相關(guān)申請的交叉引用

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背景技術(shù)：

本發(fā)明的實施方案包括特異性結(jié)合至精氨基琥珀酸合成酶的抗體及其抗原結(jié)合片段，以及其相關(guān)組合物、試劑盒和使用方法，例如作為鑒定適于精氨酸剝奪或耗盡療法的受試者的伴隨式診斷，所述精氨酸剝奪或耗盡療法諸如adi-peg20和其他基于精氨酸耗盡的療法。

相關(guān)技術(shù)描述

精氨酸為人類的半必需氨基酸。對精氨酸而言為營養(yǎng)缺陷型的細(xì)胞需要自其周遭環(huán)境進行精氨酸攝取。精氨酸營養(yǎng)缺陷細(xì)胞(auxotrope)趨向于為營養(yǎng)缺陷的，因為它們?nèi)狈?jīng)由尿素循環(huán)自代謝前體產(chǎn)生其自身精氨酸的能力。

一些腫瘤展現(xiàn)相對于氨基酸、尤其相對于氨基酸l-精氨酸的營養(yǎng)缺陷行為，因為所述腫瘤缺少精氨基琥珀酸合成酶(ass)，所述酶為負(fù)責(zé)將l-瓜氨酸轉(zhuǎn)化成l-精氨基琥珀酸的酶。因而，這些腫瘤類型需要l-精氨酸的細(xì)胞外來源以合成蛋白質(zhì)。

正在開發(fā)基于精氨酸剝奪或耗盡的療法以利用此營養(yǎng)缺陷行為。例如，精氨酸脫亞胺酶(adi)療法，例如adi-peg20，可減少l-精氨酸的生理水平，并且使腫瘤缺失必需氨基酸，從而導(dǎo)致腫瘤死亡(參見，例如，ott等,investnewdrugs.31:425-34,2013)。其他實例包括l-天門冬酰胺酶用于在諸如急性淋巴母細(xì)胞性白血病的疾病的治療中降低天冬酰胺的循環(huán)水平的用途。還描述了精氨酸降解酶的用途，所述降解酶已證明有效于治療黑素瘤、肝瘤和一些肉瘤。(參見，例如，sugimura等,melanomares.2:191-6,1992；takaku等,jpn.j.cancerres.86:840-6,1995)。

然而，精氨酸剝奪可能并非在所有患者中為有效的。為此，已開發(fā)用于鑒定最適合于精氨酸剝奪或耗盡療法的患者的方法，包括使用精氨基琥珀酸合成酶表達作為診斷標(biāo)志物(參見，例如，wo2002/063048；以及wo2013/151568)。因此，本領(lǐng)域中需要改良試劑，所述改良試劑能夠檢測受試者或相關(guān)組織樣品中的精氨基琥珀酸合成酶表達，并且進而鑒定適于精氨酸剝奪或耗盡療法的患者。

附圖簡述

圖1示出用于測定針對蛋白質(zhì)精氨基琥珀酸合成酶的雜交瘤抗體克隆的免疫球蛋白亞型的elisa分析的結(jié)果。

圖2a示出來自針對蛋白質(zhì)精氨基琥珀酸合成酶的雜交瘤抗體克隆的以下六個有效亞克隆的vh序列的氨基酸比對：6-h6(seqidno:13)、6-c5(seqidno:14)、6-c1(seqidno:15)、6-l7(seqidno:16)、6-a5(seqidno:17)以及6-d6(seqidno:18)。圖2b示出來自以下五個有效亞克隆的vl序列的氨基酸比對：4-5(seqidno:19)、7-2(seqidno:20)、7-8(seqidno:21)、7-12(seqidno:22)以及7-4(seqidno:23)。

圖3示出：亞克隆的vh和vl序列以相當(dāng)于原始雜交瘤的水平結(jié)合至精氨基琥珀酸合成酶抗原。

圖4示出通過利用抗精氨基琥珀酸合成酶單克隆抗體的免疫組織化學(xué)染色(免疫組織化學(xué)；ihc)在人類癌細(xì)胞系a431(圖4a)和skmel-3(圖4b)中檢測精氨基琥珀酸合成酶表達。

圖5示出通過利用抗精氨基琥珀酸合成酶單克隆抗體的免疫組織化學(xué)染色在正常人類組織(圖5a，腎；圖5b，皮膚；圖5c，肝)中檢測精氨基琥珀酸合成酶表達。

圖6示出通過利用抗精氨基琥珀酸合成酶單克隆抗體的免疫組織化學(xué)染色在人類肝細(xì)胞癌(hcc)微陣列中檢測精氨基琥珀酸合成酶表達。圖6a示出精氨基琥珀酸合成酶表達的強陽性染色，并且圖6b-圖6c示出精氨基琥珀酸合成酶表達的陰性染色。

發(fā)明簡述

本發(fā)明的實施方案包括分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合至人類精氨基琥珀酸合成酶多肽并且(a)包含：重鏈可變區(qū)(vh)序列，所述序列包含分別于seqidno:7、8和9中所列出的互補決定區(qū)vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3序列；以及輕鏈可變區(qū)(vl)序列，所述序列包含分別于seqidno:10、11和12中列出的互補決定區(qū)vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3序列；或(b)競爭性抑制(a)與人類精氨基琥珀酸合成酶多肽的結(jié)合。

在某些實施方案中，vh序列與seqidno:1至少90％一致。在某些實施方案中，vl序列與seqidno:3至少90％一致。在某些實施方案中，vh序列包含seqidno:1并且vl序列包含seqidno:3。

在某些實施方案中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段競爭性抑制(a)與人類精氨基琥珀酸合成酶多肽的結(jié)合，其中(a)為包含seqidno:1中列出的vh序列和seqidno:3中列出的vl序列的小鼠單克隆抗體。

在某些實施方案中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段競爭性抑制(a)與人類精氨基琥珀酸合成酶多肽的結(jié)合，其中(a)為亞型igg1或igg2a的小鼠單克隆抗體。

在某些實施方案中，抗體為完整抗體。在某些實施方案中，抗體為單克隆抗體。在某些實施方案中，抗體選自單鏈抗體、fab或fab’片段、f(ab’)2片段、scfv、缺乏鉸鏈區(qū)的單價抗體以及微型抗體。在某些實施方案中，抗體包含小鼠或人類iggfc結(jié)構(gòu)域，任選地igg1或igg2afc結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，抗體為亞型igg1或igg2a的小鼠單克隆抗體。

在某些實施方案中，分離的抗體或其抗原結(jié)合片段包含共價連接的可檢測實體。在某些實施方案中，可檢測實體為熒光團/熒光染料、基于碘的標(biāo)簽、放射性同位素或納米粒子。

還包括組合物，所述組合物包含本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段和適合的載體。

某些實施方案涉及測定生物樣品中人類精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的方法，所述方法包括：(a)獲得或接收任選地來自受試者的生物樣品樣品；(b)使生物樣品與本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；以及(c)測量樣品中抗體或其抗原結(jié)合片段的量，其中抗體或其抗原結(jié)合片段的量決定樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量。

還包括鑒定生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶的缺少的方法，所述方法包括：(a)獲得或接收任選地來自受試者的生物樣品；(b)使生物樣品與本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；(b)測量樣品中抗體或其抗原結(jié)合片段的量，其中抗體或其抗原結(jié)合片段的量決定樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量；以及(c)如果生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少，則鑒定樣品中精氨基琥珀酸合成酶的缺少。

一些實施方案包括鑒定適于精氨酸剝奪療法的受試者的方法，所述方法包括：(a)任選地經(jīng)由保健提供者獲得或接收來自受試者的生物樣品提供者；(b)使生物樣品與本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；(c)測量樣品中抗體或其抗原結(jié)合片段的量，其中抗體或其抗原結(jié)合片段的量決定樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量；以及(d)如果生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少，則將受試者鑒定為適用于精氨酸剝奪療法。

在某些實施方案中，步驟(a)包括自保健提供者接收生物樣品，并且步驟(d)包括向相同或不同保健提供者提供關(guān)于生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的信息。

某些實施方案包括步驟(e)：向(d)的受試者施用至少一種精氨酸耗盡劑。

在某些實施方案中，精氨酸耗盡劑選自精氨酸脫亞胺酶(adi)多肽、精氨酸酶多肽、精氨酸脫羧酶多肽和精氨酸激酶多肽。在特定實施方案中，adi多肽為adi-peg20。

在特定實施方案中，步驟(b)包括執(zhí)行免疫組織化學(xué)(ihc)測定。

還包括用于診斷并治療受試者的方法，所述方法包括：(a)分析測試的結(jié)果，所述測試指示來自受試者的生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量，其中測試使用本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段來執(zhí)行；(b)如果來自(a)的結(jié)果指示生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少，則將患者診斷為適用于精氨酸剝奪療法；以及(c)通過施用至少一種精氨酸耗盡劑來治療(b)的受試者。

一些實施方案包括用于治療受試者的方法，所述方法包括：(a)請求測定來自受試者的生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的測試，其中測試使用本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段來執(zhí)行；以及(b)如果來自(a)的測試指示生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少，則向受試者施用至少一種精氨酸耗盡劑。

在某些實施方案中，受試者為人類患者。在某些實施方案中，受試者患有或疑似患有癌癥。在某些實施方案中，癌癥選自黑素瘤、任選地為肝細(xì)胞癌的肝癌、胰腺癌、前列腺癌、間皮瘤、肉瘤、頭頸癌、白血病、急性骨髓白血病、復(fù)發(fā)性急性骨髓白血病、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌(nsclc)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食管癌、腦癌、子宮頸癌、睪丸癌以及胃癌。

在某些實施方案中，生物樣品為活檢樣品。在某些實施方案中，活檢樣品為癌癥或懷疑癌癥活檢樣品。在某些實施方案中，活檢樣品選自皮膚組織、肝組織、胰腺組織、前列腺組織、間皮組織、上皮組織、卵巢組織、結(jié)腸直腸組織、胃組織、腦組織、肺組織、腎組織、膀胱組織、子宮組織、食道組織、子宮頸組織、睪丸組織、乳房組織以及間葉組織，諸如骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織、血液或造血細(xì)胞/組織。

在某些實施方案中，對照為參考標(biāo)準(zhǔn)、來自健康受試者的生物樣品或來自同一受試者的健康生物樣品。在某些實施方案中，對照為來自同一受試者的非癌性生物樣品，任選地具有相同組織類型。

在某些實施方案中，生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少統(tǒng)計顯著量。

在某些實施方案中，生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少約或至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在某些實施方案中，生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量不可檢測或基本上不可檢測。

在某些實施方案中，精氨酸耗盡劑選自精氨酸脫亞胺酶(adi)多肽、精氨酸酶多肽、精氨酸脫羧酶多肽以及精氨酸激酶多肽。在某些實施方案中，adi多肽為adi-peg20。

一些實施方案包括用于診斷并治療人類患者的癌癥的方法，所述方法包括：(a)分析測試的結(jié)果，所述測試指示來自受試者的腫瘤活檢樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量，其中測試使用本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段來執(zhí)行；(b)如果來自(a)的結(jié)果指示腫瘤活檢樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少，則將患者診斷為適用于adi-peg20療法；以及(c)通過施用adi-peg20來治療(b)的受試者。

還包括用于治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括：(a)請求測定來自受試者的腫瘤活檢樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的測試，其中測試使用本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段來執(zhí)行；以及(b)如果來自(a)的測試指示生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少，則向受試者施用adi-peg20。

在某些實施方案中，癌癥選自黑素瘤和肝細(xì)胞癌。

在特定實施方案中，步驟(a)包括分析來自免疫組織化學(xué)(ihc)測定的載玻片、圖像或其他結(jié)果。

一些實施方案包括一種或多種試劑盒，所述試劑盒包含本文所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段或組合物。某些試劑盒包括用于根據(jù)本文所述的方法使用抗體的說明書。一些試劑盒還包含用于例如酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)的材料，在所述測定中將抗體連接至固體底物以用于執(zhí)行elisa。某些試劑盒包含用于免疫組織化學(xué)(ihc)測定的材料。

一些試劑盒包括用于使用抗體來鑒定適于精氨酸剝奪療法的受試者的說明書。在某些實施方案中，精氨酸剝奪療法為精氨酸耗盡劑，任選地為adi-peg20。某些試劑盒還包含至少一種精氨酸耗盡劑。在某些實施方案中，精氨酸耗盡劑選自精氨酸脫亞胺酶(adi)多肽、精氨酸酶多肽、精氨酸脫羧酶多肽和精氨酸激酶多肽。在某些實施方案中，adi多肽為adi-peg20。

發(fā)明詳述

除非另外定義，否則本文所使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義。盡管與本文所述的那些方法和材料類似或等效的任何方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或測試，但描述了優(yōu)選的方法和材料。出于本發(fā)明的目的，以下定義下列術(shù)語。本文中所列的所有專利和非專利文獻參考均以全文引用方式并入。

如本文所用的冠詞“一(個/種)”是指一個(種)或一個(種)以上(即，至少一個(種))的所述冠詞的語法對象。舉例而言，“一個要素”意指一個要素或一個以上的要素。

“約”意指數(shù)量、水平、值、數(shù)目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化多達參考數(shù)量、水平、值、數(shù)目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

如本文所用的，術(shù)語“氨基酸”旨在意指天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸以及氨基酸類似物和模擬物。天然存在的氨基酸包括在蛋白質(zhì)生物合成期間利用的20種(l)-氨基酸以及其他氨基酸，諸如，例如4-羥基脯氨酸、羥基賴氨酸、鎖鏈素、異鎖鏈素、高半胱氨酸、瓜氨酸以及鳥氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如(d)-氨基酸、正亮氨酸、正纈氨酸、對氟苯丙氨酸、乙硫氨酸以及類似氨基酸，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。氨基酸類似物包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸的修飾形式。這些修飾可包括例如氨基酸上化學(xué)基團和部分的取代或置換，或氨基酸的衍生化。氨基酸模擬物包括例如在功能上展現(xiàn)出類似性質(zhì)，諸如參考氨基酸的電荷和電荷間距特性的有機結(jié)構(gòu)。例如，模擬精氨酸(arg或r)的有機結(jié)構(gòu)將具有正電荷部分，所述正電荷部分位于類似分子空間中并且具有與天然存在arg氨基酸的側(cè)鏈的ε-氨基相同的移動性程度。模擬物還包括約束結(jié)構(gòu)以便維持氨基酸或氨基酸官能基的最佳間距和電荷相互作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉或可判定何種結(jié)構(gòu)構(gòu)成功能上等效的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。

