小分子藥物長(zhǎng)期以來(lái)是治療多種疾病(包括但不限于癌癥)的標(biāo)準(zhǔn)。此類小分子藥物通常以液體、藥丸、膠囊等形式口服施用或者以可注射制劑或靜脈內(nèi)制劑的形式腸胃外施用。雖然在治療許多病癥方面有效，但是仍然存在許多挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括但不限于控制藥物遞送的速率、將化合物靶向遞送至所需作用部位以及使化合物在循環(huán)中的半衰期最大化。例如，許多化合物在到達(dá)作用部位之前由于代謝而表現(xiàn)出功效和治療益處降低。另外，許多化合物相對(duì)不溶于水溶劑中，需要使用復(fù)雜的制劑以便施用。在一些情況下，這可能限制其在臨床上的有用性，即使它們?cè)谂R床前研究中有效。

藥物遞送領(lǐng)域中的一個(gè)目的是優(yōu)先將化合物遞送至所需作用部位。此外，另外的一個(gè)目的是一旦化合物到達(dá)作用部位至少部分地控制化合物的遞送。更進(jìn)一步地，另外的一個(gè)目的是利用遞送系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)前述目的中的一個(gè)或多個(gè)，所述遞送系統(tǒng)在化合物在體內(nèi)遞送時(shí)使其穩(wěn)定、延長(zhǎng)化合物在體內(nèi)的半衰期并且?guī)椭芙饣衔?，特別是那些不溶于水溶劑的化合物。

為了解決本領(lǐng)域的缺點(diǎn)，已經(jīng)探索出了抗體-藥物結(jié)合物(ADC)。大量的研究和開(kāi)發(fā)已經(jīng)表明ADC在提供動(dòng)物模型以及人類中的癌細(xì)胞的靶向破壞方面是有效的(P.D.Senter和E.L.Sievers，《自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)》，30，631-637(2012)；C&EN，《抗體藥物結(jié)合物(Antibody Drug Conjugates)》，2012年6月18日，第12-18頁(yè)；J.D.Thomas等人，《生物結(jié)合物化學(xué)(Bioconjugate Chem.)》，23，2007-2013(2012)；以及其中的參考文獻(xiàn))。雖然這個(gè)概念已經(jīng)討論了許多年，但是這個(gè)概念的實(shí)現(xiàn)花了幾十年才實(shí)現(xiàn)。第一個(gè)“武裝抗體”直到2011年才被批準(zhǔn)(P.D.Senter和E.L.Sievers，《自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)》，30，631-637(2012))。在其最常見(jiàn)的形式中，使用被設(shè)計(jì)成將藥劑釋放到腫瘤塊或腫瘤細(xì)胞中的連接化學(xué)物質(zhì)將藥物或其它化合物(在本文中稱為“藥劑”)的一至四個(gè)分子與抗體偶聯(lián)。這種方法的一個(gè)限制是不充分的毒素可以附著到抗體上以殺死某些腫瘤，特別是當(dāng)使用威力較小的毒素時(shí)或者當(dāng)腫瘤細(xì)胞表面上存在減少的抗原密度時(shí)。而且，增加抗體上毒素附著點(diǎn)的數(shù)量可能損害抗體結(jié)合能力并且降低其殺死癌細(xì)胞的能力。另外，這種方法對(duì)于難以溶解的化合物可能是有問(wèn)題的。最后，一些毒素當(dāng)附著到抗體上時(shí)是很疏水的，使得它們被獨(dú)立于抗體的結(jié)合區(qū)的靶外組織攝取，從而限制它們的有效治療潛力。

另一種方法是使用可生物降解的聚合物，例如衍生自氧化葡聚糖的聚縮醛(Yurokovetskiy等人，美國(guó)專利8,685,383)。在這種方法中，聚合物-ADC可以含有與聚合物主鏈連接的藥劑的多個(gè)拷貝，其中所述聚合物本身與抗體連接。當(dāng)單獨(dú)與非靶向聚合物藥物結(jié)合物相比時(shí)，大于1的藥物-抗體比例(DAR)使得細(xì)胞毒性結(jié)果得以改善?？缮锝到獾木酆衔?，例如上述聚縮醛，具有降解并因此避免體內(nèi)積累的優(yōu)點(diǎn)。然而，它們還具有在制備期間或在注射后在體內(nèi)比預(yù)期降解更快的缺點(diǎn)。該方法可能導(dǎo)致細(xì)胞毒素劑在循環(huán)過(guò)程中過(guò)早釋放，從而在其到達(dá)靶細(xì)胞上的抗原之前限制了其有效性。第二，許多此類聚合物，包括上述聚縮醛，具有生物來(lái)源，并且這可能導(dǎo)致與去除危險(xiǎn)雜質(zhì)有關(guān)的制造挑戰(zhàn)，并且當(dāng)施用于受試者時(shí)可增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

另外的一種方法是將抗體附著到生物相容性聚合物(稱為聚合物-ADC)上。一種簡(jiǎn)單的方法是將線性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))附著在抗體與藥物之間。這由Riggs-Sauthier等人(US 2014/0088021)證明，其中首先通過(guò)馬來(lái)酰亞胺化學(xué)將2kDa或20kDa的一個(gè)線性異雙功能的PEG附著到HER2抗體上的一個(gè)巰基上。然后通過(guò)酯連接將PEG抗體復(fù)合物與一種細(xì)胞毒性小分子偶聯(lián)。該方法可能具有明顯的缺點(diǎn)，因?yàn)轷ミB接在體內(nèi)不穩(wěn)定，并且將在其到達(dá)靶細(xì)胞上的抗原之前水解將細(xì)胞毒素劑釋放在血液中。當(dāng)使用2kDa或20kDa聚合物時(shí)，該項(xiàng)工作中的體內(nèi)功效研究不能證明聚合物-ADC的主動(dòng)靶向。所證明的功效可能是由于PEG部分引起的細(xì)胞毒素劑的藥代動(dòng)力學(xué)半衰期延長(zhǎng)引起的。另外，當(dāng)單獨(dú)與藥物相比時(shí)，PEG聚合物-ADC在細(xì)胞毒性測(cè)定方面喪失生物活性。在這種情況下，藥物與抗體比例(DAR)僅為一，與非聚合物-ADC方法相比沒(méi)有優(yōu)勢(shì)。利用該方法不能實(shí)現(xiàn)在線性PEG聚合物上配備藥物或抗體的多個(gè)拷貝。

考慮到前述情況，該領(lǐng)域需要一種解決上述限制的ADC，特別是聚合物-ADC。本申請(qǐng)通過(guò)提供聚合物-ADC提供了對(duì)這些問(wèn)題的解決方案，所述聚合物-ADC是合成制造的、使藥劑更多地加載到靶向抗體上(更高的DAR值)、使結(jié)合物在體內(nèi)的半衰期增加，并且基本上不干擾靶向劑(即，抗體)的結(jié)合活性。此外，本發(fā)明的聚合物-ADC結(jié)合物容易構(gòu)建，并且它們可以增強(qiáng)待遞送的化合物的溶解度。最后，本發(fā)明的聚合物-ADC結(jié)合物直到它們到達(dá)靶細(xì)胞上的抗原并且被內(nèi)在化才釋放藥物，其中所述藥劑在從聚合物裂解后釋放。在本申請(qǐng)中，使用HBL-2、MEC-1和拉莫斯細(xì)胞系(Ramos cell line)(人B細(xì)胞淋巴瘤衍生的細(xì)胞系)作為實(shí)例。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了R11POZ生物素與HBL-2和MEC-1細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)曲線圖。

圖2顯示了在提純之前、期間和之后CD79b的POZ MMAE結(jié)合物的SDS-PAGE。

圖3顯示了通過(guò)ELISA測(cè)定天然的且聚惡唑啉結(jié)合的R11抗體與ROR1抗原的結(jié)合。

圖4顯示了MMAE和脫乙?；锼蓧A(DC)的CD79b POZ藥物結(jié)合物的濃度對(duì)拉莫斯細(xì)胞的生存力的影響。

圖5顯示了MMAE和脫乙酰基秋水仙堿(DC)的CD79b POZ藥物結(jié)合物的濃度對(duì)MEC-1細(xì)胞的生存力的影響。

圖6顯示了MMAE的R11POZ藥物結(jié)合物的濃度對(duì)HBL-2和MEC-1細(xì)胞的生存力的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，描述了聚合物結(jié)合物，以及此類聚合物用于治療人類疾病的用途。在一個(gè)實(shí)施例中，聚合物結(jié)合物是聚合物-ADC。在一個(gè)實(shí)施例中，聚合物結(jié)合物是生物穩(wěn)定的。在另一個(gè)實(shí)施例中，所有或某些連接基團(tuán)是生物穩(wěn)定的。聚合物-ADC被設(shè)計(jì)成含有大量的聚合物結(jié)合劑(高DAR)。這些聚合物-ADC還可以在識(shí)別部分(例如但不限于抗體)與聚合物之間具有單個(gè)附著點(diǎn)或多個(gè)附著點(diǎn)，其中附著點(diǎn)可以遠(yuǎn)離識(shí)別部分的結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施例中，單個(gè)識(shí)別部分可以結(jié)合本文所描述的不止一種聚合物-ADC。所描述的聚合物-ADC相對(duì)于傳統(tǒng)ADC具有改善的藥代動(dòng)力學(xué)和溶解度。另外，這些聚合物-ADC具有在制備期間或在遞送期間不降解的優(yōu)點(diǎn)。此外，聚合物ADC的聚合物部分是合成的，并且不含生物雜質(zhì)?？梢远ㄖ扑巹┡c聚合物之間的連接基團(tuán)以在作用部位(例如腫瘤細(xì)胞)在所需位點(diǎn)且在所需條件下提供毒素的釋放。本發(fā)明的聚合物-ADC的另一個(gè)特征是，提純部分(例如但不限于生物素)可以附接到聚合物主鏈上，以使復(fù)合物結(jié)合物容易提純。

定義

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“藥劑”是指具有治療或診斷應(yīng)用的任何分子，其中所述藥劑能夠與聚合物上的官能團(tuán)或附著到聚合物上的連接基團(tuán)形成連接，所述藥劑包括但不限于治療劑(例如但不限于藥物)、診斷劑或有機(jī)小分子。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，藥劑可用于治療癌癥。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“連接”或“連接基團(tuán)”，當(dāng)針對(duì)本文所描述的聚合物或藥劑或其組分使用時(shí)，是指通常由于化學(xué)反應(yīng)而形成的基團(tuán)或鍵。在某些實(shí)施例中，具體的連接是共價(jià)連接。在某些實(shí)施例中，具體的連接是可水解的。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“可水解連接基團(tuán)”或“可釋放的可水解連接基團(tuán)”是指在含有可水解連接基團(tuán)的本發(fā)明的結(jié)合物已經(jīng)施用于受試者之后在受試者的特定生理?xiàng)l件下在受試者體內(nèi)可裂解的化學(xué)連接。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，可水解連接基團(tuán)可以是生物穩(wěn)定的?？伤膺B接基團(tuán)可以含有如本文所描述的可水解部分；在某些情況下，可水解連接基團(tuán)可以含有不止一個(gè)可水解部分。在一個(gè)實(shí)施例中，可水解連接基團(tuán)可在遞送至作用部位(例如但不限于腫瘤細(xì)胞)時(shí)裂解。在一個(gè)實(shí)施例中，可水解連接基團(tuán)僅可在被細(xì)胞(例如但不限于腫瘤細(xì)胞)攝取(例如通過(guò)內(nèi)吞作用)時(shí)裂解。在一個(gè)實(shí)施例中，可水解連接基團(tuán)可在溶酶體或核內(nèi)體中裂解。在一個(gè)實(shí)施例中，可水解連接基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)裂解。在該實(shí)施例的一個(gè)方面，裂解通過(guò)還原易于還原的基團(tuán)，例如但不限于二硫化物或自我擴(kuò)散反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施例中，可水解連接基團(tuán)被天然存在或被誘導(dǎo)存在于受試者中的物質(zhì)裂解。在該實(shí)施例的一個(gè)方面，這樣的物質(zhì)是酶或多肽。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，可水解連接基團(tuán)通過(guò)酶促反應(yīng)裂解。在一個(gè)實(shí)施例中，可水解連接基團(tuán)通過(guò)前述的組合裂解。在一個(gè)實(shí)施例中，包含在可水解連接基團(tuán)內(nèi)的可水解部分在相同條件下并且通過(guò)相同的機(jī)制裂解。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“生物穩(wěn)定的”是指當(dāng)施用于受試者(包括人受試者)時(shí)抗裂解的聚合物或聚合物結(jié)合物(包括其中含有的任何連接基團(tuán)或連接，例如但不限于可水解連接基團(tuán))，當(dāng)施用于受試者(包括人類受試者)時(shí)抗裂解，直到聚合物或聚合物結(jié)合物到達(dá)作用部位(例如但不限于腫瘤細(xì)胞)。“抗裂解”是指在聚合物到達(dá)作用部位之前至少80％、90％、95％、98％或99％或更多的聚合物或聚合物結(jié)合物沒(méi)有被裂解。在一個(gè)實(shí)施例中，生物穩(wěn)定的聚合物或聚合物結(jié)合物在受試者的血流中抗裂解，使得超過(guò)80％、90％、95％、98％、99％或更多的聚合物或聚合物結(jié)合物在血流中沒(méi)有被裂解。術(shù)語(yǔ)“生物穩(wěn)定的”還可以指連接基團(tuán)或連接(例如但不限于可水解連接基團(tuán))，使得連接基團(tuán)或連接在施用于受試者(包括人受試者)時(shí)抗裂解，直到連接的連接基團(tuán)被置于作用部位(例如但不限于腫瘤細(xì)胞)。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，生物穩(wěn)定的連接基團(tuán)或連接在受試者的血流中抗裂解，使得超過(guò)80％、90％、95％、98％、99％或更多的連接基團(tuán)或連接在血流中沒(méi)有被裂解。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“烷基”，無(wú)論單獨(dú)使用或作為取代基的一部分使用，包括包含1至20個(gè)碳原子的直鏈烴基。因此，所述短語(yǔ)包括直鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。所述短語(yǔ)還包括直鏈烷基的支鏈異構(gòu)體，包括但不限于通過(guò)實(shí)例提供的以下各項(xiàng)：-CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)(CH₂CH₃)、-CH(CH₂CH₃)₂、-C(CH₃)₃、-C(CH₂CH₃)₃、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)(CH₂CH₃)、-CH₂CH(CH₂CH₃)₂、-CH₂C(CH₃)₃、-CH₂C(CH₂CH₃)₃、-CH(CH₃)CH(CH₃)(CH₂CH₃)、-CH₂CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂CH₂CH(CH₃)(CH₂CH₃)、-CH₂CH₂CH(CH₂CH₃)₂、-CH₂CH₂C(CH₃)₃、-CH₂CH₂C(CH₂CH₃)₃、-CH(CH₃)CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH(CH₃)CH(CH₃)CH(CH₃)₂、-CH(CH₂CH₃)CH(CH₃)CH(CH₃)(CH₂CH₃)，以及其它。所述短語(yǔ)還包括環(huán)烷基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基，以及被如上定義的直鏈和支鏈烷基取代的這些的環(huán)。所述短語(yǔ)還包括多環(huán)烷基，例如但不限于金剛烷基、降冰片基和雙環(huán)[2.2.2]辛基，以及被如上定義的直鏈和支鏈烷基取代的這些的環(huán)。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“烯基”，無(wú)論單獨(dú)使用或作為取代基的一部分使用，包括在任何兩個(gè)相鄰碳原子之間具有至少一個(gè)雙鍵的烷基。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“炔基”，無(wú)論單獨(dú)使用或作為取代基的一部分使用，包括在任何兩個(gè)相鄰碳原子之間具有至少一個(gè)三鍵的烷基。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“未取代的烷基”、“未取代的烯基”和“未取代的炔基”是指不含雜原子的烷基、烯基和炔基。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“取代的烷基”、“取代的烯基”和“未取代的炔基”是指如上定義的烷基、烯基和炔基，其中與碳或氫鍵合的一個(gè)或多個(gè)鍵被與非氫或非碳原子鍵合的鍵置換，所述非氫或非碳原子例如但不限于：基團(tuán)(例如烷氧基和芳氧基)中的氧原子；基團(tuán)(例如烷基和芳基硫基、砜基、磺?；蛠嗧炕?中的硫原子；基團(tuán)(例如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基)中的硅原子；以及各種其它基團(tuán)中的其它雜原子。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“未取代的芳烷基”是指如上定義的未取代的烷基或烯基，其中未取代或取代的烷基或烯基的氫或碳鍵被與如上定義的取代或未取代的芳基鍵合的鍵置換。例如，甲基(CH3)是未取代的烷基。如果甲基的氫原子被與苯基鍵合的鍵置換，例如如果甲基的碳與苯的碳鍵合，則該化合物是未取代的芳烷基(即芐基)。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“取代的芳烷基”就未取代的芳烷基而言，具有和取代的芳基就未取代的芳基而言相同的含義。然而，取代的芳烷基還包括其中基團(tuán)的烷基部分的碳或氫鍵被與非碳或非氫原子鍵合的鍵置換的基團(tuán)。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“未取代的芳基”是指在環(huán)部分具有6至12個(gè)碳原子的單環(huán)或雙環(huán)芳香族烴基，例如但不限于苯基、萘基、蒽基、聯(lián)苯基和二苯基，其不含雜原子。盡管短語(yǔ)“未取代的芳基”包括含有稠環(huán)(例如萘)的基團(tuán)，但其不包括具有與一個(gè)環(huán)成員鍵合的其它基團(tuán)(例如烷基或鹵素基團(tuán))的芳基，因?yàn)榉蓟?例如甲苯基)在本文中被認(rèn)為是如下所述的取代的芳基。然而，未取代的芳基可以與母體化合物中的一個(gè)或多個(gè)碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子鍵合。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“取代的芳基”就未取代的芳基而言，具有和取代的烷基就未取代的烷基而言相同的含義。然而，取代的芳基還包括其中一個(gè)芳香族碳與非碳或非氫原子之一鍵合的芳基，所述非碳或非氫原子例如但不限于上述關(guān)于取代的烷基描述的那些原子；并且還包括其中芳基的一個(gè)或多個(gè)芳香族碳與如本文定義的取代和/或未取代的烷基、烯基或炔基鍵合的芳基。這包括其中芳基的兩個(gè)碳原子與烷基或烯基的兩個(gè)原子鍵合以限定稠環(huán)體系(例如二氫萘基或四氫萘基)的鍵合排列。因此，短語(yǔ)“取代的芳基”包括但不限于甲苯基和羥苯基等。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“未取代的雜環(huán)基”是指芳香族和非芳香族環(huán)化合物，其包括含有3個(gè)或更多個(gè)環(huán)成員的單環(huán)、雙環(huán)和多環(huán)化合物，其中所述環(huán)成員中的一個(gè)或多個(gè)是雜原子，例如但不限于N、O和S。盡管短語(yǔ)“未取代的雜環(huán)基”包括稠合雜環(huán)(例如苯并咪唑基)，但其不包括具有與一個(gè)環(huán)成員鍵合的其它基團(tuán)(例如烷基或鹵素基團(tuán))的雜環(huán)基，因?yàn)榛衔?例如2-甲基苯并咪唑基)是如下定義的“取代的雜環(huán)基”。雜環(huán)基的實(shí)例包括但不限于：含有1至4個(gè)氮原子的不飽和3至8元環(huán)、含有1至4個(gè)氮原子的稠合不飽和雜環(huán)基、含有1至2個(gè)氧原子和1至3個(gè)氮原子的不飽和3至8元環(huán)、含有1至2個(gè)氧原子和1至3個(gè)氮原子的飽和3至8元環(huán)、含有1至2個(gè)氧原子和1至3個(gè)氮原子的不飽和稠合雜環(huán)基、含有1個(gè)至3個(gè)硫原子和1至3個(gè)氮原子的不飽和3至8元環(huán)、含有1至2個(gè)硫原子和1至3個(gè)氮原子的飽和3至8元環(huán)、含有1至2個(gè)硫原子的飽和和不飽和3至8元環(huán)、含有1至2個(gè)硫原子和1至3個(gè)氮原子的不飽和稠合雜環(huán)、含有氧原子的不飽和3至8元環(huán)、含有1至2個(gè)氧原子的不飽和稠合雜環(huán)、含有氧原子和1至2個(gè)硫原子的不飽和3至8元環(huán)、含有1至2個(gè)氧原子和1至2個(gè)硫原子的飽和3至8元環(huán)、含有1至2個(gè)硫原子的不飽和稠合環(huán)，以及含有氧原子和1至2個(gè)氧原子的不飽和稠合雜環(huán)。雜環(huán)基還包括以上描述的其中環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)S原子與一個(gè)或兩個(gè)氧原子雙鍵鍵合的那些(亞砜和砜)。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“取代的雜環(huán)基”就未取代的雜環(huán)基而言，具有和取代的烷基就未取代的烷基而言相同的含義。然而，取代的雜環(huán)基還包括其中一個(gè)碳與非碳或非氫原子之一鍵合的雜環(huán)基，所述非碳或非氫原子例如但不限于上面關(guān)于取代的烷基和取代的芳基描述的那些原子；并且還包括其中雜環(huán)基的一個(gè)或多個(gè)碳與如本文定義的取代和/或未取代的烷基、烯基或芳基鍵合的雜環(huán)基。這包括其中雜環(huán)基的兩個(gè)碳原子與烷基、烯基或炔基的兩個(gè)原子鍵合以限定稠環(huán)體系的鍵合排列。實(shí)例包括但不限于2-甲基苯并咪唑基、5-甲基苯并咪唑基、5-氯苯并噻唑基、1-甲基哌嗪基和2-氯吡啶基等。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“未取代的雜環(huán)基烷基”是指如上定義的未取代的烷基或烯基，其中未取代的烷基或烯基的氫或碳鍵被與如上定義的取代或未取代的雜環(huán)基鍵合的鍵置換。例如，甲基(CH₃)是未取代的烷基。如果甲基的氫原子被與雜環(huán)基鍵合的鍵置換，例如如果甲基的碳與吡啶的碳2(與吡啶的N鍵合的碳之一)或吡啶的碳3或4鍵合，則所述化合物是未取代的雜環(huán)基烷基。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“取代的雜環(huán)基烷基”就未取代的雜環(huán)基烷基而言，具有和取代的芳基就未取代的芳基而言相同的含義。然而，取代的雜環(huán)基烷基還包括其中非氫原子與雜環(huán)基烷基的雜環(huán)基中的雜原子(例如但不限于哌啶基烷基的哌啶環(huán)中的氮原子)鍵合的基團(tuán)。

