專利名稱：一株降解二氯甲烷的甲基細菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株降解二氯甲烷的甲基細菌。
背景技術(shù)：
二氯甲烷，CH2Cl2，為無色液體，在制藥工業(yè)中做反應(yīng)介質(zhì)，用于制備氨芐青霉素、 羥芐青霉素和先鋒霉素等；還用作膠片生產(chǎn)中的溶劑、脫脂劑，氣煙霧噴射劑、聚氨酯發(fā)泡劑等。二氯甲烷在中國用于膠片生產(chǎn)的消費量占總消費量的50%，醫(yī)藥方面占總消費量的 20%，清洗劑及化工行業(yè)消費量占總消費量的20%，其他方面占10%。二氯甲烷有麻醉作用，主要損害中樞神經(jīng)和呼吸系統(tǒng)。人類接觸的主要途徑是吸入。據(jù)估計，在二氯甲烷的世界產(chǎn)量中，大約80%被釋放到大氣中去，但是由于該化合物光解的速率很快，使之不可能在大氣中蓄積。其初始降解產(chǎn)物為光氣和一氧化碳，因此二氯甲烷被認為是大氣污染中毒性較大的鹵代烴類物質(zhì)，其廣泛使用帶來一系列環(huán)境污染問題， 嚴重危機人類健康，并且破壞臭氧層。自從1980年Rittman等首次從工業(yè)廢水中分離出能以二氯甲燒作為唯一碳源和能源的甲基桿菌(Methylobacterium sp.)迄今為止包括假單胞菌、絲微菌在內(nèi)10多株分解二氯甲烷的細菌中，有關(guān)甲基細菌(Methylobacter sp.)以二氯甲烷作為碳源與能源的生物降解國內(nèi)未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一株甲基細菌(Methylobacter sp.)菌株,可高效降解二氯甲燒,可在有氧條件下降解二氯甲烷，為以二氯甲烷為代表的鹵代烴類有機污染物的生物降解機理的研究提供了重要基礎(chǔ)。本發(fā)明降解二氯甲燒的甲基細菌為甲基細菌(Methylobacter sp. )Met26,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年I月4日，保藏號為CGMCC No. 5693;本發(fā)明甲基細菌 Met26為革蘭氏陰性菌，短桿狀，細胞大小為(O. 33 μ m O. 4 μ m) X (O. 39 μ m O. 46 μ m)， 無芽孢、無鞭毛；在1匪5培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)10d，菌落直徑O. 5-lmm,圓形，透明，邊緣整齊， 表面光滑。本發(fā)明甲基細菌Met26可在MNMS培養(yǎng)基上生長，最適生長溫度為28°C，最適生長環(huán)境pH為6. 8。本發(fā)明的甲基細菌(Methylobacter sp. )Met26通過16S rDNA序列比對分析，與甲基細菌屬(Methylobacter sp.)的親緣關(guān)系最為接近,保守區(qū)相似性為99%。通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件確定甲基細菌Met26為甲基細菌屬(Methylobacter sp.)的一株新菌株，命名為甲基細菌Met26。本發(fā)明甲基細菌Met26能夠高效降解二氯甲烷，甲基細菌Met26在以二氯甲烷為唯一碳源、二氯甲烷終濃度為30mmol/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)IOd后二氯甲烷濃度下降63. 5 %，15d后二氯甲烷濃度下降78.6%。本發(fā)明的甲基細菌(Methylobacter sp. )Met26,屬于甲基細菌屬(Methylobacter sp.)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年I月4日，保藏號為CGMCC No. 5693。


圖I為甲基細菌Met26和相近菌株的16S rDNA序列進行同源性比對構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式降解二氯甲烷的甲基細菌為甲基細菌 (Methylobacter sp. )Met26,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年I月4日，保藏號為 CGMCC No. 5693。本實施方式甲基細菌Met26為革蘭氏陰性菌，短桿狀，細胞大小為(O. 33 μ m O. 4 μ m) X (O. 39 μ m O. 46 μ m)，無芽孢、無鞭毛；在MNMS培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)10d，菌落直徑O. 5-lmm，圓形，透明，邊緣整齊，表面光滑。本實施方式甲基細菌Met26可在MNMS培養(yǎng)基上生長，最適生長溫度為28°C，最適生長環(huán)境pH為6. 8。
具體實施方式
