些數(shù)據(jù)，或者是與從不同的細(xì)胞群(比如，用不同的方法制備的H2干細(xì)胞、H2干細(xì)胞子代、原代人肝細(xì)胞或者ADHLSC細(xì)胞)獲得的相似數(shù)據(jù)相比較，來(lái)確定這些也許有助于區(qū)分這些不同的細(xì)胞群的生物標(biāo)記，從而建立起一種更加精確的關(guān)于H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代的生物學(xué)性質(zhì)。作為第一種方法，通過提取這些細(xì)胞的處于增殖分化過程中的培養(yǎng)基的全部蛋白質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行二維凝膠分析，以確定這些蛋白在表達(dá)、轉(zhuǎn)化和/或蛋白質(zhì)修飾方面的變化，從而比較ADHLSC細(xì)胞和H2干細(xì)胞的蛋白質(zhì)組。不同點(diǎn)的差異是通過差異表達(dá)分析找出來(lái)的，然后通過單因素方差分析進(jìn)行定量，以進(jìn)行主要成分分析(PCA)，其是一種對(duì)實(shí)驗(yàn)組之間的變異性進(jìn)行分析的無(wú)監(jiān)督多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。使用所有的ANOVA0.05相關(guān)點(diǎn)進(jìn)行PCA分析，其導(dǎo)致兩個(gè)不同的點(diǎn)簇，這將提示不同的兩個(gè)細(xì)胞群制備物之間不同的生物標(biāo)記物性質(zhì)(此外還有功能性質(zhì))(圖9)。對(duì)這些差異點(diǎn)的更深入分析可以通過以下方式來(lái)進(jìn)行：用質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)序來(lái)實(shí)際的確定那些相關(guān)的蛋白，然后用其他技術(shù)和市售產(chǎn)品(例如，通過使用在Western印跡或流式細(xì)胞術(shù)中的抗體，針對(duì)RT-PCR的引物)來(lái)證實(shí)這些證據(jù)?；蛘撸陉嚵械募夹g(shù)和其他能夠提供大量的基因特異性檢測(cè)劑(即引物、標(biāo)記的抗體或凝集素)的方法可以允許比較不同樣品中的特定蛋白質(zhì)的數(shù)量(用活性、定位或其他標(biāo)準(zhǔn)來(lái)分組)，從而將那些在不同的細(xì)胞群和/或細(xì)胞的培養(yǎng)條件下值得更詳細(xì)的分析的蛋白的數(shù)量限制在一定的范圍之內(nèi)。當(dāng)將來(lái)自免疫學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和/或糖組學(xué)分析的數(shù)據(jù)進(jìn)行組合時(shí)，在H2干細(xì)胞或H2干細(xì)胞子代上進(jìn)一步的信息能夠提示這些細(xì)胞的特征，其可能是用于進(jìn)一步驗(yàn)證的潛在關(guān)注點(diǎn)(包括醫(yī)藥用途、旁分泌作用以及同其他細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)或其他生物效應(yīng)物之間的相互作用)。此類方法可以涉及與其他細(xì)胞群(例如作為貼壁細(xì)胞或三維細(xì)胞簇維持的原代人肝細(xì)胞、H2干細(xì)胞或不同的H2干細(xì)胞子代的不同制備物)以及來(lái)源于此類細(xì)胞群的生物材料(如條件培養(yǎng)基或特異性細(xì)胞或蛋白成分)的比較。采用不同技術(shù)能夠獲得在來(lái)自H2干細(xì)胞和不同類型H2干細(xì)胞子代的此類生物材料中特定蛋白過表達(dá)或表達(dá)不足的初步數(shù)據(jù)并且不僅將其與ADHLSC細(xì)胞而且還與成人肝臟祖細(xì)胞群或者甚至是原代人肝細(xì)胞比較。在不同細(xì)胞群中特定蛋白過表達(dá)或表達(dá)不足的這些證據(jù)能夠用于在其生產(chǎn)過程的初始步驟和在隨后的傳代中通過使用適當(dāng)?shù)慕?jīng)驗(yàn)證的生物標(biāo)記物在通常情況下需要建立定性和/或定量的成人肝臟祖細(xì)胞群的(特別是H2干細(xì)胞(一種或多種類型的H2干細(xì)胞子代))不同的體內(nèi)和/或體外應(yīng)用(如在上文的詳細(xì)說(shuō)明中所定義的)。