本發(fā)明涉及新型肽和含有該肽的免疫激活劑、疫苗用佐劑、疫苗組合物或育發(fā)劑。

背景技術(shù)：

佐劑是通過與抗原混合后給藥于生物體而增強針對所給藥的抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。佐劑包括誘導(dǎo)Th1型反應(yīng)的佐劑、誘導(dǎo)Th2型反應(yīng)的佐劑、或者誘導(dǎo)Th1型和Th2型這兩型反應(yīng)的佐劑。疫苗治療中通常需要佐劑，一方面使宿主容易識別抗原，另一方面要求長期停留在局部的性能。由于佐劑具有引起炎癥的性質(zhì)，因此給藥部位的疼痛、腫脹等副反應(yīng)常常成為問題，在迄今為止已得到臨床應(yīng)用的疫苗中給藥部位的副反應(yīng)也常常作為問題被提出。一直以來，使用Alum(氫氧化鋁)作為佐劑，但要求安全性比較高的、對于提高疫苗的效率更為有效的佐劑。

因年齡增長、遺傳因素、社會壓力等原因所導(dǎo)致的脫發(fā)癥而煩惱的人很多，對促進生發(fā)的育發(fā)劑、防止脫發(fā)的抗脫發(fā)劑等進行了各種開發(fā)。

例如，已知含有來源于具有特定序列的大豆蛋白的肽作為有效成分的抗脫發(fā)劑(專利文獻1)。

本發(fā)明人們之前發(fā)現(xiàn)了作為兼具血管新生作用和抗菌作用的肽的由30個氨基酸殘基構(gòu)成的AG30(非專利文獻1、專利文獻2)，對其加以改變而對血管新生作用和抗菌作用進行了改良(非專利文獻2、專利文獻3、專利文獻4、專利文獻5、專利文獻6)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特開2008-247874號公報

專利文獻2：國際公開第2005/090564號

專利文獻3：國際公開第2010/061915號

專利文獻4：國際公開第2010/101237號

專利文獻5：國際公開第2010/137594號

專利文獻6：日本特開2012-14583號公報

非專利文獻

非專利文獻1：J.Cell.Mol.Med.，2008；13：535-46

非專利文獻2：J.Cell.Mol.Med.Vol16，No7，2012，pp.1629-1639

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的問題

本發(fā)明的課題在于提供具有免疫激活作用或育發(fā)、生發(fā)促進作用的新型短鏈肽，并提供含有該肽的新型免疫激活劑、疫苗用佐劑、疫苗組合物或育發(fā)劑。

用于解決問題的方法

為了解決上述問題，本發(fā)明人通過對AG30進一步加以改變而發(fā)現(xiàn)了具有免疫激活作用或育發(fā)、生發(fā)促進作用的由23個以下的氨基酸殘基構(gòu)成的肽，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明包含下述各發(fā)明。

[1]一種肽，其包含LHRLKRLRKRL(序列編號1)所表示的氨基酸序列且由23個以下的氨基酸構(gòu)成。

[2]如上述[1]所述的肽，其包含LHRLKRLRKRLK(序列編號9)所表示的氨基酸序列。

[3]如上述[1]或[2]所述的肽，其包含ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(序列編號2)的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。

[4]如上述[1]～[3]中任一項所述的肽，其C末端進行了酰胺化。

[5]如上述[1]～[4]中任一項所述的肽，其N末端進行了乙?；?/p>

[6]一種免疫激活劑，其含有上述[1]～[5]中任一項所述的肽。

[7]如上述[6]所述的免疫激活劑，其為疫苗用佐劑。

[8]一種疫苗組合物，其含有上述[1]～[5]中任一項所述的肽和至少一種抗原。

[9]一種育發(fā)劑，其含有上述[1]～[5]中任一項所述的肽。

[10]一種免疫激活方法，其特性在于，對哺乳動物給藥有效量的上述[1]～[5]中任一項所述的肽。

[11]一種疫苗抗原的免疫原性增強方法，其特性在于，對哺乳動物給藥有效量的上述[1]～[5]中任一項所述的肽。

[12]如上述[1]～[5]中任一項所述的肽，其用于激活免疫應(yīng)答。

[13]如上述[1]～[5]中任一項所述的肽，其用于增強疫苗抗原的免疫原性。

[14]上述[1]～[5]中任一項所述的肽在制造免疫激活劑、疫苗用佐劑或疫苗組合物中的用途。

[15]一種育發(fā)或生發(fā)促進方法，其特征在于，對哺乳動物給藥有效量的上述[1]～[5]中任一項所述的肽。

[16]如上述[1]～[5]中任一項所述的肽，其用于促進育發(fā)或生發(fā)。

[17]上述[1]～[5]中任一項所述的肽在制造育發(fā)劑中的用途。

發(fā)明效果

本發(fā)明提供新型肽。本發(fā)明的新型肽具有免疫激活作用和育發(fā)、生發(fā)促進作用。本發(fā)明的新型肽與之前的專利等中記載的類似肽相比具有顯著強的免疫激活作用。此外，本發(fā)明能夠提供含有該肽的新型免疫激活劑、疫苗用佐劑、疫苗組合物和育發(fā)劑。

本發(fā)明的肽具有細胞因子產(chǎn)生誘導(dǎo)作用、T細胞活化共刺激分子表達誘導(dǎo)作用、炎性小體活化作用，作為免疫激活劑有用。此外，具有疫苗抗原的免疫原性增強作用，作為疫苗用佐劑特別有用。含有本發(fā)明的肽的疫苗用佐劑在針對感染癥、癌癥、生活習慣病等的各種疫苗療法中能夠作為高效的佐劑使用。此外，由于建立了高效的合成法、檢驗法，因此本發(fā)明的氨基酸殘基數(shù)為23以下的短鏈肽具有能夠以低廉的成本批量生產(chǎn)的優(yōu)點。

本發(fā)明的肽具有毛乳頭細胞生長作用和促進針對毛乳頭細胞的生長因子產(chǎn)生的作用，作為育發(fā)劑、生發(fā)促進劑等有用。本發(fā)明人們對由30個氨基酸殘基構(gòu)成的AG30加以改變而合成了多種肽，結(jié)果，在毛乳頭細胞生長作用和促進針對毛乳頭細胞的生長因子產(chǎn)生的作用方面，本發(fā)明的肽具有顯著強的活性。此外，由于建立了高效的合成法和檢驗法，因此作為有效成分的氨基酸殘基數(shù)為23以下的短鏈肽具有能夠以低廉的成本批量生產(chǎn)的優(yōu)點。

附圖說明

圖1是示出對在利用LPS致敏的THP-1細胞中添加OSK-1后的培養(yǎng)上清中的細胞因子濃度進行測定的結(jié)果的圖，(A)為IL-1β的結(jié)果、(B)為IL-18的結(jié)果、(C)為TNFα的結(jié)果、(D)為IL-6的結(jié)果。

圖2是示出對在利用PMA進行了分化的THP-1細胞中添加OSK-1后的培養(yǎng)上清中的細胞因子濃度進行測定的結(jié)果的圖，(A)為IL-1β的結(jié)果、(B)為IL-18的結(jié)果、(C)為TNFα的結(jié)果、(D)為IL-6的結(jié)果。

圖3是示出對在THP-1細胞中添加OSK-1、AAP-1～AAP-6后的CD86和CD54的表達量進行測定的結(jié)果的圖，(A)為CD86的結(jié)果、(B)為CD54的結(jié)果。

圖4是示出對在THP-1細胞中添加AAP-6、AAP-11和AAP-12后的CD86和CD54的表達量進行測定的結(jié)果的圖，(A)為CD86的結(jié)果、(B)為CD54的結(jié)果。

圖5是示出利用蛋白免疫印跡對NLRP3的表達水平進行確認的結(jié)果的圖。

圖6是示出使用轉(zhuǎn)染了針對NLRP3的siRNA或?qū)φ誷iRNA的THP-1細胞、對以10μg/mL的濃度添加OSK-1后的IL-1β和TNFα產(chǎn)生量進行比較的結(jié)果的圖，(A)為IL-1β的結(jié)果、(B)為TNFα的結(jié)果。

圖7是示出基于利用LPS對THP-1細胞致敏的有無，對OSK-1的IL-1β產(chǎn)生作用進行比較的結(jié)果的圖。

圖8是示出基于組織蛋白酶B抑制劑和半胱天冬酶-1抑制劑的有無，對OSK-1的IL-1β產(chǎn)生作用進行比較的結(jié)果的圖。

圖9是示出將犬體內(nèi)的OSK-1的佐劑效果與弗氏佐劑(FA)的效果進行比較的結(jié)果的圖，(A)為OSK-1組的結(jié)果、(B)為FA組的結(jié)果。

圖10是示出將小鼠體內(nèi)的OSK-1的佐劑效果與Alum、弗氏佐劑(FA)的佐劑效果進行比較的結(jié)果的圖。

圖11是示出使OSK-1、AAP-1～AAP-6作用于人毛乳頭細胞并對培養(yǎng)上清中的生長因子濃度進行測定的結(jié)果的圖，(A)為KGF的結(jié)果、(B)為HGF的結(jié)果、(C)為VEGF的結(jié)果。

圖12是示出將OSK-1和類似肽對THP-1細胞的CD54表達誘導(dǎo)作用進行比較的結(jié)果的圖。

圖13是示出OSK-1的MS分析結(jié)果的圖。

圖14是示出OSK-1的HPLC分析結(jié)果的圖。

圖15是示出對在利用PMA進行了分化的THP-1細胞中添加OSK-1后的培養(yǎng)上清中的細胞因子、趨化因子濃度進行測定的結(jié)果的圖，(A)為IL-1β的結(jié)果、(B)為IL-18的結(jié)果、(C)為TNFα的結(jié)果、(D)為IL-6的結(jié)果、(E)為RANTES的結(jié)果、(F)為MIP-1α的結(jié)果、(G)為MIP-1β的結(jié)果。