為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，在本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的適當(dāng)結(jié)構(gòu)情況下，化學(xué)部分始終限定和指代的可以是單價(jià)化學(xué)部分(例如烷基、芳基等)或多價(jià)部分。例如，“烷基”部分可以指一價(jià)基團(tuán)(例如，CH₃-CH₂-)，或在其它情況下，二價(jià)連接部分可以是“烷基”，在這種情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將烷基理解為相當(dāng)于術(shù)語(yǔ)“亞烷基”的二價(jià)基(例如-CH₂-CH₂-)。類似地，在其中需要二價(jià)部分并且被稱為“烷氧基”、“烷基氨基”、“芳氧基”、“烷硫基”、“芳基”、“雜芳基”、“雜環(huán)基”、“烷基”、“烯基”、“炔基”、“脂肪族基團(tuán)”或“環(huán)烷基”的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，所述術(shù)語(yǔ)指相應(yīng)的二價(jià)部分。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”是指在疾病或病癥的癥狀、方面或特征發(fā)作后開(kāi)始的作用過(guò)程(例如施用結(jié)合物或藥物組合物)，以便消除或減少這種癥狀、方面或特征。這種治療不一定是絕對(duì)有用的。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“需要治療”是指由護(hù)理者做出的患者需要治療或?qū)闹委熓芤娴呐袛?。該判斷是基于護(hù)理者專業(yè)領(lǐng)域中的各種因素而做出的，但是包括患者由于疾病或病癥而患病或?qū)⒒疾〉闹R(shí)，所述疾病或病癥可通過(guò)本發(fā)明的方法或化合物治療。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“需要預(yù)防”是指由護(hù)理者做出的患者需要預(yù)防或?qū)念A(yù)防受益的判斷。該判斷是基于護(hù)理者專業(yè)領(lǐng)域的各種因素而做出的，但是包括患者由于疾病或病癥將患病或可能會(huì)患病的知識(shí)，所述疾病或病癥可通過(guò)本發(fā)明的方法或化合物預(yù)防。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”、“受試者”或“患者”是指任何動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、其它嚙齒類動(dòng)物、兔、狗、貓、豬、牛、羊、馬或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，以及人類。所述術(shù)語(yǔ)可以指定男性或女性或兩者，或者排除男性或女性。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指單獨(dú)或作為藥物組合物的一部分的結(jié)合物的量，所述結(jié)合物能夠?qū)膊』虿“Y的任何癥狀、方面或特征具有任何可檢測(cè)的積極作用。這種作用不一定是絕對(duì)有益的。

聚惡唑啉聚合物

聚惡唑啉(POZ)是由2-取代-2-惡唑啉單體制備的聚合物。這些聚合物是水溶性的，并且已經(jīng)報(bào)道在哺乳動(dòng)物模型體系中是無(wú)毒的。POZ通常通過(guò)適當(dāng)化學(xué)計(jì)算量的2-烷基-2-惡唑啉與親電子引發(fā)劑(例如三氟甲磺酸甲酯(CH₃-OSO₂-CF₃)或強(qiáng)酸(例如三氟甲磺酸或?qū)妆交撬?)反應(yīng)、隨后通過(guò)用親核藥劑(例如但不限于氫氧化物、硫醇或胺)終止而制備。所產(chǎn)生的聚合物用由最左側(cè)基團(tuán)表示的引發(fā)基團(tuán)和由最右側(cè)基團(tuán)表示的終止基團(tuán)簡(jiǎn)化方便地描述，其中2-烷基-2-惡唑啉組分在中間。因此，當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)中使用該簡(jiǎn)化描述時(shí)，除非另有指定，否則意在名稱的左側(cè)給出“引發(fā)劑端”，以及名稱的右側(cè)給出“終止端”。

例如，當(dāng)2-烷基-2-惡唑啉是2-甲基-2-惡唑啉時(shí)，使用三氟甲磺酸甲酯作為引發(fā)劑，并且使用氫氧化物作為終止劑，產(chǎn)生以下POZ：

CH₃-[N(COCH₃)CH₂CH₂]_n-OH。

以上聚合物用簡(jiǎn)化符號(hào)方便地描述為M-PMOZ-OH，其中甲基引發(fā)劑由最左側(cè)的M表示，PMOZ表示聚甲基惡唑啉，其中重復(fù)單元的甲基由PMOZ的M表示，并且終止羥基由-OH表示。

另一種常用的單體是2-乙基-2-惡唑啉，其利用三氟甲磺酸甲酯引發(fā)和氫氧化物終止將提供以下POZ聚合物：

CH₃-[N(COCH₂CH₃)CH₂CH₂]_n-OH。

以上聚合物用簡(jiǎn)化符號(hào)方便地描述為M-PEOZ-OH，其中甲基引發(fā)劑由最左側(cè)的M表示，PEOZ表示聚甲基惡唑啉，其中重復(fù)單元的乙基由PEOZ的E表示，并且終止羥基由-OH表示。

針對(duì)良好表征的聚合物，聚合度n的范圍可以為大約3至超過(guò)1000。

聚合過(guò)程被稱為活性陽(yáng)離子聚合，因?yàn)槔糜H電子藥劑引發(fā)產(chǎn)生惡唑啉鎓陽(yáng)離子，然后在鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所述惡唑啉鎓陽(yáng)離子與另外的單體單元反應(yīng)產(chǎn)生生長(zhǎng)的“活性”陽(yáng)離子。

可以通過(guò)假設(shè)活性陽(yáng)離子可以以下面的非環(huán)狀形式(用于由三氟甲磺酸甲酯引發(fā)的2-甲基-2-惡唑啉的聚合)表示來(lái)預(yù)測(cè)終止的產(chǎn)物，盡管事實(shí)上環(huán)狀形式當(dāng)然是最重要的：

CH₃-[N(COCH₃)CH₂CH₂]_n-N(COCH₃)CH₂CH₂⁺。

在本討論中，我們將這個(gè)陽(yáng)離子表示為M-PMOZ⁺。如上所述，該P(yáng)OZ陽(yáng)離子可以通過(guò)與親核藥劑(例如氫氧化物、硫醇或胺)反應(yīng)而“終止”。

惡唑啉聚合也可以用官能性親電子藥劑引發(fā)。例如，親電子引發(fā)劑3-溴丙酸乙酯已經(jīng)用于引發(fā)2-乙基-2-惡唑啉聚合。用氫氧化物終止得到以下聚合物：

HO₂C-CH₂CH₂-[N(COCH₂CH₃)CH₂CH₂]_n-OH。

制備具有官能團(tuán)的聚惡唑啉的又一種途徑是使單體(例如2-乙基-2-惡唑啉)與在2-位具有官能團(tuán)的惡唑啉單體共聚(F.C.Gaertner，R.Luxenhofer，B.Blechert，R.Jordan和M.Essler，《控制釋放雜志(J.Controlled Release)》，2007，119，291-300)。例如，Jordan和同事已經(jīng)利用乙炔和在2-位上保護(hù)的醛、羧酸和胺制備了惡唑啉。這些官能單體與2-乙基-2-惡唑啉的共聚產(chǎn)生具有多個(gè)側(cè)基或側(cè)鏈官能團(tuán)的無(wú)規(guī)共聚物。例如，利用三氟甲磺酸甲酯引發(fā)2-乙基-2-惡唑啉和2-戊炔-2-惡唑啉的聚合，隨后用哌嗪(NHC₄H₈NH)終止，得到以下無(wú)規(guī)共聚物：

CH₃-{[N(COCH₂CH₃)CH₂CH₂]_n-[N(COCH₂CH₂CH₂-CCH)CH₂CH₂]_m}_ran-NC₄H₈NH。

下標(biāo)“ran”表示聚合物是無(wú)規(guī)共聚物。n的值通常在20-30左右，而m在2-5左右。

具有側(cè)基官能團(tuán)和末端官能團(tuán)的這些共聚物是有用的，因?yàn)閭?cè)基官能團(tuán)和末端官能團(tuán)可以是“化學(xué)正交的”官能團(tuán)?；瘜W(xué)正交的官能團(tuán)是不會(huì)彼此反應(yīng)但將與其它官能團(tuán)選擇性反應(yīng)的那些官能團(tuán)。例如，以上分子具有兩個(gè)官能團(tuán)，末端仲胺和側(cè)基乙炔。乙炔將不與胺反應(yīng)，但將例如與疊氮基(-N₃)反應(yīng)。類似地，胺將不與乙炔或疊氮化物反應(yīng)，但將與例如異硫氰酸鹽基(-NCS)反應(yīng)。Jordan已經(jīng)使用該共聚物將疊氮化物官能化的RGD肽與乙炔基耦聯(lián)，并且將異硫氰酸鹽官能化的金屬螯合劑與胺耦聯(lián)。已知RGD肽靶向腫瘤，并且診斷或治療性放射性核素可以與螯合基團(tuán)結(jié)合。最終的結(jié)合物可以用于成像或治療腫瘤(R.Luxenhofer、M.Lopez-Garcia、A.Frannk、H.Kessler和R.Jordan，《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)議記錄(Proceedings of the American Chemical Society)》，PMSE Prepr.2006，95，283-284)。

阻礙現(xiàn)有技術(shù)的聚惡唑啉聚合物(包括上面提到的哌嗪-或哌啶-封端的聚惡唑啉)的使用的一個(gè)問(wèn)題是它們難以提純。出現(xiàn)這種困難是因?yàn)樵诮K止期間存在的污染水導(dǎo)致水的親核攻擊并且隨后形成仲胺雜質(zhì)(O.Nyken、G.Maier、A.Gross、Macromol.Chem.Phys.197，83-95，1996)。由于通過(guò)哌嗪和哌啶終止的產(chǎn)物總是含有叔胺，所以不能使用離子交換色譜法來(lái)去除污染的仲胺。

上面說(shuō)明的側(cè)基聚惡唑啉的另一個(gè)限制是這些化合物具有單個(gè)末端官能團(tuán)。因此，這種結(jié)構(gòu)構(gòu)型限制了可以附著到末端的藥物或靶向部分的數(shù)量，而此類化合物有效用于治療性診斷和靶向應(yīng)用可能需要多次加載這些部分。本發(fā)明的聚合物通過(guò)提供兩個(gè)化學(xué)反應(yīng)性和正交官能團(tuán)中的每一個(gè)的多個(gè)拷貝來(lái)避免這種限制。

聚惡唑啉聚合物-抗體結(jié)合物

許多聚惡唑啉聚合物可用于本發(fā)明中。在美國(guó)專利號(hào)8,110,651、8101,706和8,383,093和PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2012/063088(所述文獻(xiàn)中的每一篇通過(guò)引用并入本文用于此類教導(dǎo))中描述了此類聚合物。在一個(gè)實(shí)施例中，用于所描述的ADC中的聚惡唑啉聚合物攜帶2種或更多種藥劑，例如但不限于細(xì)胞毒素劑。在一個(gè)實(shí)施例中，用于所描述的ADC中的聚惡唑啉聚合物攜帶5種或更多種藥劑，例如但不限于細(xì)胞毒素劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，用于所描述的ADC中的聚惡唑啉聚合物攜帶8種或更多種藥劑，例如但不限于細(xì)胞毒素劑。在一個(gè)實(shí)施例中，用于所描述的ADC中的聚惡唑啉聚合物攜帶10個(gè)或更多種藥劑，例如但不限于細(xì)胞毒素劑。在前述實(shí)施例的每一個(gè)中，所述藥劑可以相同或所述藥劑可以不同(例如，在抑制癌癥生長(zhǎng)的途徑中依次作用的兩種細(xì)胞毒性化合物)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述藥劑是相同的。本文描述了代表性的藥劑。在一個(gè)實(shí)施例中，聚惡唑啉聚合物可以是攜帶3種或更多種、5種或更多種、8種或更多種、20種或更多種或者40種或更多種藥劑的雜官能聚合物，例如但不限于如所描述的細(xì)胞毒素劑。

在一個(gè)實(shí)施例中，聚惡唑啉-抗體結(jié)合物包含與識(shí)別部分連接的聚惡唑啉，其中識(shí)別部分包含結(jié)合殘基，聚惡唑啉包含多種藥劑，并且聚惡唑啉在結(jié)合殘基處與識(shí)別劑連接。還提供了包含聚惡唑啉-抗體結(jié)合物和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。

在一個(gè)實(shí)施例中，識(shí)別部分是抗體或抗體片段，例如但不限于單鏈抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，識(shí)別部分是抗體或抗體片段，例如但不限于單鏈抗體，并且結(jié)合殘基是化學(xué)計(jì)量結(jié)合殘基，其中聚惡唑啉聚合物和抗體以1:1的比例在化學(xué)計(jì)量結(jié)合殘基處結(jié)合。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，識(shí)別部分是抗體或抗體片段，例如但不限于單鏈抗體，并且結(jié)合殘基是硒代半胱氨酸殘基，其中聚惡唑啉聚合物和抗體以1:1的比例在硒代半胱氨酸殘基處結(jié)合。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，識(shí)別部分是單鏈抗體，并且結(jié)合殘基是硒代半胱氨酸殘基，其中聚惡唑啉聚合物和單鏈抗體以1:1的比例在硒代半胱氨酸殘基上結(jié)合。在某些實(shí)施例中，多個(gè)聚惡唑啉聚合物可以與如所描述的單個(gè)識(shí)別部分結(jié)合。在某些實(shí)施例中，2、4、6、8或10個(gè)聚惡唑啉聚合物在不同位置與單個(gè)識(shí)別部分結(jié)合。在某些實(shí)施例中，2、3、4或5個(gè)聚惡唑啉聚合物在不同位置與單個(gè)識(shí)別部分結(jié)合。

在一個(gè)實(shí)施例中，聚惡唑啉結(jié)合物由以下通用結(jié)構(gòu)表示：

R₁-{[N(COX)CH₂CH₂]_o-[N(COR₂)CH₂-CH₂)]_n-[N(COY)CH₂-CH₂)]_m}_a-R₂₀

其中：

R₁是引發(fā)基團(tuán)；

R₂是非反應(yīng)性側(cè)基部分；

針對(duì)每個(gè)重復(fù)單元，X是第一側(cè)基部分，其中至少一個(gè)第一側(cè)基部分含有藥劑或提純部分并且將所述藥劑或所述提純部分與聚合物主鏈連接；

針對(duì)每個(gè)重復(fù)單元，Y是第二側(cè)基部分，其中每個(gè)第二側(cè)基部分任選地含有藥劑或提純部分并且將所述藥劑或所述提純部分與聚合物主鏈連接；

R₂₀是含有識(shí)別部分并且將所述識(shí)別部分與聚合物主鏈連接的識(shí)別劑連接部分；

a是表示無(wú)規(guī)共聚物的ran或表示嵌段共聚物的block；

n是0至1000的整數(shù)；以及

o和m各自是獨(dú)立地選自0-50的整數(shù)，

條件是o和m不都是0，并且n、o和m的總和至少為30并且存在至少一種藥劑。

在所述的聚合物結(jié)合物中，可以針對(duì)每個(gè)重復(fù)單元獨(dú)立地選擇藥劑，使得在聚合物結(jié)合物中存在不止1種類型的藥劑。同樣，可以針對(duì)每個(gè)重復(fù)單元獨(dú)立地選擇提純部分，使得在聚合物結(jié)合物中存在不止1種類型的提純部分。在某些實(shí)施例中，僅存在1種類型的藥劑和1種類型的提純部分。在某些實(shí)施例中，存在2種類型的藥劑和1種類型的提純部分。如本文所討論的，在某些實(shí)施例中，藥劑和/或提純部分(其可以包括第一和第二側(cè)基部分的一部分)可以獨(dú)立地合成并且與聚合物結(jié)合物連接，其中所連接的這些側(cè)基部分的數(shù)量可以由側(cè)基部分的摩爾比控制，從而允許在單個(gè)反應(yīng)中添加多種類型的藥劑和/或提純部分。其它組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在一個(gè)實(shí)施例中，o和m中的一個(gè)為0，并且o或m中的另一個(gè)為3、5、8、10、15、20、30、40或更多至50，并且o、m和n的總和為20至1000、30至500、30至250或30至100。在一個(gè)實(shí)施例中，o和m中的一個(gè)為0，并且o或m中的另一個(gè)大于或等于5且小于或等于20，并且o、m和n的總和為20至1000、30至500、30至250或30至100。在一個(gè)實(shí)施例中，o和m中的一個(gè)為0，并且o或m中的另一個(gè)大于或等于5且小于或等于15，并且o、m和n的總和為20至1000、30至500、30至250或30至100。在一個(gè)實(shí)施例中，o和m中的一個(gè)為0，并且o或m中的另一個(gè)大于或等于5且小于或等于10，并且o、m和n的總和為20至1000、30至500、30至250或30至100。在一個(gè)實(shí)施例中，前述任何一個(gè)中，m并非為0，而可以為1至50、1至30、1至20、1至15、1至10或1至5。在一個(gè)實(shí)施例中，前述任何一個(gè)中，m并非為0，而可以為1至50、1至30、1至20、1至15、1至10或1至5，并且第二側(cè)基部分的全部或一部分沒(méi)有藥劑或提純部分。

在一個(gè)實(shí)施例中，存在1至10、1至4或1至2個(gè)提純部分。如本文所討論的，此類提純部分可以包含在X和/或Y中。提純部分可以相同或者它們可以不同。在一個(gè)實(shí)施例中，存在2至20、2至15、2至10或2至7種藥劑。在一個(gè)實(shí)施例中，存在2、3、4、5、6、7、8、9或10種藥劑。在一個(gè)實(shí)施例中，存在多達(dá)40種藥劑。如本文所討論的，此類藥劑可以包含在X和/或Y中。藥劑可以相同或者它們可以不同。在本文所公開(kāi)的某些結(jié)構(gòu)中，結(jié)合物中存在的提純部分的數(shù)量由o1標(biāo)識(shí)表示，以及結(jié)合物中存在的藥劑的數(shù)量由o2標(biāo)識(shí)指示。

與結(jié)合物連接的藥劑和/或提純部分的數(shù)量小于或等于o和m的和。例如，如果o和m的和為15，則與聚合物連接的藥劑和/或提純部分的最大數(shù)量為15。在某些實(shí)施例中，與結(jié)合物連接的藥劑和/提純部分的數(shù)量小于o和m的和，意味著在某些實(shí)施例中存在游離的第一和/或第二側(cè)基部分。因此，不是每個(gè)側(cè)基部分都需要含有藥劑和/或提純部分。在某些實(shí)施例中，結(jié)合物具有2至40、2至20、5至20、10至20或20至40的DAR。在某些實(shí)施例中，結(jié)合物具有2、3、4、5、6、7、8、9或10的DAR。

第一和第二側(cè)基部分的性質(zhì)可以變化，只要基團(tuán)具有用于將藥劑和/或提純部分與聚合物連接的結(jié)構(gòu)。本文描述了第一和第二側(cè)基部分的代表性結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施例中，第一和第二側(cè)基部分各自含有官能團(tuán)(即，第一和第二官能團(tuán))。官能團(tuán)參與到如本文所描述的藥劑和/或提純部分與聚合物的連接中。在一個(gè)實(shí)施例中，第一和第二官能團(tuán)彼此化學(xué)正交，使得能夠使用不同的反應(yīng)化學(xué)將藥劑和/或提純部分與聚合物連接。第一和第二官能團(tuán)包括但不限于炔、胺、羥基胺、醛、酮、縮醛、縮酮、馬來(lái)酰亞胺、酯、羧酸、活化的羧酸(例如但不限于N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)和1-苯并三嗪活性酯)、活性碳酸酯、氯甲酸酯、醇、疊氮化物、乙烯基砜或鄰吡啶基二硫化物(OPSS)。另外，第一和第二側(cè)基部分可以含有將官能團(tuán)與聚合物主鏈連接的其它基團(tuán)，例如但不限于未取代或取代的烷基、未取代或取代的烯基、未取代或取代的芳烷基或者未取代或取代的雜環(huán)基烷基。在某些實(shí)施例中，第一和/或第二官能團(tuán)是炔。在某些實(shí)施例中，第一和/或第二側(cè)基部分中的至少一個(gè)不與藥劑或提純部分連接。