用于確定此類生物標(biāo)記物的優(yōu)選方法是能夠被驗(yàn)證的且不會(huì)受到由于低通量或需要檢測(cè)和破壞大量細(xì)胞造成的限制。因此，可以將進(jìn)一步的研究集中在能夠?qū)?xì)胞培養(yǎng)基上清和/或通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估的生物標(biāo)記物。在這一范圍內(nèi)，可以使用二維(2D)凝膠電泳技術(shù)初步評(píng)估H2干細(xì)胞和ADLHSC細(xì)胞中的大量蛋白。在細(xì)胞表面上和/或在細(xì)胞培養(yǎng)基上清中分泌的蛋白此前使用不同的熒光探針針對(duì)兩個(gè)細(xì)胞群染色，或使用生物素和親和層析分離特異性富含的蛋白制備物(例如，通過使用Pierce細(xì)胞表面蛋白分離試劑盒)。平行地，還針對(duì)各細(xì)胞群制備總蛋白提取物和其他內(nèi)部對(duì)照/標(biāo)準(zhǔn)品。然后將樣品應(yīng)用于用于利用2D凝膠電泳分離蛋白的凝膠中。然后使用生物信息學(xué)和成像技術(shù)比較凝膠中細(xì)胞表面和/或分泌蛋白的豐度和所關(guān)注的點(diǎn)(對(duì)于其在細(xì)胞群之間檢測(cè)到豐度具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)，然后將其從凝膠中挑出并在鑒定范圍內(nèi)使用胰酶消化，利用質(zhì)譜鑒定此類點(diǎn)中的蛋白。在使用此類方法已鑒定為在H2干細(xì)胞和ADHLSC細(xì)胞之間差異性表達(dá)的蛋白中，當(dāng)與ADHLSC細(xì)胞比較時(shí)已發(fā)現(xiàn)含有Sushi結(jié)構(gòu)域的蛋白2(SUSD2)和纖維蛋白原β鏈(FGB)或其他凝血相關(guān)分泌蛋白在H2干細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，并因此可能成為H2干細(xì)胞和H2干細(xì)胞子代感興趣的生物標(biāo)記物(單獨(dú)或組合)。即使SUSD2的生物功能到目前為止沒有被完全建立，文獻(xiàn)對(duì)具有較大細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的這種細(xì)胞表面蛋白提供了一些相關(guān)信息。這種蛋白已在多種比較基因和/或蛋白表達(dá)的研究中被鑒定，例如已發(fā)現(xiàn)部分肝臟切除后其立即過表達(dá)(WhiteP等，2005)。SUSD2和相關(guān)的小鼠蛋白(SVS-1)似乎在體外或動(dòng)物模型中通過改變其與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用影響癌細(xì)胞的活性，至少當(dāng)使用天然的(如纖連蛋白或半乳糖凝集素-1)或合成的(如基質(zhì)膠)分子檢測(cè)時(shí)(SugaharaT等，2007；WatsonA等，2013)。最后，將SUSD2鑒定為含有細(xì)胞表面抗原(W5C5，W3D5)，其被定義為從人骨髓細(xì)胞、子宮內(nèi)膜、軟骨和其他組織中鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞(SivasubramaniyanK等，2013；BenzK等，2013；MasudaH等，2012；PilzG等，2011；BühringHJ等，2007)。使用針對(duì)人SUSD2的市售抗體(純化的抗人SUSD2；目錄號(hào)：327401,Biolegend)在Western印跡(圖10A)和使用共聚焦顯微鏡的免疫熒光中確證了最初使用2D凝膠電泳發(fā)現(xiàn)的在H2干細(xì)胞中具有非常強(qiáng)的SUSD2表達(dá)。SUSD2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域還可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中作為可溶性蛋白存在并且可以與分泌蛋白(如FGB、CES1或α-1-抗胰蛋白酶及其相關(guān)活性)一起鑒定，可以將所述分泌蛋白作為在其出現(xiàn)和產(chǎn)生過程中鑒定H2干細(xì)胞和特定H2干細(xì)胞子代或者鑒定提示特異性體外和/或體內(nèi)用途特征的分泌性生物標(biāo)記物。