圖16是示出對在利用LPS致敏的RAW264.7細胞中添加OSK-1后的培養(yǎng)上清中的細胞因子濃度進行測定的結(jié)果的圖，(A)為IL-1β的結(jié)果、(B)為IL-18的結(jié)果、(C)為TNFα的結(jié)果、(D)為IL-6的結(jié)果。

圖17是示出對在小鼠骨髄來源樹突細胞中添加OSK-1后的培養(yǎng)上清中的細胞因子濃度進行測定的結(jié)果的圖，(A)為IL-1β的結(jié)果、(B)為IFNγ的結(jié)果、(C)為TNFα的結(jié)果、(D)為IL-6的結(jié)果、(E)為IL-12p70的結(jié)果。

圖18是示出對在利用LPS致敏的THP-1細胞中添加OSK-1、Alum或CpG核苷酸后的培養(yǎng)上清中的細胞因子濃度進行測定的結(jié)果的圖，(A)為IL-1β的結(jié)果、(B)為IL-18的結(jié)果、(C)為TNFα的結(jié)果、(D)為IL-6的結(jié)果。

圖19是示出對在THP-1細胞中添加OSK-1或Alum后的CD86和CD54的表達量進行測定的結(jié)果的圖，(A)為CD86的結(jié)果、(B)為CD54的結(jié)果。

圖20是示出確認OSK-1對于THP-1細胞的NFκB的活化作用的結(jié)果的圖。

圖21是示出將OSK-1-血管緊張素II結(jié)合疫苗給藥于小鼠并對抗體產(chǎn)生作用進行評價的結(jié)果的圖。

圖22是示出將OSK-1-血管緊張素II結(jié)合疫苗給藥于小鼠并對所產(chǎn)生的抗體的亞型進行分析的結(jié)果的圖，(A)是使用10倍稀釋血清的結(jié)果、(B)是使用50倍稀釋血清的結(jié)果。

圖23是示出使OSK-1、AAP-11作用于人毛乳頭細胞并對培養(yǎng)上清中的生長因子濃度進行測定的結(jié)果的圖，(A)為KGF的結(jié)果、(B)為HGF的結(jié)果、(C)為VEGF的結(jié)果。

圖24是示出對OSK-1在小鼠中的育發(fā)作用進行確認的結(jié)果的圖，(A)為第17天的被毛的長度，(B)為示出生毛得分的結(jié)果的圖。

具體實施方式

[肽]

本發(fā)明提供包含LHRLKRLRKRL(序列編號1)所表示的氨基酸序列且由23個以下的氨基酸構(gòu)成的肽(以下，也將它們簡稱為“本發(fā)明的肽”)。本發(fā)明的肽只要包含序列編號1所表示的氨基酸序列即可。

本發(fā)明的肽為由序列編號1所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽、或者由在序列編號1所表示的氨基酸序列的N末端側(cè)、C末端側(cè)、或N末端側(cè)和C末端側(cè)附加一個以上的氨基酸而得到的氨基酸序列表示的肽。本發(fā)明的肽可以包含在序列編號1所表示的氨基酸序列的N末端側(cè)附加F、IF、LIF、KLIF、LKLIF、ELKLIF等氨基酸序列而得到的氨基酸序列。本發(fā)明的肽可以包含在序列編號1所表示的氨基酸序列的C末端側(cè)附加K、KR、KRK、KRKL、KRKLR、KRKLRL、KRKLRLW、KRKLRLWH、KRKLRLWHR、KRKLRLWHRK、KRKLRLWHRKR、KRKLRLWHRKRY等氨基酸序列而得到的氨基酸序列。

本發(fā)明的肽優(yōu)選為包含在序列編號1所表示的氨基酸序列的C末端側(cè)附加K而得到的序列、即LHRLKRLRKRLK(序列編號9)所表示的氨基酸序列且由23個以下的氨基酸構(gòu)成的肽。進一步優(yōu)選序列編號9所表示的氨基酸序列的C末端的K為L型。

本發(fā)明的肽進一步優(yōu)選為包含LHRLKRLRKRL(序列編號1)所表示的氨基酸序列且由23個以下的氨基酸構(gòu)成的、包含ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(序列編號2)的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列的肽。更優(yōu)選為包含具有95％以上的同一性的氨基酸序列的肽。作為進一步優(yōu)選的肽，包括由序列編號2、3或6所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽和包含這些序列的肽。

本發(fā)明的肽進一步優(yōu)選包含序列編號1所表示的氨基酸序列且由ELKLIFLHRLKRLRKRLKRKLRLWHRKRY(序列編號14)所表示的氨基酸序列中的23個以下的氨基酸構(gòu)成的肽。

本發(fā)明的肽中氨基酸的個數(shù)的下限值為11個，可以為12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個。本發(fā)明的肽中氨基酸的個數(shù)的上限值為23個，可以為22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個。

LHRLKRLRKRL(序列編號1)所表示的氨基酸序列的C末端的“L”、“RL”或“KRL”對于本發(fā)明的肽的免疫激活作用或育發(fā)作用有很大影響。

LHRLKRLRKRL(序列編號1)所表示的氨基酸序列的N末端的“L”對本發(fā)明的肽的免疫激活作用或育發(fā)作用有很大影響。

本發(fā)明的肽進一步優(yōu)選為包含ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(序列編號2)、ELKLIFLHRLKRLRKRLK(序列編號3)、LKLIFLHRLKRLRKRLKR(序列編號6)、KLIFLHRLKRLRKRLK(序列編號7)、LIFLHRLKRLRKRL(序列編號8)、FLHRLKRLRKRL(序列編號10)等所表示的氨基酸序列的肽。

本發(fā)明的肽特別優(yōu)選為由ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(序列編號2)、ELKLIFLHRLKRLRKRLK(序列編號3)、LKLIFLHRLKRLRKRLKR(序列編號6)、KLIFLHRLKRLRKRLK(序列編號7)、LIFLHRLKRLRKRL(序列編號8)、FLHRLKRLRKRL(序列編號10)等所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。

本發(fā)明的肽進一步特別優(yōu)選為由ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(序列編號2)、ELKLIFLHRLKRLRKRLK(序列編號3)、LKLIFLHRLKRLRKRLKR(序列編號6)、KLIFLHRLKRLRKRLK(序列編號7)所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。

本發(fā)明的肽進一步特別優(yōu)選為由ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(序列編號2)、ELKLIFLHRLKRLRKRLK(序列編號3)、LKLIFLHRLKRLRKRLKR(序列編號6)構(gòu)成的肽。

本發(fā)明的肽的C末端可以為羧基(-COOH)、羧酸根(-COO-)、酰胺(-CONH₂)或酯(-COOR)中的任意一種。作為酯中的R，除了可以列舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基或正丁基等C_1-6烷基；例如環(huán)戊基、環(huán)己基等C_3-8環(huán)烷基；例如苯基、α-萘基等C_6-12芳基；例如芐基、苯乙基等苯基-C_1-2烷基或α-萘基甲基等α-萘基-C_1-2烷基等C_7-14芳烷基以外，還可以列舉作為經(jīng)口用酯通用的特戊酰氧基甲基等。作為酰胺體，可以列舉酰胺、由1個或2個C_1-6烷基取代的酰胺、由1個或2個經(jīng)苯基取代的C_1-6烷基取代的酰胺、包含酰胺基的氮原子在內(nèi)形成5至7元環(huán)的氮雜環(huán)烷烴的酰胺等。在本發(fā)明的肽在C末端以外具有羧基或羧酸根的情況下，將這些基團進行酰胺化或酯化而得到的肽也包含在本發(fā)明的肽中。本發(fā)明的肽優(yōu)選C末端進行了酰胺化。

本發(fā)明的肽還包含N末端的氨基被保護基(例如，甲?；?、乙?；菴_2-6烷酰基等C_1-6?；?保護著的肽、N末端側(cè)在生物體內(nèi)被切斷而生成的谷氨?；l(fā)生了焦谷氨酸化的肽、分子內(nèi)的氨基酸的側(cè)鏈上的取代基(例如，-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被適當?shù)谋Ｗo基(例如，甲?；⒁阴；菴_2-6烷?；菴_1-6?；?保護著的肽。本發(fā)明的肽優(yōu)選N末端進行了乙?；?。本發(fā)明的肽進一步優(yōu)選N末端進行了乙?；褻末端進行了酰胺化。

構(gòu)成本發(fā)明的肽的氨基酸的側(cè)鏈可以被任意的取代基進行修飾。取代基沒有特別限定，可以列舉例如氟原子、氯原子、氰基、羥基、硝基、烷基、環(huán)烷基、烷氧基、氨基、磷酸基等。另外，側(cè)鏈的取代基可以被保護基進行保護。此外，結(jié)合有糖鏈的糖肽也包含在本發(fā)明的肽中。

本發(fā)明的肽可以形成鹽，作為其鹽，優(yōu)選生理學(xué)上可接受的鹽。作為生理學(xué)上可接受的鹽，可以列舉例如與鹽酸、硫酸、乳酸、酒石酸、馬來酸、富馬酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸、油酸、棕櫚酸、硝酸、磷酸、三氟乙酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸等酸的鹽；與鈉、鉀、鈣等堿金屬或堿土金屬、或鋁的氫氧化物或碳酸鹽的鹽；與三乙胺、芐胺、二乙醇胺、叔丁胺、二環(huán)己胺、精氨酸等的鹽等。其中，更優(yōu)選鹽酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽。

本發(fā)明的肽只要可保持原來的肽的特性，也可以包含非天然氨基酸。另外，本發(fā)明的肽只要可保持原來的肽的特性，也可以在肽上連接其他物質(zhì)。作為可連接在肽上的其他物質(zhì)，可以列舉例如脂質(zhì)、糖或糖鏈、乙?；?、天然或合成的聚合物等。另外，本發(fā)明的肽只要可保持原來的肽的特性，也可以對肽進行糖鏈附加、側(cè)鏈氧化、磷酸化等修飾。