在某些實(shí)施例中，聚合物結(jié)合物是生物穩(wěn)定的聚合物結(jié)合物。在某些實(shí)施例中，第一和/或第二側(cè)基部分是生物穩(wěn)定的。在某些實(shí)施例中，第一和/或第二側(cè)基部分包含含有可水解部分的可水解連接基團(tuán)，并且可水解連接基團(tuán)和可水解部分是生物穩(wěn)定的。

R₂是非反應(yīng)性側(cè)基部分。因此，R₂沒(méi)有官能團(tuán)；在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)于每個(gè)重復(fù)單元，R₂獨(dú)立地選自未取代或取代的烷基、未取代或取代的烯基、未取代或取代的芳烷基或者未取代或取代的雜環(huán)基烷基。在另一個(gè)實(shí)施例中，R₂是長(zhǎng)度為1至10或1至5個(gè)碳的未取代或取代的烷基。

示范性的引發(fā)基團(tuán)包括但不限于氫、烷基、取代的烷基、芳烷基或取代的芳烷基。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，引發(fā)基團(tuán)是甲基。在一個(gè)實(shí)施例中，R₁基團(tuán)被選擇為沒(méi)有官能團(tuán)。在PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2008/078159中公開(kāi)了另外的示范性引發(fā)基團(tuán)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文用于此種教導(dǎo)。

在一個(gè)實(shí)施例中，聚合物-結(jié)合物可以由以下通用結(jié)構(gòu)表示：

其中所述藥劑是本文所描述的任何藥劑，X表示第一側(cè)基部分，以及Y表示第二側(cè)基部分。在前述的一個(gè)實(shí)施例中，o為3-15，m為1-45，并且n、m和o的總和為30-500(或者其中或本文所描述的任何子范圍)。在該實(shí)施例中，第二側(cè)基部分Y顯示為沒(méi)有與藥劑或提純部分附著。此外，為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，該實(shí)施例中的非反應(yīng)性側(cè)基顯示為乙基，應(yīng)當(dāng)理解，針對(duì)R₂，可以存在所描述的任何基團(tuán)。當(dāng)側(cè)基部分沒(méi)有與藥劑或提純部分(例如上述Y)連接時(shí)，側(cè)基部分可以是炔(以及本文所描述的其它基團(tuán))。例如，當(dāng)Y是炔時(shí)，聚合物結(jié)合物可以具有以下結(jié)構(gòu)：

在一個(gè)實(shí)施例中，聚合物結(jié)合物可以由以下通用結(jié)構(gòu)表示：

其中所述藥劑是本文所描述的任何藥劑，PM表示提純部分，X表示第一側(cè)基部分，以及Y表示第二側(cè)基部分。在前述的一個(gè)實(shí)施例中，o1為1至4、為3至15，m為1至45，并且n、m和o的總和為30至500(或者其中或本文所描述的任何子范圍)。在該實(shí)施例中，第二側(cè)基部分Y顯示為沒(méi)有與藥劑或提純部分的連接。此外，為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，該實(shí)施例中的非反應(yīng)性側(cè)基顯示為乙基，應(yīng)當(dāng)理解，針對(duì)R₂，可以存在所描述的任何基團(tuán)。當(dāng)側(cè)基部分沒(méi)有與藥劑或提純部分(例如上述Y)連接時(shí)，側(cè)基部分可以是炔(以及本文所描述的其它基團(tuán))。例如，當(dāng)Y是炔時(shí)，聚合物結(jié)合物可以具有以下結(jié)構(gòu)：

可通過(guò)調(diào)節(jié)如實(shí)例中所描述的中間體來(lái)控制結(jié)合物的合成期間藥劑和提純部分的數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施例中，用于加入藥劑和提純部分(如果存在)的反應(yīng)化學(xué)是相同的。在另一個(gè)實(shí)施例中，反應(yīng)化學(xué)是不同的。例如，如果反應(yīng)化學(xué)是相同的并且在最終結(jié)合物中需要2個(gè)提純部分和6種藥劑，則在結(jié)合反應(yīng)期間，將2摩爾當(dāng)量的含有提純部分的側(cè)基部分和6摩爾當(dāng)量的含有藥劑的側(cè)基部分加入到反應(yīng)混合物中，得到所需的結(jié)構(gòu)。當(dāng)藥劑和提純部分存在時(shí)，側(cè)基連接部分的性質(zhì)可以相同或者可以不同。換句話說(shuō)，第一側(cè)基連接基團(tuán)的性質(zhì)可以與如本文所描述的相同或不同。此外，如本文所描述的，X和Y側(cè)基連接部分的性質(zhì)可以使得所存在的反應(yīng)性基團(tuán)提供正交官能團(tuán)，使得藥劑和提純部分通過(guò)不同的反應(yīng)化學(xué)附著。

本領(lǐng)域已知的任何提純部分可以用于本文所描述的聚合物結(jié)合物中。在一個(gè)實(shí)施例中，提純部分是生物素。在一個(gè)實(shí)施例中，結(jié)合物中存在1至3個(gè)生物素分子。在一個(gè)實(shí)施例中，存在2個(gè)生物素分子。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述藥劑通過(guò)可釋放的可水解連接(即，第一和/或第二側(cè)基部分是可水解連接基團(tuán))與聚(惡唑啉)聚合物連接。在這種情況下，第一和/或第二側(cè)基部分含有允許在將聚(惡唑啉)聚合物結(jié)合物施用于受試者后使所述連接裂解的至少一個(gè)可水解部分。第一和/或第二側(cè)基部分可以含有單個(gè)可水解部分或不止一個(gè)可水解部分?？伤獠糠挚梢酝ㄟ^(guò)酶或通過(guò)化學(xué)反應(yīng)裂解。在實(shí)例中，在存在不止一個(gè)可水解部分的情況下，一個(gè)可水解部分可以被酶裂解，并且一個(gè)可水解部分可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)裂解，或者全部可以通過(guò)相同的機(jī)制裂解。在一個(gè)實(shí)施例中，第一和/或第二側(cè)基部分含有1個(gè)可水解部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，第一和/或第二側(cè)基部分含有2個(gè)可水解部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，第一和/或第二側(cè)基部分含有2個(gè)可水解部分，其中1個(gè)部分可被酶裂解。

在一個(gè)實(shí)施例中，提純部分通過(guò)穩(wěn)定的(即使在作用部位，所述連接不裂解)或可水解連接基團(tuán)與聚(惡唑啉)聚合物連接。因此，當(dāng)藥劑和提純部分各自通過(guò)相同的反應(yīng)化學(xué)與聚合物連接時(shí)(即，使用相同的反應(yīng)化學(xué)，使用第一側(cè)基部分將藥劑和提純部分連接)，第一側(cè)基部分的一部分可以含有可水解部分，并且第一側(cè)基部分的一部分可以含有穩(wěn)定的連接。在另一個(gè)實(shí)施例中，提純部分通過(guò)如本文所描述的可釋放的可水解連接與聚惡唑啉聚合物連接。在某些實(shí)施例中，可水解連接基團(tuán)可以是生物穩(wěn)定的。因此，當(dāng)藥劑和提純部分各自通過(guò)相同的反應(yīng)化學(xué)與聚合物連接時(shí)(即，使用相同的反應(yīng)化學(xué)，使用第一側(cè)基部分將藥劑和提純部分連接)，藥劑和提純部分的所有連接含有可水解部分。然而，如果需要，可水解部分的性質(zhì)可以在藥劑與提純部分之間變化。

許多酶可用于裂解可水解部分。在一個(gè)實(shí)施例中，在血液或血漿中不存在負(fù)責(zé)裂解的酶。在一個(gè)實(shí)施例中，在細(xì)胞區(qū)室中存在負(fù)責(zé)裂解的酶，例如但不限于溶酶體或核內(nèi)體。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，酶是肽酶，例如但不限于組織蛋白酶。代表性的組織蛋白酶是組織蛋白酶B。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，可水解連接和可水解部分在血液或血漿中是生物穩(wěn)定的，使得藥劑和/或提純部分在血流中不被釋放到顯著量。在一個(gè)實(shí)施例中，被酶裂解的可水解部分是酰胺鍵，并且這種酰胺鍵可以包含在氨基酸序列中。

示范性的可水解部分包括但不限于羧酸酯(-C(O)-O-)、碳酸酯(-O-C(O)-O-)、氨基甲酸酯(-O-C(O)-NH-)、二硫化物(-S-S-)、硫化物(-S-)、縮醛(-CH(OR')(OR”))、半縮醛(-CH(OR')(OH))、磷酸酯(-O-P(O)(OH)-(O)-)、膦酸酯(-O-P(O)(OR')-(O)-)和酰胺(-C(O)-NH-)；在本文中討論了其它可水解部分，其中R'和R”是H或者取代或未取代的烷基。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，可水解部分是酯。在另一個(gè)特定的實(shí)施例中，可水解部分是酰胺。另外，可釋放的可水解連接可以包含在天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或與一個(gè)或多個(gè)天然存在和/或非天然存在的氨基酸連接的聚合物中。

在一個(gè)實(shí)施例中，可釋放的可水解連接是在R₃或R₄基團(tuán)之一中含有可水解部分的二取代三唑。在一個(gè)實(shí)施例中，可水解部分在R₄基團(tuán)中。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，二取代三唑具有以下結(jié)構(gòu)：

在另一個(gè)實(shí)施例中，二取代三唑具有以下結(jié)構(gòu)：

在前述結(jié)構(gòu)的每一個(gè)中：

R₃是將三唑部分與聚合物鏈連接的連接基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施例中，R₃(至少部分地)由聚合物鏈上的官能團(tuán)限定。在一個(gè)實(shí)施例中，R₃是-R₅-或-C(O)-R₅-，其中R₅不存在或是長(zhǎng)度為1至10個(gè)碳的取代或未取代的烷基。在一個(gè)實(shí)施例中，R₅是長(zhǎng)度為1至10個(gè)碳的未取代的烷基。在一個(gè)實(shí)施例中，R₅是長(zhǎng)度為1至5個(gè)碳的未取代的烷基。

R₄形成三唑部分與藥劑之間的連接。R基團(tuán)的性質(zhì)可以變化，只要連接功能以可釋放的方式完成即可(即，所述連接含有可水解部分)。在一個(gè)實(shí)施例中，R₄含有烷基部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，R₄含有聚合物部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，R₄含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，R₄含有聚合物部分和一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其中可水解部分是氨基酸部分中的酰胺鍵。合適的聚合物包括本領(lǐng)域已知或本文所描述的任何水溶性聚合物。在一個(gè)實(shí)施例中，水溶性聚合物是由-(O-CH₂-CH₂)_S-表示的聚乙二醇(PEG)聚合物，其中s是1至15、1至10或1至5的整數(shù)。s的具體值包括但不限于2、3、4和5。

在一個(gè)實(shí)施例中，R₄是-R₆-R₇-R₈-，其中

R₆是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳烷基、聚合物或Ul-(pol)_b-U2-([NR₁₆-C(R₁₃)(R₁₄)-C(O)]_c)-NR₁₇-Ar-(CH₂)_S(如下所定義)并且任選地含有可水解部分；

R₇是連接基團(tuán)，任選地含有可水解部分或可水解部分的一部分；以及

R₈不存在或者是O、S、CR_c或NR_c，其中R_c是H或者取代或未取代的烷基，條件是R₆和R₇中的至少一個(gè)含有可水解部分。

在一個(gè)實(shí)施例中，在R₄中存在不止一個(gè)可水解部分。在一個(gè)實(shí)施例中，在R₄中存在單個(gè)可水解部分。在一個(gè)實(shí)施例中，R₇和R₈組合形成可水解部分。在一個(gè)實(shí)施例中，R₇含有可水解部分。在一個(gè)實(shí)施例中，R₆含有可水解部分。在一個(gè)實(shí)施例中，在R₆和R₇中都存在可水解部分。此類可水解部分可以通過(guò)相同的機(jī)制或通過(guò)不同的機(jī)制裂解。

在前述的一個(gè)實(shí)施例中，R₆是直鏈取代或未取代的C1-C16烷基或支鏈取代或未取代的C1-C16烷基。在前述的一個(gè)實(shí)施例中，R₆是直鏈取代或未取代的C1-C5烷基或支鏈取代或未取代的C1-C5烷基。在一個(gè)實(shí)施例中，R₆是-(CH₂)_p-，其中p為1至16、1至10或1至5。

在另一個(gè)實(shí)施例中，R₆是聚合物。合適的聚合物包括本領(lǐng)域已知或本文所描述的任何水溶性聚合物。在一個(gè)實(shí)施例中，水溶性聚合物是由-(O-CH₂-CH₂)_b-表示的聚乙二醇(PEG)聚合物，其中b是1至30、1至15、1至10或1至5的整數(shù)。b的具體值包括但不限于2、3、4和5。在另一個(gè)實(shí)施例中，聚合物是氨基酸聚合物。合適的氨基酸聚合物包括但不限于長(zhǎng)度為1至10個(gè)氨基酸的聚甘氨酸聚合物和聚丙氨酸聚合物。這種聚合物，包括PEG或氨基酸聚合物，可以含有由連接產(chǎn)生的加成末端基團(tuán)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，R₆含有與氨基酸部分連接的直鏈取代或未取代的、支鏈取代或未取代的烷基或聚合物(各自如上所述)(在聚合物是氨基酸聚合物的情況下，兩個(gè)氨基酸部分將被連接)。氨基酸部分可以含有1至6個(gè)氨基酸、1至4個(gè)氨基酸或1至2個(gè)氨基酸。合適的氨基酸包括天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或前述的組合。在某些具體的實(shí)施例中，氨基酸可以是纈氨酸、瓜氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸。在某些實(shí)施例中，氨基酸部分是纈氨酸和瓜氨酸或賴氨酸和苯丙氨酸。

在一個(gè)實(shí)施例中，R₇是-R_a-O-C(O)-R_b-、-R_a-O-C(O)-O-R_b-、-R_a-O-C(O)-NH-R_b-、-R_a-CH(OH)-R_b-、-R_a-S-S-R_b-、-R_a-S-R_b-、-R_a-O-P(O)(OR₁₁)-R_b-(其中R₁₁是H或者取代或未取代的C1-C5烷基)，或-R_a-C(O)-NH-R_b-，其中R_a和R_b各自獨(dú)立地不存在或者是取代或未取代的烷基。在另一個(gè)實(shí)施例中，R_a和R_b各自獨(dú)立地不存在或者是C1-C16取代或未取代的烷基。在另一個(gè)實(shí)施例中，R_a和R_b各自獨(dú)立地不存在或者是C1-C5取代或未取代的烷基。在另一個(gè)實(shí)施例中，R_a和R_b各自不存在。

在某些實(shí)施例中，R₇是-R_a-C(O)-R_b-、-R_a-O-C(O)-R_b-，R_a和R_b各自不存在并且R₈是O，R₇是-R_a-O-C(O)-R_b-或者-R_a-C(O)-R_b，R_a和R_b各自不存在并且R₈是NH，以及R₇是-R_a-S-S-R_b-、-R_a-S-R_b-，R_a和R_b各自不存在并且R₈不存在。

在某些具體的實(shí)施例中，R₇是-R_a-O-C(O)-R_b-、-R_a-O-C(O)-O-R_b-，R_a和R_b各自不存在并且R₈不存在。

在一個(gè)實(shí)施例中，R₆由U1-(pol)_b-U2-([NR₁₆-C(R₁₃)(R₁₄)-C(O)]_c)-NR₁₇-Ar-(CH₂)_S表示，其中

U1表示任選的連接基團(tuán)；

pol表示聚合物部分；

U2表示任選的連接基團(tuán)；

R₁₇、R₁₆和R₁₃各自獨(dú)立地是H或者取代或未取代的C1-C5烷基；

R₁₄是天然存在或非天然存在的氨基酸上的側(cè)鏈基團(tuán)；

Ar表示芳基；

b是1至15的整數(shù)；

c是1至10的整數(shù)；以及

s是0至4的整數(shù)；

合適的聚合物包括本領(lǐng)域已知或本文所描述的任何水溶性聚合物。在一個(gè)實(shí)施例中，水溶性聚合物是由-(O-CH₂-CH₂)_b-表示的聚乙二醇(PEG)聚合物，其中s是1至15、1至10或1至5的整數(shù)。s的具體值包括但不限于2、3、4和5。在另一個(gè)實(shí)施例中，聚合物是氨基酸聚合物。合適的氨基酸聚合物包括但不限于長(zhǎng)度為1至10個(gè)氨基酸的聚甘氨酸聚合物和聚丙氨酸聚合物。

在某些實(shí)施例中，U1是長(zhǎng)度為1-10、1-8、1-5或1-3個(gè)碳的取代或未取代的烷基。在一個(gè)實(shí)施例中，U1是長(zhǎng)度為1-5個(gè)碳的未取代的烷基。在某些實(shí)施例中，U1不存在。

在某些實(shí)施例中，U2由-(CH₂)_t-C(O)-、-C(O)-或-NH-表示。在某些實(shí)施例中，U2不存在。在前述內(nèi)容中，t是1-10、1-8、1-5或1-3。

在某些實(shí)施例中，R₁₆和R₁₃各自是H。

在某些實(shí)施例中，R₁₄表示來(lái)自纈氨酸、瓜氨酸、賴氨酸或苯丙氨酸的側(cè)鏈。在某些實(shí)施例中，c等于2，并且R₁₄是來(lái)自纈氨酸和瓜氨酸或賴氨酸和苯丙氨酸的側(cè)鏈。在某些實(shí)施例中，可水解部分是在基團(tuán)-([NR₁₆-C(R₁₃)(R₁₄)-C(O)]_c)-內(nèi)的酰胺鍵。

Ar基團(tuán)可以含有單環(huán)或可以是多環(huán)的。在某些實(shí)施例中，Ar基團(tuán)選自由以下組成的群組：苯、吡啶、吡嗪、咪唑、吡唑、惡唑、噻吩、萘、蒽和菲。在某些實(shí)施例中，Ar基團(tuán)是苯。

在某些實(shí)施例中，s是1。

在一個(gè)實(shí)施例中，R₆是Ul-(pol)_b-U2-([NR₁₆-C(R₁₃)(R₁₄)-C(O)]_c)-NR₁₇-Ar-(CH₂)_s，R₇是-O-C(O)-，R₈不存在。在一個(gè)實(shí)施例中，R₆是U1-(pol)_b-U2-([NR₁₆-C(R₁₃)(R₁₄)-C(O)]_c)-NR|₇-Ar-(CH₂)s，R₇是-O-C(O)-，R₈不存在，U1是取代或未取代的C1-C10烷基或不存在，U2是-(CH₂)_t-C(O)-、-C(O)-或-NH-或不存在，pol是聚乙二醇聚合物，以及Ar是苯。在一個(gè)實(shí)施例中，R₆是Ul-(pol)b-U2-([NR₁₆-C(R₁₃)(R₁₄)-C(O)]_c)-NR₁₇-Ar-(CH₂)_s，R₇是-O-C(O)-，R₈不存在，U1是取代或未取代的C1-C10烷基或不存在，U2是-(CH₂)_t-C(O)-、-C(O)-或-NH-或不存在，pol是聚乙二醇聚合物，Ar是苯，b是4，c是2以及s是1。

另外，當(dāng)在結(jié)合物上存在提純部分時(shí)，R₃和R₄部分沒(méi)有可水解部分。

在一個(gè)實(shí)施例中，R₃和R₄部分沒(méi)有可水解部分，R₄由U3-(pol)_b-U4表示，其中

U3表示任選的連接基團(tuán)；

pol表示聚合物部分；以及

U4表示任選的連接基團(tuán)；以及

b是1至15的整數(shù)。

合適的聚合物包括本領(lǐng)域已知或本文所描述的任何水溶性聚合物。在一個(gè)實(shí)施例中，水溶性聚合物是由-(O-CH₂-CH₂)_b-表示的聚乙二醇(PEG)聚合物，其中s是1至15、1至10或1至5的整數(shù)。s的具體值包括但不限于2、3、4和5。在另一個(gè)實(shí)施例中，聚合物是氨基酸聚合物。合適的氨基酸聚合物包括但不限于長(zhǎng)度為1至10個(gè)氨基酸的聚甘氨酸聚合物和聚丙氨酸聚合物。

在某些實(shí)施例中，U3是長(zhǎng)度為1-10、1-8、1-5或1-3個(gè)碳的取代或未取代的烷基。在一個(gè)實(shí)施例中，U3是長(zhǎng)度為1-5個(gè)碳的未取代的烷基。在某些實(shí)施例中，U3不存在。

在某些實(shí)施例中，U4由-C(O)-或-NH-表示。在某些實(shí)施例中，U4不存在。

在某些實(shí)施例中，R₈不存在。

在某些實(shí)施例中，R₃是-(CH₂)₃-或-C(O)-(CH₂)₃-，并且R₄是-CH₂-C(O)-O-、-CH₂-CH₂-C(O)-O-或-CH₂(CH₂)-C(O)-O-。

在一個(gè)特定的實(shí)施例中，R₃是-(CH₂)₃-或-C(O)-(CH₂)₃，并且R₄是

在一個(gè)特定的實(shí)施例中，R₃是-(CH₂)₃-或-C(O)-(CH₂)₃，并且R₄是

在一個(gè)特定的實(shí)施例中，R₃是-(CH₂)₃-或-C(O)-(CH₂)₃，并且R₄是

在另一個(gè)實(shí)施例中，可釋放的可水解連接具有結(jié)構(gòu)R₉-Y-R₁₀，其中Y是可水解部分，并且R₉和R₁₀各自是將Y與聚合物結(jié)合物和藥劑分別連接的基團(tuán)。R₉和R₁₀可以相同或不同。在一個(gè)實(shí)施例中，R₉和R₁₀各自獨(dú)立地不存在或者是取代或未取代的烷基。在另一個(gè)實(shí)施例中，R₉和R₁₀各自獨(dú)立地不存在或者是C1-C16取代或未取代的烷基。在一個(gè)實(shí)施例中，R₉和R₁₀各自不存在。