有趣的是，已鑒定出了一些在ADHLSC細(xì)胞中比在H2干細(xì)胞中具有更高表達(dá)其他表面蛋白，這提示了在其出現(xiàn)和產(chǎn)生期間用于鑒定H2干細(xì)胞和特定H2干細(xì)胞子代的替代方法。例如，CD140b是經(jīng)常使用的表征間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物，其具有能夠通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的與SUSD2相反的表達(dá)性質(zhì)。事實(shí)上，此類方法可以是補(bǔ)充性的并且與Western印跡分析組合以顯示在大多數(shù)H2干細(xì)胞中具有怎樣較強(qiáng)的SUSD2表達(dá)，和在ADHLSC細(xì)胞中SUSD2以低得多的百分率降低較多的表達(dá)(圖10B和C)。生物標(biāo)記物陽(yáng)性/陰性以及與功能性特征的這種組合能夠進(jìn)一步將H2干細(xì)胞與ADHLSC細(xì)胞以及此前描述的間充質(zhì)干細(xì)胞(BenzK等，2013)相區(qū)分，其不存在肝臟標(biāo)記物或肝臟特異性活性。此外，可以使用強(qiáng)陽(yáng)性抗-CD140b抗體在其生產(chǎn)過程中和/或其使用前評(píng)估ADHLSC細(xì)胞的質(zhì)量、純度和/或?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定。結(jié)合文獻(xiàn)(NajimiM等，2007)中列出的其他標(biāo)準(zhǔn)和(如果有的話)在提供初始原代肝細(xì)胞制備物的人類對(duì)象上的臨床信息，對(duì)CD140b的檢測(cè)可以進(jìn)一步優(yōu)化ADHLSC細(xì)胞的制備以及選擇最適宜的治療用途和/或施用該細(xì)胞的人類對(duì)象。已通過使用附加的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)針對(duì)表面標(biāo)記物和酶促活性的初始分析進(jìn)行了擴(kuò)展，不僅將這些技術(shù)應(yīng)用于H2干細(xì)胞和ADHLSC細(xì)胞，還將其應(yīng)用于從不同供體獲得原代人肝細(xì)胞的不同制備物，并且其用于產(chǎn)生H2干細(xì)胞(如上文所述)、ADHLSC細(xì)胞(如文獻(xiàn)中所述)和以更大規(guī)模生產(chǎn)的用于對(duì)肝臟遺傳代謝疾病(如克里格勒-納賈爾綜合征和尿素循環(huán)代謝障礙)進(jìn)行臨床研究的ADHLSC細(xì)胞。這些后面的細(xì)胞(稱為HHALPC)需要特定的生產(chǎn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(如符合GMP條件)、改善的生長(zhǎng)速率和群體倍增水平以及在凍存和臨床使用前符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(即細(xì)胞必須保持存活和未分化、存在給定陽(yáng)性/陰性標(biāo)記物的組合，同時(shí)保持向具有功能的肝細(xì)胞分化的能力)。這種需要優(yōu)化一些細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)的放大過程最初在多盤堆疊(例如CorningCellStack)中完成并且然后轉(zhuǎn)移至多重生物反應(yīng)器(例如PALLXpansion10)，已確證能夠以工業(yè)級(jí)提供具有均一的質(zhì)量和數(shù)量的肝臟祖細(xì)胞如ADHLSC細(xì)胞和隨后的H2干細(xì)胞(EgloffM等，2013)。然而，從將HHALPC或H2干細(xì)胞用于其他臨床適應(yīng)癥中和進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝的角度來(lái)看，可以通過鑒定其他能夠表征細(xì)胞質(zhì)量和優(yōu)化此工藝的每個(gè)步驟(即原代肝細(xì)胞的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)條件、制劑、儲(chǔ)存和/或患者的選擇)的標(biāo)記物(細(xì)胞表面蛋白、分泌蛋白或相關(guān)的酶促活性)來(lái)改善初始要求的標(biāo)準(zhǔn)。