本發(fā)明的肽可以按照公知的一般的肽合成的操作規(guī)程利用固相合成法(Fmoc法、Boc法)或液相合成法來制造。另外，可以使用導(dǎo)入有含有編碼本發(fā)明的肽的DNA的表達載體的轉(zhuǎn)化體來制造。另外，可以通過使用導(dǎo)入有含有編碼在一部分包含本發(fā)明的肽的肽的DNA的表達載體的轉(zhuǎn)化體來獲取肽、并將其用適當?shù)牡鞍酌富螂拿盖袛鄟碇圃?。另外，可以通過使用體外轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)的方法來制造。

本發(fā)明的肽具有細胞因子產(chǎn)生誘導(dǎo)作用、T細胞活化共刺激分子表達誘導(dǎo)作用、炎性小體活化作用，作為免疫激活劑有用。特別是作為疫苗用佐劑有用。此外，本發(fā)明的肽具有毛乳頭細胞生長作用、促進針對毛乳頭細胞的生長因子產(chǎn)生的作用等，對育發(fā)、養(yǎng)發(fā)、促進生發(fā)有用。

[免疫激活劑]

本發(fā)明提供含有上述本發(fā)明的肽作為有效成分的免疫激活劑。本發(fā)明適合提供疫苗用佐劑。此外，本發(fā)明提供含有上述本發(fā)明的肽的疫苗組合物。

本發(fā)明的免疫激活劑含有至少一種本發(fā)明的肽?？梢赃M一步含有為了免疫激活而使用的其他有效成分。通過將本發(fā)明的肽與為了免疫激活而使用的其他有效成分組合使用，可以期待相加或協(xié)同地提高免疫激活作用。

另外，本發(fā)明的免疫激活劑可以單獨或與多種藥劑并用來治療各種疾病。例如，可以與抗癌劑并用而用于治療。

本發(fā)明的免疫激活劑通過具有例如細胞因子產(chǎn)生誘導(dǎo)作用、T細胞活化共刺激分子表達誘導(dǎo)作用、炎性小體活化作用等而顯示出優(yōu)良的免疫激活作用。另外，本發(fā)明的免疫激活劑在激活Th1型、Th2型這兩型免疫應(yīng)答的方面有用。

此外，本發(fā)明的免疫激活劑具有增強疫苗抗原的免疫原性的作用，可以適合作為優(yōu)良的疫苗用佐劑使用。

本發(fā)明的疫苗用佐劑包含至少一種本發(fā)明的肽。本發(fā)明的疫苗用佐劑可以進一步含有其他佐劑或為了免疫激活而使用的其他有效成分。通過將本發(fā)明的肽與佐劑或為了免疫激活而使用的其他有效成分組合使用，可以期待相加或協(xié)同地提高佐劑作用或免疫激活作用。作為佐劑或為了免疫激活而使用的其他有效成分，可以列舉Alum、弗氏佐劑(Freund’s Adjuvant，完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑)、TLR激活劑(云芝多糖(Krestin)、脂多糖、鞭毛蛋白、CpG核苷酸)等。

另外，本發(fā)明的疫苗用佐劑可以是與包含至少一種抗原的疫苗分別包裝、在使用時進行混合的試劑盒制劑。

疫苗沒有限定，為了增強感染癥預(yù)防疫苗、癌疫苗、誘導(dǎo)針對導(dǎo)致疾病的生物體內(nèi)蛋白的免疫的疫苗等所有疫苗的免疫原性，可以適當使用本發(fā)明的疫苗用佐劑。作為感染癥預(yù)防疫苗，可以列舉流感、脊髓灰質(zhì)炎、流行性乙型腦炎、結(jié)核菌、人乳頭瘤、瘧疾、SARS、傷寒、副傷寒、鼠疫、百日咳、斑疹傷寒等感染癥用疫苗。作為癌疫苗的癌抗原或癌抗原肽，可以列舉例如WT1肽、MAGE肽、MUC1肽、生存素等。作為導(dǎo)致疾病的生物體內(nèi)蛋白，可以列舉β-淀粉樣蛋白、血管緊張素II、DPPIV、IgE、IL-17、PD-1、PD-L1等?？乖梢詾楸砦恍蛄信c載體蛋白(例如鑰孔戚血藍蛋白(KLH)等)結(jié)合的形態(tài)。

作為疫苗用佐劑特別優(yōu)選的肽為由序列編號2、3、6、7、8和10中任一序列所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽，更優(yōu)選由序列編號2、3、6和7中任一序列所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽，進一步優(yōu)選由序列編號2或3所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。更優(yōu)選由序列編號2所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。此外，更優(yōu)選N末端進行了乙?；褻末端進行了酰胺化的肽。認為本發(fā)明的疫苗用佐劑與以往的Alum、油性佐劑相比，不易產(chǎn)生疼痛、硬結(jié)等不期望的作用。

另外，本發(fā)明的免疫激活劑也可以適當用于將人或其他哺乳動物等的組織、細胞取出至其體外并激活、將激活的組織、細胞用于治療等的方法。例如，在取出癌癥患者的單核細胞，在含有細胞生長因子、GM-CSF、IL-4等的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，由此誘導(dǎo)出樹突細胞，使樹突細胞攝取癌抗原或癌抗原肽并將其返回至體內(nèi)的治療方法中，可以與癌抗原或癌抗原肽一同使用本發(fā)明的免疫激活劑。此時，可以與佐劑或為了免疫激活而使用的其他有效成分組合使用。作為癌抗原或癌抗原肽，可以列舉例如WT1肽、MAGE肽、MUC1肽、生存素等。

[疫苗組合物]

本發(fā)明的疫苗組合物包含至少一種上述本發(fā)明的肽和至少一種抗原。該疫苗組合物包括：至少一種本發(fā)明的肽與至少一種抗原配合而成的制劑的方式；和包含至少一種本發(fā)明的肽與至少一種抗原連接而成的連接體的制劑的方式。作為連接體，可以列舉例如本發(fā)明的肽與抗原形成一條多肽而連接的方式。該連接體可以是抗原與本發(fā)明的肽直接進行連接，另外也可以經(jīng)由間隔物等進行連接。作為間隔物，可以列舉例如ε-氨基己酸，但不限定于此。將間隔物與本發(fā)明的肽或抗原肽結(jié)合的方法可以利用酰胺鍵、二硫鍵。另外，可以列舉以PEG或任意的寡肽作為間隔物的方法等。

本發(fā)明的疫苗組合物中含有的抗原沒有特別限定。只要是能夠用于上述感染癥預(yù)防疫苗、癌疫苗、誘導(dǎo)針對導(dǎo)致疾病的生物體內(nèi)蛋白的免疫的疫苗等所有疫苗的抗原，則任意的抗原均可以適當用于本發(fā)明的疫苗組合物。另外，抗原特別優(yōu)選使用表位序列的肽?？乖部梢詾榕c載體蛋白結(jié)合的形態(tài)。本說明書中，將作為疫苗的抗原使用的抗原稱為“疫苗抗原”。

[細胞因子產(chǎn)生誘導(dǎo)劑、T細胞活化共刺激分子表達誘導(dǎo)劑、炎性小體活化劑]

本發(fā)明的免疫激活劑由于具有例如細胞因子產(chǎn)生誘導(dǎo)作用、T細胞活化共刺激分子表達誘導(dǎo)作用、炎性小體活化作用等而顯示出優(yōu)良的免疫激活作用。因此，本發(fā)明的免疫激活劑包括細胞因子產(chǎn)生誘導(dǎo)劑、T細胞活化共刺激分子表達誘導(dǎo)劑、炎性小體活化劑等。

作為確認本發(fā)明的肽的細胞因子產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的方法，可以列舉例如實施例2和3記載的方法等。作為確認本發(fā)明的肽的T細胞活化共刺激分子表達誘導(dǎo)作用的方法，可以列舉例如實施例4記載的方法等。作為確認本發(fā)明的肽的炎性小體活化作用的方法，可以列舉例如實施例5和6記載的方法等。作為確認本發(fā)明的肽的佐劑作用的方法，可以列舉例如上述免疫激活作用(實施例2～6)和實施例7和8記載的方法等。

細胞因子產(chǎn)生誘導(dǎo)劑包含至少一種本發(fā)明的肽。特別優(yōu)選的肽為由序列編號2、3、6、7、8和10中任一序列所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽，更優(yōu)選由序列編號2所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。此外，更優(yōu)選N末端進行了乙?；褻末端進行了酰胺化的肽。

本說明書中，細胞因子可以列舉例如IL-1β、IL-18、TNFα、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-γ、IFN-α、IL-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、iNOS、IL-17、IL-23等，優(yōu)選為IL-1β、IL-18、TNFα、IL-6等。

T細胞活化共刺激分子表達誘導(dǎo)劑包含至少一種本發(fā)明的肽。特別優(yōu)選的肽為由序列編號2、3、6、7、8和10中任一序列所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽，更優(yōu)選由序列編號2、3、6和7中任一序列所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽，進一步優(yōu)選由序列編號2或3所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。此外，更優(yōu)選N末端進行了乙?；褻末端進行了酰胺化的肽。

本說明書中，T細胞活化共刺激分子可以列舉例如CD86、CD54、CD80、CD106、CD40等，優(yōu)選為CD86、CD54等。

炎性小體的活化劑包含至少一種本發(fā)明的肽。特別優(yōu)選的肽為由序列編號2、3、6、7、8和10中任一序列所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽，更優(yōu)選由序列編號2所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。此外，更優(yōu)選N末端進行了乙?；褻末端進行了酰胺化的肽。