在本說明書全文中，除非上下文另外需要，否則單詞“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”將理解為暗示包括所述步驟或要素或者步驟或要素的群組，而不排除任何其他步驟或要素或者步驟或要素的群組?！坝伞M成”意指包括且限于短語“由…組成”后接的內(nèi)容。因此，短語“由...組成”指示所列要素為必需或必備的，并且不可存在其他要素?！盎旧嫌伞M成”意指包括所述短語之后所列出的任何要素，并且限于不干擾或貢獻于本公開中對所列要素所規(guī)定的活動或動作的其他要素。因此，短語“基本上由…組成”指示所列要素為必需或必備的，但其他要素為任選的并且可存在或可不存在，這取決于所述其他要素是否實質(zhì)上影響所列要素的活動或動作。

術(shù)語“生物樣品”包括可自受試者收集且結(jié)合生物學(xué)狀態(tài)的診斷或監(jiān)測一起使用的生物材料。生物樣品可包括臨床樣品，包括體液樣品，諸如體腔液、尿液、腦脊髓液、血液以及其他生物學(xué)起源的液體樣品；以及組織樣品，諸如活檢樣品、腫瘤或疑似腫瘤樣品和其他生物學(xué)起源的實體樣品。生物樣品還可包括在其收集之后以某一方式操縱的那些樣品，諸如針對某些生物學(xué)成分、培養(yǎng)物或來源于所述培養(yǎng)物的細(xì)胞及其后代通過利用試劑處理、培養(yǎng)、溶解、富集進行操縱。

術(shù)語“綴合物”包括由于藥劑或其他分子與本文所述的抗體的共價或非共價連接或鍵聯(lián)而形成的實體，所述藥劑或其他分子例如可檢測實體、生物活性分子、peg或其他聚合物。

“對照”諸如“對照受試者”或“對照組織”包括健康受試者或健康組織樣品，例如非病理性或患病的組織樣品。在某些實施方案中，對照包括來自不同健康受試者或所測試或診斷的相同受試者的非患病(例如，非癌性)組織。對照還可包括參考標(biāo)準(zhǔn)，例如，自一個或多個健康受試者或組織產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)值。

如本文所用的，術(shù)語“功能”和“功能性”及類似物是指生物功能、酶促功能或治療功能。

“同源性”是指一致的氨基酸或構(gòu)成保守取代的氨基酸的數(shù)目百分比。同源性可使用序列比較程序測定，所述序列比較程序諸如gap(deveraux等,nucleicacidsresearch.12,387-395,1984)，其以引用方式并入本文。以此方式，具有與本文中引用的那些序列類似或?qū)嵸|(zhì)上不同的長度的序列可通過在比對序列中插入空隙來比較，這些空隙例如通過gap所使用的比較算法來測定。

“分離的(isolated)”意指實質(zhì)上或基本上不含在呈材料的天然狀態(tài)時通常伴隨所述材料的組分的材料。例如，如本文所用的“分離肽”或“分離多肽”及類似物包括自肽或多肽分子的天然細(xì)胞環(huán)境并且自與細(xì)胞的其他組分的締合物中體外分離和/或純化所述肽或多肽分子；即，其并不顯著地與體內(nèi)物質(zhì)相締合。在特定實施方案中，分離多肽為抗體。

“減小”量或“減少”量通常為“統(tǒng)計顯著”量，并且可包括例如相對于對照的5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％減小(包括其間所有整數(shù)和范圍)。本文描述了比較和“統(tǒng)計顯著”量的其他實例。

在某些實施方案中，組合物中任何給定藥劑(例如，抗體)的“純度”可特定定義。例如，某些組合物可包含至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％純(包括其間所有小數(shù))的藥劑，如例如且決非限制性地通過高效液相色譜(hplc)所測定的，所述高效液體色譜為生物化學(xué)和分析化學(xué)中常用于分離、鑒定并定量化合物的柱色譜法的熟知形式。

術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可在本文中互換使用以指代氨基酸殘基的聚合物以及所述聚合物的變體和合成類似物。因此，這些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基為合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物，諸如對應(yīng)天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物；以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。本文所述的多肽不限于特定長度的產(chǎn)物；因此，肽、寡肽和蛋白質(zhì)包括于多肽的定義內(nèi)，并且除非另外特別指示，否則這些術(shù)語可在本文中互換使用。本文所述的多肽還可包含表達后修飾，諸如糖基化、乙酰化、磷酸化以及類似修飾，以及本領(lǐng)域中已知的其他修飾，其為天然存在的和非天然存在的。多肽可為整個蛋白質(zhì)，或其子序列、片段、變體或衍生物。

術(shù)語“參考序列”通常是指正與另一序列比較的核酸編碼序列或氨基酸序列。本文所述的所有多肽和多核苷酸序列均作為參考序列來包括，包括由名稱描述的那些序列以及在表和序列表中描述的那些序列。

如本文所用的術(shù)語“序列一致性”或例如包括“與...50％一致的序列”是指在比較窗口上在核苷酸對核苷酸基礎(chǔ)上或在氨基酸對氨基酸基礎(chǔ)上序列一致的程度。因此，“序列一致性百分比”可通過以下方式來計算：在比較窗口上比較兩個最佳比對序列，確定兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(例如，a、t、c、g、i)或一致氨基酸殘基(例如，ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys和met)的位置數(shù)目以得出匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的總位置數(shù)目(即，窗口大小)，并且將結(jié)果乘以100來得出序列一致性百分比。包括與本文所述的任何參考序列具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列一致性(參見，例如，序列表)的核苷酸和多肽，通常其中多肽變體維持參考多肽的至少一種生物活性。

用于描述兩種或更多種多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系的術(shù)語包括“參考序列”、“比較窗口”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”和“實質(zhì)一致性”。“參考序列”為至少12個但常常為15個至18個且往往至少25個單體單元長度，其包括核苷酸和氨基酸殘基。因為兩種多核苷酸可各自包含(1)在兩種多核苷酸之間類似的序列(即，完全多核苷酸序列的僅一部分)；以及(2)在兩種多核苷酸之間不同的序列，在兩種(或更多種)多核苷酸之間的序列比較通常通過在“比較窗口”上比較兩種多核苷酸的序列來執(zhí)行，以鑒定并比較具有序列相似性的局部區(qū)域?！氨容^窗口”是指至少6個鄰接位置、通常約50個至約100個鄰接位置、更通常為約100個至約150個鄰接位置的概念性節(jié)段，在所述比較窗口中在將兩個序列最佳比對之后，將序列與具有相同數(shù)目的鄰接位置的參考序列相比較。比較窗口可包含在與參考序列(不包含添加或缺失)相比較時約20％或更少的添加或缺失(即，空隙)，以達兩種序列的最佳比對。用于比對比較窗口的序列的最佳比對可通過計算機化算法實現(xiàn)方案(wisconsingenetics軟件包7.0發(fā)布版中的gap、bestfit、fasta和tfasta,geneticscomputergroup,575sciencedrivemadison,wi,usa)或通過檢查和由所選各種方法中的任何方法所產(chǎn)生的最佳比對(即，在比較窗口上產(chǎn)生更高百分比同源性)來進行。還可參考如例如通過altschul等,nucl.acidsres.25:3389,1997所公開的blast家族程序。序列分析的詳細(xì)論述可在ausubel等,“currentprotocolsinmolecularbiology,”johnwiley&sonsinc.,1994-1998,第15章的第19.3單元中找到。

“統(tǒng)計顯著”意指結(jié)果不可能偶然發(fā)生。統(tǒng)計顯著性可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法來測定。顯著性的常用量度包括p值，其為在虛無假設(shè)為真的情況下，將發(fā)生所觀察事件的頻率或機率。如果所獲得p值小于顯著性水平，則拒絕虛無假設(shè)。在簡單情況下，顯著性水平限定在0.05或更小的p值下。

術(shù)語“溶解度”是指本文所述的抗體溶解在液體溶劑中并且形成均質(zhì)溶液的性質(zhì)。溶解度通常表示為濃度，表示為每單位體積溶劑的溶質(zhì)質(zhì)量(g溶質(zhì)/kg溶劑、g/dl(100ml)、mg/ml等等)、摩爾濃度、重量摩爾濃度、摩爾分?jǐn)?shù)或其他類似濃度描述。每一溶劑量可溶解的溶質(zhì)的最大平衡量為在指定條件下該溶質(zhì)于該溶劑中的溶解度，所述指定條件包括溫度、壓力、ph以及溶劑的性質(zhì)。在某些實施方案中，溶解度在生理學(xué)ph下或其他ph下測量，例如在ph5.0、ph6.0、ph7.0或ph7.4下測量。在某些實施方案中，溶解度在水或生理緩沖液諸如pbs或nacl(具有或不具有nap)中測量。在特定實施方案中，溶解度在相對較低ph(例如，ph6.0)和相對較高鹽(例如，500mmnacl和10mmnap)下測量。在某些實施方案中，溶解度在諸如血液或血清的生物學(xué)流體(溶劑)中測量。在某些實施方案中，溫度可為約室溫(例如，約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃)或約體溫(約37℃)。在某些實施方案中，抗體在室溫下或在約37℃下具有至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30mg/ml的溶解度。

如本文所用的“受試者”包括展現(xiàn)癥狀或病狀或處于展現(xiàn)癥狀或病狀的風(fēng)險或疑似展現(xiàn)癥狀或病狀的任何動物，其可利用本文所述的抗體來診斷。適合的受試者(患者)包括實驗室動物(諸如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)、農(nóng)場動物和家畜或?qū)櫸?諸如貓或狗)。包括非人類靈長類動物并且優(yōu)選地為人類患者。

如本文所用的“受試者亞群”或“患者亞群”包括特征為具有一個或多個區(qū)別性可測量和/或可鑒定特性的受試者或患者子集，所述特性將所述受試者或患者子集與所屬較寬疾病類別(例如，癌癥)中的其他患者相區(qū)別。這些特性包括疾病亞類、性別、生活方式、健康史、所涉及器官/組織、治療史等等。在一些實施方案中，患者或受試者亞群的特征為在生物樣品例如腫瘤樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的(例如，減少)量或水平。

“實質(zhì)上”或“基本上”意指幾乎全部地或完全地，例如某一給定數(shù)量的95％、96％、97％、98％、99％或更大。

“實質(zhì)上不含”是指幾乎完全或完全不存在給定數(shù)量，例如，某一給定數(shù)量的小于約10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或更小。例如，某些組合物可“實質(zhì)上不含”細(xì)胞蛋白質(zhì)、膜、核酸、內(nèi)毒素或其他污染物。

如本文所用的“治療(treatment/treating)”包括對疾病或病狀的癥狀或病理學(xué)的任何合乎需要的效應(yīng)，并且可包括所治療疾病或病狀的一種或多種可測量標(biāo)記物的甚至最小改變或改良?！爸委?treatment或treating)”未必指示疾病或病狀或其相關(guān)聯(lián)癥狀的完全根除或治愈。接收此治療的受試者為有需要的任何受試者。臨床改良的示例性標(biāo)記物對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言為明顯的。

術(shù)語“野生型”是指當(dāng)與天然存在來源分離時具有基因或基因產(chǎn)物的特性的該基因或基因產(chǎn)物。野生型基因或基因產(chǎn)物(例如，多肽)為在群體中最常觀察到的并且因此經(jīng)任意設(shè)計而呈現(xiàn)基因的“正?！被颉耙吧汀毙问降脑摶蚧蚧虍a(chǎn)物。

抗體

某些實施方案涉及特異性結(jié)合至人類精氨基琥珀酸合成酶多肽的抗體，包括結(jié)合至其一個或多個鄰接或非鄰接片段或表位的那些抗體。在一些實施方案中，抗體通過本文所述的輕鏈可變區(qū)序列和/或重鏈可變區(qū)和/或其中所含的互補決定區(qū)(cdr)序列或抗原結(jié)合區(qū)(abr)來定義，包括特異性結(jié)合至人類精氨基琥珀酸合成酶的這些序列的變體和組合。還包括競爭性抑制這些抗體與人類精氨基琥珀酸合成酶的結(jié)合的抗體。

示例性抗體序列提供于以下表1中。

因此，在某些實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含表1中的一個或多個序列(例如，seqidno:1、3、7-12)，包括其組合和變體。例如，在特定實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含seqidno:1中列出的vh序列和/或seqidno:3中列出的vl序列。在一些實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含：重鏈可變區(qū)(vh)，所述重鏈可變區(qū)包含seqidno:1中所含有的互補決定區(qū)vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3序列(例如，分別為seqidno:7、8和9)；和/或輕鏈可變區(qū)(vl)，所述輕鏈可變區(qū)包含seqidno:3中所含有的互補決定區(qū)vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3序列(例如，分別為seqidno:10、11和12)。在一些實施方案中，cdr序列根據(jù)kabat、clothia的規(guī)則或其組合來定義(還參見國際immunogenetics)。

如本文所用的術(shù)語“抗原結(jié)合片段”是指多肽片段，其含有結(jié)合至所關(guān)注抗原的免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈的至少一個cdr。就此而言，本文描述的抗體的抗原結(jié)合片段可包含來自特異性結(jié)合至治療或診斷靶標(biāo)(諸如人類精氨基琥珀酸合成酶多肽，包括其片段)的抗體的vh序列和vl序列的1、2、3、4、5個或所有6個cdr。

術(shù)語“抗原”是指分子或分子的一部分，其能夠通過選擇性抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合，并且另外能夠用于動物中以產(chǎn)生能夠結(jié)合至該抗原的表位的抗體?？乖删哂幸粋€或多個表位。

術(shù)語“表位”包括任何決定簇，優(yōu)選為多肽決定簇，其能夠特異性結(jié)合至免疫球蛋白或t細(xì)胞受體。表位為抗原內(nèi)由抗體結(jié)合的區(qū)域。在某些實施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面基團，諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，并且在某些實施方案中，可具有特定三維結(jié)構(gòu)特性和/或特定電荷特性。表位可相對于抗原的主要結(jié)構(gòu)為鄰接或非鄰接的。