上文列出和測(cè)試了此類附加標(biāo)記物中的一些，但是依據(jù)這組數(shù)據(jù)，對(duì)HHALPC、H2干細(xì)胞和人原代肝細(xì)胞樣品基于附加蛋白質(zhì)組學(xué)/轉(zhuǎn)錄組學(xué)的比較表明可以使用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA或其他市售試劑盒在單一標(biāo)記物分析或多次平行分析的水平上對(duì)相關(guān)標(biāo)記物進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試(例如通過使用在eBDLyoplateTM試劑盒中包含的針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體)。通過使用上述已鑒定的標(biāo)記物作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)(以及在表征肝細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞的文獻(xiàn)中已知的其他標(biāo)準(zhǔn)，參見YuJ等，2012；SantamariaE等，2012；SlanyA等，2010；Sison-YoungR等，2015)，鑒定了一系列候選物，用于在細(xì)胞鑒定/定量和生物活性/醫(yī)藥用途水平上對(duì)HHALPC和/或H2干細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，這些候選物可能有助于開發(fā)新的生產(chǎn)/制劑工藝，以及在特定適應(yīng)癥和/或患者群體中使用HHALPC和/或H2干細(xì)胞。此類候選物的第一個(gè)實(shí)例是CD49b(也稱為整合素α-2、ITGA2或膠原受體)和CD51(也稱為整合素α-V、ITGAV或玻連蛋白受體亞基α)，其在使用HHALPC和H2干細(xì)胞產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集中顯示出強(qiáng)表達(dá)。通過流式細(xì)胞術(shù)在具有不同來(lái)源或生產(chǎn)特性的HHALPC和H2干細(xì)胞制備物中確證了其陽(yáng)性，在來(lái)源于初始針對(duì)此類標(biāo)記物為陰性的相同人原代干細(xì)胞初始制備物的HHALPC和H2干細(xì)胞中也確證了其陽(yáng)性(圖11A)。這種方法也證實(shí)了在使用HHALPC和H2干細(xì)胞產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集中指示弱表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)記物(CD271，也稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員16，TNFRSF16，低親和性神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體)，盡管已知在一些文章中其存在于肝臟來(lái)源的細(xì)胞類型上(圖11B)。因此可以將這些標(biāo)記物包括在上文列出的標(biāo)準(zhǔn)中，作為鑒定HHALPC和H2干細(xì)胞的附加的陽(yáng)性(針對(duì)CD49b和CD51)或陰性(針對(duì)CD271)標(biāo)記物。這些結(jié)果表明使用HHALPC和H2干細(xì)胞產(chǎn)生的陽(yáng)性/陰性標(biāo)記物的組學(xué)數(shù)據(jù)可以用于在此類細(xì)胞群中作為附加的候選標(biāo)記物(用于這兩種細(xì)胞類型或用于對(duì)其進(jìn)行區(qū)分)或附加的酶促活性定義具有相似表達(dá)性質(zhì)的其他蛋白，后者在體內(nèi)和/或體外用途方面也特別令人感興趣。附加候選標(biāo)記物的第一個(gè)分類包括在HHALPC和H2干細(xì)胞兩者中均具有相似強(qiáng)表達(dá)性質(zhì)的細(xì)胞表面蛋白(針對(duì)CD29、CD44、CD49b、CD51、CD73或CD90)，將通過流式細(xì)胞術(shù)或其他免疫學(xué)測(cè)定對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證(見下表2)。