本發(fā)明的免疫抑制劑、疫苗用佐劑或疫苗組合物含有上述本發(fā)明的肽，可以適當配合藥學(xué)上可接受的載體或添加劑而進行制劑化。具體而言，可以制成片劑(包括糖衣片)、包覆片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑、懸浮劑、乳劑等經(jīng)口劑；注射劑(例如皮下注射劑、靜脈內(nèi)注射劑、肌肉內(nèi)注射劑、腹腔內(nèi)注射劑)、輸液、點滴劑、外用劑(例如經(jīng)鼻給藥制劑、經(jīng)皮制劑、軟膏劑)、栓劑(例如直腸栓劑、陰道栓劑)、軟膏、貼片劑、液劑等非經(jīng)口劑。

經(jīng)口用的固體劑(片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑等)可以將有效成分與賦形劑(乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纖維素、淀粉等)、粘結(jié)劑(羥丙基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、硅酸鋁鎂等)、崩解劑(纖維素乙醇酸鈣等)、潤滑劑(硬脂酸鎂等)、穩(wěn)定劑、助溶劑(谷氨酸、天冬氨酸等)等混合，按照常規(guī)方法進行制劑化。可以根據(jù)需要用包衣劑(白糖、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯等)進行包覆，另外也可以用兩層以上的層進行包覆。

經(jīng)口用的液劑(水劑、懸浮劑、乳劑、糖漿劑、酏劑等)通過將有效成分溶解、懸浮或乳化在通常使用的稀釋劑(純水、乙醇或它們的混合液等)中進行制劑化。該液劑可以進一步含有潤濕劑、助懸劑、乳化劑、甜味劑、風味劑、芳香劑、防腐劑、緩沖劑等。

作為非經(jīng)口劑，可以列舉例如皮膚外用劑。皮膚外用劑可以應(yīng)用于液劑、霜劑、軟膏劑、凝膠劑、氣溶膠劑等，但只要是適合外用的劑型，則不限定于這些。

皮膚外用劑中可以根據(jù)需要配合水、低級醇、助溶劑、表面活性劑、乳化穩(wěn)定劑、凝膠化劑、粘合劑、以及為了得到期望的劑型而通常使用的基劑成分，也可以根據(jù)使用目的在不損害本發(fā)明效果的范圍內(nèi)適當配合血管擴張劑、腎上腺皮質(zhì)激素、保濕劑、殺菌劑、清涼劑、維生素類、香料、色素等。

作為非經(jīng)口劑，可以列舉例如注射劑。注射劑包含溶液、懸浮液、乳濁液和使用時溶解或懸浮在溶劑中使用的固體的注射劑。注射劑通過將有效成分溶解、懸浮或乳化在溶劑中進行制劑化。作為溶劑，可以使用例如注射用蒸餾水、生理鹽水、植物油、丙二醇、聚乙二醇、乙醇之類的醇類等和它們的組合。該注射劑可以進一步含有穩(wěn)定劑、助溶劑(谷氨酸、天冬氨酸、聚山梨酯80(注冊商標)等)、助懸劑、乳化劑、無痛劑、緩沖劑、防腐劑等。這些注射劑在最終工序中滅菌或者通過無菌操作法來制造。另外也可以制造無菌的固體劑、例如冷凍干燥品，在其使用前進行無菌化或溶解在無菌的注射用蒸餾水或其他溶劑中來使用。

關(guān)于本發(fā)明的免疫激活劑、疫苗用佐劑和疫苗組合物的制劑化中使用的載體或添加劑的配合比例，基于藥品領(lǐng)域中通常采用的范圍適當設(shè)定即可。可以配合的載體或添加劑沒有特別限制，可以列舉例如：水、生理鹽水、其他水性溶劑、水性或油性基劑等各種載體；賦形劑、粘結(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、崩解劑、吸收促進劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑、香料等各種添加劑。

作為在片劑、膠囊劑等中可以混合的添加劑，可以使用例如：明膠、玉米淀粉、黃蓍膠、阿拉伯樹膠之類的粘結(jié)劑；結(jié)晶性纖維素之類的賦形劑；玉米淀粉、明膠、海藻酸等之類的膨化劑；硬脂酸鎂之類的潤滑劑、蔗糖、乳糖或糖精之類的甜味劑；薄荷、白株樹油(ア力モノ油)或櫻桃之類的香味劑等。在制劑單元形態(tài)為膠囊的情況下，上述類型的材料中可以進一步含有油脂之類的液態(tài)載體。用于注射的無菌組合物可以按照通常的制劑方法(例如將有效成分溶解或懸浮在注射用水、天然植物油等溶劑中等)來制備。作為注射用的水性液，可以使用例如含有生理鹽水、葡萄糖或其他輔助藥劑的等滲液(例如D-山梨醇、D-甘露醇、氯化鈉等)等，可以與適當?shù)闹軇?、例如?例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性表面活性劑(例如聚山梨酯80^TM、HCO-50)等并用。作為油性液，可以使用例如芝麻油、大豆油等，可以與作為助溶劑的苯甲酸芐酯、芐醇等并用。另外，可以與緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖液、乙酸鈉緩沖液)、無痛劑(例如苯扎氯銨、鹽酸普魯卡因等)、穩(wěn)定劑(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐劑(例如芐醇、苯酚等)、抗氧化劑等配合。

如此得到的制劑例如可以對人或其他哺乳動物(例如大鼠、小鼠、兔、山羊、豬、牛、貓、犬、猴等)進行給藥。

給藥量根據(jù)給藥對象、對象疾病、給藥途徑等而不同，例如在經(jīng)口給藥的情況下，通常對于成人(以體重60kg計)而言，每天給藥約0.1mg～約100mg、優(yōu)選約1.0mg～約50mg、更優(yōu)選約1.0mg～約20mg的有效成分。例如，在以注射劑的形態(tài)非經(jīng)口給藥的情況下，通常對于成人(以體重60kg計)而言，每天靜脈內(nèi)給藥約0.01mg～約30mg、優(yōu)選約0.1mg～約20mg、更優(yōu)選約0.1mg～約10mg的有效成分。每天的總給藥量可以為單次給藥量，也可以為多次給藥量。

作為本發(fā)明的免疫激活劑、疫苗用佐劑或疫苗用組合物的給藥方法，可以列舉經(jīng)皮給藥、經(jīng)粘膜給藥、經(jīng)口給藥、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射等，更優(yōu)選皮內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射。在將本發(fā)明的疫苗用佐劑與疫苗抗原并用給藥的情況下，疫苗抗原的給藥可以于與本發(fā)明的疫苗用佐劑同時給藥，也可以在本發(fā)明的疫苗用佐劑給藥后進行疫苗抗原的給藥，還可以在本發(fā)明的疫苗用佐劑給藥前進行疫苗抗原的給藥。

[育發(fā)劑]

本發(fā)明提供含有上述本發(fā)明的肽作為有效成分的育發(fā)劑。本發(fā)明的育發(fā)劑由于具有例如毛乳頭細胞生長作用、促進針對毛乳頭細胞的生長因子產(chǎn)生的作用、養(yǎng)發(fā)作用、生發(fā)促進作用、生發(fā)作用、增發(fā)作用等而顯示出優(yōu)良的育發(fā)作用。因此，本發(fā)明的育發(fā)劑可以換言之為毛乳頭細胞生長劑、針對毛乳頭細胞的生長因子產(chǎn)生促進劑、養(yǎng)發(fā)劑、生發(fā)促進劑、生發(fā)劑、增發(fā)劑等。本發(fā)明的育發(fā)劑可以以化妝品、準藥品(醫(yī)薬部外品)、藥品、飲食品、營養(yǎng)補充劑等的方式實施。

本發(fā)明的育發(fā)劑、毛乳頭細胞生長劑、針對毛乳頭細胞的生長因子產(chǎn)生促進劑、養(yǎng)發(fā)劑、生發(fā)促進劑、生發(fā)劑或增發(fā)劑含有至少一種本發(fā)明的肽。特別適宜的肽為由序列編號2、3、6、7和8中任一序列所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽，更優(yōu)選由序列編號2、3、6和7中任一序列所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽，更優(yōu)選由序列編號2、3、和6中任一序列所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽，進一步優(yōu)選由序列編號2或3所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。更優(yōu)選由序列編號2所表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。此外，更優(yōu)選N末端進行了乙?；褻末端進行了酰胺化的肽。

本說明書中，生長因子可以列舉例如KGF(角質(zhì)細胞生長因子、keratinocyte growth factor)、HGF(肝細胞生長因子、hepatocyte growth factor)、VEGF(血管內(nèi)皮細胞生長因子、vascular endothelial growth factor)、IGF(胰島素生長因子，Insulin growth factor)、EGF(表皮生長因子，Epithelial growth factor)、FGF(成纖維細胞生長因子，F(xiàn)ibroblast growth factor)、PDGF(血小板衍生生長因子，Platelet derived growth factor)、TGF β1(轉(zhuǎn)化生長因子β1，Transforming growth factor β1)等，優(yōu)選為KGF、HGF、VEGF等。

在本發(fā)明的育發(fā)劑為化妝品或準藥品的方式的情況下，形態(tài)沒有特別限定。例如可以為皮膚外用劑、洗發(fā)水、護發(fā)素、焗油膏、頭發(fā)護理劑、造型劑的形態(tài)。

在本發(fā)明的育發(fā)劑為化妝品或準藥品的情況下，除了本發(fā)明的肽以外，可以根據(jù)目的適當配合作為化妝品或準藥品而通常使用的成分，例如油分、潤濕劑、保濕劑、乳化劑、紫外線吸收劑、表面活性劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、助溶劑、增稠劑、填充劑、金屬離子封端劑、防曬劑、消泡劑、柔軟劑、著色劑、防腐劑、推進劑、酸化劑或堿化劑、有機硅、維生素、染料、顏料、納米顏料、香料、醇等有機溶劑、水等。

作為化妝品或準藥品的優(yōu)選形態(tài)，可以列舉皮膚外用劑。皮膚外用劑可以列舉液劑、霜劑、軟膏劑、凝膠劑、氣溶劑等劑型，只要是適合外用的劑型，則不限定于這些。