如果與抗體、其抗原結(jié)合片段和替代細(xì)胞或物質(zhì)反應(yīng)或締合相比，所述抗體、其抗原結(jié)合片段更頻繁地、更快速地以更大持續(xù)時間和/或以更大親和力和特定細(xì)胞或物質(zhì)反應(yīng)或締合，則認(rèn)為所述抗體、其抗原結(jié)合片段展現(xiàn)出“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”。如果與抗體結(jié)合至其他物質(zhì)相比，所述抗體以更大親和力、親合力、更容易地和/或以更大持續(xù)時間結(jié)合至靶標(biāo)，則所述抗體“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先地結(jié)合”至所述靶標(biāo)。例如，特異性或優(yōu)先地結(jié)合至特定表位的抗體為與所述抗體結(jié)合至其他表位相比，以更大親和力、親合力、更容易地和/或以更大持續(xù)時間結(jié)合該特定表位的抗體。還應(yīng)理解通過例如以下方式來解讀此定義：特異性或優(yōu)先地結(jié)合至第一靶標(biāo)的抗體(或部分或表位)可以或可以不特異性或優(yōu)先地結(jié)合至第二靶標(biāo)。因而，“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”未必需要(盡管其可包括)唯一結(jié)合。通常但并非必要地，對結(jié)合的提及意指優(yōu)先結(jié)合。

免疫結(jié)合通常是指例如舉例說明而非限制地由于靜電、離子、親水性和/或疏水性吸引或排斥、立體力、氫鍵結(jié)、范德華力以及其他相互作用而在免疫球蛋白分子與免疫球蛋白對其而言具特異性的抗原之間發(fā)生的非共價相互作用類型。免疫結(jié)合相互作用的強度或親和力可以相互作用的解離常數(shù)(kd)來表示，其中較小kd表示較大親和力。所選多肽的免疫結(jié)合性質(zhì)可使用本領(lǐng)域中熟知的方法來定量。一種此類方法需要測量抗原結(jié)合位點/抗原復(fù)合物形成和解離的速率，其中那些速率取決于復(fù)合物配偶體的濃度、相互作用的親和力，并且取決于在兩個方向上同等地影響速率的幾何參數(shù)。因此，“締合速率常數(shù)”(kon)和“解離速率常數(shù)”(koff)可通過計算濃度和締合與解離的實際速率來測定。koff/kon的比率允許消除與親和力不相關(guān)的所有參數(shù)，且因此等于解離常數(shù)kd。

抗體及其抗原結(jié)合片段的免疫結(jié)合性質(zhì)可使用本領(lǐng)域中熟知的方法來定量(參見davies等,annualrev.biochem.59:439-473,1990)。在一些實施方案中，據(jù)說當(dāng)平衡解離常數(shù)為約≤10^-7或10^-8m時，抗體特異性結(jié)合抗原或其表位。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)平衡解離常數(shù)可為約≤10^-9m或≤10^-10m。在某些說明性實施方案中，蛋白質(zhì)對本文所述的抗原或靶標(biāo)(所述蛋白質(zhì)與其特異性結(jié)合)具有約、至少約或不超過約0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50nm的親和力(kd)。

如上所述，本文所述的抗體特異性結(jié)合至人類精氨基琥珀酸合成酶多肽或其片段或表位。精氨基琥珀酸合成酶(synthase)或合成酶(synthetase)(ass或ass1)(ec6.3.4.5)為催化精氨基琥珀酸由瓜氨酸和天冬氨酸酯合成的酶。精氨基琥珀酸合成酶負(fù)責(zé)尿素循環(huán)的第三步驟和瓜氨酸-no循環(huán)的反應(yīng)之一。人類精氨基琥珀酸合成酶的主要氨基酸序列示出于以下表2中。

因此，本文所述的抗體特異性結(jié)合至seqidno:5的多肽或其片段或表位。在某些實施方案中，這些抗體特異性結(jié)合至seqidno:5的約或至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50個或更多個氨基酸的鄰接片段。

在某些實施方案中，如本文所述的抗體及其抗原結(jié)合片段包括分別插入在重鏈架構(gòu)區(qū)(fr)組與輕鏈架構(gòu)區(qū)(fr)組之間的重鏈cdr組和輕鏈cdr組，所述架構(gòu)區(qū)(fr)組對cdr提供支撐并且限定cdr相對于彼此的空間關(guān)系。如本文所用的，術(shù)語“cdr組”是指重鏈v區(qū)或輕鏈v區(qū)的三個高變區(qū)。自重鏈或輕鏈的n末端起，這些區(qū)域分別表示為“cdr1”、“cdr2”和“cdr3”。因此，抗原結(jié)合位點包括六個cdr，包含來自每個重鏈v區(qū)和輕鏈v區(qū)的cdr組。包含單一cdr(例如，cdr1、cdr2或cdr3)的多肽在本文中稱為“分子識別單元”。許多抗原抗體復(fù)合物的結(jié)晶學(xué)分析已證明：cdr的氨基酸殘基與所結(jié)合抗原形成廣泛接觸，其中最廣泛抗原接觸為與重鏈cdr3的接觸。因此，分子識別單元主要負(fù)責(zé)抗原結(jié)合位點的特異性。

如本文所用的，術(shù)語“fr組”是指四個側(cè)接氨基酸序列，其限定重鏈v區(qū)或輕鏈v區(qū)的cdr組的cdr。一些fr殘基可接觸所結(jié)合抗原；然而，fr主要負(fù)責(zé)將v區(qū)折疊成抗原結(jié)合位點，尤其為直接相鄰于cdr的fr殘基。在fr內(nèi)，某些胺基殘基和某些結(jié)構(gòu)特點為極高度保守的。就此而言，所有v區(qū)序列均含有大約90個氨基酸殘基的內(nèi)部二硫化物環(huán)。當(dāng)v區(qū)折疊成結(jié)合位點時，cdr顯示為形成抗原結(jié)合表面的突出環(huán)基序。一般認(rèn)為，存在fr的影響cdr環(huán)成為某些“典型”結(jié)構(gòu)的折疊形狀的保守結(jié)構(gòu)區(qū)—與精確cdr氨基酸序列無關(guān)。另外，已知某些fr殘基參與非共價域間接觸，從而穩(wěn)定抗體重鏈和輕鏈的相互作用。

可參考kabat,e.a.等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.第4版,usdepartmentofhealthandhumanservices.1987及其更新內(nèi)容來確定免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置。

在一些實施方案中，抗體為“單克隆抗體”，其是指同源抗體群體，其中單克隆抗體包含涉和表位的選擇性結(jié)合的氨基酸(天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸)。單克隆抗體針對單一表位具有高特異性。術(shù)語“單克隆抗體”不僅涵蓋完整單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且涵蓋其片段(諸如fab、fab’、f(ab’)2、fv)、單鏈(scfv)、其變體、包含抗原結(jié)合部分的融合蛋白質(zhì)、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體以及免疫球蛋白分子的任何其他修飾構(gòu)型，所述免疫球蛋白分子包含具有所需特異性和結(jié)合至表位的能力的抗原結(jié)合片段(表位識別位點)。并不意味著在抗體的來源或制成(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉(zhuǎn)基因動物)所述抗體的方式方面受到限制。術(shù)語包括在“抗體”的定義下的本文所述的完整免疫球蛋白以及片段等等。

蛋白水解酶木瓜酶優(yōu)先地裂解igg分子以產(chǎn)生若干片段，其中兩個片段(f(ab)片段)各自包含具有完整抗原結(jié)合位點的共價異源二聚物。酶胃蛋白酶能夠裂解igg分子以提供若干片段，包括含有兩個抗原結(jié)合位點的f(ab’)2片段。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案來使用的fv片段可通過igm以及在極少情形下igg或iga免疫球蛋白分子的優(yōu)先蛋白水解裂解來產(chǎn)生。然而，fv片段更通常使用本領(lǐng)域中已知的重組技術(shù)來得到。fv片段包括非共價vh::vl異源二聚物，其包括保持天然抗體分子的大部分抗原識別和結(jié)合能力的抗原結(jié)合位點。參見inbar等,pnasusa.69:2659-2662,1972；hochman等,biochem.15:2706-2710,1976；以及ehrlich等,biochem.19:4091-4096,1980。

在某些實施方案中，涵蓋單鏈fv或scfv抗體。例如，κ抗體(ill等,prot.eng.10:949-57,1997)；微型抗體(martin等,emboj13:5305-9,1994)；雙抗體(holliger等,pnas90:6444-8,1993)；或janusins(traunecker等,emboj10:3655-59,1991；以及traunecker等,int.j.cancersuppl.7:51-52,1992)可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)遵循本申請關(guān)于選擇具有所需特異性的抗體的教義來制備。

單鏈fv(sfv)多肽為共價連接的vh::vl異源二聚物，其表達自包含由肽編碼接頭連接的vh編碼基因和vl編碼基因的基因融合物。huston等,(pnasusa.85(16):5879-5883,1988)。已描述許多方法來分辨用于將來自抗體v區(qū)的天然聚集—但化學(xué)分離—輕鏈多肽鏈和重鏈多肽鏈轉(zhuǎn)化成sfv分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，所述sfv分子將折疊成實質(zhì)上類似于抗原結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)。參見，例如，huston等的美國專利號5,091,513和5,132,405；以及l(fā)adner等的美國專利號4,946,778。

在某些實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段為人源化的。這些實施方案是指嵌合分子，其通常使用重組技術(shù)制備，具有來源于來自非人類物種的免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點并具有基于人類免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白結(jié)構(gòu)。抗原結(jié)合位點可包含融合于恒定結(jié)構(gòu)域上的完全可變結(jié)構(gòu)域，或僅接枝于可變結(jié)構(gòu)域中的適當(dāng)架構(gòu)區(qū)上的cdr。表位結(jié)合位點可為野生型的或通過一個或多個氨基酸取代修飾。這消除作為人類個體中的免疫原的恒定區(qū)，但保留對外來可變區(qū)的免疫反應(yīng)的可能性(lobuglio等,pnasusa86:4220-4224,1989；queen等,pnasusa.86:10029-10033,1988；riechmann等,nature.332:323-327,1988)。用于抗體的人源化的說明性方法包括美國專利號7,462,697中所述的方法。

另一種方法不僅關(guān)注于提供源于人類的恒定區(qū)，而且也關(guān)注修飾可變區(qū)以便將所述可變區(qū)盡可能緊密地改造成人類形式。已知的是，重鏈和輕鏈兩者的可變區(qū)含有三個互補決定區(qū)(cdr)，其響應(yīng)于所論述的表位而變化并且決定結(jié)合能力，其側(cè)接有四個架構(gòu)區(qū)(fr)，所述架構(gòu)區(qū)在給定物種中相對保守并且推定地提供用于cdr的支架。當(dāng)相對于特定表位來制備非人類抗體時，可變區(qū)可通過將來源于非人類抗體的cdr接枝于存在于人類抗體中待修飾的fr上來“改造”或“人源化”。此方法對各種抗體的應(yīng)用已由以下各項報導(dǎo)：sato等,cancerres.53:851-856,1993；riechmann等,nature332:323-327,1988；verhoeyen等,science239:1534-1536,1988；kettleborough等,proteinengineering.4:773-3783,1991；maeda等,humanantibodieshybridoma2:124-134,1991；gorman等,pnasusa.88:4181-4185,1991；tempest等,bio/technology9:266-271,1991；co等,pnasusa.88:2869-2873,1991；carter等,pnasusa.89:4285-4289,1992；以及co等,jimmunol.148:1149-1154,1992。在一些實施方案中，人源化抗體保存所有cdr序列(例如，人源化小鼠抗體，其含有來自小鼠抗體的所有六個cdr)。在其他實施方案中，人源化抗體具有一個或多個cdr(一個、兩個、三個、四個、五個、六個)，其相對于原始抗體來改變，也稱為“來源于”來自原始抗體的一個或多個cdr的一個或多個cdr。

本文所述的抗體及其抗原結(jié)合片段可包含來自任何種類的哺乳動物的具有任何種類的免疫球蛋白亞型(例如，iga、igd、ige、igg、igm，包括其子類及組合，例如，igg1、igg2、igg3、igg4)的輕鏈恒定區(qū)或重鏈恒定區(qū)(例如，fc區(qū))，所述哺乳動物諸如小鼠、人類、兔或山羊。“fc區(qū)”序列通常來源于免疫球蛋白(ig)分子的重鏈。典型ig分子由兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成。重鏈可分成至少三個功能區(qū)：fd區(qū)、fc區(qū)(片段可結(jié)晶區(qū))和鉸鏈區(qū)，后者僅在igg、iga和igd免疫球蛋白中找到。fd區(qū)包含重鏈的可變(vh)結(jié)構(gòu)域和恒定(ch1)結(jié)構(gòu)域，并且連同輕鏈的可變(vl)結(jié)構(gòu)域和恒定(cl)結(jié)構(gòu)域一起形成抗原結(jié)合片段或fab區(qū)。

igg、iga和igd免疫球蛋白的fc區(qū)包含重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2和3，其分別命名為ch2區(qū)和ch3區(qū)；并且ige和igm免疫球蛋白的fc區(qū)包含重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2、3和4，其分別命名為ch2區(qū)、ch3區(qū)和ch4區(qū)。fc區(qū)主要負(fù)責(zé)免疫球蛋白效應(yīng)物功能，其包括例如補體固定和與效應(yīng)物細(xì)胞的同源fc受體的結(jié)合。

鉸鏈區(qū)(在igg、iga和igd找到)充當(dāng)柔性間隔物，其允許fab部分在空間中相對于fc區(qū)自由地移動。與恒定區(qū)對比，鉸鏈區(qū)在結(jié)構(gòu)上不同，在免疫球蛋白類別和子類中在序列和長度兩者上有所變化(參見以上)。鉸鏈區(qū)還可含有一個或多個糖基化位點，其包括許多結(jié)構(gòu)上相異類型的位點以用于碳水化合物連接。例如，iga1在鉸鏈區(qū)的17氨基酸節(jié)段內(nèi)含有五個糖基化位點，從而賦予鉸鏈區(qū)多肽賦予對腸蛋白酶的顯著抵抗力。ch2結(jié)構(gòu)域的鉸鏈近端區(qū)中的殘基還可影響免疫球蛋白與其相應(yīng)fc受體之間的相互作用的特異性(參見，例如，shin等,intern.rev.immunol.10:177-186,1993)。

