本發(fā)明涉及生物過程技術(bioprocess technology)領域，特別地涉及使用酵母和丙酸桿菌(propionibacterium)(即，丙酸桿菌屬(Propionibacterium sp.))的共同培養(yǎng)的生物過程領域。

背景技術：

具有高有機化學需氧量(chemical oxygen demand)(COD)的廢棄流股是生態(tài)負擔，因此需要被處理掉。這些廢棄流股可以是不同行業(yè)如乳制品、水果和蔬菜或糖加工行業(yè)的副產物。一個實例是作為由干酪制造得到的副產物通過乳制品行業(yè)產生的乳清。該過程產生大體積量(high volume)的乳清(甜的(sweet)或酸的(sour))，其具有高COD且另一方面由于低相對低含量的可用的固體含量(例如乳蛋白和乳糖)而不能容易地/經濟地利用它。

根據(jù)干酷制造的過程，殘留乳清的COD值可以在35000mg O₂/L至100000mg O₂/L的范圍內。高有機負荷的主要貢獻者是乳糖，其可以代表最高達90％的COD值。在酸乳清的情況下，乳酸的存在甚至加重該問題。乳糖也代表約75％的乳清干物質并因此可以通過利用微生物的過程使用它。已經研究了多種乳清溶液的利用，如生物乙醇和沼氣(biogas)生產、乳糖或蛋白質的提取、有機酸或生物質的生產，但是仍需要利用乳清的經濟方式。

WO 2011/140649描述了通過乳酸菌和酵母的混合培養(yǎng)用于生產可食用的生物質的乳清的利用。該過程可以成功降低乳清的COD負荷，但是最終產物具有較小的商業(yè)價值。

乳清可以用于培養(yǎng)來自丙酸桿菌屬的細菌，其屬于放線菌目(Actinomycetales)(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(1986第一版)。已知丙酸桿菌屬是有價值的產物如有機酸(丙酸和乙酸)、維生素B12和雙歧桿菌化合物(bifidogenic compound)的生產者。雖然可以成功地在乳清上培養(yǎng)丙酸桿菌屬，但是它們不能令人滿意地降低COD負荷，因為它們產生在發(fā)酵的(消耗的)乳清中積累并顯著增加最終的COD負荷的有機酸。在下面，互換地使用術語“丙酸桿菌屬(Propionibacterium sp.)”和“丙酸桿菌(propionibacterium)”。

已知丙酸桿菌屬和其他細菌的共同培養(yǎng)能夠降低消耗的介質的COD負荷(Miyano等人，2000)，但是這種過程具有不是食品級并因此不能用于食品加工廠的缺點。

已知由丙酸桿菌屬產生的代謝物抑制其他微生物(尤其是真菌)的生長，且它們在食品腐敗變質預防中的用途是廣為人知的。US 5,260,061描述了應用丙酸桿菌屬代謝物用于食品應用來抑制酵母的生長。WO 2008/030089描述了丙酸桿菌屬與酵母的共同培養(yǎng)，以在干酪制造過程中得到良好的香味/香氣特征。在這種情況下，將丙酸桿菌屬用于控制和最后抑制混合培養(yǎng)物中的酵母的生長，因為施加的酵母細胞不耐來自丙酸桿菌屬的生長抑制物質。

鑒于以上陳述的現(xiàn)有技術，本發(fā)明的一個目的是提供由甜的或酸的乳清生產有價值的生物技術產物的新型生物過程，其中，最終消耗的發(fā)酵介質表現(xiàn)出相對低的COD。本發(fā)明的另一個目的是提供可用于本發(fā)明的過程的真菌細胞。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過提供能夠在與丙酸桿菌共同培養(yǎng)中生長的新型真菌細胞，優(yōu)選地酵母細胞，滿足了以上陳述的目的。通過它們在丙酸桿菌培養(yǎng)之后得到的靜止階段(stationary-phase)上清液(消耗的介質(spent medium))上的生長能力可以表征/定義這種真菌細胞或細胞。本發(fā)明還涉及使用這種可以在與丙酸桿菌的共同培養(yǎng)中在所述介質的存在下生長的真菌細胞的生物技術過程。