皮膚外用劑中可以根據(jù)需要配合水、低級醇、助溶劑、表面活性劑、乳化穩(wěn)定劑、凝膠化劑、粘合劑、以及為了得到所期望的劑型而通常使用的基劑成分，也可以根據(jù)使用目的在不損害本發(fā)明效果的范圍內(nèi)適當配合血管擴張劑、腎上腺皮質(zhì)激素、保濕劑、殺菌劑、清涼劑、維生素類、香料、色素等。

在本發(fā)明的育發(fā)劑為藥品的方式的情況下，可以將上述本發(fā)明的肽作為有效成分，適當配合藥學(xué)上可接受的載體或添加劑進行制劑化。劑型沒有特別限定，可以制成例如：片劑(包括糖衣片)、包覆片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑、懸浮劑、乳劑等經(jīng)口劑；注射劑(例如皮下注射劑、靜脈內(nèi)注射劑、肌肉內(nèi)注射劑、腹腔內(nèi)注射劑)、輸液、點滴劑、外用劑(例如經(jīng)鼻給藥制劑、經(jīng)皮制劑、軟膏劑)、栓劑(例如直腸栓劑、陰道栓劑)、軟膏、貼片劑、液劑等非經(jīng)口劑。優(yōu)選為外用劑。

作為非經(jīng)口劑，可以列舉例如皮膚外用劑。皮膚外用劑可以應(yīng)用于液劑、霜劑、軟膏劑、凝膠劑、氣溶膠劑等，但只要是適合外用的劑型，則不限定于這些。

皮膚外用劑中可以根據(jù)需要配合水、低級醇、助溶劑、表面活性劑、乳化穩(wěn)定劑、凝膠化劑、粘合劑、以及為了得到期望的劑型而通常使用的基劑成分，也可以根據(jù)使用目的在不損害本發(fā)明效果的范圍內(nèi)適當配合血管擴張劑、腎上腺皮質(zhì)激素、保濕劑、殺菌劑、清涼劑、維生素類、香料、色素等。

經(jīng)口用的固體劑(片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑等)可以將有效成分與賦形劑(乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纖維素、淀粉等)、粘結(jié)劑(羥丙基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、硅酸鋁鎂等)、崩解劑(纖維素乙醇酸鈣等)、潤滑劑(硬脂酸鎂等)、穩(wěn)定劑、助溶劑(谷氨酸、天冬氨酸等)等混合，按照常規(guī)方法進行制劑化?？梢愿鶕?jù)需要用包衣劑(白糖、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯等)進行包覆，另外也可以用兩層以上的層進行包覆。

經(jīng)口用的液劑(水劑、懸浮劑、乳劑、糖漿劑、酏劑等)通過將有效成分溶解、懸浮或乳化在通常使用的稀釋劑(純水、乙醇或它們的混合液等)中進行制劑化。該液劑可以進一步含有潤濕劑、助懸劑、乳化劑、甜味劑、風味劑、芳香劑、防腐劑、緩沖劑等。

作為非經(jīng)口劑，可以列舉例如注射劑。注射劑包含溶液、懸浮液、乳濁液和使用時溶解或懸浮在溶劑中使用的固體的注射劑。注射劑通過將有效成分溶解、懸浮或乳化在溶劑中進行制劑化。作為溶劑，可以使用例如：注射用蒸餾水、生理鹽水、植物油、丙二醇、聚乙二醇、乙醇之類的醇類等和它們的組合。該注射劑可以進一步含有穩(wěn)定劑、助溶劑(谷氨酸、天冬氨酸、聚山梨酯80(注冊商標)等)、助懸劑、乳化劑、無痛劑、緩沖劑、防腐劑等。這些注射劑在最終工序中滅菌或者通過無菌操作法來制造。另外也可以制造無菌的固體劑、例如冷凍干燥品，在其使用前進行無菌化或溶解在無菌的注射用蒸餾水或其他溶劑中來使用。

關(guān)于本發(fā)明的藥品的制劑化中使用的載體或添加劑的配合比例，基于藥品領(lǐng)域中通常采用的范圍適當設(shè)定即可。可以配合的載體或添加劑沒有特別限制，可以列舉例如：水、生理鹽水、其他水性溶劑、水性或油性基劑等各種載體；賦形劑、粘結(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、崩解劑、吸收促進劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑、香料等各種添加劑。

作為在片劑、膠囊劑等中可以混合的添加劑，可以使用例如：明膠、玉米淀粉、黃蓍膠、阿拉伯樹膠之類的粘結(jié)劑；結(jié)晶性纖維素之類的賦形劑；玉米淀粉、明膠、海藻酸等之類的膨化劑；硬脂酸鎂之類的潤滑劑；蔗糖、乳糖或糖精之類的甜味劑、薄荷、白株樹油或櫻桃之類的香味劑等。在制劑單元形態(tài)為膠囊的情況下，上述類型的材料中可以進一步含有油脂之類的液態(tài)載體。用于注射的無菌組合物可以按照通常的制劑方法(例如將有效成分溶解或懸浮在注射用水、天然植物油等溶劑中等)來制備。作為注射用的水性液，可以使用例如含有生理鹽水、葡萄糖或其他輔助藥劑的等滲液(例如D-山梨醇、D-甘露醇、氯化鈉等)等，可以與適當?shù)闹軇?、例如?例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性表面活性劑(例如聚山梨酯80^TM、HCO-50)等并用。作為油性液，可以使用例如芝麻油、大豆油等，可以與作為助溶劑的苯甲酸芐酯、芐醇等并用。另外，可以與緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖液、乙酸鈉緩沖液)、無痛劑(例如苯扎氯銨、鹽酸普魯卡因等)、穩(wěn)定劑(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐劑(例如芐醇、苯酚等)、抗氧化劑等配合。

如此得到的制劑例如可以對人或其他哺乳動物(例如大鼠、小鼠、兔、山羊、豬、牛、貓、犬、猴等)進行給藥。

給藥量根據(jù)給藥對象、對象疾病、給藥途徑等而不同，例如在以皮膚外用劑的形態(tài)給藥的情況下，通常對于成人(以體重60kg計)而言，每天給藥約0.01mg～約30mg、優(yōu)選約0.1mg～約20mg、更優(yōu)選約0.1mg～約10mg的有效成分。在經(jīng)口給藥的情況下，通常對于成人(以體重60kg計)而言，每天給藥約0.1mg～約100mg、優(yōu)選約1.0mg～約50mg、更優(yōu)選約1.0mg～約20mg的有效成分。例如，在以注射劑的形態(tài)非經(jīng)口給藥的情況下，通常對于成人(以體重60kg計)而言，每天靜脈內(nèi)給藥約0.01mg～約30mg、優(yōu)選約0.1mg～約20mg、更優(yōu)選約0.1mg～約10mg的有效成分。每天的總給藥量可以為單次給藥量，也可以多次給藥量。

在本發(fā)明的育發(fā)劑為飲食品的方式的情況下，飲食品包括健康食品、功能性食品、特定保健用食品、患者用食品、食品添加劑等。飲食品的形態(tài)沒有特別限定?？梢粤信e例如：茶飲料、清涼飲料、碳酸飲料、營養(yǎng)飲料、果實飲料、乳酸飲料等飲料、蕎麥面、烏冬面、中華面、速食面等面類、糖、糖果、口香糖、巧克力、零食點心、餅干、果凍、果醬、奶油、烘焙糕點、面包等糕點和面包類、魚糕、火腿、香腸等水產(chǎn)/畜產(chǎn)加工食品、加工乳、發(fā)酵乳等乳產(chǎn)品、色拉油、天婦羅油、人造黃油、蛋黃醬、起酥油、生奶油、調(diào)味品等油脂和油脂加工食品、調(diào)味醬、調(diào)味汁等調(diào)味料、咖喱、燉菜、蓋飯、粥、雜燴粥等蒸煮袋食品、冰激凌、沙冰、刨冰等冷飲等。

在本發(fā)明的育發(fā)劑為營養(yǎng)補充劑的方式的情況下，例如可以以片劑、顆粒劑、散劑、飲料劑等的形態(tài)提供。

在制造營養(yǎng)補充劑時，可以添加例如：糊精、淀粉等糖類；明膠、大豆蛋白、玉米蛋白等蛋白質(zhì)；丙氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸等氨基酸類；纖維素、阿拉伯樹膠等多糖類；大豆油、中鏈脂肪酸甘油三酸酯等油脂類等任意的助劑，制劑化成任意的劑型。

本發(fā)明的肽通過與為了育發(fā)或生發(fā)促進而使用的其他有效成分組合使用，可以期待相加或協(xié)同地提高育發(fā)或生發(fā)促進作用。作為為了育發(fā)或生發(fā)促進而使用的其他有效成分，可以列舉米諾地爾、非那雄胺等。

本發(fā)明進一步含有下述發(fā)明。

(a)上述本發(fā)明的肽在制造疫苗用佐劑、疫苗組合物、免疫激活劑或育發(fā)劑中的使用。

(b)用于增強疫苗抗原的免疫原性、用于誘導(dǎo)細胞因子的產(chǎn)生、用于誘導(dǎo)T細胞活化共刺激分子的表達、用于活化炎性小體、用于使毛乳頭細胞生長、或用于促進針對毛乳頭細胞的生長因子產(chǎn)生的上述本發(fā)明的肽。

(c)一種非治療性的免疫激活或者育發(fā)或生發(fā)促進方法，其特征在于，對哺乳動物給藥有效量的上述本發(fā)明的肽。

(d)一種免疫原性增強、免疫激活或者育發(fā)或生發(fā)促進方法，其特征在于，對哺乳動物給藥有效量的上述本發(fā)明的肽。

(e)一種疫苗抗原的免疫原性增強方法，其特征在于，包括對需要疫苗給藥的哺乳動物給藥有效量的上述本發(fā)明的肽的步驟。

(f)一種育發(fā)或生發(fā)促進方法，其特征在于，包括對需要育發(fā)或生發(fā)促進的哺乳動物給藥有效量的上述本發(fā)明的肽的步驟。

實施例

以下，通過實施例詳細地對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不限定于這些實施例。

[實施例1：肽的合成]