在前述的一個(gè)實(shí)施例中，連接基團(tuán)是-R₉-C(O)-O-R₁₀-、-R₉-O-C(O)-O-R₁₀-、-R₉-O-C(O)-NR₁₈-R₁₀-(其中R₁₈是H或者取代或未取代的C1-C5烷基)、-R₉-CH(OH)-O-R₁₀-、R₉-CH(OR₁₂)-O-R₁₀-(其中R₁₂是H或者取代或未取代的C1-C5烷基)、-R₉-S-S-R₁₀-、-R₉-S-R₁₀-、-R₉-O-P(O)(OR₁₂)-O-R₁₀-(其中R₁₂是H或者取代或未取代的C1-C5烷基)、-R₉-C(O)-NR₁₈-R₁₀-(其中R₁₈是H或者取代或未取代的C1-C5烷基)或-R₉-[NR₁₈-C(R₁₃)(R₁₄)-C(O)]_c-R₁₀-(其中R₁₈是H或者取代或未取代的C1-C5烷基，R₁₃是H或C1-C5烷基，R₁₄是天然存在或非天然存在的氨基酸上的側(cè)鏈基團(tuán)，并且c是1-10)。

在一個(gè)實(shí)施例中，可水解部分的裂解速率由可釋放的可水解連接的性質(zhì)控制。在前述的每一個(gè)中，可釋放的可水解連接的可水解部分可以被裂解以釋放藥劑。在一個(gè)實(shí)施例中，可釋放的可水解連接的可水解部分在施用于受試者后在受試者的生理?xiàng)l件下被化學(xué)裂解。在一個(gè)實(shí)施例中，可釋放的可水解連接的可水解部分被在施用于受試者后在受試者的生理?xiàng)l件下天然存在或誘導(dǎo)存在于受試者中的物質(zhì)裂解。在一個(gè)實(shí)施例中，這種物質(zhì)是酶或多肽。在一個(gè)實(shí)施例中，可釋放的可水解連接的可水解部分被前述的組合裂解。

在一個(gè)實(shí)施例中，聚合物-ADC可以由以下通用結(jié)構(gòu)表示：

其中所述藥劑是本文所描述或本領(lǐng)域已知的任何藥劑，PM是本文所描述或本領(lǐng)域已知的任何提純部分，q是1至10的整數(shù)，b和d獨(dú)立地是1至30的整數(shù)，并且其余的變量如在當(dāng)前說(shuō)明書(shū)中所定義的。

在前述的一個(gè)實(shí)施例中，o是3-15，并且m和o的總和是1至50，并且n是1-1000或1-500。在某些實(shí)施例中，m是0。在另一個(gè)實(shí)施例中，o1、o2和m的和小于或等于50，o1是1至5的整數(shù)，o2是3至45的整數(shù)，m是1至50的整數(shù)，以及n是1至1000或1至500。

在一個(gè)實(shí)施例中，R₂₀是用于將識(shí)別部分與聚合物連接的連接基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施例中，R₂₀含有與識(shí)別部分上的結(jié)合殘基反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施例中，反應(yīng)性基團(tuán)具體地與識(shí)別部分上的化學(xué)計(jì)量結(jié)合殘基以1:1的比例反應(yīng)。在一個(gè)特定的方面，識(shí)別部分是抗體，例如但不限于單鏈抗體，化學(xué)計(jì)量結(jié)合殘基是如本文所描述的硒代半胱氨酸部分，并且反應(yīng)性基團(tuán)是馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。在一個(gè)特定的方面，識(shí)別部分是抗體，例如但不限于單鏈抗體，化學(xué)計(jì)量結(jié)合殘基是如本文所描述的硒代半胱氨酸部分，并且反應(yīng)性基團(tuán)是碘代乙酰亞胺基團(tuán)。在一個(gè)方面，R₂₀包含間隔物以提供識(shí)別部分和聚惡唑啉聚合物的分離。在一個(gè)方面，R₂₀可以通過(guò)使本發(fā)明的聚惡唑啉聚合物與終止親核藥劑反應(yīng)并且任選地使所述結(jié)構(gòu)進(jìn)一步進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而形成。

在一個(gè)特定的實(shí)施例中，R₂₀可以由以下結(jié)構(gòu)表示：

R₂₁-Z-R₂₂，其中

R₂₁選自由以下組成的群組：S、O或N；

Z是連接基團(tuán)；以及

R₂₂是含有識(shí)別部分的部分。

在一個(gè)實(shí)施例中，Z由-(CH₂)_r-表示，其中r是1至10。

在另一個(gè)實(shí)施例中，Z由-(CH₂)_r1-R₂₃-R₂₄-(CH₂)_r2-表示，其中R₂₃不存在、是-C(O)-或-N-R₂₅-，其中R₂₅是H或者取代或未取代的烷基，R₂₄不存在、是-O-或-N-R₂₆-，其中R₂₆是H或者取代或未取代的烷基，r1和r2各自獨(dú)立地是0至10的整數(shù)。

在前述的一個(gè)方面，R₂₃是-C(O)-。在一個(gè)方面，R₂₄是-O-或-NH-。在一個(gè)方面，r1是1至4的整數(shù)并且r2是0至4的整數(shù)。在一個(gè)方面，R₂₃是-C(O)-，R₂₄是-O-，r1是2并且r2是0。在一個(gè)方面，R₂₃是-C(O)-，R₂₄是-NH-，r1是2并且r2是2。

在前述的一個(gè)方面，Z由-(CH₂)_r1-R₂₃-R₂₄-(CH2)_r2-表示，R₂₂是-NH-C(O)-CH₂-S-Ab、-NH-C(O)-CH₂-Se-Ab、其中Ab表示抗體。

在另一個(gè)實(shí)施例中，Z由-(CH₂)_r1-R₂₃-R₂₄-(CH₂)_r2-R₂₇-R₂₈-(CH₂)_r3-表示，其中R₂₃不存在、是C＝O或N-R₂₅，其中R₂₅是H或者取代或未取代的烷基，R₂₄不存在、是O或N-R₂₆，其中R₂₆是H或者取代或未取代的烷基，R₂₇不存在、是N-R₂₉，其中R₂₉是H或者取代或未取代的烷基或-C(O)-，R₂₈不存在、是-C(O)-或N-R₃₀，其中R₃₀是H或者取代或未取代的烷基，并且r1、r2和r3各自獨(dú)立地是0至10的整數(shù)。

在前述的一個(gè)方面，R₂₃是-C(O)-。在一個(gè)方面，R₂₄是-O-或-NH-。在一個(gè)方面，r1是1至4的整數(shù)，r2是0至4的整數(shù)，并且r3是0至4的整數(shù)。

在一個(gè)方面，R₂₃是-C(O)-，R₂₄是-NH-，R₂₇是-NH-，以及R₂₈是-C(O)-，r1是2，r2是2，并且r3是1。

在前述的一個(gè)方面，其中Z由-(CH₂)_r1R₂₃-R₂₄-(CH₂)_r2-R₂₇-R₂₈-(CH₂)_r3-表示，R₂₂是S-Ab或Se-Ab，其中Ab表示抗體。

在一個(gè)方面，R₂₂含有用于將識(shí)別部分與聚合物連接的反應(yīng)性基團(tuán)中的所有或一部分。代表性的連接基團(tuán)包括但不限于與識(shí)別部分連接的碘乙酰胺、溴乙酰胺、氯乙酰胺、馬來(lái)酰亞胺或丙烯酰胺基團(tuán)。在一個(gè)方面，R₂₂是與識(shí)別部分連接的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)或碘乙酰胺基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施例中，R₂₂沒(méi)有這樣的部分。

在進(jìn)一步的方面，識(shí)別部分是抗體，并且結(jié)合殘基是半胱氨酸殘基。在進(jìn)一步的方面，識(shí)別部分是sc-抗體，并且結(jié)合殘基是半胱氨酸殘基。

在進(jìn)一步的方面，識(shí)別部分是抗體，并且結(jié)合殘基是硒代半胱氨酸殘基，其中聚惡唑啉聚合物和抗體以1:1的比例結(jié)合在硒代半胱氨酸殘基處。

在進(jìn)一步的方面，識(shí)別部分是sc-抗體，并且結(jié)合殘基是硒代半胱氨酸殘基，其中聚惡唑啉聚合物和sc-抗體以1:1的比例結(jié)合在硒代半胱氨酸殘基處。

在這種方面，R₂₂基團(tuán)可以由以下結(jié)構(gòu)表示。盡管顯示了代表性的反應(yīng)性基團(tuán)和結(jié)合殘基的結(jié)構(gòu)，但是本申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容不應(yīng)限于所公開(kāi)的實(shí)例。當(dāng)馬來(lái)酰亞胺是用于將抗體與聚合物連接的反應(yīng)性基團(tuán)時(shí)，R₂₂可以具有以下結(jié)構(gòu)：

當(dāng)?shù)庖阴０肥怯糜趯⒖贵w與聚合物連接的反應(yīng)性基團(tuán)時(shí)，R₂₂可以具有以下結(jié)構(gòu)：

因此，代表性的R₂₀基團(tuán)包括但不限于(應(yīng)當(dāng)理解，以下結(jié)構(gòu)中的硒(Se)可以被硫(S)或其它結(jié)合殘基置換)：

以及

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了以下結(jié)合物，其中o1、o2的和小于或等于50，o1是1至5的整數(shù)，o2是1至45的整數(shù)，m是1至50的整數(shù)，a表示無(wú)規(guī)或嵌段共聚物，藥劑表示所述藥劑，BR表示抗體上的結(jié)合殘基，Ab表示抗體，以及PM表示提純部分：

以及

在一個(gè)實(shí)施例中，Ab表示sc-抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，Ab表示IgG、IgM、IgA、IgE或IgD抗體。Ab項(xiàng)可以表示本文所描述或本領(lǐng)域已知的抗體中的任何一種。在一個(gè)實(shí)施例中，BR表示硒代半胱氨酸。在一個(gè)實(shí)施例中，BR表示硫。BR項(xiàng)可以表示可以存在于所描述的抗體上的任何結(jié)合殘基。在一個(gè)實(shí)施例中，藥劑是秋水仙堿(例如但不限于脫乙?；锼蓧A)或奧瑞斯他汀(auristatin)(例如但不限于單甲基奧瑞斯他汀E、單甲基奧瑞斯他汀F或去甲基奧瑞斯他汀F)。所述藥劑可以是本文所描述或本領(lǐng)域已知的任何藥劑。

聚惡唑啉聚合物的合成方法

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的聚合物通過(guò)含有官能團(tuán)的適當(dāng)?shù)?-取代-2-惡唑啉的共聚而制備。例如，除了簡(jiǎn)單的2-烷基-2-惡唑啉外，可以使用以下惡唑啉單體合成含有炔基和縮醛基的水溶性共聚物：

所述聚合由親電子藥劑(例如但不限于三氟甲磺酸甲酯、甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸或三氟甲磺酸)引發(fā)。所述共聚可以通過(guò)如本文所討論的親核藥劑終止。如果需要末端官能度，可以使用官能化的終止劑，例如但不限于甲基硫代乙酸酯。對(duì)于非反應(yīng)性終止末端，可以使用親核藥劑，例如烷基硫醇。類似地，終止羥基對(duì)許多藥劑也不具有反應(yīng)性，并且因此可用于本申請(qǐng)中。用于聚合的優(yōu)選溶劑是氯苯或乙腈。優(yōu)選的溫度范圍為約40℃至約120℃。聚合所需的時(shí)間取決于溫度、所需的分子量和溶劑，并且范圍可以為約1小時(shí)至約100小時(shí)。在某些實(shí)施例中，期望將聚合反應(yīng)限制在基本上完成聚合反應(yīng)所需的時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施例中，使用MALDI和/或GPC監(jiān)測(cè)聚合反應(yīng)的進(jìn)展。

聚合可以以幾種方式進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，可以將適當(dāng)?shù)膼哼蜻M分的混合物與引發(fā)劑在優(yōu)選的溶劑中在攪拌下反應(yīng)。當(dāng)所述惡唑啉組分中的一種或多種對(duì)彼此較不具有反應(yīng)性時(shí)，當(dāng)惡唑啉組分與彼此或與嵌段共聚物具有相同的反應(yīng)性時(shí)，該反應(yīng)產(chǎn)生無(wú)規(guī)共聚物。在一個(gè)替代的實(shí)施例中，聚合物也可以通過(guò)使用僅一種惡唑啉組分在優(yōu)選的溶劑中用適當(dāng)?shù)囊l(fā)劑引發(fā)聚合而以嵌段形式合成?？梢岳肕ALDI或GPC監(jiān)測(cè)反應(yīng)以確定反應(yīng)何時(shí)基本上完成。當(dāng)?shù)谝磺抖蔚木酆贤瓿蓵r(shí)，加入第二惡唑啉組分以在聚合物鏈的末端用初始活性陽(yáng)離子重新引發(fā)聚合；聚合反應(yīng)的監(jiān)測(cè)可以如所描述的那樣進(jìn)行。所述溶劑可以與第一聚合反應(yīng)中相同或不同；反應(yīng)溫度和其它變量也可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。在第二嵌段的聚合完成時(shí)，加入第三惡唑啉組分以在聚合物鏈的末端用活性陽(yáng)離子重新引發(fā)聚合；聚合反應(yīng)的監(jiān)測(cè)可以如所描述的那樣進(jìn)行。所述溶劑可以與第一或第二聚合反應(yīng)中相同或不同；反應(yīng)溫度和其它變量也可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)?shù)谌酆喜襟E完成時(shí)，可以通過(guò)加入終止劑來(lái)終止聚合。惡唑啉組分可以含有官能團(tuán)，或者可以沒(méi)有官能團(tuán)。連續(xù)聚合可以以任何順序進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施例中，也可以進(jìn)行兩種惡唑啉單體的無(wú)規(guī)共聚，隨后繼續(xù)第三嵌段的聚合，以制備具有無(wú)規(guī)和嵌段構(gòu)型的聚合物。在一個(gè)實(shí)施例中，所述惡唑啉單體中的一種沒(méi)有官能團(tuán)。

一旦所需的聚合過(guò)程完成，聚合物例如在乙醚中沉淀數(shù)次并且在真空下干燥。聚合物可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如但不限于MALDI、NMR和GPC)進(jìn)一步表征。

對(duì)聚乙二醇有效已經(jīng)表明，在靶分子的修飾中經(jīng)常需要利用分子量(MW)為20,000Da或更高且分子量分布或多分散性(PD)小于1.1的聚合物。已經(jīng)有大量的工作表明，針對(duì)POZ鏈，利用常規(guī)技術(shù)不能實(shí)現(xiàn)在上述范圍內(nèi)的MW和PD。如本領(lǐng)域已知的，PD值將隨MW變化；通常，隨著分子量的增加，PD值也增加。通?？吹?，隨著生長(zhǎng)POZ鏈的分子量達(dá)到大約5,000Da，多分散性明顯增加。副反應(yīng)(包括但不限于鏈轉(zhuǎn)移)開(kāi)始在重要性方面增長(zhǎng)。當(dāng)用于產(chǎn)生高M(jìn)W的POZ鏈時(shí)，上述現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)生具有不可接受的PD值的POZ衍生物。本發(fā)明的聚惡唑啉衍生物可以使用聚惡唑啉鏈產(chǎn)生，所述聚惡唑啉鏈?zhǔn)褂眯碌姆椒ㄖ圃?，所述新的方法?dǎo)致具有低PD值和由不想要的副反應(yīng)(例如但不限于鏈轉(zhuǎn)移)產(chǎn)生的減少量的雜質(zhì)的聚惡唑啉衍生物。在一個(gè)實(shí)施例中，制造聚惡唑啉鏈以使不想要的副反應(yīng)(例如但不限于鏈轉(zhuǎn)移)最小化，使得產(chǎn)生具有低PD值、提高純度的POZ衍生物。因此，本發(fā)明的POZ衍生物可以被產(chǎn)生具有適合用于藥物應(yīng)用的提高純度和低PD值。在PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2008/078159中描述了此類方法，所述文獻(xiàn)通過(guò)引入并入本文用于此種教導(dǎo)。

在一個(gè)實(shí)施例中，使用點(diǎn)擊化學(xué)將藥劑與聚惡唑啉聚合物連接。點(diǎn)擊化學(xué)方法涉及炔基與疊氮基之間的反應(yīng)。在一個(gè)方面，點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)涉及藥劑上的疊氮基酯和聚惡唑啉聚合物上的炔的反應(yīng)。在該方面的一個(gè)特定的實(shí)施例中，疊氮基酯基團(tuán)通過(guò)與藥劑上的化學(xué)基團(tuán)(例如但不限于羥基)進(jìn)行合適的化學(xué)反應(yīng)而形成。示范性的反應(yīng)將是通過(guò)用疊氮化鈉取代來(lái)自鹵酸的鹵化物以形成疊氮酸，隨后用所述藥劑(在此示例為羅替戈汀)上的羥基酯化疊氮基酸來(lái)制備疊氮基酯。

然后將疊氮基酯與存在于聚惡唑啉聚合物上的炔官能團(tuán)連接。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，炔官能團(tuán)是存在于聚惡唑啉聚合物的側(cè)位的乙炔官能團(tuán)。

雖然可以使用上述方法，但是可以使用其它方法形成可水解部分。例如，還可以通過(guò)在聚惡唑啉聚合物上產(chǎn)生疊氮官能團(tuán)(例如在聚惡唑啉聚合物上的側(cè)基)、在藥劑上產(chǎn)生炔基(例如乙炔酯)，以及使疊氮基和炔基反應(yīng)以形成包含可水解部分的可釋放的可水解連接(在這種情況下為酯鍵)來(lái)形成含有酯可水解部分的連接。

在另一種方法中，可以在聚惡唑啉聚合物上產(chǎn)生羧酸基團(tuán)，例如在聚惡唑啉聚合物上產(chǎn)生側(cè)基，并且通過(guò)直接酯化該藥劑上的醇或酚基使羧酸基團(tuán)反應(yīng)來(lái)形成含有可水解部分的可釋放的可水解連接(在這種情況下為酯鍵)。在一個(gè)實(shí)施例中，在聚惡唑啉聚合物上的羧酸基團(tuán)通過(guò)在聚合反應(yīng)中包括羧化單體而產(chǎn)生在聚惡唑啉聚合物的側(cè)位處。

在本發(fā)明的聚惡唑啉聚合物結(jié)合物的制備中，聚惡唑啉聚合物上的藥劑數(shù)量由存在于聚惡唑啉聚合物上的反應(yīng)性基團(tuán)的數(shù)量控制；在一個(gè)實(shí)施例中，反應(yīng)性基團(tuán)存在于聚惡唑啉聚合物上的側(cè)位中。對(duì)于在側(cè)位的反應(yīng)性基團(tuán)，存在于聚合物上的反應(yīng)性基團(tuán)的數(shù)量由具有能夠與藥劑或連接基團(tuán)形成連接的官能化側(cè)鏈(例如乙炔)的單體單元(例如單體惡唑啉)相對(duì)于在聚合中使用的具有非活性側(cè)鏈(例如烷基)的單體單元的比例控制。另外，對(duì)于具有官能化側(cè)鏈的單體單元的給定比例，可以控制聚合物長(zhǎng)度，提供對(duì)加載到給定聚合物結(jié)合物上的藥劑的數(shù)量的進(jìn)一步控制。因此，可以控制附著于特定聚合物結(jié)合物的藥劑的數(shù)量。如上所述，連接基團(tuán)的性質(zhì)、聚合物的尺寸和施用途徑允許控制藥劑從聚合物的釋放動(dòng)力學(xué)。

識(shí)別部分

本發(fā)明的ADC包含識(shí)別部分。如本發(fā)明中所使用的，術(shù)語(yǔ)“識(shí)別部分”是指識(shí)別并結(jié)合特異性表位/抗原/細(xì)胞表面標(biāo)志物的分子，包括但不限于經(jīng)歷內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中所述蛋白質(zhì)可以與催化附著的藥劑的釋放的核內(nèi)體融合。示范性的識(shí)別部分包括但不限于抗體、抗體的片段、單鏈抗體、多肽或肽模擬物等。除了將ADC靶向特定細(xì)胞、組織或位置之外，識(shí)別部分還可以具有某些治療效果(例如針對(duì)靶細(xì)胞或途徑的抗增殖(即，細(xì)胞抑制和/或細(xì)胞毒性)活性)。識(shí)別部分包含或可以被工程化以包含至少一個(gè)用于與ADC的聚合物部分連接的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)。在一個(gè)方面，反應(yīng)性基團(tuán)是硒代半胱氨酸部分。