因此，本發(fā)明的第一方面涉及能夠在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長的真菌細胞。

通過本專利申請中所描述的誘變/選擇步驟可以再現(xiàn)地得到這種真菌細胞。根據(jù)本發(fā)明，具有在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長能力的真菌細胞，特別是酵母細胞，可用于降低來自發(fā)酵過程的廢棄材料的COD負荷。到現(xiàn)在為止本領域的技術人員不能獲得這種真菌細胞(特別是這種酵母細胞)。

通過本文以下公開的步驟可以容易地識別本發(fā)明的真菌細胞并將其與其他真菌細胞相區(qū)別。特別地，根據(jù)本發(fā)明，公開了其中的丙酸桿菌的良好限定的培養(yǎng)介質和良好限定的培養(yǎng)條件，用于測試真菌細胞“在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長”的能力。

因此，在一個優(yōu)選的實施方式中，由在缺氧條件下在由60g/L甜乳清粉(sweet whey powder)、5g/L的酵母提取物、和40mg/L的鈣D-泛酸酯組成的介質中在35℃和pH 6.5的培養(yǎng)的費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)的靜止培養(yǎng)物得到靜止階段上清液(用于測試真菌細胞是否是根據(jù)本發(fā)明的一種)。優(yōu)選地，甜乳清粉具有食品級質量，并且優(yōu)選地其包含至少63％wt.的乳糖、至少10％wt.的蛋白質和至多5％wt.的水。

可以將在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長的能力、真菌(酵母)培養(yǎng)物的培養(yǎng)定義為當在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長時真菌細胞實現(xiàn)的最大生長速率。因此，在另一個優(yōu)選的實施方式中，將所述真菌細胞在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中的所述生長能力定義為在至少0.02h^-1的最大生長速率(μ_max)下所述真菌細胞在所述靜止階段上清液上生長的能力。確定微生物在培養(yǎng)物中的生長速率的方法在本領域中是眾所周知的。

當培養(yǎng)物沒有暴露于通風(aeration)時，可以通過經過一段時間在培養(yǎng)介質中的乙酸和丙酸的恒定濃度來指出丙酸桿菌培養(yǎng)物的靜止培養(yǎng)狀態(tài)。在另一個實施方式中，通過經過一段時間的丙酸桿菌的恒定細胞密度(以g(DW)/L計))來指出丙酸桿菌培養(yǎng)物的靜止狀態(tài)。

在一個優(yōu)選的實施方式中，在本文以下的實施例2描述的測試方法中測試真菌細胞在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長的能力。

優(yōu)選的真菌細胞是酵母細胞。

在一個實施方式中，酵母細胞是在2014年1月20日在登錄號DSM28271下保藏在DSMZ-德國微生物保藏中心(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)下的酵母細胞。

本發(fā)明的第二方面涉及用于生產生物技術產物的方法，所述方法包括在培養(yǎng)介質中共同培養(yǎng)丙酸桿菌和真菌細胞。真菌細胞優(yōu)選地能夠在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長。

如上文和以下所描述的，真菌細胞優(yōu)選地是酵母細胞如根據(jù)本發(fā)明的真菌細胞。

生物技術產物優(yōu)選地是通過丙酸桿菌產生的物質。

優(yōu)選的生物技術產物是維生素B12。

在一個優(yōu)選的實施方式中，該方法包括沒有通風的第一階段，隨后是通風出現(xiàn)的第二階段。優(yōu)選地，兩個階段是至少24小時、或48小時、或72小時長。

在一個優(yōu)選的實施方式中，丙酸桿菌的生長的至少90％[以％克干重計]出現(xiàn)在沒有通風的所述第一階段期間。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，真菌細胞的生長的至少90％[以％克干重計]出現(xiàn)在其中出現(xiàn)通風的所述第二階段期間。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，將培養(yǎng)介質的化學需氧量(COD)降低至培養(yǎng)介質的初始COD的等于或小于25％、優(yōu)選地等于或小于10％、或等于或小于1％的水平。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，培養(yǎng)介質是(或包含)乳清。培養(yǎng)介質是或包含例如甜乳清或酸乳清。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，在所述丙酸桿菌達到在培養(yǎng)物中其最大細胞密度[g(DW)/L]的至少90％的時間點或之后添加所述真菌細胞。在本發(fā)明的方法的其他實施方式中，在丙酸桿菌達到其靜止生長階段時或之后添加真菌細胞。