如本文所用的術(shù)語“fc區(qū)”或“fc片段”或“fc”因此是指抗體的一部分或其抗原結(jié)合片段，其含有來自一個或多個所選免疫球蛋白的ch2區(qū)、ch3區(qū)和/或ch4區(qū)中的一種或多種，包括其片段和變體以及組合?！癴c區(qū)”還可包括免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)的一個或多個鉸鏈區(qū)。在某些實施方案中，fc區(qū)不含有免疫球蛋白的ch1區(qū)、cl區(qū)、vl區(qū)和/或vh區(qū)中的一種或多種。

fc區(qū)可包含任何一個或多個免疫球蛋白類別的ch2區(qū)、ch3區(qū)、ch4區(qū)和/或鉸鏈區(qū)，包括但不限于iga、igd、ige、igg、igm，包括其子類和組合。在一些實施方案中，fc區(qū)來自iga免疫球蛋白(例如，小鼠、人類、兔、山羊)，包括子類iga1和/或iga2。在某些實施方案中，fc區(qū)來自igd免疫球蛋白(例如，小鼠、人類、兔、山羊)。在特定實施方案中，fc區(qū)來自ige免疫球蛋白(例如，小鼠、人類、兔、山羊)。在一些實施方案中，fc區(qū)來自igg免疫球蛋白(例如，小鼠、人類、兔、山羊)，包括子類igg1、igg2、igg3和/或igg4。在某些實施方案中，fc區(qū)來自igm免疫球蛋白(例如，小鼠、人類、兔、山羊)。

還包括抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含表1中的序列的“變體”(例如，seqidno:1、3、7-12的變體)。如本文中所用的術(shù)語“變體”序列是指與本文公開的參考序列(例如，表1，seqidno:1、3、7-12)相差一個或多個取代、缺失(例如，截斷)、添加和/或插入的多肽或多核苷酸序列。某些變體因此包括本文所述的參考序列的片段。變體多肽為生物活性的，即，其持續(xù)具有參考多肽的結(jié)合活性。這些變體可由例如遺傳多態(tài)性和/或人類操縱而產(chǎn)生。

在許多情況下，生物活性變體將含有一個或多個保守取代。“保守取代”為氨基酸由具有類似性質(zhì)的另一個氨基酸取代以使得肽化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員將預(yù)期多肽的二級結(jié)構(gòu)和疏水性質(zhì)實質(zhì)上不會改變的取代。如上所述，可在本發(fā)明的多核苷酸和多肽的結(jié)構(gòu)中進行修飾，并且仍獲得編碼具有合乎需要特性的變體或衍生多肽的功能分子。當(dāng)意圖改變多肽的氨基酸序列以產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的等效或甚至改良的變體或部分時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將通常根據(jù)以下表a改變編碼dna序列的密碼子中的一種或多種。

例如，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可由其他氨基酸取代，而沒有與例如像抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)的相互作用結(jié)合能力的可觀損失。因為蛋白質(zhì)的相互作用能力和性質(zhì)限定該蛋白質(zhì)的生物功能活性，所以可在蛋白質(zhì)序列中并且當(dāng)然可在其基本dna編碼序列中做出某些氨基酸序列取代，并且雖然如此仍獲得具有類似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。因此涵蓋的是，可在所公開組合物的肽序列或編碼所述肽的相應(yīng)dna序列中做出各種改變，而沒有其實用性的可觀損失。

在做出此類改變時，可考慮氨基酸的疏水指數(shù)。本領(lǐng)域中通常理解疏水氨基酸指數(shù)在對蛋白質(zhì)賦予相互作用生物功能中的重要性(kyte&doolittle,1982,以引用方式并入本文)。所接受的是，氨基酸的相對疏水特性有助于所得蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，其繼而限定蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，所述其他分子例如酶、底物、受體、dna、抗體、抗原以及類似物。已基于各種氨基酸的疏水性和電荷特性來指定所述氨基酸的疏水指數(shù)(kyte&doolittle,1982)。這些值為：異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸酯(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。本領(lǐng)域中已知的是，某些氨基酸可由具有類似疏水指數(shù)或評分的其他氨基酸取代，并且仍產(chǎn)生具有類似生物活性的蛋白質(zhì)，即，仍獲得生物學(xué)功能等效的蛋白質(zhì)。在做出這些改變時，疏水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸的取代為優(yōu)選的，疏水指數(shù)在±1內(nèi)的氨基酸的取代為尤其優(yōu)選的，并且疏水指數(shù)在±0.5內(nèi)的氨基酸的取代為甚至尤其更優(yōu)選的。

本領(lǐng)域中還理解的是，可基于親水性來有效地做出類似氨基酸的取代。美國專利4,554,101(特別地以全文引用方式并入本文中)闡述：如受蛋白質(zhì)的相鄰氨基酸的親水性所支配的，蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性與所述蛋白質(zhì)的生物性質(zhì)有關(guān)。如美國專利4,554,101中所詳述的，已對氨基酸殘基指定以下親水性值：精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸酯(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。應(yīng)理解，氨基酸可由具有類似親水性值的另一個氨基酸取代，并且仍獲得生物學(xué)等效且尤其免疫學(xué)等效的蛋白質(zhì)。在這些改變中，親水性值在±2內(nèi)的氨基酸的取代為優(yōu)選的，親水性值在±1內(nèi)的氨基酸的取代為尤其優(yōu)選的，并且親水性值在±0.5內(nèi)的氨基酸的取代為甚至尤其更優(yōu)選的。

如以上所概述，氨基酸取代因此通?；诎被醾?cè)鏈取代基的相對相似性，例如基于其疏水性、親水性、電荷、大小以及類似特性。將各種前述特性考慮在內(nèi)的示例性取代為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸酯；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。

氨基酸取代可進一步基于殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)的相似性來做出。例如，帶負(fù)電氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；并且具有未帶電極性頭部基團的具有類似親水性值的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？杀硎颈Ｊ匦愿淖兊钠渌被崛航M包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。

變體還可或可選地含有非保守性改變。在一更優(yōu)選實施方案中，變體多肽與天然或參考序列相差約或少于約10、9、8、7、6、5、4、3、2個氨基酸或甚至1個氨基酸的取代、缺失或添加。變體還可(或可選地)通過例如對多肽的免疫原性、二級結(jié)構(gòu)、酶促活性和/或疏水性質(zhì)具有最小影響的氨基酸的缺失或添加來修飾。

一般而言，變體將顯示與參考多肽序列(例如，表1，seqidno:1、3、7-12)至少約30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性或序列一致性或序列同源性。此外，涵蓋與參考序列相差約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個氨基酸(包括其間所有整數(shù)和范圍)的添加(例如，c末端添加、n末端添加、兩者兼有)、缺失、截斷、插入或取代(例如，保守取代)，但保持親本或參考多肽序列的性質(zhì)或活性的序列。

在一些實施方案中，變體多肽與參考序列相差至少一個但小于50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2個氨基酸殘基。在其他實施方案中，變體多肽與參考序列相差至少1％但小于20％、15％、10％或5％的殘基。(如果此比較需要比對，則序列應(yīng)針對最大相似性來比對。在一些情況下，因缺失或插入或失配而處于“環(huán)”外的序列視為差異。

序列之間的序列相似性或序列一致性(所述術(shù)語在本文中可互換使用)的計算執(zhí)行如下。為測定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的一致性百分比，出于最佳比較目的來比對序列(例如，可將空隙引入第一氨基酸或核酸序列和第二氨基酸或核酸序列的一者或兩者中以達最佳比對，并且出于比較目的可忽視非同源序列)。在某些實施方案中，出于比較目的而比對的參考序列的長度為參考序列的長度的至少30％、優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選至少50％、60％以及甚至更優(yōu)選至少70％、80％、90％、100％。隨后比較對應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢糜膳c第二序列中的對應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，則分子在該位置處為一致的。

兩個序列之間的一致性百分比隨序列共享的一致位置的數(shù)目而變化，這考慮了空隙的數(shù)目和每個空隙的長度，需要引入所述空隙以達兩個序列的最佳比對。

可使用數(shù)學(xué)算法來完成序列的比較和兩個序列之間的一致性百分比的測定。在一個優(yōu)選實施方案中，使用已并入gcg軟件包中的gap程序中的needleman和wunsch(j.mol.biol.48:444-453,1970)算法、使用blossum62矩陣或pam250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的空隙加權(quán)值和1、2、3、4、5或6的長度加權(quán)值來測定兩個氨基酸序列之間的一致性百分比。在又一個優(yōu)選實施方案中，使用gcg軟件包中的gap程序、使用nwsgapdna.cmp矩陣以及40、50、60、70或80的空隙加權(quán)值和1、2、3、4、5或6的長度加權(quán)值來測定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比。一組優(yōu)選參數(shù)包括blossum62評分矩陣，其中空隙罰分為12、空隙延伸罰分為4并且框架移位空隙罰分為5。

兩個氨基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比可使用已并入align程序(2.0版)中的e.meyers和w.miller(cabios.4:11-17,1989)的算法、使用pam120加權(quán)殘基表、空隙長度罰分12和空隙罰分4來測定。

本文所述的核酸和蛋白質(zhì)序列可用作“查詢序列”以執(zhí)行針對公共數(shù)據(jù)庫的搜索，以便例如鑒定其他家族成員或相關(guān)序列。這些搜索可使用altschul,等,(1990,j.mol.biol,215:403-10)的nblast和xblast程序(2.0版)執(zhí)行。blast核苷酸搜索可利用nblast程序、評分＝100、字長＝12來執(zhí)行，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。blast蛋白質(zhì)搜索可利用xblast程序、評分＝50、字長＝3來執(zhí)行，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為獲得用于比較目的的空隙化比對，可利用如altschul等,(nucleicacidsres.25:3389-3402,1997)中所述的空隙化blast。當(dāng)利用blast和空隙化blast程序時，可使用相應(yīng)程序(例如，xblast和nblast)的默認(rèn)參數(shù)。

在一個實施方案中，如上所述，可使用blast比對工具評估多核苷酸和/或多肽。局部比對簡單地由一對序列節(jié)段組成，序列節(jié)段之一來自進行比較的每個序列。smith-waterman或sellers算法的修改形式將找出評分無法通過延伸或修整而改良的所有節(jié)段對，其稱為高評分節(jié)段對(hsp)。blast比對的結(jié)果包括統(tǒng)計學(xué)量度，以指示可有機會單獨預(yù)期blast評分的可能性。

原始評分s由與每個比對序列相關(guān)聯(lián)的空隙和取代的數(shù)目計算，其中較高相似性評分指示更顯著比對。取代評分由查找表(參見pam,blosum)給出。

空隙評分通常計算為空隙開放罰分g和空隙延伸罰分l的總和。對于長度n的空隙而言，空隙成本將為g+ln?？障冻杀?、g和l的選擇為經(jīng)驗性的，但習(xí)慣對g選擇高值(10-15)，例如11，而對l選擇低值(1-2)，例如1。

比特評分s’得自原始比對評分s，其中已考慮所使用評分系統(tǒng)的統(tǒng)計學(xué)性質(zhì)。比特評分相對于評分系統(tǒng)加以正規(guī)化，因此所述比特評分可用于比較來自不同搜索的比對評分。術(shù)語“比特評分”和“相似性評分”可互換使用。比特評分給出對所述比對良好程度如何的指示；評分愈高，比對愈好。

e-值或預(yù)期值描述具有類似評分的序列將偶爾出現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫中的可能性。其為具有相當(dāng)于或好于s的評分的不同比對數(shù)目的預(yù)測值，預(yù)期所述評分偶爾出現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫搜索中。e-值愈小，比對愈顯著。例如，具有e^-117的e值的比對意指：具有類似評分的序列極不可能偶爾簡單地出現(xiàn)。另外，用于比對一對隨機氨基酸的預(yù)期評分需要為負(fù)，否則長的比對將趨向于具有高評分，這獨立于所比對節(jié)段是否相關(guān)。另外，blast算法使用適當(dāng)取代矩陣、核苷酸或氨基酸，并且針對空隙化比對而言，使用空隙創(chuàng)建和延伸罰分。例如，多肽序列的blast比對和比較通常使用blosum62矩陣、空隙存在罰分11和空隙延伸罰分1來進行。

在一個實施方案中，序列相似性評分由使用blosum62矩陣、空隙存在罰分11和空隙延伸罰分1進行的blast分析來報導(dǎo)。

在一個特定實施方案中，本文中提供的序列一致性/相似性評分是指使用gap第10版(gcg,accelrys,sandiego,calif.)、使用以下參數(shù)獲得的值：對核苷酸序列而言的一致性％和相似性％，使用空隙加權(quán)值50和長度加權(quán)值3以及nwsgapdna.cmp評分矩陣；對氨基酸序列而言的一致性％和相似性％，使用空隙加權(quán)值8和長度加權(quán)值2以及blosum62評分矩陣(henikoff和henikoff,pnasusa.89:10915-10919,1992)。gap使用needleman和wunsch(jmolbiol.48:443-453,1970)的算法來找出最大化匹配數(shù)目并最小化空隙數(shù)目的兩個完全序列的比對。

在一個特定實施方案中，變體多肽包含可與參考多肽序列最佳比對的氨基酸序列(參見，例如，表、序列表；seqidno:1、3、7-12)，以產(chǎn)生為至少約50、60、70、80、90、100、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多的blast比特評分或序列相似性評分，包括其間所有整數(shù)和范圍，其中blast比對使用blosum62矩陣、空隙存在罰分11和空隙延伸罰分1。