附加候選標(biāo)記物的第二個(gè)分類包括在HHALPC和H2干細(xì)胞兩者中均具有相似低表達(dá)性質(zhì)的細(xì)胞表面標(biāo)記物(針對(duì)CD45、CD117、CD31、CD34、CD133、CD271和CD326)，將通過流式細(xì)胞術(shù)或其他免疫學(xué)測(cè)定對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證(見下表3)。附加候選標(biāo)記物的第三個(gè)分類包括當(dāng)與HHALPC比較時(shí)在H2干細(xì)胞中具有相似較高表達(dá)性質(zhì)的細(xì)胞表面標(biāo)記物(或分泌蛋白)(針對(duì)SUSD2或AAT)，將通過流式細(xì)胞術(shù)或其他免疫學(xué)(或功能性)測(cè)定對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證(見下表4)。附加候選標(biāo)記物的第四個(gè)分類包括當(dāng)與H2干細(xì)胞比較時(shí)在HHALPC中具有相似較高表達(dá)性質(zhì)的細(xì)胞表面標(biāo)記物(或分泌蛋白)(針對(duì)CD140b)，將通過流式細(xì)胞術(shù)或其他免疫學(xué)(或功能性)測(cè)定對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證(見下表5)。唯一蛋白編碼基因名稱蛋白名稱(相關(guān)生物學(xué)特性)P03956MMP1間質(zhì)膠原酶，成纖維細(xì)胞膠原酶，基質(zhì)金屬蛋白酶-1(分泌的)Q9UKX5ITGA11整合素α-11Q06828FMOD纖維調(diào)節(jié)蛋白，F(xiàn)M，膠原結(jié)合59kDa蛋白(分泌的)Q9NZV8KCND2鉀電壓門控通道亞家族D成員2，電壓門控鉀通道亞基Kv4.2P51671CCL11Eoataxin，小的可誘導(dǎo)細(xì)胞因子A11(分泌的)Q9BXN1ASPN無(wú)孢蛋白(分泌的)O95069KCNK2鉀通道亞家族K成員2，TREK-1Q96RW7HMCN1半細(xì)胞素-1，纖維蛋白-6(分泌的)附加候選標(biāo)記物的第五個(gè)分類包括與肝細(xì)胞生物活性相關(guān)并且在H2干細(xì)胞和HHALPC中具有相似較高表達(dá)性質(zhì)的酶，將通過使用相關(guān)底物和酶促測(cè)定對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證(見下表6)。附加標(biāo)記物的第六個(gè)分類包括與肝細(xì)胞生物活性相關(guān)并且與HHALPC相比在H2干細(xì)胞中具有較高表達(dá)性質(zhì)的酶(針對(duì)CES1)，將使用相關(guān)底物和酶促測(cè)定對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證(見下表6)。.唯一蛋白編碼基因名稱蛋白名稱(相關(guān)生物學(xué)特性)P01011SERPINA3α-1-抗糜蛋白酶P36955SERPINF1色素上皮細(xì)胞衍生因子(與成骨不全癥6相關(guān))Q16719KYNU犬尿氨酸酶(與羥基犬尿氨酸尿癥相關(guān))P32754HPD4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶(與酪氨酸血癥3相關(guān))P08263GSTA1谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A1P37059HSD17B2雌二醇17-β-脫氫酶2因此，上表中顯示的結(jié)果為附加地鑒定哪些標(biāo)記物和生物活性能夠與HHALPC和/或H2干細(xì)胞的制備相關(guān)，然后改進(jìn)其在生產(chǎn)過程中的質(zhì)量以及其有效藥用的體外或體內(nèi)用途提供指導(dǎo)。實(shí)施例4：在小鼠模型中注射的H2干細(xì)胞的表征材料&方法免疫組化分析在一系列梯度乙醇中將5μm厚的肝臟切片脫蠟和再水化。通過在3％過氧化氫甲醇溶液中孵育30min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。通過將切片在98℃下的檸檬酸一水合物溶液(pH6.0)中孵育35分鐘進(jìn)行抗原修復(fù)。