本發(fā)明進一步涉及制造耐受丙酸桿菌的真菌菌株如耐受丙酸桿菌的酵母菌株的方法。該方法包括：

1.得到起始真菌菌株。

2.將起始真菌菌株暴露于誘變劑和/或誘變條件。

3.在第一濃度的乙酸和/或(優(yōu)選“和”)丙酸的存在下培養(yǎng)步驟2的暴露的真菌菌株。

4.可選地將步驟3的所述培養(yǎng)的真菌菌株暴露于誘變劑和/或誘變條件以及在第二濃度的乙酸和/或(優(yōu)選“和”)丙酸的存在下培養(yǎng)所述可選地暴露的真菌菌株，其中，所述第二濃度優(yōu)選地分別高于所述第一濃度。

5.將步驟3或4的培養(yǎng)的真菌菌株暴露于誘變劑和/或誘變條件。

6.在包含丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液的介質中培養(yǎng)步驟6的暴露的真菌菌株。

7.可選地通過升高丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液的濃度重復步驟7。

8.從而得到能夠在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長的真菌細胞。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的誘變劑是甲磺酸乙酯。然而可以使用增加突變發(fā)生頻率的任何其他的誘變劑，即化學的或物理的?？梢杂糜谝陨戏椒ǖ囊阎T變劑包括：活性氧物質(reactive oxygen species)(ROS)如過氧化物、羥基基團和過氧化氫；脫氨基試劑，例如亞硝酸；多環(huán)芳族烴(PAH)；烷基化劑如乙基亞硝基脲或甲磺酸甲酯；鳥嘌呤；亞硝胺；亞硝基胍；芥子氣；氯乙烯；芳香族胺；酰胺；2-乙酰氨基芴；來自植物的生物堿；如來自長春花(vinca)物種的那些；溴；在它們的化學結構中包含溴的化合物；疊氮化鈉；苯。合適的誘變條件或物理誘變原(mutagen)是例如UV輻射、暴露于X射線、和/或暴露于放射。

技術人員將了解可以省去以上的步驟2至4，例如如果步驟1中的起始菌株已經充分耐受乙酸和/或丙酸，或另外能夠在包含丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液的介質中生長。在這種情況下，將步驟1的起始菌株直接暴露于步驟5中的誘變劑和/或條件。

本發(fā)明的進一步方面涉及通過以上方法得到的真菌菌株。

附圖說明

圖1示出了通過丙酸桿菌屬的乳糖利用以及在乳清上在兩階段過程中乙酸和丙酸和維生素B12的生產。以這種方式，可以將COD值從85000mg O₂/L降低到36000mg O₂/L。在沒有通風的情況下進行發(fā)酵最高達到75小時，以及在75小時之后，引入通風。

圖2示出了通過丙酸桿菌屬的乳糖利用以及在乳清上在兩階段過程中的乙酸和丙酸和維生素B12的生產，其中，在引入氧氣的階段添加耐受的DSM 28271酵母培養(yǎng)物。以這種方式，可以將COD值從85000mg O₂/L降低到13000mg O₂/L。在沒有通風的情況下進行發(fā)酵最高達到75小時，以及在75小時之后，引入酵母和通風。

圖3示出了根據(jù)本發(fā)明用于共同培養(yǎng)丙酸桿菌屬與耐受的酵母的生物過程的示意圖。

圖4示出了通過丙酸桿菌屬的乳糖利用以及在乳清上在兩階段過程中乙酸和丙酸和維生素B12的生產，其中，在引入氧氣的階段添加耐受的乳酸克魯維酵母(K.lactis)ABLMKL6酵母培養(yǎng)物。以這種方式，可以將COD值從80000mg O₂/L降低到14500mg O₂/L。在沒有通風的情況下進行發(fā)酵最高達到112小時，以及在112小時之后，引入酵母和通風。