按照文獻Solid Phase Peptide Synthesis，pierce(1984)、Fmoc solid synthesis：a practical approach，牛津大學(xué)出版社(2000)和第5版實驗化學(xué)講座16有機化合物的合成IV等中記載的方法，使用全自動固相合成儀利用Fmoc法合成保護肽樹脂。在所得到的保護肽樹脂中添加三氟乙酸(TFA)和清除劑(苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、三異丙基硅烷、水等的混合物)，將肽從樹脂上切下的同時進行脫保護，得到粗制肽。使用反相HPLC柱(ODS)，利用0.1％TFA-H20/CH3CN的體系對該粗制肽進行梯度洗脫，進行純化。收集包含目標物的級分進行冷凍干燥，得到目標肽。合成的肽的氨基酸序列使用氨基酸測序儀G1000A(Helett Packard)、PPSQ-23A(島津制作所)或ProciscLC(ABI公司)進行確認，所得到的肽的N末端進行了乙?；⑶褻末端進行了酰胺化。合成的肽的序列如下所示。

使用質(zhì)譜分析裝置(Voyager DE-Pro系列號6344)測定所合成的OSK-1的分子量。作為基質(zhì)，使用二羥基苯甲酸(DHB)，將基質(zhì)0.5μL和樣品0.5μL進行點樣，并進行干燥。將MS分析的結(jié)果示于圖13。

利用HPLC裝置，在下述分析條件下測定所合成的OSK-1的純度。

HPLC機型：Waters Alliance 2690

試樣溶液：1mg/mL水溶液

注入量：20μL

測定波長：215nm

流量：每分鐘1.2mL

柱：Discovery，C18，4.6mm×250mm，5微米

柱溫：室溫

流動相A：0.1％三氟乙酸水溶液

流動相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液

梯度條件：用20分鐘使流動相B的濃度以直線梯度從25％變?yōu)?5％。

(在20分鐘內(nèi)從25％緩沖液B→45％緩沖液B)

將HPLC分析的結(jié)果示于圖14。

表1

[實施例2：對人單核細胞系細胞株(THP-1細胞)中的細胞因子產(chǎn)生的影響(1)]

(1)實驗方法

將人單核細胞系細胞株THP-1細胞(JCRB注冊編號：JCRB0112)以1×10⁶細胞/mL懸浮在含有1μg/mL脂多糖(LPS)和10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，在CO₂孵箱內(nèi)靜置3小時進行致敏。將細胞懸浮液離心，以1×10⁶細胞/mL再懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基(含有10％FBS)中，以500μL/孔接種到24孔板中。以500μL/孔添加另外按照最終濃度的2倍濃度用RPMI1640培養(yǎng)基(10％FBS)制備的OSK-1溶液。約16小時后回收培養(yǎng)上清，通過ELISA測定上清中的細胞因子濃度。

(2)結(jié)果

將對培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-18、TNFα和IL-6濃度進行測定的結(jié)果示于圖1(A)～(D)。

對利用LPS致敏的THP-1細胞添加OSK-1時，確認到以濃度依賴的方式誘導(dǎo)了細胞因子的產(chǎn)生。

[實施例3：對人單核細胞系細胞株(THP-1細胞)中的細胞因子產(chǎn)生的影響(2)]

(1)實驗方法

將THP-1細胞以5×10⁵細胞/mL懸浮在含有50ng/mL PMA(佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯)和10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，以5×10⁵細胞/孔接種在24孔板中。在CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)2天，使其分化為巨噬細胞。2天后，除去培養(yǎng)基，在孔內(nèi)添加用RPMI1640培養(yǎng)基(含有10％FBS)制備的OSK-1溶液，進一步培養(yǎng)一夜。16小時后回收培養(yǎng)上清，通過ELISA測定上清中的細胞因子濃度。

(2)結(jié)果

將對培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-18、TNFα和IL-6濃度進行測定的結(jié)果示于圖2(A)～(D)。

在利用PMA分化的THP-1細胞中添加OSK-1時，在30μg/mL的濃度下確認到強細胞因子產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。

[實施例4：對人單核細胞系細胞株(THP-1細胞)中的CD86和CD54表達的影響]

(1)實驗方法

將THP-1細胞使用含有10％FBS和0.05mM巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基以2.0×10⁵細胞/mL的密度添加50mL至75cm²燒瓶中，進行48小時預(yù)培養(yǎng)。

離心回收預(yù)培養(yǎng)的THP-1細胞，使用含有10％FBS和0.05mM巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基制備2.0×10⁶細胞/mL的細胞懸浮液，在24孔板的各孔中接種500μL。在接種了細胞懸浮液的各孔中添加500μL使用同一培養(yǎng)基制備的肽。

培養(yǎng)一夜后，離心回收細胞，利用含有0.1％BSA的PBS(FACS緩沖液)反復(fù)進行兩次清洗。然后，分散至600μL含有0.01％人γ-球蛋白溶液(Sigma，G2388)的FACS緩沖液中，在4℃孵育10分鐘，進行Fc受體的封閉。

然后，為了用于抗體反應(yīng)，將細胞懸浮液分成3份各180μL，分注到1.5mL管中，然后，對離心回收的顆粒添加將CD86抗體(Pharmingen；Cat#555657)、CD54抗體(Dako；Cat#F7143)和同種型對照(小鼠IgG)抗體(Dako；Cat#X0927)的各FITC標記抗體液用FACS緩沖液制備成適當濃度而得到的溶液50μL，在4℃下孵育30分鐘。30分鐘孵育后，離心回收細胞，利用FACS緩沖液反復(fù)進行兩次清洗。將離心回收的細胞分散至含有0.625μg/mL碘化丙啶的FACS緩沖液200μL中，利用流式細胞儀測定活細胞1×10⁴細胞，測定細胞表面抗原的表達量。不進行基于前向散射和側(cè)向散射的設(shè)門，由所測定的平均熒光強度(MFI)利用以下所示的式算出相對熒光強度(RFI)。

(2)結(jié)果

將在THP-1細胞中添加OSK-1、AAP-1～AAP-6后的CD86和CD54的表達量示于圖3(A)、(B)。

在THP-1細胞中添加OSK-1后，確認到強CD86和CD54表達誘導(dǎo)活性。對于從OSK-1的序列中使C末端的氨基酸(LKRK或KRLKRK)缺失而得到的序列(AAP-2～AAP-3)而言，隨著氨基酸數(shù)減少，確認到CD86和CD54表達誘導(dǎo)活性大大降低的趨勢。在CD54的情況下特別顯著。對于從OSK-1的C末端使2個氨基酸缺失而得到的序列(AAP-1)、以及從OSK-1的N末端和C末端各自缺失1個氨基酸而得到的序列(AAP-4～AAP-6)，未確認到大幅的活性降低。確認到OSK-1與具有佐劑活性的胞壁酰二肽(MDP)相比具有同等或更高的表達誘導(dǎo)活性(圖9和圖10)。由以上提示，LHRLKRLRKRL(序列編號1)所表示的氨基酸序列的C末端的“L”是本發(fā)明的肽的免疫激活作用所需要的。

將向THP-1細胞添加AAP-6、AAP-11和AAP-12后的CD86和CD54的表達量示于圖4(A)、(B)。

對于從OSK-1的序列N末端使7個氨基酸缺失而得到的序列(AAP-12)而言，確認到CD86和CD54表達誘導(dǎo)活性大大降低的趨勢。對于從OSK-1的N末端和C末端使3個氨基酸缺失而得到的序列(AAP-6)、從OSK-1的N末端使5個氨基酸缺失并且從C末端使3個氨基酸缺失而得到的序列(AAP-11)，未確認到大幅的活性降低(圖11和圖12)。由以上提示，LHRLKRLRKRL(序列編號1)所表示的氨基酸序列的N末端的“L”是本發(fā)明的肽的免疫激活作用所需要的。

[實施例5：由OSK-1產(chǎn)生的炎性小體活化作用(1)]

(1)實驗方法

對于THP-1細胞使用轉(zhuǎn)染試劑(6μL/孔、HiPerfect轉(zhuǎn)染試劑、QIAGEN公司制)轉(zhuǎn)染針對作為炎性小體構(gòu)成分子的NLRP3(NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3)的siRNA(終濃度100nM、Hs_CIAS1_6和Hs_CIAS1_9、QIAGEN公司制)或?qū)φ誷iRNA，培養(yǎng)一夜后，利用蛋白免疫印跡法確認NLRP3的表達水平。

將該THP-1細胞以1×10⁶細胞/mL懸浮在含有1μg/mL LPS和10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，在CO₂孵箱內(nèi)靜置3小時進行致敏。將細胞懸浮液離心，以1×10⁶細胞/mL再懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基(10％FBS)中后，以500μL/孔添加至24孔板中，添加以最終濃度的2倍濃度用RPMI1640培養(yǎng)基(10％FBS)制備的OSK-1溶液500μL。16小時后回收培養(yǎng)上清，通過ELISA測定上清中的IL-1β和TNFα濃度。

(2)結(jié)果

將利用蛋白免疫印跡法對NLRP3的表達水平進行確認的結(jié)果示于圖5。確認了在THP-1細胞中，通過將針對NLRP3的siRNA轉(zhuǎn)染到THP-1細胞中，使NLRP3的表達沉默。

將使用該THP-1細胞以10μg/mL的濃度添加OSK-1后的IL-13和TNFα產(chǎn)生量的比較結(jié)果示于圖6(A)、(B)。在未使NLRP3表達沉默(轉(zhuǎn)染了對照siRNA)的細胞中確認到由OSK-1引起的IL-1β產(chǎn)生誘導(dǎo)，但在使NLRP3表達沉默的細胞中由OSK-1引起的IL-1β產(chǎn)生誘導(dǎo)受到抑制。另一方面，對于不參與炎性小體的活化的TNFα，無論有無NLRP3表達的沉默，均確認到由OSK-1引起的TNFα產(chǎn)生誘導(dǎo)。