在一個(gè)特定的實(shí)施例中，識(shí)別部分是抗體。

如本說(shuō)明書(shū)中所使用的，術(shù)語(yǔ)抗體是指任何含多肽鏈的分子結(jié)構(gòu)，該分子結(jié)構(gòu)具有結(jié)合并識(shí)別靶細(xì)胞上的抗原/表位的特定形狀，其中一個(gè)或多個(gè)非共價(jià)結(jié)合相互作用穩(wěn)定含多肽鏈的分子結(jié)構(gòu)與抗原/表位之間的復(fù)合。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體分子是免疫球蛋白。因此，術(shù)語(yǔ)抗體包括來(lái)自所有來(lái)源(例如，人、嚙齒類動(dòng)物、兔、牛、羊、豬、狗、其它哺乳動(dòng)物等)的所有類型的免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)?？贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體；在一個(gè)方面，抗體是單克隆抗體。產(chǎn)生抗體和產(chǎn)生單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。抗體或抗原結(jié)合片段也可以通過(guò)遺傳工程產(chǎn)生。

在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體被修飾以減少誘導(dǎo)受試者(例如人受試者)中免疫應(yīng)答的可能性。因此，術(shù)語(yǔ)抗體包括人源化、嵌合或異種人抗體，當(dāng)施用于人時(shí)它們產(chǎn)生較少的免疫應(yīng)答。可選地，可以產(chǎn)生含有人可變區(qū)的單鏈抗體(sc-Fv，如下所述)。因此，術(shù)語(yǔ)抗體可以包括單鏈抗體(本文中也稱為sc-抗體或sc-Fv片段)。

除了整個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)之外，可以使用包含抗原/表位結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白片段。因此，術(shù)語(yǔ)抗體包括免疫球蛋白片段。此類片段包括但不限于Fab'、F(ab')₂或其它片段。此類抗體片段可以通過(guò)胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其它蛋白酶裂解從完整免疫球蛋白產(chǎn)生。也可以利用重組免疫球蛋白技術(shù)設(shè)計(jì)此類片段。例如，用于本發(fā)明中的sc-抗體“Fv”免疫球蛋白可以通過(guò)經(jīng)由肽連接基團(tuán)(例如，不形成α螺旋或β折疊基序的聚甘氨酸或另一種序列)將可變輕鏈區(qū)與可變重鏈區(qū)連接而制備。

術(shù)語(yǔ)抗體還包括功能等同物。術(shù)語(yǔ)“功能等同物”包括具有同源序列的抗體、嵌合抗體、人工抗體和修飾抗體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，在稱為“抗體片段”的分子組和稱為“功能等同物”的組中存在重疊。產(chǎn)生功能等同物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。人工抗體包括scFv片段、雙抗體、三抗體、四抗體和分子識(shí)別單位(mru)，它們中的每一個(gè)具有抗原結(jié)合能力。在單鏈抗體中，抗體的V_H和VL結(jié)構(gòu)域通過(guò)柔性肽連接。通常，該連接基團(tuán)肽約為15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)。如果連接基團(tuán)較小，例如5個(gè)氨基酸，則形成為二價(jià)scFv二聚體的雙抗體。如果連接基團(tuán)減少到少于三個(gè)氨基酸殘基，則形成被稱為三抗體和四抗體的三聚體和四聚體結(jié)構(gòu)。抗體的最小結(jié)合單位是CDR，通常是重鏈的CDR2，其具有足夠的特異性識(shí)別和結(jié)合以使其可以單獨(dú)使用。這樣的片段稱為mru。幾個(gè)這樣的mru可以利用短連接基團(tuán)肽連接在一起，因此形成具有比單個(gè)mru更高親合力的人工結(jié)合蛋白。

功能等同物還包括修飾抗體，包括通過(guò)將任何類型的分子與抗體共價(jià)連接而修飾的抗體。例如，修飾抗體包括通過(guò)由已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)、蛋白水解裂解、與細(xì)胞配體或其它蛋白質(zhì)的連接糖基化，乙?；?、磷酸化、酰胺化、衍生化而修飾的抗體。這些修飾可以通過(guò)已知技術(shù)(包括但不限于特異性化學(xué)裂解、乙?；图柞；?進(jìn)行。

功能等同物可以通過(guò)使在不同框架內(nèi)不同鏈上的不同CDR互換來(lái)產(chǎn)生。因此，例如，針對(duì)給定的一組CDR，通過(guò)取代不同的重鏈，不同類別的抗體是可能的，由此可以產(chǎn)生例如1gG1-4、IgM、IgA1-2、IgD、IgE抗體類型和同種型。類似地，在本發(fā)明范圍內(nèi)的人工抗體可以通過(guò)在完全合成的框架內(nèi)嵌入給定的一組CDR來(lái)產(chǎn)生?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種方法，通過(guò)在特定一組CDR側(cè)翼的可變和/或恒定區(qū)序列內(nèi)的突變、刪除和/或插入容易地產(chǎn)生功能等同物。對(duì)于表位識(shí)別和抗體結(jié)合，CDR是最重要的。然而，可以對(duì)包含CDR的殘基進(jìn)行改變，而不干擾抗體識(shí)別和結(jié)合其同源表位的能力。例如，可以進(jìn)行不影響表位識(shí)別但增加抗體對(duì)表位的結(jié)合親和力的改變。因此，同樣包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是前述的改進(jìn)形式，優(yōu)選具有增加的親和力?；谝患?jí)抗體序列的知識(shí)，基于其性質(zhì)(例如結(jié)合和表達(dá)水平)，幾個(gè)研究已經(jīng)調(diào)查了在抗體序列中的多個(gè)位置處引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變的效果(Yang，W.P.等人，1995，J.Mol.Biol.，254：392-403；Rader，C.等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：8910-8915；Vaughan，T.J.等人，1998，《自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)》，16：535-539)。在這些研究中，通過(guò)使用例如寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變、盒式誘變、易錯(cuò)PCR、DNA改組或者大腸桿菌的增變株等方法改變CDR1、CDR2、CDR3或框架區(qū)中重鏈和輕鏈基因的序列，產(chǎn)生了一級(jí)抗體的等同物(Vaughan，T.J.等人，1998，《自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)》，16：535-539；Adey，N.B.等人，1996，第16章，第277-291頁(yè)，在“肽和蛋白質(zhì)的噬菌體展示(Phage Display of Peptides and Proteins)”中，Eds.Kay，B.K.等人，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press))。這些改變一級(jí)抗體序列的方法導(dǎo)致抗體親和力改善(Gram，H.等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：3576-3580；Boder，E.T.等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：10701-10705；Davies，J.和Riechmann，L，1996，《免疫技術(shù)(Immunotechnolgy)》，2：169-179；Thompson，J.等人，1996，J.Mol.Biol，256：77-88；Short，M.K.等人，2002，《生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)》，277：16365-16370；Furukawa，K.等人，2001，《生物化學(xué)雜志》，276：27622-27628)。

在一個(gè)實(shí)施例中，此類氨基酸取代是這樣的氨基酸取代：(1)降低對(duì)蛋白水解的易感性、(2)降低對(duì)氧化的易感性、(3)改變形成蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合親和力，以及(4)賦予或修飾此類抗體的其它物理化學(xué)或功能性質(zhì)。此類功能等同物可以包括來(lái)自天然存在的肽序列的序列的各種突變。例如，可以在天然存在的序列中(優(yōu)選地在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外的多肽部分中)進(jìn)行單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代(優(yōu)選地保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代實(shí)質(zhì)上不應(yīng)改變親本序列的結(jié)構(gòu)特征(例如，替代氨基酸不應(yīng)傾向于破壞親本序列中出現(xiàn)的螺旋，或破壞表征親本序列的其它類型的二級(jí)結(jié)構(gòu))。在《蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)和分子原理(Proteins，Structures and Molecular Principles)》(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))中、《蛋白結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介(Introduction to Protein Structure)》(C.Branden和J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))，以及Thornton等人，1991，《自然(Nature)》，354：105中描述了本領(lǐng)域公認(rèn)的多肽二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)例，所述文獻(xiàn)各自通過(guò)引用并入本文。

此外，前述抗體中的任何一種可以被修飾以含有一個(gè)或多個(gè)非經(jīng)典氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，非經(jīng)典氨基酸是硒代半胱氨酸殘基(例如，如在《生物化學(xué)(Biochemistry)》.2009年12月22日；48(50)：12047-57中所描述的，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文用于此種教導(dǎo))。在一個(gè)實(shí)施例中，將非經(jīng)典氨基酸置于抗體的C-末端處，以使與抗原/表位結(jié)合的干擾最小化。

在一個(gè)特定的實(shí)施例中，識(shí)別部分是抗體。在進(jìn)一步特定的實(shí)施例中，識(shí)別部分是單鏈抗體?？贵w，特別是單克隆抗體和sc-抗體在預(yù)防、診斷和治療人類疾病中的使用正在增加。超過(guò)20種單克隆抗體由食品和藥物管理局批準(zhǔn)，并且更多的單克隆抗體處于臨床發(fā)展的各個(gè)階段。另外，還正在探索ADC以開(kāi)發(fā)抗體組分的特異性和化學(xué)組分/藥劑(例如小分子或含藥劑的聚合物)的作用。例如，盡管抗體分子提供特異性和親和力，但是小分子提供成像能力或細(xì)胞毒性。

在一個(gè)實(shí)施例中，無(wú)論抗體是單鏈抗體還是其它形式，識(shí)別部分與受體酪氨酸激酶樣孤兒受體(ROR)結(jié)合(綜述于Front.Oncol.，2012年4月18日|doi：10.3389/fonc.2012.00034)。已知受體酪氨酸激酶(RTK)是正常細(xì)胞過(guò)程(例如分化、遷移、增殖和存活)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，但是它們?cè)谠S多類型的人類癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中也具有關(guān)鍵作用。因此，RTK及其配體已成為用于癌癥的治療性干預(yù)的有吸引力的分子靶。這些受體通常在發(fā)育期間以高水平表達(dá)，在骨骼和神經(jīng)器官發(fā)生中起關(guān)鍵作用，但隨后在成體組織中被抑制。RTK的ROR族由兩個(gè)進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì)(ROR1和ROR2)和將ROR1和ROR2鑒定為在各種癌癥中過(guò)表達(dá)的簽名基因之一的基因表達(dá)譜組成。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ROR1在多種造血癌癥(包括B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病，B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病，以及套細(xì)胞白血病)中過(guò)表達(dá)，同時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ROR2在多種肉瘤和癌中過(guò)表達(dá)。

ROR2是在正常骨和軟骨發(fā)育過(guò)程中通過(guò)其與Wnt5A糖蛋白的締合而被非規(guī)范Wnt信號(hào)傳導(dǎo)激活的膜鍵合的RTK。需要ROR2表達(dá)以在哺乳動(dòng)物的腭發(fā)育期間介導(dǎo)細(xì)胞的遷移，并且已經(jīng)顯示ROR2基因中的突變引起例如短指癥B型和常染色體隱性Robinow綜合征的疾病。已經(jīng)報(bào)道ROR2在某些細(xì)胞系中具有促腫瘤發(fā)生作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ROR2在多種肉瘤和癌中過(guò)表達(dá)。

癌是最常見(jiàn)類型的人類癌癥，其由已經(jīng)形成上皮細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)外觀、組織結(jié)構(gòu)或分子特征的細(xì)胞引起。癌是相當(dāng)異質(zhì)性的實(shí)體，反映了各種致癌啟動(dòng)子的廣泛的種類、強(qiáng)度和效力。亞型包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、間變性癌、大細(xì)胞和小細(xì)胞癌及其混合。癌也根據(jù)其發(fā)生的部位分類，例如肺癌、乳腺導(dǎo)管癌、前列腺腺癌、結(jié)腸和直腸的腺癌或鱗狀細(xì)胞癌等。肉瘤是超過(guò)60種腫瘤類型的異質(zhì)組，其源自間充質(zhì)細(xì)胞，并且占所有人類惡性腫瘤的大約1％。大多數(shù)肉瘤顯示出局部侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的傾向。

硒代半胱氨酸結(jié)合

將抗體與化合物結(jié)合的許多常規(guī)方法是已知的。例如，在與藥劑上的適當(dāng)官能團(tuán)的結(jié)合反應(yīng)中可以使用賴氨酸(Lys)殘基的ε-氨基或半胱氨酸(Cys)殘基的硫醇基。然而，使用這些方法，所產(chǎn)生的ADC不是單一種類的分子，而是具有一系列抗體/藥劑化學(xué)計(jì)量和附著點(diǎn)的分子的混合物。此外，所產(chǎn)生的ADC的特征在于基本的批次間可變性。這種結(jié)合的隨機(jī)模型在許多情況下可能損害抗原/抗體結(jié)合反應(yīng)。化學(xué)組分/藥劑與抗體的位點(diǎn)特異性結(jié)合提供了限定的化學(xué)計(jì)量、降低的批次可變性和保持抗原/抗體結(jié)合反應(yīng)的可能性。位點(diǎn)特異性結(jié)合的目的是向抗體中引入獨(dú)特的化學(xué)反應(yīng)性，而不顯著影響抗體分子的結(jié)構(gòu)和/或功能。

硒代半胱氨酸形式近來(lái)已經(jīng)用于通過(guò)在抗體與化學(xué)組分之間提供工程界面來(lái)提供化學(xué)組分與抗體的位點(diǎn)特異性結(jié)合。硒代半胱氨酸提供化學(xué)組分在所需位置的靶向放置，并且提供1:1的化學(xué)計(jì)量。該過(guò)程已由Hofer及其同事描述(PNAS，105(34)，12451-12456，2008；《生物化學(xué)(Biochemistry)》，48(50)，12047-12057，2009；前述文獻(xiàn)中的每一篇通過(guò)引用并入本文用于此類教導(dǎo))。硒代半胱氨酸界面技術(shù)已經(jīng)與完整抗體分子和抗體片段一起使用，而不影響抗體或抗體片段的生物學(xué)性質(zhì)。與其它位點(diǎn)特異性抗體結(jié)合方法相比，硒代半胱氨酸界面方法：(a)涉及抗體結(jié)構(gòu)的微小修飾，例如在C-末端，其不干擾結(jié)構(gòu)或功能；(b)利用簡(jiǎn)單和有效的偶聯(lián)化學(xué)；以及(C)導(dǎo)致抗體和化學(xué)組分的1:1化學(xué)計(jì)量。

藥劑

藥劑可以是用于治療疾病或病癥或診斷疾病或病癥的任何藥劑。在某些實(shí)施例中，藥劑是診斷劑或治療劑。在某些實(shí)施例中，治療劑是有機(jī)小分子。此外，藥劑可以是具有治療或診斷應(yīng)用的任何分子，其中藥劑能夠與本發(fā)明的聚合物(例如但不限于POZ聚合物)上的官能團(tuán)或者與本發(fā)明的聚合物連接的連接基團(tuán)形成連接。

用于本發(fā)明的藥劑可以包括任何已知的藥劑。在一個(gè)實(shí)施例中，藥劑可用于治療癌癥。在一個(gè)實(shí)施例中，藥劑是細(xì)胞毒素劑。在一個(gè)實(shí)施例中，藥劑是微管抑制劑、DNA-損傷劑或聚合酶II抑制劑。微管抑制劑結(jié)合微管蛋白、使微管不穩(wěn)定，并且引起G2/M階段細(xì)胞周期停滯。奧瑞斯他汀和美登木素生物堿類美登素(maytansinoid)是兩類微管抑制劑。DNA-損傷劑包括蒽環(huán)霉素、卡奇霉素(calicheamicin)、多卡霉素(duocarmycin)和吡咯并苯二氮呯類(PBD)。所有這些藥物通過(guò)結(jié)合DNA的小溝和引起DNA斷裂、烷基化或交聯(lián)而起作用。

可用于本發(fā)明的結(jié)合物中的藥劑類別包括但不限于奧瑞斯他汀(例如但不限于單甲基奧瑞斯他汀E、單甲基奧瑞斯他汀F、去甲基奧瑞斯他汀F)、蒽環(huán)霉素(例如但不限于柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、戊柔比星和米托蒽醌)、加利車卡奇霉素(例如但不限于加利車卡奇霉素和N-乙?；?γ加利車卡奇霉素1,2-二甲基肼二氯化物)、美登木素生物堿類美登素(例如但不限于DM1、DM4和安絲菌素)、吡咯并苯并二氮雜苯并二氮呯(例如但不限于赤霉素、芝加霉素、DC-81、甲基氨茴霉素、新斯拉霉素A和B、波羅斯拉霉素、prothracarcin、西班米星(DC-102)、西伯利亞霉素和托馬霉素)、吡咯并苯并二氮雜苯并二氮呯類的二聚體(例如但不限于SJG-136、SG 2285、DRG-16和ELB-21)、秋水仙堿類(例如但不限于秋水仙堿、脫乙?；锼蓧A)、多拉司他汀海兔毒素類(例如但不限于多拉司他汀海兔毒素10、15和16)、微管蛋白類(例如但不限于微管蛋白、A、B、D和M)、美登醇、多卡霉素類(例如但不限于多卡霉素A、B1、B2、C1、C2、D、SA和CC-1065和阿多來(lái)新、比折來(lái)新和卡折來(lái)新)，奈莫柔比星和其它多柔比星類似物，以及隱藻素類(例如但不限于隱藻素8、24、52、55、296和309)、埃坡霉素類(例如但不限于埃坡霉素A、B、C、D、E、F、BMS 247550和BMS 310705)和番紅菌素(例如但不限于番紅菌素A和B)。前述的衍生物和類似物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

藥用組合物

本發(fā)明的聚合物結(jié)合物(包括聚合物-ADC)可以被配制用于人和獸醫(yī)用途，并且可以包含聚合物-ADC和藥學(xué)上可接受的載體。通常，除了一種或多種無(wú)活性劑，例如無(wú)菌的生物相容性載體(包括但不限于無(wú)菌水、鹽水、緩沖鹽水或葡萄糖溶液)，藥物組合物將包括本發(fā)明的聚合物-ADC。藥物組合物可以單獨(dú)施用或與其它治療方案(包括其它化學(xué)治療化合物、激素、疫苗和/或放射治療)組合施用?！芭c……組合”并不意味著額外的方案必須同時(shí)施用或被配制用于一起遞送，盡管這些遞送方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通常，每一種將以一定劑量和根據(jù)為該方案確定的時(shí)間表施用。另外，本發(fā)明包括與可以改善生物利用度、減少或改變代謝、抑制排泄或改變體內(nèi)分布的藥劑組合遞送本發(fā)明的聚合物-ADC?？蛇x地或另外，本發(fā)明的聚合物-ADC可以與一種或多種解決所治療的疾病或病癥的癥狀或病因或患者所患的任何其它疾病的其它化合物一起施用。盡管本發(fā)明的藥物組合物可以用于治療有需要的任何受試者(例如，任何動(dòng)物)，但是它們最優(yōu)選用于人的治療。

本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)多種途徑(包括口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、心室內(nèi)、經(jīng)皮、直腸、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(如通過(guò)粉末、軟膏或滴劑)、口腔，或作為口或鼻噴霧劑或氣霧劑)施用于人和其它動(dòng)物。通常，最適當(dāng)?shù)氖┯猛緩綄⑷Q于多種因素，包括化合物的性質(zhì)(例如，其在胃腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性)、患者的狀況(例如，患者是否能夠忍受口服施用)。目前，靜脈內(nèi)途徑最常用于遞送本發(fā)明的聚合物-ADC。然而，本發(fā)明涵蓋通過(guò)考慮藥物遞送科學(xué)中的可能進(jìn)展的任何適當(dāng)途徑遞送本發(fā)明的聚合物-ADC。

治療方法

在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的聚合物-結(jié)合物可以靶向特定的細(xì)胞或組織，例如癌細(xì)胞或腫瘤塊。在該實(shí)施例的一個(gè)方面，聚合物-ADC可以用于靶向表達(dá)抗原(例如但不限于細(xì)胞表面受體)的特定細(xì)胞或組織，所述抗原能夠被附著于聚合物的抗體結(jié)合。

在一個(gè)實(shí)施例中，公開(kāi)了一種治療疾病狀態(tài)或病癥的方法。此種方法包含向受試者施用一定量的本發(fā)明的聚合物結(jié)合物(包括聚合物-ADC結(jié)合物)的步驟，所述聚合物結(jié)合物結(jié)合靶細(xì)胞上的選定抗原并將藥劑遞送至細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述藥劑是細(xì)胞毒素劑。在一個(gè)實(shí)施例中，所述藥劑是微管抑制劑、DNA-損傷劑或聚合酶II抑制劑。

提供了用于抑制表達(dá)由本發(fā)明的聚合物結(jié)合物上的抗體識(shí)別的抗原的細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法。此種方法包含向受試者施用一定量的本發(fā)明的聚合物結(jié)合物(包括聚合物-ADC結(jié)合物)的步驟，所述聚合物結(jié)合物結(jié)合靶細(xì)胞上的選定抗原并將藥劑遞送至細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述藥劑是細(xì)胞毒素劑。在一個(gè)實(shí)施例中，所述藥劑是微管抑制劑、DNA-損傷劑或聚合酶II抑制劑。抑制所選細(xì)胞群體生長(zhǎng)的方法可以在體外、體內(nèi)或離體進(jìn)行。如本文所使用的，“抑制生長(zhǎng)”是指在短時(shí)間或長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)減緩細(xì)胞的生長(zhǎng)、降低細(xì)胞生存力、引起細(xì)胞死亡、裂解細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

因此，本發(fā)明包括被描述為藥物的抗聚合物-ADC結(jié)合物的使用。

在所描述的方法中，聚合物結(jié)合物可以單獨(dú)施用或作為如本文所描述的藥物組合物的一部分施用。在一個(gè)實(shí)施例中，確定受試者需要這種治療。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，聚合物結(jié)合物以治療有效量施用。在本文所公開(kāi)的方法中，受試者可以是哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施例中，受試者是人。