具體實施方式

在本發(fā)明的上下文中的表達“上清液”或“培養(yǎng)物上清液”是指當過濾或離心發(fā)酵肉湯從而除去細胞和其他不溶性物質時得到的液體。上清液包含沒有(還沒有)被微生物消耗的培養(yǎng)介質中的任何營養(yǎng)物和其他組分或降解產物、以及在發(fā)酵期間由微生物產生的任何產物。

應將“培養(yǎng)物介質”理解為是微生物可以在其中生長的含營養(yǎng)物的介質。液體培養(yǎng)物介質是優(yōu)選的。

應將“肉湯”或“發(fā)酵肉湯”理解為是指微生物在其中生長或已經生長的培養(yǎng)物介質。肉湯可以包含未使用的營養(yǎng)物和/或由微生物產生的產物。

應將根據(jù)本發(fā)明的“靜止階段上清液”或“消耗的介質”理解為是來自靜止階段發(fā)酵肉湯的上清液。

應將靜止階段理解為是其中微生物基本上已經停止生長，例如微生物已經達到培養(yǎng)期間其最大細胞密度的培養(yǎng)階段。通過監(jiān)測發(fā)酵產物的濃度也可以檢測培養(yǎng)的靜止階段。在一個實施方式中，將丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段定義為從乙酸和/或丙酸的濃度已經達到其最大值或可替換地已經達到其最大值的90％的時間點開始的階段。

“乳清”是乳制品行業(yè)的副產物，當添加或原位形成粗制凝乳酶(rennet)或酸性物質時，其分離自凝固之后的奶制品。“甜乳清”制造于制備硬質干酪如切德(cheddar)干酪或瑞士干酪的粗制凝乳酶類型期間?！八嵝匀榍?acid whey)”或“酸乳清(sour whey)”是在制備酸類型乳制品如松軟干酪(cottage cheese)或菌株酸奶(strained yogurt)期間產生的副產物。

應將“化學需氧量”或“COD”理解為是通過ISO 6060:1989標準方法確定的化學需氧量。應當理解的是，根據(jù)該方法，如果待確定的COD在允許的700mg/L的最大COD以上，則可能需要用水稀釋樣品。然后由確定的COD乘以稀釋因數(shù)計算COD。

本發(fā)明提供了耐受與丙酸桿菌共同培養(yǎng)的真菌細胞。本發(fā)明還提供了共同培養(yǎng)丙酸桿菌和真菌細胞的方法，該細胞耐受由丙酸桿菌產生的抑制性化合物。

本發(fā)明提供了真菌細胞，其能夠在丙酸桿菌和它們的抑制性代謝物的存在下生長。通過在之前已經培養(yǎng)了丙酸桿菌的生長基板上通?？色@得的真菌細胞的天然存在的隨機突變體的選擇流程得到這些細胞。優(yōu)選地，以至少兩步進行這種耐受的真菌細胞的選擇。在第一步驟中，選擇可以耐受較高濃度的有機酸例如乙酸和丙酸的真菌細胞的隨機突變體。在第二步驟中，使這些耐酸細胞的隨機突變體在之前已經培養(yǎng)了丙酸桿菌且達到生長靜止階段的使用的生長介質上經受另外輪的選擇。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的真菌細胞是酵母細胞。

通過經典的選擇方法，可能性地通過隨機誘變、通過基因工程或通過篩選天然的分離體支持，可以得到耐受與丙酸桿菌共同培養(yǎng)，例如能夠在丙酸桿菌培養(yǎng)物的靜止階段上清液中生長的本發(fā)明的真菌細胞。