[實施例6：由OSK-1產(chǎn)生的炎性小體活化作用(2)]

(1)實驗方法

將THP-1細胞以1×10⁶細胞/mL懸浮在含有1μg/mL LPS和10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，在CO₂孵箱內(nèi)靜置3小時進行致敏。將細胞懸浮液離心，以1×10⁶細胞/mL再懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基(含有10％FBS)中后，以100μL/孔接種到96孔板中。添加作為組織蛋白酶B抑制劑的Ca-074-Me(終濃度10μM)、半胱天冬酶-1抑制劑Z-YVAD-FMK(終濃度10μM)或培養(yǎng)基，進一步添加OSK-1或培養(yǎng)基后，在CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)。16小時后回收培養(yǎng)上清，通過ELISA測定上清中的細胞因子濃度。

(2)結(jié)果

將基于利用LPS對THP-1細胞致敏的有無對OSK-1的IL-1β產(chǎn)生作用進行比較的結(jié)果示于圖7。僅在利用LPS進行了致敏的情況下，確認到由OSK-1引起的IL-1β的產(chǎn)生。

將基于組織蛋白酶B抑制劑和半胱天冬酶-1抑制劑的有無對OSK-1的IL-1β產(chǎn)生作用進行比較的結(jié)果示于圖8。確認到由OSK-1引起的IL-1β的產(chǎn)生誘導(dǎo)受到作為使炎性小體活化的組織蛋白酶B的抑制劑的Ca-074-Me、或者作為炎性小體構(gòu)成分子半胱天冬酶-1的抑制劑的Z-YVAD-FMK的抑制。

由以上提示，通過LPS致敏而表達的proIL-1β被由OSK-1活化的作為炎性小體的構(gòu)成分子的半胱天冬酶-1加工成IL-1β并釋放到細胞外。

[實施例7：犬中的OSK-1的佐劑(疫苗抗原的免疫原性增強)效果的確認]

(1)實驗方法

將犬中的OSK-1的佐劑效果與現(xiàn)有的弗氏佐劑(Freund’s Adjuvant)的佐劑效果進行比較。作為疫苗，使用AngII-KLH(血管緊張素II鑰孔戚血藍蛋白，Angiotensin II Keyhole limpet hemocyanin)(25μg/只)，另外，作為佐劑，使用OSK-1(500μg/只)或弗氏佐劑(250μL/只)，以2周的間隔對比格犬進行2次皮內(nèi)給藥(1組2只)。其中，弗氏佐劑組第一次給藥使用完全弗氏佐劑，第二次給藥使用不完全弗氏佐劑。在給藥前和第一次給藥起2周后、4周后進行采血，測定針對AngII的抗體效價。

在以AngII-BSA包被的ELISA用96孔板中添加使用5％脫脂奶粉/PBS進行了連續(xù)稀釋的血清，在4℃下靜置一夜。用PBS-T將孔清洗后，添加用5％脫脂奶粉/PBS稀釋的HRP標記抗小鼠IgG抗體，在室溫下振蕩3小時。用PBS-T將孔清洗后，添加TMB溶液，避光靜置30分鐘，添加0.5N H₂SO₄使反應(yīng)停止。測定450nm的吸光度，對抗體效價進行比較。

(2)結(jié)果

將結(jié)果示于圖9。(A)為OSK-1組的結(jié)果，(B)為弗氏佐劑(FA)組的結(jié)果。在OSK-1組的個體中確認到AngII抗體效價的上升。

[實施例8：小鼠中的OSK-1的佐劑(疫苗抗原的免疫原性增強)效果的確認]

(1)實驗方法

將小鼠中的OSK-1的佐劑效果與Alum和弗氏佐劑(Freund’s Adjuvant)的佐劑效果進行比較。作為疫苗，使用AngII-KLH(2μg/只)，作為佐劑，使用OSK-1(100μg/只)、Alum(400μg/只)或弗氏佐劑(50μg/只)，以2周的間隔對C57/BL6小鼠進行3次皮內(nèi)給藥(1組3只)。其中，弗氏佐劑組第一次給藥使用完全弗氏佐劑，第二次和第三次給藥使用不完全弗氏佐劑。在給藥前和第一次給藥起2周后、4周后、6周后、8周后進行采血，測定針對AngII的抗體效價。

抗體效價的測定利用與實施例7同樣的方法進行。

(2)結(jié)果

將對OSK-1、Alum、弗氏佐劑(FA)的佐劑效果進行比較的結(jié)果示于圖10。對于OSK-1組而言，盡管不及弗氏佐劑(FA)組，但確認到與Alum組相同程度的針對AngII的抗體效價的上升。

[實施例9：針對毛乳頭細胞的生長因子產(chǎn)生促進作用(1)]

(1)實驗方法

使用含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基將人毛乳頭細胞以3×10⁴細胞/孔接種到24孔板中，在CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)一夜。次日，除去培養(yǎng)基，添加使用含有1％FBS的DMEM培養(yǎng)基制備的肽溶液，在CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)5天。回收培養(yǎng)上清，通過ELISA測定KGF、HGF和VEGF的濃度。

(2)結(jié)果

將通過ELISA測定使各種肽作用于人毛乳頭細胞時的培養(yǎng)上清中的KGF、HGF、VEGF濃度的結(jié)果示于圖11(A)～(C)。確認到OSK-1以濃度依賴的方式促進各生長因子的產(chǎn)生。對于AAP-1、AAP-4～AAP-6，也與OSK-1同樣地以濃度依賴的方式確認到各生長因子的產(chǎn)生作用。對于從OSK-1的序列中使C末端的氨基酸(LKRK或KRLKRK)缺失而得到的序列(AAP-2和AAP-3)而言，各生長因子的產(chǎn)生作用降低。特別是HGF的產(chǎn)生促進作用降低。由以上提示，LHRLKRLRKRL(序列編號1)所表示的氨基酸序列的C末端的“L”是本發(fā)明的肽的生長因子產(chǎn)生促進作用所需要的。

[實施例10：OSK-1與類似肽(SR-07和SR-08)的CD54表達誘導(dǎo)作用的比較]

將OSK-1與類似肽(SR-07和SR-08)的CD54表達誘導(dǎo)作用進行比較。實驗方法與實施例4同樣地進行。SR-07和SR-08為WO2010/137594中記載的肽，序列如下表2所示。

表2

*dK：D型

將試樣未處理對照細胞(溶劑處理細胞)的生存率顯示為90％以上時作為試驗成立，在試驗實施時的各試樣濃度下的細胞生存率低于50％的情況下，將該濃度下的CD54的值排除在判定之外。

將結(jié)果示于圖12。與SR-07和SR-08相比較，OSK-1確認到強CD54表達誘導(dǎo)活性。

[實施例11：對人單核細胞系細胞株(THP-1細胞)中的細胞因子產(chǎn)生的影響(3)]

(1)實驗方法

利用與實施例3相同的方法進行實驗，測定培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-18、TNFα、IL-6、RANTES、MIP-1α和MIP-1β濃度。

(2)結(jié)果

將結(jié)果示于圖15(A)～(G)。在利用PMA進行了分化的THP-1細胞中添加OSK-1時，確認到OSK-1濃度依賴性的趨化因子、細胞因子的產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。

[實施例12：對小鼠巨噬細胞(RAW264.7細胞)中的細胞因子產(chǎn)生的影響]

(1)實驗方法

將RAW264.7細胞以1×10⁶細胞/mL懸浮在含有50ng/mL LPS和10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在CO₂孵箱內(nèi)靜置3小時進行致敏。將細胞懸浮液離心，以1×10⁶細胞/mL再懸浮在DMEM培養(yǎng)基(含有10％FBS)中，以500μL/孔接種到24孔板中。以500μL/孔添加另外以最終濃度的2倍濃度用DMEM培養(yǎng)基(含有10％FBS)制備的OSK-1溶液。約16小時后回收培養(yǎng)上清，通過ELISA測定上清中的細胞因子濃度。

(2)結(jié)果

將對培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-18、TNFα和IL-6濃度進行測定的結(jié)果示于圖16(A)～(D)。

對利用LPS致敏的RAW264.7細胞添加OSK-1時，確認到OSK-1濃度依賴性的細胞因子的產(chǎn)生誘導(dǎo)。

[實施例13：對小鼠骨髄來源樹突細胞中的細胞因子產(chǎn)生的影響]

(1)實驗方法

從C57BL/6小鼠的股骨采集骨髄細胞，將骨髄細胞接種到含有20mg/mL GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor)和10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天。培養(yǎng)3天后追加培養(yǎng)基，進一步培養(yǎng)4天?；厥瘴促N附到培養(yǎng)板上的細胞，作為骨髄來源樹突細胞。使用RPMI1640培養(yǎng)基(含有10％FBS)以2×10⁶細胞/mL制備細胞懸浮液，以500μL/孔接種到24孔板中。以500μL/孔添加另外以最終濃度的2倍用RPMI1640培養(yǎng)基(含有10％FBS)制備的OSK-1溶液。約16小時后回收培養(yǎng)上清，通過ELISA測定上清中的細胞因子濃度。

(2)結(jié)果

將對培養(yǎng)上清中的IL-1β、IFNγ、TNFα、IL-6和IL-12p70濃度進行測定的結(jié)果示于圖17(A)～(E)。

對小鼠骨髄來源樹突細胞添加OSK-1時，確認到OSK-1濃度依賴性的細胞因子的產(chǎn)生誘導(dǎo)。

[實施例14：對人單核細胞系細胞株(THP-1細胞)中的細胞因子產(chǎn)生的影響(與Alum、CpG核苷酸的比較)]