在一個(gè)實(shí)施例中，疾病狀態(tài)是癌癥。本發(fā)明的聚合物-ADC可用于治療或預(yù)防多種癌癥，包括(但不限于)以下各項(xiàng)：癌，包括膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宮頸癌、甲狀腺癌和皮膚癌；包括鱗狀細(xì)胞癌；造血淋巴系腫瘤，包括白血病、急性淋巴細(xì)菌性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤；髓系的造血腫瘤，包括急性和慢性髓細(xì)胞性白血病和早幼粒細(xì)胞性白血病；間質(zhì)源性腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；其它腫瘤，包括黑色素瘤、精原細(xì)胞瘤、畸形瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤；中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)鞘瘤；間質(zhì)源性腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤；以及其它腫瘤，包括黑色素瘤、著色性干皮病、角化棘皮瘤、精原細(xì)胞瘤、甲狀腺濾泡狀癌和畸胎癌。待治療的癌癥的性質(zhì)可以通過(guò)與聚合物結(jié)合物結(jié)合的抗體的性質(zhì)來(lái)確定。

提供了通過(guò)向有需要的患者施用本發(fā)明的聚合物-ADC來(lái)抑制ROR1和/或ROR2陽(yáng)性細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述本發(fā)明的聚合物-ADC與ROR1和/或ROR2結(jié)合并且將藥劑遞送至ROR1和/或ROR2陽(yáng)性細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述藥劑是細(xì)胞毒素劑。抑制所選細(xì)胞群體生長(zhǎng)的方法可以在體外、體內(nèi)或離體進(jìn)行。如本文所使用的，“抑制生長(zhǎng)”是指在短時(shí)間或長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)減緩細(xì)胞生長(zhǎng)、降低細(xì)胞生存力、引起細(xì)胞死亡、裂解細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，本發(fā)明包括被描述為藥物的抗聚合物-ADC結(jié)合物的使用。

對(duì)于臨床體內(nèi)使用，聚合物-結(jié)合物將作為測(cè)試無(wú)菌性和內(nèi)毒素水平的溶液提供。用于施用本發(fā)明的聚合物結(jié)合物的合適方案的實(shí)例如下：通過(guò)任何合適的途徑每日、每半周、每周施用至少一周、至少2周、至少3周、至少4周或更久。關(guān)于施用途徑的具體臨床方案、賦形劑、稀釋劑、劑量、時(shí)間等可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)臨床情況確定。

本發(fā)明提供了試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的聚合物結(jié)合物、包裝材料，以及用于將前述施用于受試者以治療疾病或病癥(例如但不限于癌癥)的說(shuō)明書(shū)，基本上由其組成或由其組成。

具體實(shí)施方式

實(shí)例

材料的制備

為了說(shuō)明本發(fā)明的教導(dǎo)，提供了聚惡唑啉-ADC結(jié)合物的制備，并且描述了這些結(jié)合物的生物活性。所使用的縮寫(xiě)如下：DC，脫乙酰基秋水仙堿；MMAE，奧瑞斯他??；POZ，用丙酸封端的聚惡唑啉；VC，纈氨酸-黃晶；Phe-Lys，苯丙氨酸和賴氨酸；PAB，對(duì)氨基芐醇；DCM，二氯甲烷；TEA，三甲胺；DMAP，二甲基氨基吡啶；DIPEA，二異丙基乙胺；ACN，乙腈；NPC，硝基苯基碳酸酯，PEG，聚乙二醇；N₃，疊氮化物或疊氮基。

材料：

秋水仙堿購(gòu)自西格瑪(Sigma)。二碳酸二叔丁酯、4-(二甲基氨基)吡啶DMAP、三乙胺(TEA)、0.5N甲醇鈉甲醇溶液、三氟乙酸(TFA)、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-Boc-乙二胺(Boc-EDA)、N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)、Fmoc氯化物(Fmoc-Cl)、N-(2-氨基乙基)馬來(lái)酰亞胺TFA鹽、1-羥基苯并三唑水合物(HOBT)、碘化銅(I)和哌啶購(gòu)自西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)。N₃-PEG4-VC-PAB-PNP、N₃-PEG4-VC-PAB-MMAE和N₃-PEG4-Phe-Lys(Trt)-PAB-NPC購(gòu)自Concortis。二乙醚、二氯甲烷(DCM)和乙腈(ACN)購(gòu)自EMD。生物素-PEG3-疊氮化物購(gòu)自Chempep。L(+)-抗壞血酸鈉鹽和五水硫酸銅(CUSO₄·5H₂O)購(gòu)自Fluka。M4195購(gòu)自Supelco。二甲基甲酰胺(DMF)、四氫呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(ACN)、無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水硫酸鎂和硅膠60(70-230目)購(gòu)自EMD。琥珀酰亞胺基碘乙酸酯購(gòu)自CovaChem。生物素-PEG3-疊氮化物購(gòu)自Chempep。

實(shí)例1.

POZ 10p馬來(lái)酰亞胺5K的制備

具有10個(gè)側(cè)基炔基并且用羧酸封端的MW 5,000的POZ(POZ 10p酸5K)根據(jù)在美國(guó)專利號(hào)8,110,651和8,101,706(所述文獻(xiàn)中的每一篇通過(guò)引用并入本文用于此類教導(dǎo))中描述的程序合成。POZ 10p酸5K具有通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)質(zhì)譜法(MS)測(cè)定的為5,500g/mol的M_n和為1.01的PDI。通過(guò)AKTA色譜法(DEAE柱)的聚合物的端基分析顯示聚合物具有99.8％的酸端基。¹H NMR譜與結(jié)構(gòu)一致，并且表明聚合物中的2-戊炔基-2-惡唑啉和2-乙基-2-惡唑啉單元的比例為10:40。

作為琥珀酰亞胺基衍生物(POZ 10p SPA 5K)活化的POZ酸根據(jù)在美國(guó)專利號(hào)7,943,141中描述的程序合成。¹H NMR譜與結(jié)構(gòu)一致并且表明酸基團(tuán)定量轉(zhuǎn)化為琥珀酰亞胺基酯。

在25mL圓底燒瓶中將N-(2-氨基乙基)馬來(lái)酰亞胺三氟乙酸鹽(0.0794g，3.125×10^-4mol，1.25當(dāng)量)溶解于15mL的二氯甲烷中。將0.0871mL的三乙胺(0.0632g，6.25×10^-4mol，2.5當(dāng)量)加入到燒瓶中。然后將1.375g的POZ 10p SPA 5K(2.5×10^-4mol，1當(dāng)量)加入燒瓶中，并且將溶液在室溫下在氬氣下攪拌20小時(shí)。在該時(shí)間結(jié)束時(shí)，將溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。將殘余物溶解在100mL的去離子水，10wt.％氯化鈉中，并且萃取到二氯甲烷(3×25mL)中。分離二氯甲烷相并用25mL的10wt.％氯化鈉溶液洗滌。再次分離二氯甲烷相，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮至15mL，并且沉淀到225mL的二乙醚中。將聚合物通過(guò)玻璃燒結(jié)的玻璃料過(guò)濾并且在高真空下干燥過(guò)夜，得到1.00g的產(chǎn)物(產(chǎn)率：72％)。¹H NMR(Varian，10mg/mL CDCl₃，δ)在1.12ppm(s，3H，CH₃CH₂CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(總面積2H，CH₃CH₂CO-)和3.47ppm(s，4H，-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的主鏈峰。側(cè)基峰出現(xiàn)在1.84ppm(m，2H，-CH₂CH₂CH₂CC≡H)和2.00ppm(m，1H，CH₂CH₂CH₂CC≡H)處。端基-CH₂SCH₂CH₂CONH-峰出現(xiàn)在2.70-2.82ppm處。連接到馬來(lái)酰亞胺的氮和馬來(lái)酰亞胺的-CH基團(tuán)的-CH₂基團(tuán)分別出現(xiàn)在3.68ppm和6.72ppm處。聚合物中2-戊炔基-2-惡唑啉和2-乙基-2-惡唑啉單元的比例為10.2:40。POZ 10p馬來(lái)酰亞胺5K具有通過(guò)MALDI測(cè)定的為6400g/mol的M_n和為1.02的PDI。

POZ 2p馬來(lái)酰亞胺5K的制備

POZ 2p酸5K是根據(jù)在美國(guó)專利號(hào)8,110,651和8,101,706中描述的程序合成的。POZ2p酸5K具有通過(guò)MALDI測(cè)定的為5,200g/mol的M_n和為1.02的PDI。通過(guò)AKTA(DEAE柱)的聚合物的端基分析顯示聚合物具有98.6％的酸端基。¹H NMR表明聚合物中2-戊炔基-2-惡唑啉和2-乙基-2-惡唑啉單元的比例為1.9:48。

POZ 2p SPA 5K是根據(jù)在美國(guó)專利號(hào)7,943,141中描述的方法合成的。¹H NMR光譜與結(jié)構(gòu)一致并且表明酸基團(tuán)定量轉(zhuǎn)化為NHS酯。

在100mL圓底燒瓶中將0.31g的N-(2-氨基乙基)馬來(lái)酰亞胺三氟乙酸鹽(1.2×10^-3mol，1.25當(dāng)量)溶解于50mL的二氯甲烷中。將三乙胺(0.24g，2.4×10^-3mol，2.5當(dāng)量)加入到燒瓶中。然后將POZ 2p SPA 5K(5.0g，9.6×10^-4mol，1當(dāng)量)加入燒瓶中。將溶液在室溫下在氬氣下攪拌24小時(shí)。用10wt％NaCl(0.1N HCl)溶液(3x 50mL)洗滌所述溶液。分離二氯甲烷相，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮至50mL，并且沉淀到750mL的二乙醚中。將聚合物通過(guò)玻璃燒結(jié)的玻璃料過(guò)濾并且在高真空下干燥過(guò)夜，得到4.53g的產(chǎn)物(產(chǎn)率：90％)。¹H NMR(Varian，10mg/mL CDCl₃，δ)在1.13ppm(s，3H，CH₃CH₂CO-)、2.29ppm(小s)和2.41ppm(大s)(總面積2H，CH₃CH₂CO-)和3.47ppm(s，4H，-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的主鏈峰。側(cè)基峰出現(xiàn)在1.84ppm(m，2H，-CH₂CH₂CH₂CC≡H)和2.00ppm(m，1H，CH₂CH₂CH₂CC≡H)處。端基-CH₂SCH₂CH₂CONH-峰出現(xiàn)在2.28-2.82ppm處。連接到馬來(lái)酰亞胺的氮和馬來(lái)酰亞胺的-CH基團(tuán)的-CH₂基團(tuán)分別出現(xiàn)在3.67ppm和6.72ppm處。聚合物中2-戊炔基-2-惡唑啉和2-乙基-2-惡唑啉單元的比例為1.9:48。POZ 2p馬來(lái)酰亞胺5K具有通過(guò)MALDI測(cè)定的為4,850g/mol的M_n和為1.02的PDI。

實(shí)例2.疊氮基毒素與具有側(cè)基戊炔基的POZ的偶聯(lián)

該反應(yīng)如在美國(guó)專利8,101,706中所描述的那樣進(jìn)行，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文用于此種教導(dǎo)。

實(shí)例3.脫乙?；锼蓧A·TFA(3)的合成

步驟1.N-Boc-秋水仙堿(1)的合成

根據(jù)L.Lebeaii等人，《合成化學(xué)(Syn.Comm.)》，27(2)，293-296(1997)來(lái)合成脫乙?；锼蓧A(DC)。將秋水仙堿(2.00gm，4.76mmol)在乙腈(ACN)(20mL)中的溶液蒸發(fā)至干。然后將ACN(20mL)加入到固體中。向溶液中加入三乙胺(TEA)(0.74mL，5.34mmol)和二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.65gm，5.33mmol)，隨后加入二碳酸二叔丁酯(6.23mL，27.1mmol)。將溶液在氬氣氣氛下在80℃下攪拌過(guò)夜。在冷卻至室溫后，將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干。將粗殘余物溶解于乙酸乙酯中，并使用乙酸乙酯作為流動(dòng)相在Biotage Isolera系統(tǒng)上通過(guò)硅膠色譜法進(jìn)行提純。將產(chǎn)物餾分在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干，得到1.47gm的固體(1.產(chǎn)率：59％)。通過(guò)HPLC測(cè)定純度>99％。化合物1在CDCl₃中的¹H-NMR：7.573ppm，s，1H；7.198ppm，d，1H；6.758ppm，d，1H；6.524ppm，s，1H；5.139ppm，m，1H；3.966ppm，s，3H；3.930ppm，s，3H；3.894ppm，m，3H；3.657ppm，s，3H；2.497-2.672ppm，m，3H；2.277ppm，s，3H；1.961ppm，m，1H；1.558ppm，s，9H。

步驟2.N-Boc-脫乙酰基秋水仙堿(2)和脫乙?；锼蓧A·TFA(3)的合成

將N-Boc-秋水仙堿(1，1.47gm，2.94mmol)溶解于甲醇(35mL)中，在氬氣氣氛下將其冷卻至0℃。向攪拌的溶液中逐滴加入0.5N甲醇鈉的甲醇溶液(23.6mL，11.78mmol)。將溶液在0℃下攪拌。反應(yīng)65分鐘后，加入NH₄Cl(0.63gm，11.78mmol)以在0℃下中和反應(yīng)混合物。攪拌5分鐘后，將澄清溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干。將殘余物與DCM(30mL)一起攪拌，并且然后過(guò)濾以去除固體鹽。將鹽用更多的DCM(10mL)沖洗，并過(guò)濾到相同的濾液中。向粗N-Boc-脫乙?；锼蓧A(2)的DCM的濾液中加入TFA(4mL)。將溶液在室溫下在氬氣下攪拌。反應(yīng)2.5小時(shí)后，將甲苯(35mL)加入到反應(yīng)混合物中，隨后蒸發(fā)至干(斜升至0托)。將粗殘余物溶解于DCM(10mL)中，使用DCM-甲醇(9:1v/v)作為流動(dòng)相在Biotage上經(jīng)硅膠柱進(jìn)行提純。在247nm處監(jiān)測(cè)洗脫。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將含產(chǎn)物的餾分(通過(guò)TLC測(cè)定R_f＝0.34)蒸發(fā)至接近干燥，并進(jìn)一步在真空中干燥過(guò)夜，得到1.2gm的黃色固體(3，產(chǎn)率：87％)。通過(guò)HPLC測(cè)定純度>99％。3在DMSO-d6中的¹H-NMR：8.447ppm，s，3H；7.105-7.189ppm，m，3H；6.823ppm，s，1H；3.910ppm，s，3H；3.844ppm，s，3H；3.813ppm，m，1H；3.780ppm，s，3H；2.655ppm，m，1H；2.267ppm，m，2H；1.929ppm，m，1H。

實(shí)例4.N-(N₃-PEG4-VC-PABC)-脫乙?；锼蓧A(4)的合成

將脫乙酰基秋水仙堿·TFA(3，0.30gm，0.64mmol)溶解于無(wú)水DCM(20mL)中，并且在氬氣氣氛下攪拌。向黃色溶液中加入N₃-PEG4-VC-PAB-PNP(0.66gm，0.76mmol)，隨后加入TEA(0.27mL，1.91mmol)、ACN(5mL)和DMF(5mL)。然后將DIPEA(0.44mL，2.55mmol)加入到反應(yīng)混合物中。反應(yīng)2天后，反應(yīng)混合物的反相HPLC分析顯示97％的轉(zhuǎn)化率。將反應(yīng)混合物在37℃下在真空下蒸發(fā)至干。將粗殘余物溶解于乙酸乙酯-甲醇(10mL，10:1v/v)中，通過(guò)使用乙酸乙酯作為流動(dòng)相A和甲醇作為流動(dòng)相B在Biotage上用硅膠柱進(jìn)行提純。在247nm處監(jiān)測(cè)洗脫。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將含產(chǎn)物的餾分蒸發(fā)至接近干燥，并且進(jìn)一步在真空中干燥過(guò)夜，得到0.56gm的黃色固體(4，產(chǎn)率：84％)。化合物4在DMSO-d6中的¹H-NMR：9.985ppm，s，1H；8.112ppm，m，2H；7.868ppm，d，1H；7.576ppm，d，2H；7.234ppm，d，3H；7.115ppm，d，1H；7.032ppm，d，1H；6.768ppm，s，1H；5.977ppm，t，未溶解，1H；5.411ppm，s，NH₂-；4.903ppm，q，2H；4.379ppm，m，1H；4.230ppm，m，1H；4.147ppm，m，1H；3.879ppm，s，3H；3.833ppm，s，3H；3.789ppm，s，3H；3.592ppm，s，3H；3.531ppm，m，-CH₂CH₂O-；3.316ppm，t，2H；3.020ppm，m，1H；2.949ppm，m，1H；2.568ppm，m，1H；2.375ppm，m，1H；2.184ppm，m，1H；1.829ppm，m，1H；1.686ppm，m，1H；1.592ppm，m，1H；1.433ppm，m，1H；1.369ppm，m，1H；0.860ppm，d，3H；0.827ppm，d，3H。

實(shí)例5.N-(N₃-PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC)-脫乙?；锼蓧A5

將脫乙酰基秋水仙堿·TFA(3，0.18gm，0.39mmol，1.0當(dāng)量)和N₃-PEG4-Phe-Lys(Trt)-PAB-NPC(0.50gm，0.46mmol，1.2當(dāng)量)溶解于無(wú)水DMF(5mL)中。向反應(yīng)混合物中加入TEA(162μL，1.16mmol，3.0當(dāng)量)和DIPEA(202μL，1.16mmol，3.0當(dāng)量)。將黃色溶液在室溫下在氬氣氣氛下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物在37℃下在真空下蒸發(fā)至干。將粗產(chǎn)物溶解于乙酸乙酯中，使用乙酸乙酯作為流動(dòng)相A和甲醇作為流動(dòng)相B在Biotage上用硅膠柱進(jìn)行提純。在317nm處監(jiān)測(cè)洗脫。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將含產(chǎn)物的餾分蒸發(fā)至接近干燥，并且進(jìn)一步在真空中干燥過(guò)夜，得到0.47gm的黃色固體(5，產(chǎn)率：79％)。純度98％(HPLC)?；衔?的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)：9.992ppm，s，1H；8.112ppm，m，2H；8.020ppm，d，1H；7.566ppm，d，2H；7.381ppm，d，6H；7.226-7.271ppm，m，14H；7.105-7.209ppm，m，4H；7.039ppm，d，1H；6.766ppm，s，1H；4.891ppm，dd，2H；4.557ppm，t，1H，未溶解；4.080ppm，m，1H；3.870ppm，s，3H；3.828ppm，s，3H；3.784ppm，s，3H；3.527ppm，m，-CH₂CH₂O-；3.519ppm，s，3H；2.996ppm，dd，1H；2.742ppm，7，1H；2.575ppm，m，1H；1.2-2.3ppm，多重峰。

實(shí)例6.POZ 10p-EDA-Boc 20K(7)的合成

將側(cè)基POZ 10p酸20K(10gm，0.52mmol，1.0當(dāng)量)和NHS(0.078gm，0.67mmol，1.3當(dāng)量)溶解于無(wú)水ACN(200mL)中。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶液蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于無(wú)水DCM(100mL)中，隨后加入DCC(0.138gm，0.67mmol，1.3當(dāng)量)。將溶液在氬氣氣氛下攪拌過(guò)夜。通過(guò)緩慢加入到乙醚(1600mL)中來(lái)沉淀反應(yīng)混合物。將沉淀物過(guò)濾，并且在真空下干燥過(guò)夜，得到8.8gm的白色粉末(6)。如通過(guò)離子交換色譜法所測(cè)定的，6上的琥珀酰亞胺基團(tuán)的取代度為98％。化合物6的¹H NMR(Varian，10mg/mL CDCl₃，δ)在1.12ppm(s，3H，CH₃CH₂CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(總面積2H，CH₃CH₂CO-)，以及3.47ppm(s，4H，-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的主鏈峰。側(cè)基峰出現(xiàn)在1.84ppm(m，2H，-CH₂CH₂CH₂CC≡H)，以及2.00ppm(m，1H，CH₂CH₂CH₂CC≡H)處。末端琥珀酰亞胺基團(tuán)峰出現(xiàn)在2.86ppm(s，4H)處。

向BOC-EDA(0.10gm，0.62mmol，2.1當(dāng)量)和TEA(0.17mL，1.2mmol，4.1當(dāng)量)的無(wú)水DCM(100mL)溶液中加入化合物6(5.6gm，0.29mmol，1當(dāng)量)。將溶液在室溫下在氬氣氣氛下攪拌過(guò)夜。然后通過(guò)緩慢加入到二乙醚(800mL)中使反應(yīng)混合物沉淀。將沉淀物過(guò)濾，并且在真空中干燥過(guò)夜，得到5.0gm的白色粉末(7)。如通過(guò)離子交換色譜法所測(cè)定的，在7上的Boc-EDA的取代度為91％?；衔?的¹H NMR(Varian，10mg/mL CDCl₃，8)在1.12ppm(s，3H，CH₃CH₂CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(總面積2H，CH₃CH₂CO-)，以及3.45ppm(s，4H，-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的主鏈峰。側(cè)基峰出現(xiàn)在1.84ppm(m，2H，-CH₂CH₂CH₂CC≡H)，以及1.94ppm(m，1H，CH₂CH₂CH₂CC≡H)處。末端-O-C(CH₃)₃基團(tuán)峰出現(xiàn)在1.43ppm(s，9H)處。