如上所述，參考多肽可以包括氨基酸取代、缺失、截斷、添加和插入的各種方式改變。用于這些操縱的方法為本領(lǐng)域中通常已知的。例如，參考多肽的氨基酸序列變體可通過dna中的突變來制備。用于誘變和核苷酸序列改變的方法為本領(lǐng)域中熟知的。參見，例如，kunkel(pnasusa.82:488-492,1985)；kunkel等,(methodsinenzymol.154:367-382,1987)；美國專利號4,873,192；watson,j.d.等,(“molecularbiologyofthegene”,第四版,benjamin/cummings,menlopark,calif.,1987)以及其中引用的參考文獻。關(guān)于不影響所關(guān)注蛋白質(zhì)的生物活性的適當(dāng)氨基酸取代的指導(dǎo)可在dayhoff等,(1978)atlasofproteinsequenceandstructure(natl.biomed.res.found.,washington,d.c.)的模型中找到。

用于篩選通過這些修飾制成的組合文庫的基因產(chǎn)物并且用于篩選具有所選性質(zhì)的基因產(chǎn)物的cdna文庫的方法為本領(lǐng)域中已知的。對快速篩選通過參考多肽的組合誘變所產(chǎn)生的基因文庫而言，這些方法為可接受的。作為一個實例，遞回整體誘變(rem)可與篩選測定組合使用來鑒定多肽變體，所述遞回整體誘變?yōu)橐环N增強文庫中功能突變體的出現(xiàn)頻率的技術(shù)(arkin和yourvan,pnasusa89:7811-7815,1992；delgrave等,proteinengineering.6:327-331,1993)。

還包括抗體或其抗原結(jié)合片段，其“競爭性抑制”本文所述的抗體(參見，例如，實施例1)與人類精氨基琥珀酸合成酶多肽的結(jié)合。用于通過競爭性抑制測定mab特異性和親和力的方法可例如在harlow等,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1988)；colligan等編,currentprotocolsinimmunology,greenepublishingassoc.andwileyinterscience,n.y.,(1992,1993)；muller,meth.enzymol.92:589-601,1983；以及jia,x-c.等,j.immunol.methods288:91-98,2004(所述文獻各自以引用方式并入)中找到。

特定實施方案包括抗體或其抗原結(jié)合片段，其競爭性抑制抗體與人類精氨基琥珀酸合成酶(seqidno:5)的結(jié)合，其中抗體(其受到競爭性抑制)包含seqidno:1中列出的vh序列和/或seqidno:3中列出的vl序列。在特定實施方案中，抗體(其受到競爭性抑制)為如本文所述的單克隆抗體，例如，完整單克隆抗體，諸如igg抗體，。在特定實施方案中，抗體(其受到競爭性抑制)為igg1或igg2a免疫球蛋白亞型。

在某些實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段綴合至或共價地連接至可檢測實體，例如以促進檢測。示例性可檢測實體包括而不限于基于碘的標(biāo)簽、放射性同位素、熒光團/熒光染料以及納米粒子。

示例性基于碘的標(biāo)簽包括泛影酸(gehealthcare)及其陰離子形式，即泛影酸鹽。泛影酸為用于先進x射線技術(shù)諸如ct掃描中的放射性顯影劑。還包括以下所述的碘放射性同位素。

可用作可檢測實體的示例性放射性同位素包括³²p、³³p、³⁵s、³h、¹⁸f、11c、¹³n、¹⁵o、¹¹¹in、¹⁶⁹yb、⁹⁹mtc、⁵⁵fe，以及碘的同位素，諸如¹²³i、¹²⁴i、¹²⁵i以及¹³¹i。這些放射性同位素具有不同的半衰期、衰變類型和能量水平，其可特制來匹配特定協(xié)定的需要。

可用作直接可檢測實體的熒光團或熒光染料的實例包括熒光素、四甲基若丹明、德克薩斯紅、oregon以及許多其他實例(例如，haugland,handbookoffluorescentprobes-第9版,2002,molec.probes,inc.,eugeneor；haugland,thehandbook:aguidetofluorescentprobesandlabelingtechnologies-第10版,2005,invitrogen,carlsbad,ca)。還包括發(fā)光染料或其他可檢測染料。通過染料發(fā)射的光可為可見光或不可見光，諸如紫外光或紅外光。在示例性實施方案中，染料可為熒光共振能量傳遞(fret)染料；咕噸染料，諸如熒光素和若丹明；在α或β位置具有氨基的染料(諸如萘胺染料、1-二甲基氨基萘基-5-磺酸鹽、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽和2-對-甲苯胺基-6-萘磺酸鹽)；具有3-苯基-7-異氰酸基香豆素的染料；吖啶，諸如9-異硫氰基吖啶和吖啶橙；芘，苯并噁二唑和二苯乙烯；具有3-(ε-羧基戊基)-3’-乙基-5,5’-二甲基氧雜羰花青(cya)的染料；6-羧基熒光素(fam)；5&6-羧基若丹明-110(r110)；6-羧基若丹明-6g(r6g)；n,n,n’,n’-四甲基-6-羧基若丹明(tamra)；6-羧基-x-若丹明(rox)；6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基熒光素(joe)；alexafluor^tm；cy2；德克薩斯紅和若丹明紅；6-羧基-2’,4,7,7’-四氯熒光素(tet)；6-羧基-2’,4,4’,5’,7,7’-六氯熒光素(hex)；5-羧基-2’,4’,5’,7’-四氯熒光素(zoe)；nan；ned；cy3；cy3.5；cy5；cy5.5；cy7；以及cy7.5；ir800cw,icg,alexafluor350；alexafluor488；alexafluor532；alexafluor546；alexafluor568；alexafluor594；alexafluor647；alexafluor680或alexafluor750。

納米粒子的大小范圍通常為約1-1000nm，并且包括不同化學(xué)結(jié)構(gòu)，諸如金和銀粒子和量子點。當(dāng)利用成角度入射白光來照射時，在約40-120nm范圍變化的銀或金納米粒子將散射具有高強度的單色光。散射光的波長取決于粒子的大小。四至五種緊密接近的不同粒子將各自散射單色光，當(dāng)單色光疊加時將得到特定、獨特色彩。衍生化納米粒子諸如銀或金粒子可連接至較寬分子陣列，包括蛋白質(zhì)、抗體、小分子、受體配體以及核酸。納米粒子的特定實例包括金屬納米粒子和金屬納米殼，諸如金粒子、銀粒子、銅粒子、鉑粒子、鎘粒子、復(fù)合物粒子、金中空球、金涂布二氧化硅納米殼以及二氧化硅涂布金殼。還包括二氧化硅、乳膠、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、pvdf納米粒子以及任何這些材料的有色粒子。

量子點為直徑約1-5nm的發(fā)熒光晶體，其可通過在大波長范圍上的光激發(fā)。在通過具有適當(dāng)波長的光激發(fā)后，這些晶體以取決于所述晶體的化學(xué)組成和大小的波長發(fā)射光，諸如單色光。量子點諸如cdse、znse、inp或inas具有獨特光學(xué)性質(zhì)；這些和類似量子點可購自許多商業(yè)來源(例如，nn-labs,fayetteville,ar；oceannanotech,fayetteville,ar；nanocotechnologies,manchester,uk；sigma-aldrich,st.louis,mo)。

抗體可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種技術(shù)中的任何技術(shù)來制備。參見，例如，harlow和lane,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,1988。對所關(guān)注多肽具有特異性的單克隆抗體可例如使用kohler和milstein,eur.j.immunol.6:511-519,1976的技術(shù)和對所述技術(shù)的改進技術(shù)來制備。還包括利用轉(zhuǎn)基因動物諸如小鼠來表達人類抗體的方法。參見，例如，neuberger等,naturebiotechnology14:826,1996；lonberg等,handbookofexperimentalpharmacology113:49-101,1994；以及l(fā)onberg等,internalreviewofimmunology13:65-93,1995。特定實例包括的平臺(參見，例如，美國專利號6,596,541)?？贵w還可通過本文所述和本領(lǐng)域中已知的重組技術(shù)來制備。

本發(fā)明的抗體可用于本文所述的任何診斷和分析方法以及組合物中。

多核苷酸、宿主細(xì)胞和產(chǎn)生方法

某些實施方案涉及編碼抗體及其抗原結(jié)合片段的多核苷酸，以及例如包含這些多核苷酸的載體，其中多核苷酸可操作地連接至一個或多個調(diào)節(jié)元件。還包括重組宿主細(xì)胞，其包含這些多核苷酸、載體、抗體及其抗原結(jié)合片段；另外包括重組產(chǎn)生所述細(xì)胞的方法。

抗體及其抗原結(jié)合片段可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備。在特定實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段在表達系統(tǒng)中表達為重組蛋白質(zhì)，如本文所述和本領(lǐng)域中已知的。

多核苷酸可含有編碼抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸的一個或多個拷貝。在特定實施方案中，多核苷酸序列包含以下表3中的至少一個序列或其變體或片段。

適合的載體可選擇或構(gòu)建為含有適當(dāng)調(diào)節(jié)序列，包括啟動子序列、終止子序列、多腺苷酸化序列、增強子序列、標(biāo)記基因以及適當(dāng)?shù)钠渌蛄?。載體適當(dāng)時可為質(zhì)粒(例如，病毒性的)、噬菌體或噬菌粒。對進一步細(xì)節(jié)而言，參見，例如，molecularcloning:alaboratorymanual:第2版,sambrook等,1989,coldspringharborlaboratorypress。用于操縱核酸，例如用于制備核酸構(gòu)建體、進行誘變、測序、將dna引入細(xì)胞中并進行基因表達以及分析蛋白質(zhì)的許多已知的技術(shù)和方案詳細(xì)地描述于currentprotocolsinmolecularbiology,第二版,ausubel等編,johnwiley&sons,1992或其后續(xù)更新中。

如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，在一些情況下可能有利的是：產(chǎn)生具有非天然存在的密碼子的編碼多肽的核苷酸序列。例如，受特定原核或真核宿主偏好的密碼子可被選擇來增加蛋白質(zhì)表達的速率，或產(chǎn)生具有合乎需要性質(zhì)的重組rna轉(zhuǎn)錄物，所述性質(zhì)諸如半衰期，其比由天然存在的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的半衰期長。這些多核苷酸通常稱為“密碼子優(yōu)化的”。本文所述的任何多核苷酸可以密碼子優(yōu)化形式使用。在某些實施方案中，多核苷酸可被密碼子優(yōu)化以用于特定細(xì)菌，諸如大腸桿菌(e.coli)或酵母，諸如啤酒酵母菌(s.cerevisiae)(參見，例如，burgess-brown等,proteinexprpurif.59:94-102,2008)。

在一些實施方案中，編碼抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸或載體被直接引入宿主細(xì)胞中，并且在足以誘導(dǎo)編碼多肽的表達的條件下孵育細(xì)胞。因此，根據(jù)某些相關(guān)實施方案，提供一種重組宿主細(xì)胞，其包含編碼本文所述的一種或多種抗體或其抗原結(jié)合片段(任選地與抗體的其他組分(例如，fc區(qū))組合)的多核苷酸，并且任選地包含另外的外源多核苷酸。

抗體或其抗原結(jié)合片段于宿主細(xì)胞中的表達可通過在適當(dāng)條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞(含有多核苷酸)來達成。在通過表達而產(chǎn)生之后，可使用任何適合的技術(shù)將抗體或其抗原結(jié)合片段分離和/或純化，并且隨后按需要使用。術(shù)語“宿主細(xì)胞”用于指代其中已引入或能夠引入編碼一種或多種本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸序列的細(xì)胞。術(shù)語包括親本細(xì)胞的后代，無論所述后代在形態(tài)上或在遺傳構(gòu)成上是否與原始親本細(xì)胞一致，只要所選擇基因存在即可。宿主細(xì)胞可針對某些特性來選擇，所述特性例如氨基酰基trna合成酶的表達，所述氨基?；鵷rna合成酶可將非天然氨基酸并入抗體或其抗原結(jié)合片段中。

用于在各種不同宿主細(xì)胞中克隆并表達異源或重組蛋白質(zhì)的系統(tǒng)為熟知的。適合的宿主細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母以及桿狀病毒系統(tǒng)。本領(lǐng)域中可用于表達蛋白質(zhì)的哺乳動物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞、hela細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞、hek-293細(xì)胞、nso小鼠黑素瘤細(xì)胞以及許多其他細(xì)胞。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的另外實例包括通過sv40轉(zhuǎn)化的猴腎cv1系(cos-7，atcccrl1651)；人類胚胎腎系(針對在懸浮液培養(yǎng)物中的生長來亞克隆的293或293細(xì)胞，graham等,j.genvirol.36:59(1977))；幼倉鼠腎細(xì)胞(bhk，atccccl10)；小鼠塞氏細(xì)胞(tm4,mather,biol.reprod.23:243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(cv1atccccl70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(vero-76,atcccrl-1587)；人類宮頸癌細(xì)胞(hela,atccccl2)；犬腎細(xì)胞(mdck,atccccl34)；水牛大鼠肝細(xì)胞(brl3a,atcccrl1442)；人類肺細(xì)胞(w138,atccccl75)；人類肝細(xì)胞(hepg2,hb8065)；小鼠乳腺腫瘤(mmt060562,atccccl51)；tr1細(xì)胞(mather等,annalsn.y.acad.sci.383:44-68(1982))；mrc5細(xì)胞；fs4細(xì)胞；以及人類肝腫瘤系(hepg2)。其他有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞，包括dhfr-cho細(xì)胞(urlaub等,pnasusa77:4216(1980))；以及骨髓瘤細(xì)胞系，諸如nso和sp2/0。為回顧適用于抗體產(chǎn)生的某些哺乳動物宿主細(xì)胞系，參見，例如，yazaki和wu,methodsinmolecularbiology,第248卷(b.k.clo編,humanapress,totowa,n.j.,2003),第255-268頁。某些優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞表達系統(tǒng)包括基于cho和hek293-細(xì)胞的表達系統(tǒng)，其包括293f細(xì)胞。哺乳動物表達系統(tǒng)可利用例如在t形燒瓶、滾瓶或細(xì)胞工廠中的黏附細(xì)胞系，或例如在1l和5l旋轉(zhuǎn)器、5l、14l、40l、100l和200l攪拌槽生物反應(yīng)器或20/50l和100/200lwave生物反應(yīng)器以及本領(lǐng)域中已知的其他容器中的懸浮液培養(yǎng)物。