在與丙酸桿菌共同培養(yǎng)的過程中使用耐受的酵母細胞的本發(fā)明的生物技術過程可以包括以下步驟：

1.制備培養(yǎng)介質

2.接種丙酸桿菌。

3.在沒有通風的情況下發(fā)酵

4.轉換至需氧條件

5.接種耐受的酵母細胞

6.作為丙酸桿菌和酵母的共同培養(yǎng)繼續(xù)發(fā)酵

7.可選地下游處理并回收產物

發(fā)酵介質

發(fā)酵介質可以是丙酸桿菌和真菌細胞兩者在其中可以生長的任何合適的發(fā)酵介質。例如，發(fā)酵介質可以包含糖蜜(molasses)或乳清。發(fā)酵介質可以由來自不同行業(yè)的廢棄流股(如乳清)組成，向其中可以添加特定的添加劑(如礦物質、維生素、氮和另外的碳源、前體等)以提高生長速率或形成期望的產物。介質可以包含適用于丙酸桿菌的不同的碳源如葡萄糖、乳糖、果糖、乳酸和氮源如硫酸銨、氨基酸、肽和蛋白質。可以在過程開始調節(jié)或可以在發(fā)酵過程期間保持發(fā)酵介質的pH值以允許丙酸桿菌的良好的生長和/或產物形成。

在接種丙酸桿菌之前，正常通過失活初始存在于發(fā)酵介質中的足夠比例的微生物的過程處理介質。這些過程可以是殺菌/巴氏殺菌，例如高壓滅菌(autoclaving)、過濾、輻射和/或化學處理。

應通過能夠除去足夠比例的初始存在的微生物以及然后用發(fā)酵介質填充的方法制備培養(yǎng)容器或發(fā)酵罐。用于本發(fā)明的過程的培養(yǎng)容器可以非常簡單，只要它可以保持期望的溫度，并可以保持適當?shù)臄嚢枰苑乐勾蟮膒H或營養(yǎng)物梯度。其可以理想地保留輕微的過壓。

接種丙酸桿菌

含丙酸桿菌的接種物可以由一個或多個階段組成，這取決于最終的種菌培養(yǎng)物(seed culture)體積和使用的過程。在支持丙酸桿菌生長的介質中可以制備接種物。在優(yōu)選的溫度下培養(yǎng)接種物期望的時間，這之后可以將其用于接種發(fā)酵介質。用于接種物的隨后階段或發(fā)酵階段的接種體積可以在1至20％的范圍內。

在沒有通風的情況下發(fā)酵

首先將發(fā)酵肉湯保持在沒有通風的期望的溫度下，用于最佳生長或產物形成。該溫度可以在25℃至40℃的范圍內，優(yōu)選35℃。如果糖存在于發(fā)酵介質中，那么應當將pH值保持在期望的水平，其可以在5.5至8.0的范圍內，優(yōu)選是6.5。通過多種不同的酸/堿如H₂SO₄、HCl、NaOH、NH₄OH等可以保持pH?？梢栽跊]有通風的情況下進行生物過程或可以將生物過程保持在CO₂和/或N₂噴射和/或過壓下。在CO₂過壓下的培養(yǎng)是有利的。

應當充分攪拌發(fā)酵介質以防止大的pH梯度并可以但不限于通過Rushton渦輪機、船用推進器(marine propeller)或內部和/或外部再循環(huán)泵執(zhí)行。

轉換到需氧條件

由丙酸桿菌耗盡可消耗的營養(yǎng)物之后，可以將培養(yǎng)物轉換到需氧條件。可以將空氣引入到培養(yǎng)容器中且其對于以下描述的酵母的生長應是足夠的。通風速率還影響酵母代謝丙酸桿菌產生的有機酸的速率。

這時可以引入影響肉湯的性質(即消泡(antifoam))，影響丙酸桿菌產生的產物的形成(即5,6-二甲基苯并咪唑)或影響酵母的生長或產物形成(氮源、前體等)的另外補充物。

在已經將培養(yǎng)物轉換到需氧條件之后，應將pH再次保持在期望的水平。pH值可以在5.5至8的范圍內，優(yōu)選地是6.5以使酵母能夠良好生長。

接種耐受丙酸桿菌的酵母細胞

耐受的酵母細胞的接種物可以由一個或多個階段組成，這取決于最終的種菌培養(yǎng)物的體積。在支持酵母生長的介質中制備酵母接種物。在優(yōu)選的溫度下培養(yǎng)接種物期望的時間。然后在已經將其轉換到需氧條件之后，可以將酵母接種物用于接種含有培養(yǎng)的丙酸桿菌的發(fā)酵介質。用于接種物的隨后階段或最終階段的接種體積可以在但不限于1至20％的范圍內。優(yōu)選地，酵母接種物代表了最終體積的5％。