實(shí)例7.POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG 4-VC-PABC-脫乙?；锼蓧A)₆]_a-碘乙酰胺(11)的合成

POZ 20k側(cè)基生物素₂-EDA-Boc(8)的結(jié)構(gòu)

POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-脫乙?；锼蓧A)₆]_a-EDA-Boc(9)的結(jié)構(gòu)

POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-脫乙?；锼蓧A)₆]_a-EDA(10)的結(jié)構(gòu)

POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-脫乙?；锼蓧A)₆]_a-碘乙酰胺(11)的結(jié)構(gòu)

將疊氮化物-PEG3-生物素(98mg，0.22mmol，2.1當(dāng)量)和POZ 10p-EDA-BOC 20K(7，2.000gm，0.10mmol，1.0當(dāng)量)溶解于去離子水(25mL)中。將溶液用緩慢的氬氣流鼓鼓泡15分鐘。然后向燒瓶中加入L(+)-抗壞血酸鈉鹽(44mg，0.22mmol，2.1當(dāng)量)，隨后立即加入CuSO₄·5H₂O(55mg，0.22mol，2.1當(dāng)量)。將溶液在室溫下在氬氣氣氛下攪拌過(guò)夜。反應(yīng)混合物的反相HPLC分析表明反應(yīng)完成。使溶液通過(guò)填充有M4195介質(zhì)(20gm)的柱以去除銅。用另外的去離子水(175mL)洗脫所述柱。將NaCl(30gm)溶解在洗脫液(200mL)中。將溶液用DCM(3×100mL)萃取。將DCM溶液用無(wú)水硫酸鎂(1.5gm)和硫酸鈉(100gm)干燥。將混合物通過(guò)玻璃料過(guò)濾。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將濾液濃縮至接近干燥，并且在真空中進(jìn)一步干燥過(guò)夜，得到1.7gm的白色固體(8)?；衔?的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，8)在0.95ppm(s)和0.97(s)(總面積3H/CH₃CH₂CO-)、2.28ppm(大s)和2.33ppm(小s)(總面積2H/CH₃CH₂CO-)，以及3.35ppm(大s)和3.44(小s)(總面積4H/-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的POZ主鏈峰。剩余的側(cè)基峰出現(xiàn)在1.65ppm(m，2H/-CH₂CH₂CH₂CC≡H)，以及2.75ppm(m，1H/CH₂CH₂CH₂CC≡H)處。POZ末端基團(tuán)峰出現(xiàn)在1.37ppm(s，9H，-O-C(CH₃)₃)、6.77ppm(t，未溶解，1H，-NH-Boc)、7.92ppm(t，未溶解，1H，-CONH-)處。側(cè)基生物素相關(guān)峰包括3.79ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、4.12ppm(m，在生物素上1H/-CONHCH(CH₂S-)-)和4.30ppm(m，在生物素上1H/-CONHCH)、4.45ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、6.34ppm(s)和6.40ppm(s)(2H/-NH-CO-NH-)、7.81ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N，1H/-CONH-)。

向50mL圓底燒瓶中的N-(N₃-PEG4-YC-PABC)-脫乙?；锼蓧A(4，0.15gm，0.15mmol，7.5當(dāng)量)中加入無(wú)水THF(10mL)。然后將POZ 20K側(cè)基生物素₂-EDA-Boc(8，0.40gm，0.020mmol，1當(dāng)量)溶解在溶液中。將溶液在緩慢的氬氣流下攪拌10分鐘。然后加入CuI(23mg，0.12mmol，6.0當(dāng)量)，隨后立即加入TEA(17μL，0.12mmol，6.0當(dāng)量)。將DMF(1mL)加入到反應(yīng)混合物中。將綠色溶液在氬氣氣氛下在40℃下攪拌過(guò)夜。反應(yīng)混合物的反相HPLC分析表明，反應(yīng)在攪拌過(guò)夜后完成。過(guò)濾反應(yīng)混合物，并且通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將濾液濃縮至接近干燥。在真空下進(jìn)一步蒸發(fā)殘余的DMF。向殘余物中加入20mL的甲醇。通過(guò)使澄清的綠色溶液通過(guò)填充有M4195介質(zhì)(20mL)的柱來(lái)對(duì)其進(jìn)行提純以去除銅。用另外的甲醇(80mL)洗脫所述柱。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將洗脫液(100mL)濃縮至干。將殘余物溶解于DCM(10mL)中，通過(guò)緩慢加入二乙醚(150mL)使其沉淀。過(guò)濾沉淀物，并且然后在真空中干燥過(guò)夜，得到0.49gm的琥珀色粉末(9)。化合物9的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)在0.95ppm(s)和0.97(s)(總面積3H/CH₃CTI₂CO-)、2.28ppm(大s)和2.33ppm(小s)(總面積2H/CH₃CH₂CO-)，以及3.35ppm(大s)和3.44(小s)(總面積4H/-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的POZ主鏈峰。POZ末端基團(tuán)峰出現(xiàn)在1.37ppm(s，9H，-O-C(CH₃)₃)、6.77ppm(t，未溶解，1H，-NH-Boc)、7.82ppm(t，未溶解，1H，-CONH-)處。側(cè)基生物素相關(guān)峰包括3.79ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、4.12ppm(m，在生物素上1H/-CONHCH(CH₂S-)-)和4.30ppm(m，在生物素上1H/-CONHCH)、4.46ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、6.34ppm(s)和6.40ppm(s)(2H/-NH-CO-NH-)、7.81ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N，1H/-CONH-)。側(cè)基PEG4-VC-PABC-脫乙?；锼蓧A峰中的一些(下面H的數(shù)量是指每個(gè)側(cè)基PEG4-VC-PABC-脫乙?；锼蓧A)包括：0.827ppm，d，3H；0.860ppm，d，3H；1.37ppm，m，1H；1.43ppm，m，1H；1.59ppm，m，1H；1.69ppm，m，1H；1.83ppm，m，1H；2.58ppm，m，1H；2.95ppm，m，1H；3.02ppm，m，1H；3.53ppm，m，-CH₂CH₂O-；3.59ppm，s，3H；3.79ppm，s，3H；3.83ppm，s，3H；3.88ppm，s，3H；4.15ppm，m，1H；4.23ppm，m，1H；4.38ppm，m，1H；4.45ppm，t，2H；4.90ppm，q，2H；5.41ppm，s，NH₂-；5.98ppm，t，未溶解，1H；6.77ppm，s，1H；7.03ppm，d，1H；7.12ppm，d，1H；7.23ppm，d，3H；7.58ppm，d，2H；7.82ppm，t，1H；7.87ppm，d，1H；8.11ppm，m，2H；9.98ppm，s，1H。

將POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-脫乙?；锼蓧A)₆]_a-EDA-BOC(9，0.480gm)溶解于DCM(3.2mL)中，隨后加入TFA(3.2mL)。將溶液在室溫下在氬氣下攪拌3小時(shí)。然后通過(guò)在28℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將混合物蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于DCM(30mL)中。將溶液用15％鹽水(2×20mL)洗滌。相分離后，用15％鹽水(40mL，用1N NaOH將pH調(diào)節(jié)至12)洗滌DCM溶液。相分離后，收集DCM溶液，用無(wú)水硫酸鈉(20gm)干燥。將混合物通過(guò)玻璃料過(guò)濾。將濾液蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于DCM(7mL)中，隨后在二乙醚(150mL)中沉淀。過(guò)濾沉淀物，并且在真空中干燥過(guò)夜，得到0.13gm的白色粉末(10)?；衔?0的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)在0.95ppm(s)和0.97(s)(總面積3H/CH₃CH₂CO-)、2.28ppm(大s)和2.33ppm(小s)(總面積2H/CH₃CH₂CO-)，以及3.35ppm(大s)和3.44(小s)(總面積4H/-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的POZ主鏈峰。POZ末端Boc基團(tuán)的1.37ppm峰大大降低，這表明去除了末端Boc基團(tuán)。末端酰胺NH出現(xiàn)在7.82ppm(t，未溶解，1H，-CONH-)處。側(cè)基生物素相關(guān)峰中的一些包括3.79ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、4.12ppm(m，在生物素上1H/-CONHCH(CH₂S-)-)和4.30ppm(m，在生物素上1H/-CONHCH)、4.46ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、6.34ppm(s)(2H/-NH-CO-NH-)和6.40ppm(s)、7.81ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N，1H/-CONH-)。側(cè)基PEG4-VC-PABC-脫乙基秋水仙堿峰中的一些(下面的H的數(shù)量是指每個(gè)側(cè)基PEG4-VC-PABC-脫乙?；锼蓧A)包括：0.827ppm，d，3H；0.860ppm，d，3H；1.37ppm，m，1H；1.43ppm，m，1H；1.59ppm，m，1H；1.69ppm，m，1H；1.83ppm，m，1H；2.58ppm，m，1H；2.95ppm，m，1H；3.02ppm，m，1H；3.53ppm，m，-CH₂CH₂O-；3.59ppm，s，3H；3.79ppm，s，3H；3.83ppm，s，3H；3.88ppm，s，3H；4.15ppm，m，1H；4.23ppm，m，1H；4.38ppm，m，1H；4.45ppm，t，2H；4.90ppm，q，2H；5.41ppm，s，NH₂-；5.98ppm，t，未溶解，1H；6.77ppm，s，1H；7.03ppm，d，1H；7.12ppm，d，1H；7.23ppm，d，3H；7.58ppm，d，2H；7.82ppm，t，1H；7.87ppm，d，1H；8.11ppm，m，2H；9.98ppm，s，1H。

將POZ側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-脫乙酰基秋水仙堿)₆]_a-EDA 20K(10，0.11gm，0.0042mmol，1當(dāng)量)溶解于ACN(5mL)中，然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于DCM(5mL)中。加入琥珀酰亞胺碘乙酸酯(2.5mg，0.0083mmol，2當(dāng)量)，隨后加入TEA(4.6μL，0.033mmol，8當(dāng)量)。將溶液在氬氣氣氛下在黑暗中攪拌。反應(yīng)過(guò)夜后，將溶液沉淀到80mL的二乙醚中。過(guò)濾沉淀物，用二乙醚(5mL)沖洗，并且在真空中干燥，得到99mg的白色粉末(11)。如在與3-巰基丙酸反應(yīng)之后通過(guò)離子交換色譜法測(cè)定的，11的碘乙酰胺取代度為81％。

實(shí)例8.POZ 10p-EDA-Fmoc 20K(13)的合成

將POZ 10p-EDA-BOC 20K(7，1.0gm)溶解于DCM(6mL)中，隨后加入TFA(6mL)。將溶液在室溫下在氬氣氣氛下攪拌2小時(shí)。然后將混合物在28℃下蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于去離子水(10mL)中，并且通過(guò)1N NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)至11。向溶液中加入NaCl以制備15％鹽水，將其用DCM(4×30mL)萃取。相分離后，收集DCM相，用無(wú)水MgSO₄(1gm)和Na₂SO₄(90gm)干燥。濾除固體后，將濾液蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于DCM(10mL)中，將其加入道二乙醚(200mL)中以沉淀聚合物。過(guò)濾沉淀物，并且在真空中干燥過(guò)夜，得到0.86gm的白色粉末(12)?；衔?2的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)在0.95ppm(s)和0.97(s)(總面積3H/CH₃CH₂CO-)、2.28ppm(大s)和2.33ppm(小s)(總面積2H/CH₃CH₂CO-)，以及3.35ppm(大s)和3.44(小s)(總面積4H/-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的POZ主鏈峰。側(cè)基峰出現(xiàn)在1.64ppm(m，2H/-CH₂CH₂CH₂CC≡H)，以及2.77ppm(m，1H/CH₂CH₂CH₂CC≡H)處。POZ末端Boc基團(tuán)(1.37ppm)消失，這表明完全去除了末端Boc基團(tuán)。

通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將POZ 10p-EDA 20K(12，0.42gm，0.022mmol，1當(dāng)量)在10mL的ACN(10mL)中的溶液蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于DCM(6mL)中。加入DIPEA(15μL，0.087mmol，4當(dāng)量)和Fmoc氯化物(12mg，0.044mmol，2當(dāng)量)。在氬氣下攪拌過(guò)夜后，將溶液蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于去離子水(10mL)中，隨后溶解NaCl(1gm)。將水溶液用二乙醚(15mL)洗滌，隨后用DCM(3×15mL)萃取剩余的水溶液。將DCM溶液用Na₂SO₄(20gm)干燥，并且然后過(guò)濾以去除固體。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將濾液濃縮至約4mL，并且然后在二乙醚(80mL)中沉淀。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物，并且在真空中干燥過(guò)夜，得到0.36gm的白色粉末(13)。在CDCl₃中的NMR顯示轉(zhuǎn)化為Fmoc。化合物13的¹H NMR(Varian，10mg/mL CDC_l3，δ)在1.12ppm(s，3H，CH₃CH₂CO-)、2.31ppm(小s)和2.41ppm(大s)(總面積2H，CH₃CH₂CO-)，以及3.45ppm(s，4H，-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的主鏈峰。側(cè)基峰出現(xiàn)在1.84ppm(m，2H，-CH₂CH₂CH₂CC≡H)，以及2.03ppm(m，1H，CH₂CH₂CH₂CC≡H)處。Fmoc基團(tuán)峰出現(xiàn)在4.20ppm(t，1H)、4.37ppm(m，2H)、7.31ppm(t，2H)、7.40ppm(t，2H)、7.59ppm(d，2H)，以及7.76ppm(d，2H)處。

實(shí)例9.POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-Phe-Lys-PABC-脫乙?；锼蓧A)₅]_a-碘乙酰胺(17)的合成

POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC-脫乙?；锼蓧A)₅]_a-EDA-Fmoc,14

POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC-脫乙?；锼蓧A)₅]_a-EDA,15

POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC-脫乙?；锼蓧A)₅]_a-碘乙酰胺,16

POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-Phe-Lys-PABC-脫乙酰基秋水仙堿)₅]_a-碘乙酰胺,17

向100mL圓底燒瓶中的N₃-PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC-碳酸酯-脫乙?；锼蓧A(5，193mg，0.145mmol，6當(dāng)量)和POZ 10p-EDA-Fmoc 20K(13，470mg，0.0242mmol，1當(dāng)量)中加入預(yù)先溶解于1mL的DMF中的生物素-PEG3-疊氮化物(22mg，0.048mmol，2.0當(dāng)量)。使用DMF(1mL)沖洗并將殘余的生物素-PEG3-疊氮化物轉(zhuǎn)移到反應(yīng)混合物中。然后加入無(wú)水TF1F(15mL)。將溶液在氬氣下攪拌15分鐘。然后加入CuI(29mg，0.15mmol，6.4當(dāng)量)，隨后立即加入TEA(22μL，0.15mmol，6.4當(dāng)量)。將綠色溶液在50℃下在氬氣下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物通過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾，并且通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將濾液蒸發(fā)至干。在真空下蒸發(fā)DMF。加入甲醇(10mL)以溶解殘余物。將澄清的綠色溶液通過(guò)填充有M4195介質(zhì)(9gm)的柱以去除銅。用另外的甲醇(90mL)洗脫所述柱。將洗脫液濃縮至干。將殘余物溶解于DCM(12mL)中。通過(guò)緩慢加入到二乙醚(200mL)中來(lái)沉淀DCM溶液。過(guò)濾沉淀物，并且然后在真空中干燥，得到0.64gm的琥珀色粉末(14)。化合物14的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)在0.95ppm(s)和0.97(s)(總面積3H/CH₃CH₂CO-)、2.27ppm(大s)和2.32ppm(小s)(總面積2H/CH₃CH₂CO-)，以及3.35ppm(大s)和3.44(小s)(總面積4H/-NHCB₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的POZ主鏈峰。Fmoc基團(tuán)峰出現(xiàn)在4.12ppm(m，1H)、4.30ppm(m，2H)處。側(cè)基生物素相關(guān)峰中的一些包括3.79ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、4.12ppm(m，在生物素上1H/-CONHCH(CH₂S-)-)和4.30ppm(m，在生物素上1H/-CONHCH)、4.44ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、6.34ppm(s)(2H/-NH-CO-NH-)和6.40ppm(s)、7.81ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N，1H/-CONH-)。側(cè)基PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC-脫乙?；锼蓧A相關(guān)峰中的一些(下面的H的數(shù)量是指每個(gè)側(cè)基PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC-脫乙酰基秋水仙堿)為3.52ppm，s，3H；3.78ppm，s，3H；3.82ppm，s，3H；3.87ppm，s，3H；4.12ppm，m，1H；4.44ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)；4.53ppm，t，1H，未溶解；4.91ppm，s，2H；6.76ppm，s，1H；7.02ppm，d，1H；7.11-7.21ppm，m，4H；7.37ppm(d，來(lái)自Trt基團(tuán))；7.56ppm，d，2H；7.80ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N)；8.03ppm，d，1H；8.11p pm，m，2H；9.99ppm，s，1H。

在Ar下將POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC-脫乙酰基秋水仙堿)₅]_a-Fmoc(14，0.44gm)溶解于無(wú)水DMF(4mL)中。向溶液中加入哌啶(0.20mL)。將溶液在氬氣氣氛下攪拌1小時(shí)。然后將溶液在40℃下在真空下蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于DCM(4mL)中，隨后在二乙醚(80mL)中沉淀。將沉淀物用二乙醚(5mL)洗滌，并且然后在真空中干燥，得到0.42gm的粉末。將干燥的粉末溶解于DCM(15mL)中，并且然后在分液漏斗中用7％鹽水(30mL)洗滌。相分離后，將DCM溶液用Na₂SO₄干燥。過(guò)濾以去除Na₂SO₄后，將濾液濃縮至約7mL，將其沉淀到二乙醚(150mL)中。通過(guò)過(guò)濾去除沉淀物，用二乙醚(10mL)沖洗，并且然后在真空中干燥過(guò)夜，得到0.37gm的粉末(15)?；衔?5的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)在0.95ppm(s)和0.97(s)(總面積3H/CH₃CH₂CO-)、2.27ppm(大s)和2.32ppm(小s)(總面積2H/CH₃CH₂CO-)，以及3.35ppm(大s)和3.44(小s)(總面積4H/-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的POZ主鏈峰。側(cè)基生物素相關(guān)峰中的一些包括4.44ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、6.34ppm(s)和6.40ppm(s)(2H/-NH-CO-NH-)、7.81ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N，1H/-CONH-)。側(cè)基PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC-脫乙?；锼蓧A相關(guān)峰中的一些(下面的H的數(shù)量是指每個(gè)側(cè)基PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC-脫乙酰基秋水仙堿)是3.44ppm，s，PEG4-CH₂CH₂O-；3.52ppm，s，3H；3.78ppm，s，3H；3.82ppm，s，3H；3.86ppm，s，3H；4.13ppm，m，1H；4.44ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)；4.56ppm，t，1H，未溶解；4.91ppm，m，2H；6.76ppm，s，1H；7.03ppm，d，1H；7.14-7.26ppm，m，Ar；7.37ppm(d，Trt基團(tuán))；7.56ppm，d，2H；7.80ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N)；8.03ppm，d，1H；8.11ppm，m，2H；9.99ppm，s，1H。

將POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC-脫乙?；锼蓧A)₅]_a-EDA(15，0.36gm，MW 26685Da，0.013mmol，1當(dāng)量)溶解于ACN(5mL)中，然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于無(wú)水DCM(5mL)中并且在氬氣氣氛下保護(hù)。加入琥珀酰亞胺基碘乙酸酯(12mg，0.040mmol，3.0當(dāng)量)，隨后加入TEA(11μL，0.080mmol，6當(dāng)量)。在黑暗中攪拌過(guò)夜后，將溶液沉淀到二乙醚(150mL)中。將溶液過(guò)濾，用二乙醚(10mL)沖洗，并且在真空中干燥，得到0.36gm的白色粉末(16)。

將POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-Phe-Lys(Trt)-PABC-脫乙酰基秋水仙堿)₅]_a-碘乙酰胺(16，0.16gm)溶解于DCM(2mL)中，隨后加入TFA(0.10mL)。將溶液在室溫下在黑暗中在氬氣下攪拌過(guò)夜。然后通過(guò)在28℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將混合物蒸發(fā)至干。將溶液溶解于DCM(4mL)中，并且然后在二乙醚(80mL)中沉淀。過(guò)濾沉淀物，用大量乙醚洗滌，并且在真空中干燥。將干燥的粉末(0.15gm)溶解在去離子水(20mL)中。使用具有PLBC膜(44.5mm，NMWL 3000)的艾美康恩(amicon)超濾單元通過(guò)超濾將溶液濃縮至5mL。將濃縮的溶液用去離子水稀釋至50mL，再次濃縮至5mL。將濃縮的溶液稀釋至30mL，隨后濃縮至5mL。將濃縮的溶液轉(zhuǎn)移至50mL小瓶中。將超濾單元用去離子水(10mL)沖洗并轉(zhuǎn)移到50mL小瓶中。將溶液在凍干機(jī)中冷凍干燥，得到0.15gm的白色粉末(17)。化合物17的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)在0.95ppm(s)和0.97(s)(總面積3H/CH₃CH₂CO-)、2.27ppm(大s)和2.32ppm(小s)(總面積2H/CH₃CH₂CO-)，以及3.35ppm(大s)和3.44(小s)(總面積4H/-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的POZ主鏈峰。POZ末端碘乙酰胺(-COCH₂I)峰出現(xiàn)在3.62ppm(s，2H)處。側(cè)基生物素相關(guān)峰包括4.44ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、6.34ppm(s)和6.40ppm(s)(2H/-NH-CO-NH-)、7.81ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N，1H/-CONH-)。側(cè)基PEG4-Phe-Lys-PABC-脫乙?；锼蓧A相關(guān)峰中的一些(下面的H的數(shù)量是指每個(gè)側(cè)基PEG4-Phe-Lys-PABC-脫乙?；锼蓧A)包括：3.46ppm，s，PEG4-CH₂CH₂O-；3.52ppm，s，3H；3.79ppm，s，3H；3.83ppm，s，3H；3.87ppm，s，3H；4.13ppm，m，1H；4.44ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)；4.56ppm，t，1H，未溶解；4.92ppm，m，2H；6.76ppm，s，1H；7.04ppm，d，1H；7.13ppm，m，Ar；7.23ppm，m，Ar；7.57ppm，d，2H；7.64ppm，m，Ar；7.80ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N)；8.05ppm，d，1H；8.11ppm，m，1H；10.0ppm，s，1H。