常用的優(yōu)選細(xì)菌宿主為大腸桿菌。蛋白質(zhì)于原核細(xì)胞諸如大腸桿菌中的表達在本領(lǐng)域中已良好確立。有關(guān)綜述，參見，例如pluckthun,a.bio/technology.9:545-551(1991)。在培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞中的表達也可由本領(lǐng)域技術(shù)人員用來作為用于重組產(chǎn)生多肽的選項(參見ref,curr.opinionbiotech.4:573-576,1993；以及trill等,curr.opinionbiotech.6:553-560,1995)。在特定實施方案中，蛋白質(zhì)表達可通過t7rna聚合酶(例如，pet載體系列)來控制。這些和相關(guān)實施方案可利用表達宿主菌株bl21(de3)，其為一種bl21的λde3溶素原，其支持t7介導(dǎo)的表達并且在lon和ompt蛋白酶中缺乏以提高靶標(biāo)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。還包括運載極少用于大腸桿菌中的編碼trna的質(zhì)粒的表達宿主菌株，諸如rosetta^tm(de3)和rosetta2(de3)菌株。細(xì)胞溶解和樣品處置還可使用試劑諸如核酸酶和蛋白質(zhì)提取試劑來改進。對細(xì)胞培養(yǎng)而言，自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基可提高包括高通量表達系統(tǒng)在內(nèi)的許多表達系統(tǒng)的效率。此類型的培養(yǎng)基(例如，overnightexpress^tm自動誘導(dǎo)系統(tǒng))經(jīng)由代謝遷移而不添加諸如iptg的人工誘導(dǎo)劑來逐步引出蛋白質(zhì)表達。特定實施方案使用六組氨酸標(biāo)記(諸如his·融合物)，繼而進行固定金屬親和力色譜(imac)純化或相關(guān)技術(shù)。然而，在某些方面中，臨床等級蛋白質(zhì)可在使用或不使用親和力標(biāo)記的情況下自大腸桿菌包涵體分離(參見，例如，shimp等,proteinexprpurif.50:58-67,2006)。作為另一個實例，某些實施方案可使用冷休克誘導(dǎo)的大腸桿菌高產(chǎn)率生產(chǎn)系統(tǒng)，因為在低溫下蛋白質(zhì)于大腸桿菌中的過度表達提高其溶解度和穩(wěn)定性(參見，例如，qing等,naturebiotechnology.22:877-882,2004)。

另外，宿主細(xì)胞菌株可針對其調(diào)變插入序列的表達或以所需方式加工所表達蛋白質(zhì)的能力來加以選擇。多肽的這些修飾包括但不限于翻譯后修飾，諸如乙?；?、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化以及?；?。裂解蛋白質(zhì)的“蛋白質(zhì)前體(prepro)”形式的翻譯后加工亦可用于促進正確的插入、折疊和/或功能。除細(xì)菌細(xì)胞之外，可選擇不同宿主細(xì)胞諸如酵母、cho、hela、mdck、hek293以及w138來確保所關(guān)注蛋白質(zhì)(例如，抗體)的正確修飾和加工，所述宿主細(xì)胞具有或甚至缺乏達成此類翻譯后活性的特定細(xì)胞機器和特性機制。

對重組蛋白質(zhì)的長期、高產(chǎn)率生產(chǎn)而言，穩(wěn)定表達通常優(yōu)選。例如，穩(wěn)定地表達所關(guān)注多核苷酸的細(xì)胞系可使用表達載體來轉(zhuǎn)化，所述表達載體可含有病毒復(fù)制起源和/或內(nèi)源性表達元件，以及在相同或單獨載體上的可選擇標(biāo)記基因。在載體引入之后，可使細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長約1-2天，之后將培養(yǎng)基交換為選擇性培養(yǎng)基。可選擇標(biāo)志物的目的為賦予選擇抵抗力，并且可選擇標(biāo)志物的存在允許成功地表達所引入序列的細(xì)胞的生長和回收。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗性克隆可使用適于細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)來增殖。還可使用諸如通過瞬時轉(zhuǎn)染或感染進行的瞬時生產(chǎn)。適用于瞬時生產(chǎn)的示例性哺乳動物表達系統(tǒng)包括基于hek293(例如，293f細(xì)胞)和cho的系統(tǒng)。

利用所關(guān)注多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可在適用于由細(xì)胞培養(yǎng)物表達和回收蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)。某些特定實施方案利用無血清細(xì)胞表達系統(tǒng)。實例包括可在無血清培養(yǎng)基上生長的hek293細(xì)胞和cho細(xì)胞(參見，例如，rosser等,proteinexpr.purif.40:237-43,2005；以及美國專利號6,210,922)。

通過重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)純化并表征。用于執(zhí)行蛋白質(zhì)純化并分析蛋白質(zhì)純度的示例性系統(tǒng)包括快速蛋白質(zhì)液相色譜(fplc)(例如，akta和bio-radfplc系統(tǒng))、高效液相色譜(hplc)(例如，beckman和watershplc)。用于純化的示例性化學(xué)方法包括離子交換色譜(例如，q、s)、尺寸排阻色譜、鹽梯度、親和純化(例如，ni、co、flag、麥芽糖、谷胱甘肽、蛋白質(zhì)a/g)、凝膠過濾、反相、陶瓷離子交換色譜以及疏水性相互作用柱(hic)，以及本領(lǐng)域中已知的其他方法。還包括諸如以下各項的分析方法：sds-page(例如，考馬斯、銀染色)、免疫印跡、bradford和elisa，所述方法可用于生產(chǎn)或純化過程的任何步驟期間，通常用以測量蛋白質(zhì)組合物的純度。

還包括將重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(例如，抗體)濃縮的方法。實例包括凍干，其通常在溶液含有除所關(guān)注蛋白質(zhì)之外的難溶性組分時使用。凍干常常在hplc運作之后執(zhí)行，并且可自混合物移除大部分或所有揮發(fā)性組分。還包括超濾技術(shù)，其通常使用一種或多種選擇性可滲透膜來濃縮蛋白質(zhì)溶液。所述膜允許水和小分子通過并且保留蛋白質(zhì)；溶液可通過機械泵、氣體壓力或離心以及其他技術(shù)來迫使抵靠所述膜。

在某些實施方案中，如根據(jù)本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)所測量的，抗體或其抗原結(jié)合片段具有至少約90％的純度。在某些實施方案中，作為診斷組合物或某些治療組合物，抗體或其抗原結(jié)合片段具有至少約95％的純度。在特定實施方案中，作為治療或醫(yī)藥組合物，抗體或其抗原結(jié)合片段具有至少約97％或98％或99％的純度。在其他實施方案中，諸如當(dāng)用作參考試劑或研究試劑時，抗體或其抗原結(jié)合片段可具有較小純度，并且可具有至少約50％、60％、70％或80％的純度。純度可整體測量或相對于所選組分諸如其他蛋白質(zhì)來測量，例如測量基于蛋白質(zhì)的純度。

在某些實施方案中，本文所述的組合物約為實質(zhì)上無內(nèi)毒素的，包括例如約95％無內(nèi)毒素的、優(yōu)選約99％無內(nèi)毒素的并且更優(yōu)選地約99.99％無內(nèi)毒素的?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)來檢測內(nèi)毒素的存在，如本文所述的。在特定實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段在實質(zhì)上無血清的培養(yǎng)基中由真核細(xì)胞諸如哺乳動物或人類細(xì)胞制成。

使用方法

本發(fā)明的實施方案包括使用本文所述的抗體及其抗原結(jié)合片段來測定樣品諸如生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的存在、不存在、量或水平的方法。這些方法包括例如使用抗體或其抗原結(jié)合片段作為伴隨式診斷來鑒定適于精氨酸剝奪療法、包括適于施用至少一種精氨酸耗盡劑的受試者。在一些實施方案中，如果生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少，則認(rèn)為受試者適用于精氨酸剝奪療法。在特定實施方案中，所述方法包括使用抗體或其抗原結(jié)合片段作為伴隨式診斷來鑒定患有或疑似患有展現(xiàn)精氨基琥珀酸合成酶的缺少(例如，精氨基琥珀酸合成酶的表達減少)的癌癥或腫瘤的受試者，并且治療待利用精氨酸剝奪療法治療的受試者或使所述受試者利用精氨酸剝奪療法來治療。

某些實施方案因此包括測定生物樣品中人類精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的方法，所述方法包括：(a)獲得或接收任選地來自受試者的生物樣品；(b)使生物樣品與本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；以及(c)測量樣品中抗體或其抗原結(jié)合片段的量，其中抗體或其抗原結(jié)合片段的量決定樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量。

還包括鑒定生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶的缺少的方法，所述方法包括：(a)獲得或接收任選地來自受試者的生物樣品；(b)使生物樣品與本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；(c)測量樣品中抗體或其抗原結(jié)合片段的量，其中抗體或其抗原結(jié)合片段的量決定樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量；以及(d)如果生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少，則鑒定為樣品中精氨基琥珀酸合成酶的缺少。

一些實施方案包括鑒定適于精氨酸剝奪或耗盡療法的受試者的方法，所述方法包括：(a)任選地經(jīng)由保健提供者獲得或接收來自受試者的生物樣品提供者；(b)使生物樣品與本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；(c)測量樣品中抗體或其抗原結(jié)合片段的量，其中抗體或其抗原結(jié)合片段的量決定樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量；以及(d)如果生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少，則將受試者鑒定為適用于精氨酸剝奪療法。

在一些實施方案中，步驟(a)包含自保健提供者接收生物樣品，所述保健提供者諸如醫(yī)師、診所或醫(yī)院。接收生物樣品和/或執(zhí)行測試的實體可與保健提供者相關(guān)聯(lián)或與保健提供者分離。在特定實施方案中，接收樣品和/或執(zhí)行測試的實體為第三方診斷公司。在一些實施方案中，接收樣品和/或執(zhí)行測試的實體為臨床或醫(yī)院相關(guān)聯(lián)的診斷實驗室。在一些實施方案中，所述方法(例如，步驟(c)或(d))包含向相同或不同保健提供者(例如，醫(yī)師)提供關(guān)于生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的信息。

任何這些和相關(guān)實施方案還可包括向(d)的受試者施用如本文所述和/或本領(lǐng)域中已知的至少一種精氨酸耗盡劑。

還包括用于診斷并治療受試者的方法，所述方法包括：(a)分析測試的結(jié)果，所述測試指示來自受試者的生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量，其中所述測試使用本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段來執(zhí)行；(b)如果來自(a)的結(jié)果指示生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少，則將患者診斷為適用于精氨酸剝奪療法；以及(c)通過施用至少一種精氨酸耗盡劑來治療(b)的受試者。

用于治療受試者的方法包括：(a)請求測定來自受試者的生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的測試，其中所述測試使用本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段來執(zhí)行；以及(b)如果來自(a)的測試指示生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相對于對照減少，則向受試者施用至少一種精氨酸耗盡劑。

在特定實施方案中，受試者為哺乳動物，例如，人類患者。

在某些實施方案中，受試者患有或疑似患有癌癥或腫瘤。癌癥和腫瘤的實例包括黑素瘤、肝腫瘤、胰腺癌、前列腺癌、間皮瘤、肉瘤、頭頸癌、白血病、急性骨髓白血病、復(fù)發(fā)性急性骨髓白血病、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌(nsclc)、諸如腎細(xì)胞癌的腎癌、膀胱癌、子宮癌、食管癌、腦癌、子宮頸癌、睪丸癌以及胃癌。

術(shù)語“黑素瘤”包括由皮膚和其他器官的黑色素細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的惡性或良性腫瘤，所述其他器官包括口腔、食道、肛管、陰道、軟腦膜和/或結(jié)膜或眼睛。作為非限制性實例，術(shù)語“黑素瘤”包括肢端小痣性黑素瘤、無黑色素黑素瘤、良性幼年黑素瘤、小痣性惡性黑素瘤、惡性黑素瘤、結(jié)節(jié)狀黑素瘤、甲下黑素瘤和淺表擴散性黑素瘤。

“肝腫瘤”可為肝的惡性或良性腫瘤，作為非限制性實例，其包括肝細(xì)胞癌、惡性肝腫瘤、纖維層狀肝癌和肝細(xì)胞膽管癌、混合型肝細(xì)胞膽管癌以及未分化肝細(xì)胞癌。

術(shù)語“肉瘤”包括在結(jié)締組織中產(chǎn)生的惡性或良性腫瘤，作為非限制性實例，所述結(jié)締組織包括骨、軟骨和橫紋肌。肉瘤的實例包括但不限于脂肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、纖維肉瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、腸胃道間質(zhì)瘤(gist)、尤恩氏肉瘤、骨肉瘤以及軟骨肉瘤。

“乳腺癌”是指乳房中產(chǎn)生的惡性或良性腫瘤，并且包括但不限于局部階段性乳腺癌、區(qū)域階段性腫瘤和遠(yuǎn)側(cè)階段性癌癥。乳腺癌的實例包括但不限于腺癌(包括導(dǎo)管癌和小葉性癌)、小葉原位癌(lcis)髓質(zhì)癌、黏液素癌、乳頭的佩吉特氏病、葉狀腫瘤以及管狀癌。

這些癌癥的更特定實例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、垂體癌、食管癌、星狀細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗狀細(xì)胞癌、腹膜的癌癥、肝細(xì)胞癌、腸胃癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、腦癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、膽管癌、膽囊癌、胃癌、黑素瘤以及各種類型的頭頸癌。在特定實施方案中，癌癥為以下各項的癌癥：乳房、大腦、前列腺、腎、胰腺、肺、甲狀腺、結(jié)腸、子宮頸、卵巢、睪丸、直腸、膽囊、肛門、脾、肝、皮膚、骨、垂體、子宮內(nèi)膜、胃、血液或淋巴腺。

生物樣品可包括任何種類的樣品、流體或組織。生物樣品的非限制性實例包括血液、血漿、皮膚、毛發(fā)、毛囊、唾液、口腔黏膜、陰道黏膜、汗液、淚液、上皮組織、尿、精子、精液、精漿、前列腺液、排泄物、活檢、腹水、腦脊髓液、淋巴液、組織提取物樣品以及活檢樣品，諸如癌癥或腫瘤活檢樣品或疑似癌癥或腫瘤活檢樣品。癌性或腫瘤活檢樣品的特定實例包括來自以下各項的那些活檢樣品：皮膚組織、肝組織、胰腺組織、前列腺組織、間皮組織、上皮組織、卵巢組織、結(jié)腸直腸組織、胃組織、腦組織、肺組織、腎組織、膀胱組織、子宮組織、食道組織、子宮頸組織、睪丸組織、乳房組織以及間葉組織，諸如骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織、血液和造血細(xì)胞/組織。