通過得到的微生物的共同培養(yǎng)物繼續(xù)發(fā)酵

將發(fā)酵肉湯保持在期望的溫度下并通過添加適當?shù)乃峄驂A將pH值恒定保持在期望的水平。應當將攪拌和通風保持在要求的水平以確保完全利用有機酸。通風和/或混合的量影響酵母代謝有機酸。

也可以在這時引入影響肉湯的性質(即消泡)、影響丙酸桿菌產生的產物的形成或影響酵母的生長或產物形成的另外的補充物。監(jiān)測發(fā)酵肉湯的上清液的COD值和由丙酸桿菌或酵母細胞產生的有價值的產物的產率，以實現(xiàn)期望的肉湯的性質。使用這種共同培養(yǎng)流程，可以將肉湯的上清液的COD值降低至小于20000mg O₂/L、優(yōu)選地小于15000mg O₂/L、更優(yōu)選地小于10000mg O₂/L以及更加優(yōu)選地小于5000mg O₂/L。如果選擇的高價值產物是維生素B12，那么維生素B12的產率可以大于5mg/L、優(yōu)選地大于10mg/L、更優(yōu)選地大于20mg/L以及更加優(yōu)選地大于100mg/L。

發(fā)酵肉湯的下游處理

有機酸被消耗且上清液的COD達到令人滿意的水平之后，停止生物過程。通過離心、過濾或任何其他合適的方法可以從上清液分離混合的丙酸桿菌/酵母生物質連同肉湯的不可溶的組分。如果處理到水處理廠，則上清液具有低COD并存在小負擔，或在理想的情況下，COD足夠低使得可以直接將其處理(dispose)到環(huán)境中。如果生物質富含有價值的物質如維生素和蛋白質，特別是維生素B₁₂，那么可以將這些物質用作動物飼料的添加劑?？商鎿Q地，可以將生物質用作用于分離有價值的物質如任何形式的維生素B₁₂(例如氰鈷胺素或甲基鈷胺素)的原材料。根據(jù)純度等級，可以將維生素B₁₂用作動物飼料的添加劑或用作用于人類消耗的藥物或食物補充物。

根據(jù)本發(fā)明的酵母可以是克魯維酵母屬(Kluyveromyces)(例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)；馬克斯克魯維酵母(K.marxianus))，優(yōu)先地是乳酸克魯維酵母，和/或亞羅酵母屬(Yarrowia)，優(yōu)選解脂亞羅酵母(Y.lipolytica)。然而，菌株也可以是德巴利酵母屬(Debaryomyces)(例如漢氏德巴利酵母(Debaryomyces hansenii))、假絲酵母屬(Candida)(例如皺狀假絲酵母(Candida versatilis)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、薔薇色酵母屬(Rhodotorula)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、毛孢子菌屬(Trichosporon)(例如白吉利毛孢子菌(Trichosporon beigelii))、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)(例如東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis))、地絲菌屬(Geotrichum)、酵母屬(Saccharomyces)或接合酵母屬(Zygosaccharomyces)。這種細胞是在本領域可獲得的且可以由保藏機構得到或可以從食品中分離它們。