實(shí)例10.POZ 20K側(cè)基[(PEG4-VC-PABC-MMAE)₉]_a-馬來(lái)酰亞胺(19)

向玻璃小瓶中的N₃-PEG4-VC-PABC-MMAE(72mg，0.049mmol，9當(dāng)量)中加入THF(4mL)。然后將聚[(EOZ)_n-co-(PtynOZ)₁₀]-酸20K(106mg，0.00544mmol，1當(dāng)量)加入到溶液中。將溶液在氬氣下攪拌10分鐘。然后向混合物中加入CuI(9mg，0.05mmol，9當(dāng)量)，隨后立即加入TEA(7μL，0.05mmol，9當(dāng)量)。將溶液在氬氣下在45℃下攪拌過(guò)夜。通過(guò)反相HPLC分析綠色混合物，所述綠色混合物表明反應(yīng)完成，因?yàn)榉磻?yīng)混合物中沒(méi)有殘余的N₃-PEG4-VC-PABC-MMAE。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶液蒸發(fā)至干。加入2mM HCl(4mL)和ACN(4mL)以溶解殘余物，將其通過(guò)填充有Dowex M4195介質(zhì)(2mL)的柱進(jìn)行提純以去除銅。通過(guò)1:1v/v的2mM HCl和ACN(10mL)洗脫所述柱。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸發(fā)ACN。向剩余的水溶液中加入NaCl以制備15％鹽水。將溶液用DCM(3×30mL)萃取。相分離后，將DCM溶液濃縮至約20mL，并且用無(wú)水硫酸鈉(10gm)干燥。將混合物通過(guò)玻璃料過(guò)濾，并且將濾液濃縮至約4mL。然后將溶液沉淀到二乙醚(80mL)中。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物并且在真空中干燥，得到108mg的白色粉末18?；衔?8的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)在0.95ppm(s)和0.97(s)(總面積3H/CH₃CH₂CO-)、2.27ppm(大s)和2.32ppm(小s)(總面積2H/CH₃CH₂CO-)，以及3.35ppm(大s)和3.47(小s)(總面積4H/-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的POZ主鏈峰。側(cè)基PEG4-VC-PABC-MMAE相關(guān)峰中的一些(下面H的數(shù)量是指每個(gè)側(cè)基PEG4-VC-PABC-MMAE)包括：0.70-0.95ppm，m，24H，-CH₃；3.50ppm，s，-(CH₂CH₂O)₃-；3.79ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-；3.99ppm，m，2H；4.23ppm，m，2H；4.45ppm(主峰，t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)；5.04ppm，m，2H；5.41ppm，s，2H；6.04ppm，s，1H；7.17ppm，m，1H，在MMAE上的Ar；7.27ppm，d，2H，PAB的Ar；7.31ppm，m，4H，在MMAE上的Ar；7.59ppm，d，2H，PAB的Ar；7.82ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N)；8.13ppm，d，1H；10.03ppm，s，1H。

將POZ 20K側(cè)基-(PEG4-VC-PABC-MMAE)₉-酸(18，93mg，0.0029mmol，1.0當(dāng)量)溶解于無(wú)水ACN(2mL)中，隨后加入HOBT(0.4mg，0.002mmol，0.8當(dāng)量)和N-(2-氨基乙基)馬來(lái)酰亞胺TFA鹽(1mg，0.004mmol，1.3當(dāng)量)。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶液蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于無(wú)水DCM(3mL)中，隨后加入TEA(0.6μL，0.004mmol，1.5當(dāng)量)和DCC(0.7mg，3.5101×10^-6mol，1.2當(dāng)量)。將溶液在氬氣氣氛下攪拌過(guò)夜。將混合物過(guò)濾，并且加載到小硅膠柱(10mL)上，隨后用DCM洗脫。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將洗脫液(30mL)濃縮至1mL。將溶液加入到乙醚(15mL)中以沉淀。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物并且在真空中干燥，得到30mg的白色粉末(19)?；衔?9的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)在0.95ppm(s)和0.97(s)(總面積3H/CH₃CH₂CO-)、2.27ppm(大s)和2.32ppm(小s)(總面積2H/CH₃CH₂CO-)，以及3.35ppm(大s)和3.47(小s)(總面積4H/-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的POZ主鏈峰。POZ末端馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)峰出現(xiàn)在7.00ppm(s，2H)處。側(cè)基PEG4-VC-PABC-MMAE相關(guān)峰中的一些(下面的H的數(shù)量是指每個(gè)側(cè)基PEG4-VC-PABC-MMAE)包括：0.70-0.95ppm，m，24H，-CH₃；3.50ppm，s，-(CH₂CH₂O)₃-；3.79ppm，t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)；3.99ppm，m，2H；4.23ppm，m，2H；4.45ppm(主峰，t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)；5.04ppm，m，2H；5.41ppm，s，2H；6.04ppm，s，1H；7.17ppm，m，1H，在MMAE上的Ar；7.27ppm，d，2H，PAB的Ar；7.31ppm，m，4H，在MMAE上的Ar；7.59ppm，d，2H，PAB的Ar；7.82ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N)；8.13ppm，d，1H；10.03ppm，s，1H。

實(shí)例11.POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-MMAE)₅]_a-碘乙酰胺(22)

反應(yīng)方案：

20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-MMAE)₅]_a-EDA-Boc(20)的結(jié)構(gòu)

POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-MMAE)₅]_a-EDA(21)的結(jié)構(gòu)

POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-MMAE)₅]_a-碘乙酰胺(22)的結(jié)構(gòu)

向50mL圓底燒瓶中的N₃-PEG4-VC-PABC-MMAE(132mg，0.0944mmol，6.0當(dāng)量)和POZ 10p-EDA-Boc 20K(7，305mg，0.0157mmol，1當(dāng)量)中計(jì)入生物素-PEG3-疊氮化物(14mg，0.032mmol，2當(dāng)量，溶解于0.6mL的DMF中)，隨后加入9mL的無(wú)水THF(9mL)。將溶液在氬氣下保護(hù)并且在室溫下攪拌15分鐘。然后加入CuI(19mg，0.10mmol，6.8當(dāng)量)，隨后立即加入TEA(52μL，0.37mmol，24當(dāng)量)。將綠色溶液在氬氣下在50℃下攪拌過(guò)夜。將溶液通過(guò)0.2μm注射器式過(guò)濾器過(guò)濾，并且將濾液蒸發(fā)至干。在真空下蒸發(fā)DMF。將甲醇(10mL)加入到殘余固體中。通過(guò)使甲醇溶液通過(guò)填充有M4195介質(zhì)(5gm)的柱來(lái)去除銅離子。將洗脫液濃縮至干并溶解于DCM(6mL)中。在攪拌下，將澄清溶液在二乙醚(150mL)中沉淀。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物并且在真空中干燥，得到400mg的琥珀色粉末(20)。化合物20的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)在0.95ppm(s)和0.97(s)(總面積3H/CH₃CH₂CO-)、2.27ppm(大s)和2.32ppm(小s)(總面積2H/CH₃CH₂CO-)，以及3.35ppm(大s)和3.47(小s)(總面積4H/-NHCH₂CH₂NH-)處顯示常見(jiàn)的POZ主鏈峰。POZ末端Boc基團(tuán)峰出現(xiàn)在1.37ppm(s，9H)處。側(cè)基生物素相關(guān)峰中的一些包括3.79ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、4.12ppm(m，在生物素上1H/-CONHCH(CH₂S-)-)和4.30ppm(m，在生物素上1H/-CONHCH)、4.45ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)、6.34ppm(s)(2H/-NH-CO-NH-)和6.40ppm(s)、7.81ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N，1H/-CONH-)。側(cè)基PEG4-VC-PABC-MMAE相關(guān)峰中的一些(下面的H的數(shù)量是指每個(gè)側(cè)基PEG4-VC-PABC-MMAE)包括：0.70-0.95ppm，m，-CH₃；3.50ppm，s，-(CH₂CH₂O)₃-；3.79ppm(t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)；3.99ppm，m，2H；4.23ppm，m，2H；4.45ppm(主峰，t，未溶解，2H/三唑-CH₂CH₂O-)；5.04ppm，m，2H；5.40ppm，s，2H；5.90ppm，s，1H；7.16ppm，m，1H，在MMAE上的Ar；7.27ppm，d，2H，PAB的Ar；7.31ppm，m，4H，在MMAE上的Ar；7.58ppm，d，2H，PAB的Ar；7.82ppm(m，1H/三唑環(huán)＝CH-N)；8.13ppm，d，1H；9.98ppm，s，1H。

將化合物20(390gm)溶解于無(wú)水DCM(2mL)中，隨后加入TFA(2mL)。將溶液在室溫下在氬氣下攪拌3小時(shí)。然后將混合物蒸發(fā)至干。將殘余固體溶解于ACN(5mL)中，隨后與去離子水(15mL)混合。然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸發(fā)ACN。用1N NaOH將剩余溶液的pH調(diào)節(jié)至11，隨后將氯化鈉(1.5gm)溶解于溶液中。將水溶液用DCM(3×30mL)萃取。收集DCM相，用無(wú)水MgSO₄(1.5gm)和Na₂SO₄(20gm)干燥。將混合物過(guò)濾以去除固體，并且通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將濾液蒸發(fā)至干。將殘余物在真空中干燥過(guò)夜，得到289mg的固體(21)?；衔?1的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)表明末端Boc基團(tuán)完全裂解，如在1.37ppm處的單峰的消失所示?；衔?1的¹H NMR(Varian，10mg/mL DMSO-d6，δ)表明末端Boc基團(tuán)完全裂解，如在1.37ppm處的單峰的消失所示。

將化合物21(150mg，5.86×10^-3mmol，1當(dāng)量)溶解于氯仿(6mL)中，然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于DCM(6mL)中并且在氬氣氣氛下保護(hù)。加入琥珀酰亞胺基碘乙酸酯(3.4mg，1.2×10^-2mmol，2.0當(dāng)量)，隨后加入TEA(6.5μL，4.7×10^-2mmol，8當(dāng)量)。將溶液在黑暗中攪拌過(guò)夜。然后在攪拌下將溶液緩慢加入到80mL的二乙醚中以沉淀產(chǎn)物。過(guò)濾沉淀物，用二乙醚(5mL)沖洗，并且在真空中干燥，得到140mg的白色粉末。將固體溶解于50mM NaH₂PO₄(7mL，pH 4.6)中。然后將溶液在Slide-A-Lyzer(3-12mL，2,000MWCO)透析盒中針對(duì)DI水(3×1L)透析過(guò)夜。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶液蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于氯仿(5mL)中并且蒸發(fā)。將殘余物再溶解于氯仿(5mL)中，并且蒸發(fā)至干。然后將殘余物溶解于DCM(6mL)中，并且然后在攪拌下沉淀在二乙醚(80mL)中。過(guò)濾沉淀物，并且用二乙醚(5mL)沖洗，并且在真空中干燥，得到118mg的白色粉末(22)。22的反相HPLC分析顯示純度>99％。22的碘乙酰胺取代度為67％，如通過(guò)與3-巰基丙酸反應(yīng)后的離子交換色譜法測(cè)定的。

實(shí)例12.POZ(生物素)₁₀馬來(lái)酰亞胺與抗體的結(jié)合

將5、10和20kDa的POZ(生物素)₁₀-馬來(lái)酰亞胺試劑附著到R11sc-Fv-FC特異性ROR1抗體上。典型的結(jié)合條件是溶解于100μM乙酸鈉緩沖液(pH 5.2)中并且在室溫下混合1小時(shí)的抗體4μM、POZ-生物素100μM，DTT 0.1mM。然后使用蛋白質(zhì)-A分離柱，利用100mM乙酸鈉(pH 5.2)的洗滌和洗脫緩沖液將未結(jié)合的POZ聚合物與抗體和POZ-抗體結(jié)合物分離。然后借助于單體抗生物素蛋白流通試劑盒將結(jié)合的抗體與未結(jié)合的抗體分離，其中與聚合物主鏈連接的生物素對(duì)抗生物素蛋白具有強(qiáng)親和力。然后將不同分子量的POZ結(jié)合物與HBL-2(ROR+)和MEC-1(ROR-)細(xì)胞溫育。圖1顯示當(dāng)連接到抗體上的單個(gè)位點(diǎn)時(shí)，POZ聚合物的大小似乎不改變其與表達(dá)抗原的細(xì)胞(HBL-2)的選擇性結(jié)合的能力；聚合物-結(jié)合物顯示很少與不表達(dá)抗原的細(xì)胞(MEC-1)結(jié)合。

POZ-ADC結(jié)合活性也可以通過(guò)ELISA來(lái)驗(yàn)證。用hROR1ECD抗原包覆96孔板的每個(gè)孔，并且在37℃下在TBS中溫育1小時(shí)。用150μL 3％(w/v)BSA/TBS在37℃封閉1小時(shí)后，加入連接有或沒(méi)有連接有POZ聚合物的R11sc-Fv-FC特異性ROR1抗體，并且在37℃下溫育2小時(shí)。在該實(shí)驗(yàn)中使用的POZ分子是上面所描述的POZ 10p馬來(lái)酰亞胺聚合物。在洗滌每個(gè)孔后，加入片段特異性第二抗體、具有穩(wěn)定的HRP活性的抗人驢IgG Feγ的稀釋液。在用水洗滌后，使用2,2'-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸進(jìn)行比色檢測(cè)。使用酶標(biāo)儀在405nm處測(cè)量吸光度。繪制吸光度對(duì)ROR1抗體濃度(圖2)的圖，以描繪天然抗體與聚合物-ADC結(jié)合的抗體的結(jié)合效率。該圖顯示天然抗體和聚合物-ADC結(jié)合的抗體以類似的方式結(jié)合hROR1ECD抗原，導(dǎo)致POZ聚合物不干擾抗原結(jié)合的結(jié)論。

實(shí)例13.POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-MMAE)₁]_r-碘乙酰胺和POZ20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-MMAE)₅]_r-碘乙酰胺與抗體的結(jié)合

將POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-MMAE)₁]_a-碘乙酰胺和POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-MMAE)₅]_a-碘乙酰胺與R11sc-Fv-Fc特異性ROR1抗體、R12sc-Fv-Fc特異性ROR2抗體和CD79b抗體附著。上文對(duì)結(jié)合和提純條件進(jìn)行了說(shuō)明。使用蛋白質(zhì)-A分離柱，利用100mM乙酸鈉(pH 5.2)的洗滌和洗脫緩沖液將未結(jié)合的POZ聚合物與天然抗體和POZ-抗體結(jié)合物分離。然后借助于單體親和素流通試劑盒將POZ結(jié)合的抗體與未結(jié)合的抗體分離，其中聚合物主鏈上的生物素對(duì)抗生物素蛋白具有強(qiáng)親和力。圖3中的CD-79b POZ val-cit-PABC-MMAE結(jié)合物的SDS PAGE圖譜(考馬斯染色)顯示了結(jié)合和提純的每個(gè)步驟。然后將提純的POZ抗體結(jié)合物與HBL-2(ROR+)、MEC-1(ROR-)和拉莫斯細(xì)胞溫育。流式細(xì)胞術(shù)顯示所有POZ結(jié)合物與拉莫斯細(xì)胞而不與MEC-1細(xì)胞進(jìn)行高細(xì)胞表面結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。下面示出了通道分配。

通道樣品

1CD79b-終止

2蛋白MW標(biāo)志物

3在結(jié)合前CD79b-Sec

4蛋白A分離后CD79b-POZ-(MMAE)1

5單-抗生物素蛋白流過(guò)CD79b-POZ-(MMAE)1

6單-抗生物素蛋白分離后CD79b-POZ-(MMAE)1

7蛋白A分離后CD79b-POZ-(MMAE)5

8單-抗生物素蛋白流過(guò)CD79b-POZ-(MMAE)5

9單-抗生物素蛋白分離后CD79b-POZ-(MMAE)5

10CD79b-vc-MMAE

實(shí)例14.POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-VC-PABC-脫乙?；锼蓧A)₆]_α-碘乙酰胺和POZ 20K側(cè)基[(生物素)₂(PEG4-Phe-Lys-PABC-脫乙?；锼蓧A)₅]_α-碘乙酰胺與抗體的結(jié)合

將POI(生物素)₂(Val-Cit-PAB-DC)₆碘乙酰胺和POZ(生物素)₂(Phe-Lys-PAB-DC)₅碘乙酰胺與R11sc-Fv-FC特異性ROR1抗體、R12sc-Fv-FC特異性ROR2抗體和CD79b抗體附著。上文對(duì)典型的結(jié)合和提純條件進(jìn)行了說(shuō)明。在結(jié)合和提純的每個(gè)步驟期間，CD-79b POZ(phe-lys-PAB-DC)₅結(jié)合物的SDS PAGE圖譜(考馬斯染色)顯示發(fā)生結(jié)合和提純。然后將純的POZ抗體結(jié)合物與HBL-2(ROR+)、MEC-1(ROR-)和拉莫斯細(xì)胞溫育。流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示所有POZ結(jié)合物與HBL-2和拉莫斯細(xì)胞而不與MEC-1細(xì)胞進(jìn)行高細(xì)胞表面結(jié)合。

實(shí)例15.POZ 20K側(cè)基(PEG4-VC-PABC-MMAE)₁、POZ 20K側(cè)基(PEG4-VC-PABC-MMAE)₅、POZ(PEG4-VC-PABC-脫乙酰基秋水仙堿)₆和POZ 20K側(cè)基(PEG4-Phe-Lys-PABC-脫乙?；锼蓧A)₅的CD79b結(jié)合物的效力

在細(xì)胞毒性測(cè)定中，將拉莫斯和MEC-1細(xì)胞與不同濃度的CD79b結(jié)合的POZ藥物結(jié)合物溫育96小時(shí)。圖4顯示增加濃度的CD79b-POZ結(jié)合物對(duì)體外拉莫斯細(xì)胞生存力(％)的影響。數(shù)據(jù)顯示具有一個(gè)附著的MMAE分子的POZ Val-Cit-PAB結(jié)合物具有約20nM的IC₅₀。當(dāng)與具有平均5個(gè)MMAE分子的結(jié)合物相比時(shí)，IC₅₀降低約一個(gè)log至約2nM。該數(shù)據(jù)顯示，增加每個(gè)POZ結(jié)合物的MMAE分子的數(shù)量使IC₅₀增加10倍；即較高的藥物抗體比例(DAR)改善聚合物-ADC的活性和效力。DC的POZ val-cit-PAB結(jié)合物具有約200nM的IC₅₀，并且DC的POZ Phe-Lys-PAB結(jié)合物具有降低的活性，即使兩種CD-79b結(jié)合物與拉莫斯細(xì)胞進(jìn)行高細(xì)胞表面結(jié)合。這表明在拉莫斯細(xì)胞研究中，脫乙?；锼蓧A(DC)不如MMAE有效。另外，Val-Cit連接基團(tuán)似乎在細(xì)胞內(nèi)釋放時(shí)更容易，這可能對(duì)于其中細(xì)胞內(nèi)釋放是一個(gè)因素的一些應(yīng)用具有吸引力。圖5顯示CD79b-POZ結(jié)合物的濃度對(duì)MEC-1細(xì)胞的生存力(％)的影響。數(shù)據(jù)顯示MMAE的POZ val-cit-PAB結(jié)合物具有大于300nM的IC₅₀，并且利用DC作為細(xì)胞毒素劑的結(jié)合物沒(méi)有活性。由于CD79b抗體的低濃度的抗原，如所預(yù)期的，所有這些結(jié)合物與MEC-1細(xì)胞進(jìn)行較差的細(xì)胞表面結(jié)合。

實(shí)例16.POZ 20K側(cè)基(PEG4-VC-PABC-MMAE)₅的R11結(jié)合物的效力

在細(xì)胞毒性測(cè)定中將HBL-2和MEC-1細(xì)胞與不同濃度的與POZ-MMAE結(jié)合的R11溫育96小時(shí)。圖6顯示了R11-POZ-(PEG4-VC-PABC-MMAE)₅結(jié)合物的濃度對(duì)體外HBL-2(ROR+)和MEC-1(ROR-)細(xì)胞的生存力(％)的影響。數(shù)據(jù)顯示，該化合物對(duì)HBL-2細(xì)胞的IC₅₀為約200nM，以及對(duì)MEC-1細(xì)胞沒(méi)有活性。