二本實施方式甲基細菌(Methylobacter sp. )Met26由2010年8 月份采集于雙鴨山寶山區(qū)新陽煤礦的600m煤層夾心巖中篩選得到。篩選按以下步驟進行 稱取已晾干、粉碎好的夾心巖樣品10. 0g，裝入加有玻璃珠無菌水的三角瓶中，浸泡30min 后,在180r/min的振蕩器上振蕩30mim,然后靜止,取懸池液在10000r/min離心10_15min, 靜止備用。用2. 5ml醫(yī)用注射器取Iml上清液加入到100ml MNMS液體培養(yǎng)基中，再通入 IOOml甲烷氣體，每隔2-3天加一次甲烷氣體，每次50-100ml。搖床培養(yǎng)120r/min 28°C培養(yǎng)9-15天，以發(fā)酵液渾濁，為第一次富集培養(yǎng)完成。再從第一次富集培養(yǎng)液中取Iml進行第二次富集培養(yǎng)，方法同上。連續(xù)富集培養(yǎng)不少于3次。得到單一純菌后保藏，對初篩菌株進行二氯甲烷利用能力測定，在MNMS固體培養(yǎng)基上以二氯甲烷為唯一碳源和能源，提供純凈空氣方法進行選擇性培養(yǎng)，挑選單菌落，轉(zhuǎn)接MNMS培養(yǎng)基，上搖床通過檢測降解效率進行復(fù)篩，得到對二氯甲烷具有高效降解能力菌株甲基細菌Met26。MNMS培養(yǎng)基由I. 0g/L的磷酸二氫鉀、2. 9g/L的十二水磷酸氫二鈉、0. 32g/L的七水硫酸鎂、3. 0g/L的硫酸二銨、IOmL微量元素溶液和990mL蒸餾水組成，pH值為6. 8。其中微量元素溶液組成(mg/L)如下0. 287mg/L七水硫酸鋅、0. 223mg/L七水硫酸錳、0. 062mg/ L硼酸，0. 048mg/L 二水鑰酸鈉、0. 048mg/L六水三氯化鈷、0. 083mg/L碘化鉀、3. 5mg/L 二水氯化鈣和蒸餾水組成。MNMS固體培養(yǎng)基由I. 0g/L的磷酸二氫鉀、2. 9g/L的十二水磷酸氫二鈉、0. 32g/ L的七水硫酸鎂、3. 0g/L的硫酸二銨、IOmL微量元素溶液和990mL蒸餾水組成，pH值為6.8。其中微量元素溶液組成(mg/L)如下0. 287mg/L七水硫酸鋅、O. 223mg/L七水硫酸錳、O. 062mg/L硼酸，O. 048mg/L 二水鑰酸鈉、O. 048mg/L六水三氯化鈷、O. 083mg/L碘化鉀、
3.5mg/L 二水氯化鈣、瓊脂和蒸餾水組成,其中瓊脂的質(zhì)量濃度為2%。對篩選得到的甲基細菌Met26進行分子鑒定，按以下步驟進行提取菌株的總 DNA，采用細菌的16S rDNA通用引物，以基因組DNA為模板進行PCR擴增。然后利用膠回收試劑盒(購自于大連寶生物工程有限公司)回收純化PCR產(chǎn)物，之后進行克隆、轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆子菌落，經(jīng)擴大培養(yǎng)后委托上海生工生物技術(shù)有限公司測序。甲基細菌(Methylobactersp. )Met26 的 16SrDNA 序列長度為 1498bp,其序列如 SEQ ID NO :I所示，測序結(jié)果與GenBank中的16S rDNA序列進行同源性比對，然后用軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖I所示)，以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，該序列與甲基細菌屬(Methylobacter sp.)的親緣關(guān)系最為接近，保守區(qū)相似性為99 %。命名為甲基細菌Met26。通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件確定甲基細菌Met26為甲基細菌屬 (Methylobacter sp.)的一株新菌株,命名為甲基細菌Met26。對本實施方式甲基細菌Met26降解二氯甲烷的降解率進行測定，具體方法如下取106cfu/ml的菌懸液1ml，加入IOOmlMNMS培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，以二氯甲烷為唯一碳源的培養(yǎng)基，即在MNMS培養(yǎng)基中添加二氯甲烷，二氯甲烷終濃度為30mmol/L，分4次加入。120r/min，28°C培養(yǎng)。檢測生物量、pH、二氯甲烷濃度變化，每12h檢測一次。結(jié)果 IOd后二氯甲烷濃度下降63. 5%,15d后二氯甲烷濃度下降78. 6%。
權(quán)利要求
1. 一株降解二氯甲烷的甲基細菌，其特征在于降解二氯甲烷的甲基細菌為甲基細菌 (Methylobacter sp. )Met26,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2012年I月4日，保藏號為CGMCC No.5693。
全文摘要
一株降解二氯甲烷的甲基細菌，它涉及一株降解二氯甲烷的甲基細菌，本發(fā)明提供一株甲基細菌菌株，可高效降解二氯甲烷，可在有氧條件下降解二氯甲烷，為以二氯甲烷為代表的鹵代烴類有機污染物的生物降解機理的研究提供了重要基礎(chǔ)。本發(fā)明降解二氯甲烷的甲基細菌為甲基細菌Met26，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年1月4日，保藏號為CGMCC No.5693。本發(fā)明甲基細菌Met26能夠高效降解二氯甲烷，甲基細菌Met26在以二氯甲烷為唯一碳源、二氯甲烷終濃度為30mmol/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10d后二氯甲烷濃度下降63.5％，15d后二氯甲烷濃度下降78.6％。
文檔編號A62D101/22GK102586149SQ20121005155
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者吳皓瓊, 曹亞彬, 殷博, 牛彥波, 甄濤, 郭立姝 申請人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所