在一些實施方案中，如果生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量或水平相對于對照減少，則將生物樣品鑒定為缺少精氨基琥珀酸合成酶，或?qū)⑹茉囌哞b定或診斷為適用于精氨酸剝奪療法。在一些實施方案中，對照為參考標(biāo)準(zhǔn)、來自健康受試者的生物樣品或來自同一受試者的健康生物樣品。在一些實施方案中，對照為來自同一受試者的非癌性生物樣品，例如來自與癌癥或疑似癌癥相同組織類型的非癌性生物樣品。

在特定實施方案中，例如，為鑒定適于精氨酸剝奪療法的受試者，生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量或水平相對于對照(例如，非癌性組織、參考標(biāo)準(zhǔn))減少統(tǒng)計顯著量。僅僅舉例說明，在一些方面中，生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量或水平相對于對照減少約或至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，包括其間所有整數(shù)和范圍。在特定實施方案中，生物樣品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量或水平不可檢測或?qū)嵸|(zhì)上不可檢測。

樣品中抗體和因此精氨基琥珀酸合成酶多肽的存在、不存在、量或水平可根據(jù)本領(lǐng)域中的任何種類的技術(shù)測量。例如，某些實施方案可使用標(biāo)準(zhǔn)方法和檢測器。實例包括免疫組織化學(xué)(ihc)、蛋白質(zhì)印跡法、免測沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、狹線印跡法以及肽質(zhì)量指紋鑒定。某些實施方案可使用細(xì)胞分選或細(xì)胞可視化或成像裝置/技術(shù)，以檢測或定量抗體的量或水平。實例包括流式細(xì)胞術(shù)(或facs)、免疫熒光分析(ifa)和原位雜交技術(shù)，諸如熒光原位雜交(fish)。

某些實施方案可使用常規(guī)生物學(xué)方法、軟件和系統(tǒng)以達診斷目的。計算機軟件產(chǎn)品或方法通常包括或使用具有用于執(zhí)行方法的邏輯步驟的計算機可執(zhí)行指令的計算機可讀介質(zhì)。適合的計算機可讀介質(zhì)包括軟盤、cd-rom/dvd/dvd-rom、硬盤驅(qū)動器、快閃存儲器、rom/ram、磁帶等等。計算機可執(zhí)行指令可以適合的計算機語言或若干種語言的組合來寫入。基本的計算生物學(xué)方法描述于例如setubal和meidanis等,introductiontocomputationalbiologymethods(pwspublishingcompany,boston,1997)；salzberg,searles,kasif,(編),computationalmethodsinmolecularbiology,(elsevier,amsterdam,1998)；rashidi和buehler,bioinformaticsbasics:applicationinbiologicalscienceandmedicine(crcpress,london,2000)，以及ouelette和bzevanisbioinformatics:apracticalguideforanalysisofgeneandproteins(wiley&sons,inc.,第2版,2001)中。還參見美國專利號6,420,108。

還包括利用精氨酸剝奪或耗盡療法治療受試者的方法。在一些實施方案中，精氨酸剝奪或耗盡療法包括精氨酸耗盡劑的施用。精氨酸耗盡劑的非限制性實例包括精氨酸脫亞胺酶(adi)多肽、精氨酸酶多肽、精氨酸脫羧酶多肽以及精氨酸激酶多肽。

在特定實施方案中，精氨酸耗盡劑為adi多肽，例如重組adi多肽。治療adi多肽的實例描述于例如wo2013/151568；以及美國申請?zhí)杣s14/214,040；us13/214,398；us10/645,723；us10/757,843中；所述專利均以全文引用的方式并入。adi多肽可從包括例如微生物、重組生物技術(shù)或其任何組合的任何來源獲得、克隆或產(chǎn)生。例如，adi基因和多肽可自以下屬的微生物克隆并制備：支原體屬(mycoplasma)、梭菌屬(clostridium)、芽孢桿菌屬(bacillus)、疏螺旋體屬(borrelia)、腸球菌屬(enterococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、乳桿菌屬(lactobacillus)以及梨形鞭毛蟲屬(giardia)。在某些實施方案中，adi多肽來自肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae)、人型支原體(mycoplasmahominis)、精氨酸支原體(mycoplasmaarginini)、產(chǎn)膿鏈球菌(steptococcuspyogenes)、肺炎鏈球菌(steptococcuspneumoniae)、伯氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)、阿氏疏螺旋體(borreliaafzelii)、腸蘭賈地鞭毛蟲(giardiaintestinalis)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、糞腸球菌(enterococcusfaecalis)、清酒乳桿菌(lactobacillussake)或其任何組合。

在某些實施方案中，adi多肽來自支原體屬的微生物。在一些實施方案中，adi來自人型支原體、關(guān)節(jié)炎支原體(mycoplasmaarthritides)、精氨酸支原體或其任何組合。在特定實施方案中，adi多肽包含seqidno:6(來自人型支原體的adi，參見以下表4)的氨基酸序列，或其具有adi活性(例如，能夠?qū)⒕彼岽x成瓜氨酸和氨)的變體或片段。在某些實施方案中，adi多肽被修飾(例如，通過取代、缺失修飾)以移除seqidno:6的位置112、374、405和/或408處的至少一個賴氨酸。

天然adi可在微生物中找到，并且為抗原性的并自患者的循環(huán)快速清除?？赏ㄟ^修飾adi來克服這些問題。因此，在某些實施方案中，adi多肽包含(例如，共價連接至)改性劑，包括但不限于大分子聚合物、蛋白質(zhì)、肽、多糖或其他化合物。adi多肽和改性劑可通過共價鍵或非共價相互作用連接，以形成穩(wěn)定綴合物或穩(wěn)定組合物，從而達成所需效應(yīng)。在某些實施方案中，修飾的adi多肽保持adi的生物活性，并且相對于未修飾adi具有更長體內(nèi)半衰期和更低抗原性。在一些實施方案中，adi多肽經(jīng)由連接基團共價鍵結(jié)至聚乙二醇。在特定實施方案中，adi多肽為adi-peg20。

在一些實施方案中，精氨酸耗盡劑為精氨酸酶i多肽，例如，重組精氨酸酶i多肽。在特定實施方案中，精氨酸酶i多肽包含人類精氨酸酶i蛋白質(zhì)的至少50個鄰接氨基酸(參見uniprot:p05089)。在特定實施方案中，精氨酸耗盡劑為精氨酸酶ii多肽，例如，重組精氨酸酶ii多肽。在特定實施方案中，重組人類精氨酸酶ii多肽包含人類精氨酸酶ii蛋白質(zhì)的至少50個鄰接氨基酸(參見uniprot:p78540)。在一些實施方案中，精氨酸耗盡劑為包含金屬輔因子諸如鈷原子或錳原子的精氨酸酶多肽。在某些實施方案中，含鈷精氨酸酶多肽為如例如wo2010/051533中所述的多肽。

在一些實施方案中，精氨酸耗盡劑為精氨酸脫羧酶多肽，例如重組精氨酸脫羧酶多肽。在一些實施方案中，精氨酸耗盡劑包含人類精氨酸脫羧酶的至少50個鄰接氨基酸(參見uniprot:q96a70)。

在特定實施方案中，精氨酸耗盡劑為聚乙二醇化多肽。

在一些情況下，本文中提供的方法可包括在精氨酸耗盡劑的施用之前、與所述施用并行或在所述施用之后向受試者施用一種或多種化學(xué)治療劑或其他抗癌劑。在某些實施方案中，待利用精氨酸剝奪療法治療的受試者經(jīng)歷、已經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷手術(shù)、輻射療法、免疫療法和/或激素療法。

組合物和試劑盒

還包括組合物，所述組合物包含本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其任選地與適合的載體組合。組合物或載體可為液體、半液體、半固體或固體。

溶液或懸浮液可包括例如無菌稀釋劑(諸如水)、鹽水溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)、生理鹽水、林格氏溶液、等張氯化鈉)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗微生物劑(諸如芐醇和對羥基苯甲酸甲酯)；抗氧化劑(諸如抗壞血酸和亞硫酸氫鈉)、螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(edta))；和/或緩沖液(諸如，乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽以及其他有機酸)，包括前述各項的組合。作為適合的載體，還包括含有增稠劑和增溶劑的溶液，所述增稠劑和助溶劑諸如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇以及其混合物?？商砑颖砻婊钚詣┮源龠M均質(zhì)溶液或懸浮液的形成。表面活性劑為與抗體或其抗原結(jié)合片段非共價地相互作用以便促進綴合物于水性系統(tǒng)中的溶解或均質(zhì)懸浮的化合物。

載體的另外實例包括低分子量(例如，小于約10個殘基)多肽或肽；蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如聚山梨醇酯20(tween^tm)、聚乙二醇(peg)和泊洛沙姆(pluronics^tm)和類似物。

在一些實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段可包埋在例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合作用制備的微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、在膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子和納米膠囊)中或在粗乳液中。這些技術(shù)公開于remington'spharmaceuticalsciences,第16版,oslo,a.編(1980)中。粒子或脂質(zhì)體還可包含其他診斷劑，諸如可檢測實體。

在特定實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段為冷凍-干燥的或凍干的、冷凍干燥的。這些術(shù)語是指冷凍抗體組合物并且隨后減少周圍壓力以允許組合物中的冷凍水直接自固相升華至氣相的脫水過程。還包括固體組合物，諸如粉末、顆粒、壓縮片劑、丸劑、膠囊以及類似物。在一些實施方案中，固體組合物含有一種或多種稀釋劑或可食用載體。在某些實施方案中，可存在以下一種或多種：粘合劑，諸如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；以及賦形劑，諸如淀粉、乳糖或糊精；崩解劑，諸如海藻酸、海藻酸鈉、primogel、玉米淀粉和類似物。

某些實施方案包括試劑盒，其包含如本文所述的一種或多種抗體或其抗原結(jié)合片段，其任選地處于一個或多個容器中。試劑盒可包括關(guān)于如何使用和/或制備抗體以例如用作檢測劑和/或診斷劑的書面說明書。在一些實施方案中，書面說明書描述如何使用抗體或其抗原結(jié)合片段來鑒定適于例如利用精氨酸耗盡劑的精氨酸剝奪療法的受試者。在一些實施方案中，試劑盒包含用于例如酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)或類似測定的材料，其中抗體或其抗原結(jié)合片段連接或可連接至固體底物以用于執(zhí)行elisa或類似測定。在一些實施方案中，試劑盒包含用于免疫組織化學(xué)(ihc)測定的材料。

本文中的試劑盒還可包括適合于或意圖用于所治療適應(yīng)癥或所需診斷應(yīng)用的一種或多種另外的治療劑或其他組分。另一種治療劑可在需要時包含在第二容器中。另外的治療劑的實例包括例如如本文所述的精氨酸耗盡劑，諸如精氨酸脫亞胺酶(adi)多肽、精氨酸酶多肽、精氨酸脫羧酶多肽和精氨酸激酶多肽。在特定實施方案中，精氨酸耗盡劑為adi-peg20。

以下實施例經(jīng)由說明方式而非經(jīng)由限制方式來提供。

實施例

實施例1

針對精氨基琥珀酸合成酶的雜交瘤抗體的測序和表征

執(zhí)行實驗來鑒定針對蛋白質(zhì)精氨基琥珀酸合成酶的雜交瘤抗體克隆的vh和vl序列。執(zhí)行酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)分析來測定作為小鼠igg2a的雜交瘤亞型(參見圖1)。隨后自雜交瘤細(xì)胞中提取rna，并且通過聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)擴增重鏈和輕鏈的可變區(qū)并且將其亞克隆至小鼠igg1表達載體中。

為表征vh序列，鑒定并比對六個有效亞克隆的氨基酸序列(參見圖2a)。為表征vl序列，鑒定并比對五個有效亞克隆的氨基酸序列(參見圖2b)?；谶@些克隆間的序列相似性，測定vh和vl核苷酸和氨基酸序列，如以下表e1所示。

在293f細(xì)胞中重組表達亞克隆vh和vl序列(于小鼠igg1表達載體中)，將其分離，并且通過elisa測試相對于原始雜交瘤而言與精氨基琥珀酸合成酶抗原的結(jié)合。如圖3所示，來自以上表e1的vh和vl序列顯示與精氨基琥珀酸合成酶抗原0218和0529的強的特異結(jié)合。

實施例2

通過免疫組織化學(xué)檢測臨床樣品中的精氨基琥珀酸合成酶

執(zhí)行實驗來測定用于檢測各種臨床樣品中精氨基琥珀酸合成酶的表達水平的免疫組織化學(xué)測定的準(zhǔn)確度和精確度。針對精氨基琥珀酸合成酶的單克隆抗體(參見實施例1)與leicabond聚合物精制檢測試劑盒一起組合使用，以檢測在超過100種不同組織中的表達，所述組織包括正常組織和各種腫瘤組織，諸如肝腫瘤(例如，肝細(xì)胞癌)、淋巴瘤、腎細(xì)胞癌、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)胚細(xì)胞瘤、精細(xì)胞瘤、黑素瘤、骨髓(aml)、結(jié)腸癌、肺癌、甲狀腺癌、子宮癌、胃癌、腦癌以及乳腺癌。臨床樣品組由總計103種組織組成：60種陽性組織和43種陰性組織。

精氨基琥珀酸合成酶免疫反應(yīng)性通常位于細(xì)胞質(zhì)中，但也可觀察到核染色。對染色的解釋通過病理學(xué)家手動執(zhí)行。報導(dǎo)具有陽性染色的腫瘤細(xì)胞的百分比和平均染色強度。

方法。將福馬林固定、石蠟包埋試樣以4-5μm切片并且安裝在帶正電載玻片上。使載玻片風(fēng)干并且隨后置放于60℃烘箱中持續(xù)60分鐘。使用leicabondiii儀器將載玻片染色。使用標(biāo)準(zhǔn)leicabond脫蠟方案自載玻片移除石蠟。利用bonder1對組織進行5分鐘的抗原回收，或利用bonder2進行20分鐘的抗原回收。