實施例

實施例1-耐受丙酸桿菌的酵母細胞的制備

在由酵母提取物(20g/L)、蛋白胨(20g/L)和右旋糖(10g/L)組成的YEPD介質中在35℃下培養(yǎng)酵母產朊假絲酵母(Candida utilis)NRRLY-7586持續(xù)72小時，用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 7)洗滌兩次并將其暴露于適當劑量的誘變劑(甲磺酸乙酯)以得到99.9％的殺死率?？梢允褂萌魏纹渌线m的真菌細胞或酵母細胞。在包含酵母提取物(10g/L)和最小抑制濃度的乙酸和丙酸的介質中培養(yǎng)存活細胞。在35℃下培養(yǎng)三天之后，將來自該肉湯的等分部分(aliquot)轉移到YEPD介質中，使其生長72小時并經受另一輪誘變。然后在包含酵母提取物(10g/L)和升高濃度的乙酸和丙酸(相對于上一輪)的介質中培養(yǎng)存活細胞(surviving cell)。反復地重復該流程直至酵母能夠耐受高濃度的乙酸和丙酸(即酵母能夠生長和消耗15g/L的濃度的乙酸和丙酸)。以這種方式，得到菌株產朊假絲酵母ABLMCU1。

用得到的耐受高濃度的乙酸和丙酸的產朊假絲酵母菌株(ABLMCU1)，使用類似的誘變/選擇方案，這次將來自丙酸桿菌的發(fā)酵的稀釋的靜止階段上清液用作抑制劑。更詳細地，使之前選擇為耐受有機酸的產朊假絲酵母細胞在YEPD介質中生長，經受甲磺酸乙酯以及隨后在介質上培養(yǎng)，該介質是費氏丙酸桿菌菌株ABLM1700在乳清中發(fā)酵得到的靜止階段上清液(乳清，5g/L酵母提取物、20mg/L CoCl₂，在35℃下培養(yǎng)費氏丙酸桿菌96小時，下文中將上清液稱為介質“As”)和用于發(fā)展耐受有機酸的酵母細胞的介質(即乙酸(15g/L)、丙酸(15g/L)和酵母提取物(10g/L))(本文中稱為介質“Bs”)的混合物。這些介質以As:Bs＝3:7的比率混合，其在ABLMCU1酵母細胞能夠生長的水平以上。72小時之后，將得到的產朊假絲酵母培養(yǎng)物的等分部分轉移到YEPD中，使其生長并再次暴露于甲磺酸乙酯，以及隨后將其轉移到較高比率的As:Bs(即4:6)的介質As和Bs的混合物中。重復該流程直至得到酵母克隆，其耐受丙酸桿菌的發(fā)酵的未稀釋的靜止階段上清液(100％As)。得到的酵母菌株于2014年1月20日保藏在DSMZ-德國微生物保藏中心，并在登錄號DSM28271下可獲得。

以上描述的流程產生耐受丙酸桿菌的產朊假絲酵母菌株。然而，應當注意的是，使用類似的流程成功生產了其他耐受丙酸桿菌的菌株，即起始于不同的酵母菌株。例如，在類似的流程中處理乳酸克魯維酵母Y-17597菌株并產生根據(jù)本發(fā)明的耐受丙酸桿菌的真菌菌株(乳酸克魯維酵母ABLMKL6)。因此示出該流程是可再現(xiàn)的并適用于其他酵母菌株。

實施例2-用于建立“在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長的能力”的測試

根據(jù)權利要求1，以下方法適用于確定真菌菌株(例如酵母菌株)是否“能夠在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長”。

步驟1：得到丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液

如下在介質P1(以下表1)中制備第一階段丙酸桿菌種菌培養(yǎng)物。將由培養(yǎng)物保藏中心得到的100μL丙酸桿菌儲備培養(yǎng)物(stock culture)(費氏丙酸桿菌ATCC 6207)轉移到50mL的介質P1中，并在沒有通風和沒有搖動的情況下在35℃下溫育4天。

然后將15mL的該第一階段種菌培養(yǎng)物轉移到填充有135mL的介質P2(以下表2)的150mL玻璃瓶中，并在沒有通風和沒有搖動的情況下在35℃下溫育4天以得到第二段種菌培養(yǎng)物。

然后將100mL如此得到的第二階段種菌培養(yǎng)物用于接種填充有900mL介質P3(以下表3)的1L工作體積攪拌槽生物反應器。培養(yǎng)參數(shù)是：溫度：35±0.5℃，pH：6.5±0.1(用15％NaOH或H₂SO₄控制)，攪動：100±10RPM，噴射CO₂：0.1±0.05vvm，NH₄⁺濃度：400±100mg/L(使用15％(NH₄)₂SO₄每12小時調節(jié)一次，pH 6.5)。運行發(fā)酵直至乳糖濃度低于1g/L。發(fā)酵結束后，肉湯中的乙酸和丙酸的濃度總和優(yōu)選地大于或等于20g/L。