根據(jù)所使用的試劑盒，在室溫下孵育1小時(shí)阻止非特異性免疫染色。根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明，使用下述針對(duì)人抗原的一抗孵育切片：抗-CK19(Dako，目錄號(hào)：M0888；稀釋1/100)、抗-CYP3A4(Enzo，目錄號(hào)：BML-CR3340-0025；稀釋1/750)、抗-α1-抗胰蛋白酶(Abcam，目錄號(hào)：ab9399；稀釋1/1000)以及抗-MRP2(Enzo，目錄號(hào)：Alx-801-016；稀釋1/100)。使用EnvisionDako抗兔試劑盒(針對(duì)抗-CYP3A4)或MOM試劑盒(針對(duì)抗-MRP2、抗-CK19和抗α1-抗胰蛋白酶)以及使用二氨基聯(lián)苯胺(Sigma,Belgium)作為顯色底物進(jìn)行目測(cè)染色檢測(cè)。使用Mayer蘇木精將核復(fù)染10分鐘并且使用(Merck)封片以進(jìn)行顯微鏡分析。結(jié)果H2干細(xì)胞的臨床應(yīng)用需要在動(dòng)物模型中進(jìn)行初步的臨床前驗(yàn)證，以顯示此類細(xì)胞在實(shí)際中是否和如何在組織中特別是在肝臟內(nèi)植入和增殖，以及顯示與肝分化相關(guān)的性質(zhì)并且無(wú)致瘤性轉(zhuǎn)化。在此范圍內(nèi)，已將H2干細(xì)胞給予動(dòng)物模型以評(píng)估一系列標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，以及一些與潛在臨床應(yīng)用相關(guān)的參數(shù)。在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)試后，H2干細(xì)胞不存在癌細(xì)胞中常見的特征，如核型改變或人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTET)高表達(dá)，在NSG小鼠模型(免疫缺陷動(dòng)物NODScidγ小鼠，在其中避免了由異種移植引起的細(xì)胞排斥反應(yīng)；NOD.Cg-PrkdcSCIDIl2rgtm1Wjl/SZJ來(lái)自JacksonLaboratories，目錄號(hào)：005557)中與HHALPC平行地測(cè)試了H2干細(xì)胞的潛在致瘤作用，在其中肝內(nèi)給予細(xì)胞。將HeLa細(xì)胞(來(lái)源于人宮頸腺癌的致瘤細(xì)胞)和用于注射的溶劑(cryostor5)分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。在單次肝內(nèi)細(xì)胞注射(每種細(xì)胞類型100萬(wàn)個(gè)，相當(dāng)于2000萬(wàn)個(gè)/Kg；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序施用)6個(gè)月后，處死小鼠并對(duì)器官取樣，確證肝內(nèi)施用后與在陰性對(duì)照中獲得的那些相比H2干細(xì)胞和HHALPC均未形成顯著不同數(shù)量的腫瘤。使用這種肝內(nèi)途徑，在注射期間無(wú)動(dòng)物死亡，在尸體解剖期間未見人源(針對(duì)Ku80抗原陽(yáng)性)的結(jié)節(jié)。而且，在H2干細(xì)胞肝內(nèi)或脾內(nèi)注射1周后，處死單獨(dú)的一組動(dòng)物，在其肝臟中發(fā)現(xiàn)人源的、Ku80陽(yáng)性細(xì)胞聚集，表明H2干細(xì)胞能夠迅速植入。因此，通過肝內(nèi)注射施用基于HHALPC和H2干細(xì)胞的細(xì)胞療法治療是安全的和對(duì)于腫瘤形成是安全的。在一項(xiàng)更深入的功能性測(cè)定中，將還表達(dá)FAH基因(根據(jù)RT-PCR和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù))的H2干細(xì)胞肝內(nèi)或脾內(nèi)注射進(jìn)入FRG小鼠模型。這項(xiàng)研究能夠在缺乏肝功能的肝臟中(FAH小鼠缺乏具有功能的FAH基因，與人酪氨酸血癥類似)評(píng)估H2干細(xì)胞的植入、重建和分化，使用相等數(shù)量的人原代肝細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。