將小鼠抗精氨基琥珀酸合成酶單克隆抗體以0.625μg/ml的濃度涂覆于載玻片并且孵育15min，或以0.4μg/ml的濃度涂覆并孵育30分鐘。使用leicabond聚合物精制檢測試劑盒使后初次染色(staining-postprimary)可視化8分鐘，并且使聚合物可視化8分鐘。隨后利用peroxideblock處理載玻片五分鐘，繼而通過mixeddabrefine處理十分鐘。利用蘇木精將染色區(qū)段復(fù)染色7分鐘。隨后將載玻片脫水并且加以滑動覆蓋。

結(jié)果。總體而言，103種樣品中的60種顯示上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的一致陽性細(xì)胞質(zhì)染色，而各種腫瘤類型中的腫瘤細(xì)胞不顯示精氨基琥珀酸合成酶的表達。腫瘤組織對比正常組織的染色圖案在所有情況下均與文獻中所報導(dǎo)相符。測定間再現(xiàn)性研究顯示染色批次之間的100％一致性。將如文獻中報導(dǎo)的陽性樣品和陰性樣品測試多次，并且它們與文獻一致。在脫鈣樣品與非脫鈣樣品之間未觀察到顯著染色差異。

示例性結(jié)果展示于圖4-圖6中。

圖4示出通過利用抗精氨基琥珀酸合成酶單克隆抗體的免疫組織化學(xué)染色檢測在人類癌細(xì)胞系a431(圖4a)和skmel-3(圖4b)中的精氨基琥珀酸合成酶表達。

圖5示出通過利用抗精氨基琥珀酸合成酶單克隆抗體的免疫組織化學(xué)染色檢測在正常人類組織(圖5a，腎；圖5b，皮膚；圖5c，肝)中的精氨基琥珀酸合成酶表達。

圖6示出通過利用抗精氨基琥珀酸合成酶單克隆抗體的免疫組織化學(xué)染色檢測在人類肝細(xì)胞癌(hcc)中的精氨基琥珀酸合成酶表達。圖6a展示精氨基琥珀酸合成酶表達的強陽性染色，并且圖6b-圖6c展示精氨基琥珀酸合成酶表達的陰性染色。

這些研究指示：通過免疫組織化學(xué)(ihc)分析測得的抗精氨基琥珀酸合成酶單克隆抗體的效能特性對各種組織類型中的臨床診斷應(yīng)用而言為可接受的。

序列表

<110>tdwgroup

he,wei

guo,yunyun

wu,bor-wen

<120>精氨基琥珀酸合成酶的抗體和相關(guān)方法

<130>tdwg-005/01wo

<150>us62/022,066

<151>2014-07-08

<160>23

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>113

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>通過比對六個有效亞克隆測定的vh鏈

<400>1

glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu

151015

thrvallysilesercyslysthrserglytyrthrphethrasptyr

202530

serilehistrpvallysglnalaproglylysglyleuthrtrpmet

354045

glytrpileasnthrgluthrglygluprothrtyralaaspaspphe

505560

lysglyargphealaleuserleugluthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnleulysasnleuargasngluaspthralathrtyrphecys

859095

glysersertyrsertyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser

100105110

ser

<210>2

<211>339

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>通過比對六個有效亞克隆測定的vh鏈

<400>2

cagatccagttggtgcagtctggacctgagttgaagaagcctggagagacagtcaagatc60

tcctgcaagacttctggttataccttcacagactattcaatacactgggtgaagcaggct120

ccaggaaagggtttaacgtggatgggctggataaacactgagactggtgagccaacttat180

gcagatgacttcaagggacgctttgccctctctttggaaacctctgccagcactgcctat240

ttgcagctcaagaacctcagaaatgaggacacggctacatatttctgtggtagttcttat300

tcttactggggccaagggactctggtcactgtctcttca339

<210>3

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>通過比對五個有效亞克隆測定的vl鏈

<400>3

aspvalvalmetthrglnthrproleuserleuprovalserleugly

151015

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65707580

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859095

lyshisvalprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105110

<210>4

<211>336

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>通過比對五個有效亞克隆測定的vl鏈

<400>4

gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctcc60

atctcttgcaggtctagtcagagccttgaaaacagtaatggaaagacctatttgaactgg120

ttcctccagaaaccaggccagtctccacagctcctgatctacagggtttccaaccgattt180

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agcagagtggaggctgaggatttgggagtttatttctgcctccaagttaaacatgtcccg300

tggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa336

<210>5

<211>412

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>5

metserserlysglyservalvalleualatyrserglyglyleuasp

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thrsercysileleuvaltrpleulysgluglnglytyraspvalile

202530

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cysilealaarglysglnvalgluilealaglnarggluglyalalys

100105110

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115120125

gluleusercystyrserleualaproglnilelysvalilealapro

130135140

trpargmetprogluphetyrasnargphelysglyargasnaspleu

145150155160

metglutyralalysglnhisglyileproileprovalthrprolys

165170175

asnprotrpsermetaspgluasnleumethisilesertyrgluala

180185190

glyileleugluasnprolysasnglnalaproproglyleutyrthr

195200205

lysthrglnaspproalalysalaproasnthrproaspileleuglu

210215220

ilegluphelyslysglyvalprovallysvalthrasnvallysasp

225230235240

glythrthrhisglnthrserleugluleuphemettyrleuasnglu

245250255

valalaglylyshisglyvalglyargileaspilevalgluasnarg

260265270

pheileglymetlysserargglyiletyrgluthrproalaglythr

275280285

ileleutyrhisalahisleuaspileglualaphethrmetasparg

290295300

gluvalarglysilelysglnglyleuglyleulysphealagluleu

305310315320

valtyrthrglyphetrphisserproglucysgluphevalarghis

325330335

cysilealalysserglngluargvalgluglylysvalglnvalser

340345350

valleulysglyglnvaltyrileleuglyarggluserproleuser

355360365

leutyrasnglugluleuvalsermetasnvalglnglyasptyrglu

370375380

prothraspalathrglypheileasnileasnserleuargleulys

385390395400

glutyrhisargleuglnserlysvalthralalys

405410

<210>6

<211>409

<212>prt

<213>人型支原體(mycoplasmahominis)

<400>6

metservalpheaspserlyspheasnglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleugluthrvalleuvalhisgluproglyarggluile

202530

asptyrilethrproalaargleuaspgluleuleupheseralaile

354045

leugluserhisaspalaarglysgluhisglnserphevallysile

505560

metlysaspargglyileasnvalvalgluleuthraspleuvalala

65707580

gluthrtyraspleualaserlysalaalalysgluglupheileglu

859095

thrpheleuglugluthrvalprovalleuthrglualaasnlyslys

100105110

alavalargalapheleuleuserlysprothrhisglumetvalglu

115120125

phemetmetserglyilethrlystyrgluleuglyvalgluserglu

130135140

asngluleuilevalaspprometproasnleutyrphethrargasp

145150155160

prophealaservalglyasnglyvalthrilehisphemetargtyr

165170175

ilevalargargarggluthrleuphealaargphevalpheargasn

180185190

hisprolysleuvallysthrprotrptyrtyraspproalametlys

195200205

metproilegluglyglyaspvalpheiletyrasnasngluthrleu

210215220

valvalglyvalsergluargthraspleuaspthrilethrleuleu

225230235240

alalysasnilelysalaasnlysgluvalgluphelysargileval

245250255

alaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleuaspthrtrp

260265270

leuthrmetleuasplysasnlyspheleutyrserproilealaasn

275280285

aspvalphelysphetrpasptyraspleuvalasnglyglyalaglu

290295300

proglnproglnleuasnglyleuproleuasplysleuleualaser

305310315320

ileileasnlysgluprovalleuileproileglyglyalaglyala

325330335

thrglumetgluilealaarggluthrasnpheaspglythrasntyr

340345350

leualailelysproglyleuvalileglytyraspargasnglulys

355360365

thrasnalaalaleulysalaalaglyilethrvalleuprophehis

370375380

glyasnglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmetsermet

385390395400

proleuserarglysaspvallystrp

405

<210>7

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>通過比對六個有效亞克隆測定的vhcdr1

<400>7

glytyrthrphethrasptyrser

15

<210>8

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>通過比對六個有效亞克隆測定的vhcdr2

<400>8

ileasnthrgluthrglyglupro

15

<210>9

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>通過比對六個有效亞克隆測定的vhcdr3

<400>9

glysersertyrsertyr

15

<210>10

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>通過比對五個有效亞克隆測定的vlcdr1

<400>10

glnserleugluasnserasnglylysthrtyr

1510

<210>11

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>通過比對五個有效亞克隆測定的vlcdr2

<400>11

argvalser

1

<210>12

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>通過比對五個有效亞克隆測定的vlcdr3

<400>12

leuglnvallyshisvalprotrpthr

15

<210>13

<211>113

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>來自雜交瘤抗體克隆的有效亞克隆(6-h6)的vh序列

<400>13

glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu

151015

thrvallysilesercyslysthrserglytyrthrphethrasptyr

202530

serilehistrpvallysglnalaproglylysglyleuthrtrpmet

354045

glytrpileasnthrgluthrglygluprothrtyralaaspaspphe

505560

lysglyargphealaleuserleugluthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnleulysasnleuargasngluaspthralathrtyrphecys

859095

glysersertyrsertyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser

100105110

ser

<210>14

<211>113

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>來自雜交瘤抗體克隆的有效亞克隆(6-c5)的vh序列

<400>14

glnileglnleuvalglnserglyprogluserlyslysproglyglu

151015

thrvallysilesercyslysthrserglytyrthrphethrasptyr

202530

serilehistrpvallysglnalaproglylysglyleuthrtrpmet

354045

glytrpileasnthrgluthrglygluprothrtyralaaspaspphe

505560

lysglyargphealaleuserleugluthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnleulysasnleuargasngluaspthralathrtyrphecys

859095

glysersertyrsertyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser

100105110

ser

<210>15

<211>113

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>來自雜交瘤抗體克隆的有效亞克隆(6-c1)的vh序列

<400>15

glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu

151015

thrvallysileprocyslysthrserglytyrthrphethrasptyr

202530

serilehistrpvallysglnalaproglylysglyleuthrtrpmet

354045

glytrpileasnthrgluthrglygluprothrtyralaaspaspphe

505560

lysglyargphealaleuserleugluthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnleulysasnleuargasngluaspthralathrtyrphecys

859095

glysersertyrsertyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser

100105110

ser

<210>16

<211>113

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>來自雜交瘤抗體克隆的有效亞克隆(6-l7)的vh序列

<400>16

glnileglnleuvalglnserglyprogluleulysgluproglyglu

151015

thrvallysilesercyslysthrserglytyrthrphethrasptyr

202530

serilehistrpvallysglnalaproglylysglyleuthrtrpmet

354045

glytrpileasnthrgluthrglygluprothrtyralaaspaspphe

505560

lysglyargphealaleuserleugluthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnleulysasnleuargasngluaspthralathrtyrphecys

859095

glysersertyrsertyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser

100105110

ser

<210>17

<211>113

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>來自雜交瘤抗體克隆的有效亞克隆(6-a5)的vh序列

<400>17

glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu

151015

thrvallysilesercyslysthrserglytyrthrphethrasptyr

202530

serilehistrpvallysglnalaproglylysglyleuthrtrpmet

354045

glytrpileasnthrgluthrglygluprothrtyralaaspaspphe

505560

lysglyargphealaleuserleugluthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnleulysasnleuargasngluaspthralathrtyrphecys

859095

glysersertyrsertyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser

100105110

ser

<210>18

<211>113

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>來自雜交瘤抗體克隆的有效亞克隆(6-d6)的vh序列

<400>18

glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu

151015

thrvallysilesercyslysthrserglytyrthrphethrasptyr

202530

serilehistrpvallysglnalaproglylysglyleuthrtrpmet

354045

glytrpileasnthrgluthrglygluprothrtyralaaspaspphe

505560

lysglyargphealaleuserleugluthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnleulysasnleuargasngluaspthralathrtyrphecys

859095

glysersertyrsertyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser

100105110

ser

<210>19

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>來自雜交瘤抗體克隆的有效亞克隆(4-5)的vl序列

<400>19

aspvalvalmetthrglnthrproleuserleuprovalserleugly

151015

aspglnalaserilesercysargserserglnserleugluasnser

202530

asnglylysthrtyrleuasntrppheleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrargvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythrgluphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspleuglyvaltyrphecysleuglnval

859095

lyshisvalprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105110

<210>20

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>來自雜交瘤抗體克隆的有效亞克隆(7-2)的vl序列

<400>20

aspvalvalmetthrglnthrproleuserleuprovalserleugly

151015

aspglnalaserilesercysargserserglnserleugluasnser

202530

asnglylysthrtyrleuasntrppheleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrargvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythrgluphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspleuglyvaltyrphecysleuglnval

859095

lyshisvalprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105110

<210>21

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>來自雜交瘤抗體克隆的有效亞克隆(7-8)的vl序列

<400>21

aspvalvalmetthrglnthrproleuserleuprovalserleugly

151015

aspglnalaserilesercysargserserglnserleugluasnser

202530

asnglylysthrtyrleuasntrppheleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrargvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythrgluphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspleuglyvaltyrphecysleuglnval

859095

lyshisvalprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105110

<210>22

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>來自雜交瘤抗體克隆的有效亞克隆(7-12)的vl序列

<400>22

aspvalvalmetthrglnthrproleuserleuprovalserleugly

151015

aspglnalaserilesercysargserserglnserleugluasnser

202530

asnglylysthrtyrleuasntrppheleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrargvalproasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythrgluphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspleuglyvaltyrphecysleuglnval

859095

lyshisvalprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105110

<210>23

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>來自雜交瘤抗體克隆的有效亞克隆(7-4)的vl序列

<400>23

aspvalvalmetthrglnthrproleuserleuprovalserleugly

151015

aspglnalaserthrsercysargserserglnserleugluasnser

202530

asnglylysthrtyrleuasntrppheleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrargvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythrgluphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspleuglyvaltyrphecysleuglnval

859095

lyshisvalprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105110