(1)實驗方法

將THP-1細胞以1×10⁶細胞/mL懸浮在含有1μg/mL LPS和10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，在CO₂孵箱內(nèi)靜置3小時進行致敏。將細胞懸浮液離心，以1×10⁶細胞/mL再懸浮在RPMI1640培養(yǎng)基(含有10％FBS)中，以500μL/孔接種到24孔板中。以500μL/孔添加另外以最終濃度的2倍濃度用RPMI1640培養(yǎng)基(含有10％FBS)制備的OSK-1、Alum(2％Alhydrogel、InvivoGen)或CpG核苷酸(CpG ODN 2006、Novus Biologicals)溶液。約16小時后回收培養(yǎng)上清，通過ELISA測定上清中的細胞因子濃度。

(2)結(jié)果

將對培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-18、TNFα、IL-6濃度進行測定的結(jié)果示于圖18(A)～(D)。

對利用LPS致敏的THP-1細胞添加OSK-1時，與Alum和CpG核苷酸相比，確認到IL-1β、IL-18和TNFα的強產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。對于IL-18，雖然弱于Alum，但OSK-1仍確認到顯著的產(chǎn)生誘導(dǎo)。

[實施例15：對人單核細胞系細胞株(THP-1細胞)中的CD86和CD54表達的影響(與Alum的比較)]

(1)實驗方法

作為肽，使用OSK-1，作為對照，使用Alum，除此以外，通過與實施例4相同的方法進行實驗。

(2)結(jié)果

將在THP-1細胞中添加OSK-1或Alum時的CD86和CD54的表達量示于圖19(A)、(B)。

在THP-1細胞中添加OSK-1時，確認到強CD86和CD54表達誘導(dǎo)活性。另一方面，在THP-1細胞中添加Alum時，未確認到CD86和CD54表達誘導(dǎo)活性。

[實施例16：人單核細胞系細胞株(THP-1細胞)中的由OSK-1引起的NFκB的活化]

(1)實驗方法

使用RPMI1640培養(yǎng)基(含有10％FBS)以5×10⁵細胞/500μL制備THP-1細胞，以500μL/孔接種在24孔板中。添加用RPMI1640培養(yǎng)基(含有10％FBS)制備的QNZ(Enzo、最終濃度10μM)、BAY11-7082(Enzo、最終濃度10μM)或RPMI1640培養(yǎng)基(含有10％FBS)，培養(yǎng)2.5小時。添加OSK-1使最終濃度為100ng/mL，培養(yǎng)2小時后，回收培養(yǎng)上清，通過ELISA測定上清中的TNFα濃度。

(2)結(jié)果

將結(jié)果示于圖20。OSK-1在THP-1細胞中誘導(dǎo)了TNFα的產(chǎn)生，但添加作為NFκB抑制劑的QNZ或BAY11-7082時，由OSK-1引起的TNFα的產(chǎn)生受到抑制。由該結(jié)果確認，OSK-1具有NFκB活化作用。

[實施例17：由OSK-1-血管緊張素II結(jié)合疫苗引起的抗體產(chǎn)生]

(1)實驗方法

制作將OSK-1肽和血管緊張素II肽以ε-Acp作為間隔物結(jié)合而成的“OSK-1-AngII結(jié)合疫苗”，使用小鼠對抗體產(chǎn)生作用進行評價。組構(gòu)成設(shè)定為(1)AngII-KLH(5μg/小鼠)+Alum(2％Alhydrogel、InvivoGen、0.4mg/小鼠)、(2)OSK-1-AngII結(jié)合疫苗(10μg/小鼠)、(3)OSK-1-AngII結(jié)合疫苗(50μg/小鼠)這3組，以2周的間隔對Balb/c小鼠進行3次皮內(nèi)給藥(各組6只)。在給藥前和第一次給藥起2周后、4周后、6周后、8周后進行采血，通過ELISA測定針對血管緊張素II的抗體效價。此外，通過ELISA對所產(chǎn)生的抗體的IgG亞型進行分析。

(2)結(jié)果

將針對血管緊張素II的抗體效價的測定結(jié)果示于圖21，將所產(chǎn)生的抗體的IgG亞型的分析結(jié)果示于圖22(A)、(B)。

OSK-1-AngII結(jié)合疫苗以濃度依賴的方式誘導(dǎo)了針對血管緊張素II的抗體產(chǎn)生。

IgG亞型的分析中，在由與被視為Th2型佐劑的Alum一同給藥的AngII-KLH疫苗產(chǎn)生的抗體中，作為Th2型的IgG1的產(chǎn)生高，而在由OSK-1-AngII結(jié)合疫苗產(chǎn)生的抗體中，不僅Th2型的IgG1的產(chǎn)生高，而且作為Th1型的IgG2a、IgG2b和IgG3的產(chǎn)生也高。

[實施例18：由OSK-1-WT1結(jié)合疫苗引起的WT1特異的免疫誘導(dǎo)]

(1)實驗方法

制作將OSK-1肽和WT1肽以ε-Acp作為間隔物結(jié)合而成的“OSK-1-WT1結(jié)合疫苗”，使用小鼠對WT1特異性的免疫誘導(dǎo)能力進行評價。組構(gòu)成設(shè)定為(1)生理鹽水、(2)WT1肽(15μg/小鼠)+不完全弗氏佐劑(IFA、SIGMA；Cat#F5506、50μL/小鼠)、(3)WT1肽(15μg/小鼠)+OSK-1(100μg/小鼠)、(4)OSK-1-WT1結(jié)合疫苗(50μg/小鼠)、(5)OSK-1-WT1結(jié)合疫苗(300μg/小鼠)這5組(各組3只)。對C57BL/6小鼠每周1次進行4周疫苗給藥，在第4次給藥起2周后從免疫的小鼠中摘取脾臟，進行ELISpot分析。即，由摘取的脾臟制備脾細胞，將脾細胞接種到包被有抗IL-4抗體或抗IFNγ抗體的過濾板中。添加WT1肽或OSK-1-WT1肽培養(yǎng)3天后，對過濾板的孔進行染色，測定IL-4或IFNγ產(chǎn)生細胞的點數(shù)。

(2)結(jié)果

在添加OSK-1作為佐劑的組(3)以及將OSK-1與WT1結(jié)合的組(4)和組(5)中，確認到大量對于WT1肽刺激產(chǎn)生IFNγ的細胞。特別是在組(5)中反應(yīng)性高。另一方面，在添加IFA作為佐劑的組(2)中，確認到大量對于WT1肽的刺激發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生IL-4的細胞。

[實施例19：針對毛乳頭細胞的生長因子產(chǎn)生促進作用(2)]

(1)實驗方法

作為肽，使用OSK-1和AAP-11，通過與實施例9相同的方法測定KGF、HGF和VEGF的濃度。

(2)結(jié)果

將結(jié)果示于圖23。AAP-11以濃度依賴的方式促進各生長因子的產(chǎn)生。

[實施例20：OSK-1的育毛作用]

(1)實驗方法

對于處于毛靜止期的8周齡的雄性C3H/HeN小鼠的背部以不損傷背部的方式進行推剪和剃刀剃毛。剃毛區(qū)域的面積設(shè)定為2×4cm。從剃毛3天后開始1天1次涂布0.02％(w/v)、0.1％(w/v)或0.5％(w/v)的OSK-1溶液各100μL，涂布14天。對照組涂布生理鹽水，陽性對照組涂布3％(w/v)米諾地爾。將剃毛日設(shè)為第0天，將第3天、第7天、第10天、第14天和第17天生毛部位的面積相對于小鼠剃毛部的總面積按照“0％：得分0”、“～20％：得分1”、“～40％：得分2”、“～60％：得分3”、“～80％：得分4”、“～100％：得分5”進行得分化。另外，在第17天拔取10根在小鼠的剃毛部生出的被毛，使用實體顯微鏡測定這些被毛的長度，將其合計值作為各個體的毛的長度(mm)。

(2)結(jié)果

將結(jié)果示于圖24。(A)為第17天的被毛的長度，(B)為生毛面積得分的結(jié)果。可知OSK-1以濃度依賴的方式促進育毛。另外，0.5％OSK-1組的生毛得分和毛的長度與3％米諾地爾組基本同等。

需要說明的是，本發(fā)明并不限定于上述各實施方式和實施例，可以在權(quán)利要求所示的范圍內(nèi)進行各種變更，將不同實施方式中分別公開的技術(shù)手段適當組合而得到的實施方式也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍中。另外，本說明書中記載的學(xué)術(shù)文獻和專利文獻全部以參考的方式援引到本說明書中。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

本發(fā)明的肽具有免疫激活作用，因此能夠作為免疫激活劑使用。能夠適合作為疫苗用佐劑使用。另外，含有本發(fā)明的肽的疫苗組合物能夠進行更有效的治療。此外，本發(fā)明的肽能夠適合作為以育發(fā)或生發(fā)促進為目的的化妝品、準藥品、藥品、飲食品、營養(yǎng)補充劑的成分使用。

序列表

<110> 國立大學(xué)法人大阪大學(xué)（Osaka University）

<120> 新型肽及其用途（New peptide and utilization thereof）

<130> O11F5368

<150> JP 2014-197386

<151> 2014-09-26

<160> 14

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 1

Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu

1 5 10

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 2

Glu Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg

1 5 10 15

Leu Lys Arg Lys

20

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 3

Glu Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg

1 5 10 15

Leu Lys

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 4

Glu Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg

1 5 10 15

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 5

Glu Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg

1 5 10

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 6

Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu

1 5 10 15

Lys Arg

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 7

Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu Lys

1 5 10 15

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 8

Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 9

Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 10

Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 11

His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu Lys Arg Lys

1 5 10

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 12

Met Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Met Arg Lys Arg

1 5 10 15

Leu Lys Arg Lys

20

<210> 13

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 13

Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Met Arg Lys Arg Leu

1 5 10 15

Lys Arg Lys

<210> 14

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthesized peptide

<400> 14

Glu Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg

1 5 10 15

Leu Lys Arg Lys Leu Arg Leu Trp His Arg Lys Arg Tyr

20 25