其證實(shí)了體外的數(shù)據(jù)，表明在小鼠血液中存在H2干細(xì)胞分泌的人白蛋白，其在幾周內(nèi)累積(圖12A)。對(duì)肝內(nèi)注射H2干細(xì)胞或肝細(xì)胞動(dòng)物的肝臟進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析并通過免疫組化對(duì)一系列人標(biāo)記物分析時(shí)，Ku80陽(yáng)性細(xì)胞形成了類似地、較大的增殖性和肝分化細(xì)胞的聚集體(圖12B)，表明H2干細(xì)胞是重建肝臟所需的肝活性細(xì)胞。這些細(xì)胞聚集體對(duì)肝酶是強(qiáng)陽(yáng)性的，如人精氨酸酶和OTC(圖12C)。與此同時(shí)，如果在這些體內(nèi)分化H2干細(xì)胞中也檢測(cè)到了其他酶如α1-抗胰蛋白酶和CYP3A4，則CK-19陽(yáng)性消失(圖12D)。這些數(shù)據(jù)表明，在體外H2干細(xì)胞維持肝臟活性的同時(shí)(如果不增加)，H2干細(xì)胞失去一些非肝臟標(biāo)記物并且在其植入和在肝臟內(nèi)增殖后獲得更多的肝臟樣性質(zhì)(肝細(xì)胞較少表達(dá)CK-19)。這些體內(nèi)模型確證了H2干細(xì)胞用于需要使用肝活性細(xì)胞重建人肝臟的醫(yī)藥用途(如在某些先天性代謝性肝臟疾病或急性/創(chuàng)傷性嚴(yán)重肝損傷或作為肝臟移植的替代方案)的適用性，以及使用此類細(xì)胞全身性遞送酶、生長(zhǎng)因子和由具有功能的肝細(xì)胞天然表達(dá)的其他蛋白(如在患有相關(guān)疾病的患者中與凝血、肝硬化或纖維化相關(guān)的那些)或者由基因修飾的H2干細(xì)胞適宜地表達(dá)的非肝臟蛋白(如在多種適應(yīng)癥如癌癥、糖尿病或炎性病癥的治療中可能是有用的抗體或激素)的可能性。已在文獻(xiàn)中綜述了用于驗(yàn)證施用肝細(xì)胞肝臟祖細(xì)胞(如H2干細(xì)胞)對(duì)于肝臟重建和再生作用的其他臨床前模型和方法(參見書籍“LiverRegenerationBasicMechanisms,RelevantModelsandClinicalApplications”,Edit.:UdayanM.Apte,Elsevier2015)。參考文獻(xiàn)AlépéeNetal.,2014.ALTEX.31:441-77.AllamehAandKazemnejadS,ClinBiochem(2012).45:385-96.AzumaHetal.,Hepatology(2003).37:1385-94.BaudoinRetal.,Xenobiotica(2013).43:140-52.BaleSetal.,2014.ExpBiolMed.239:1180-91.BenzKetal.,JTranslMed(2013).11:27BühringHJetal.,AnnNYAcadSci(2007).1106:262-71.BusserHetal.,2015.StemCellsDev.2015Jul28Epubaheadofprint]CaraltMetal.,Organogen(2014).10:250-9.Castilho-FernandesA,etal.2011.ExpMolPathol.91:664-72.DanYY,MethodsMolBiol(2012).826:11-23.DarwicheHandPetersenBE,ProgMolBiolTranslSci(2010).97:229-49.EgloffMetal.,2013.BMCProceedings.7(Suppl6):P6.GeretsHHetal.,CellBiolToxicol(2012).28:69-87.Gomez-LechonMJetal.,MethodsMolBiol(2012).806:87-97.HalladayJSetal.,JPharmacolToxicolMethods(2012).66:270-5.HerreraMBetal.,StemCells(2006).24:2840-50.HoffmannSAetal.,BiotechnolBioeng(2012).109:3172-81.HookLA,DrugDiscovToday(2012).17:336-42.KabelA,IntJHematolDis(2014).1:22-26.KhuuDNetal.,CellTransplant(2011).20:287-302.LauGandCrichleyJ,JPharmBiomedAnal(1994).12:1563-72.LeeJetal.,Biomacromol(2014).15:206-18.LinCetal.,2015.ExpertOpinDrugDiscov.10:519-40LuYetal.,BiotechnolBioeng(2012).109:595-604.LubberstedtMetal.,JPharmacolToxicolMethods(2011).63:59-68.MassieIetal.,TissueEngPartCMethods(2011).17:765-74.MasudaHetal.,CellTransplant(2012).21:2201-14.MengQ,ExpertOpinDrugMetabToxicol(2010).6:733-46.MitakaTandOoeH,DrugMetabRev(2010).42:472-81.MiyazakiMetal.,StemCells(2007).25:2855-63.NajimiMetal.,CellTransplant(2007).16:717-28.NajarMetal.,2012.StemCellRev.8:1188-98.NajarMetal.,2013.IntImmunopharmacol.15:693-702.ParveenNetal.,CurrPharmBiotechnol(2011).12:226-30.PilzGetal.,StemCellsDev(2011).20:635-46.RaicevicGetal.,2015.Cytotherapy.17:174-85.RussoFPandParolaM,BestPractResClinGastroenterol(2012).26:35-45.SahinMBetal.,LiverTranspl(2008).14:333-45.SaitoRetal.,ArtifOrgans(2011).35:80-3.SalehF.etal.in“ProgenitorCells”inMeth.Mol.Biol.(2012).916:31-45.SantamariaEetal.,MethodsMolBiol(2012).909:165-80.ScheersIetal.2012.CellTransplant.21:2241-55.SchmelzerEetal.,JExpMed(2007).204:1973-87.ShiojiriNandNitouM,MethodsMolBiol(2012).826:3-10.Sison-YoungRetal.,2015.ToxicolSci.Jul8.pii:kfv136.[Epubaheadofprint]SivasubramaniyanKetal.,StemCellsDev(2013).2:1944-54.SlanyAetal.,JProteomeRes(2010).9:6-21.SmithCMetal.,JPharmSci(2012).101:3989-4002.SnykersSetal.,StemCells(2009).27:577–605.SokalEM,CellProlif(2011).44Suppl1:39-43.Soto-GutierrezAetal.,CellTransplant(2010).19:815-22.SugaharaTetal.,CancerSci(2007).98:900-8.TanakaMandMiyajimaA,MethodsMolBiol(2012).826:25-32.TorresDMandHarrisonSA,Hepatology(2012).56:2013-5.TostoesRMetal.,Hepatology(2012).55:1227-36.VanheelAetal.,PLoSOne(2012).7:e35544.WangCetal.,Hepatology(2012).55:108-20.WatsonAetal.,MolCancerRes(2013)11:74-85.WhitePetal.,JBiolChem(2005).280:3715-22.WuXetal.,PLoSPathog(2012).8:e1002617.YalaouiSetal.,2008.PLoSPathog.4:e1000010.YuJetal.,PLoSOne(2012).7:e35230.ZhuCetal.,JTissueEngRegenMed(2013).7:757-66.當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3