在10000g下離心如此得到的50mL發(fā)酵肉湯，并將上清液轉移到愛倫美氏瓶(Erlenmeyer flask)中，并在121℃下高壓滅菌(autoclave)20分鐘。高壓滅菌的介質是“丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液”。

步驟2：測試在丙酸桿菌的靜止階段上清液中生長的能力

通過將100μL的儲備培養(yǎng)物添加到10mL的Y1介質(表4)中制備待測試的真菌細胞的接種物。在35℃和200RPM下在旋轉搖瓶機上(rotary shaker)溫育接種物培養(yǎng)物72小時。將得到的培養(yǎng)物用作以下步驟中的“真菌接種物”。

用2.5mL真菌接種物來接種包含以上步驟1得到的靜止階段上清液的高壓滅菌的愛倫美氏瓶并在35℃和200RPM下在旋轉搖瓶機上溫育。將初始pH值設置為pH 6.5。將這視為“測試培養(yǎng)”。

24小時培養(yǎng)之后，通過測量培養(yǎng)物中的pH的變化評估真菌的生長。在一個實施方式中，在所附權利要求1的含義內，如果24h培養(yǎng)時間之后測試培養(yǎng)中的肉湯的pH值從起始pH(pH 6.5)升高到pH值8.0或更高，則將測試的真菌細胞視為“能夠在丙酸桿菌的靜止階段上清液中生長”。

因此，如果24h培養(yǎng)時間之后測試培養(yǎng)中的肉湯的pH值保持低于8.0，則認為測試的真菌細胞不能在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長。

能夠在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長的要求保護的真菌細胞優(yōu)選地是在以上測試中測試陽性的細胞。

實施例2b)-替換測試

可替換地，通過測量24小時培養(yǎng)之后培養(yǎng)物的變化OD可以評估真菌的生長。

在所附權利要求1的含義內，如果在接種之后24h內肉湯的光密度(在620nm下測量)的差增加至少0.5，則認為測試的真菌細胞能夠在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長?？商鎿Q地，在所附權利要求1的含義內，如果測試培養(yǎng)中的真菌細胞的最大生長速率(μ_max)等于0.02h^-1或更高，則認為測試的真菌細胞能夠在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長。

因此，在所附權利要求1的含義內，如果在接種之后24h內肉湯的光密度(在620nm下測量)的差增加小于0.5，則認為測試的真菌細胞不能夠在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長。可替換地，在所附權利要求1的含義內，如果測試培養(yǎng)中的真菌細胞的最大生長速率(μ_max)低于0.02h^-1，則認為測試的真菌細胞不能夠在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長。

因此，能夠在丙酸桿菌培養(yǎng)的靜止階段上清液中生長的要求保護的真菌細胞是在以上替換測試中的一個中測試陽性的細胞。

表1：用于丙酸桿菌的定義介質P1

表2：用于丙酸桿菌的定義介質P2

*滅菌之后添加

表3：用于丙酸桿菌的介質P3

*滅菌之后添加

**具有以下規(guī)格的食品級甜乳清粉：乳糖最低63％wt.、蛋白質最低10％wt.、水分最高5％是合適的并可由不同的供應商如：HoogwegtInternational(荷蘭)、Lactalis Ingredients(法國)、James Farrell&Co(美國)得到。

表4：用于酵母的介質Y1

實施例3-丙酸桿菌和酵母的有效共同培養(yǎng)

i)丙酸桿菌接種物制備

在兩個階段中制備丙酸桿菌的接種物。將費氏丙酸桿菌ABLM2475(可以使用任何其他的產生維生素B12的菌株如費氏丙酸桿菌ATCC6207)0.5mL的儲備懸浮液(stock suspension)接種到50mL的第一營養(yǎng)介質(vegetative medium)(酵母提取物20g/L和DL-乳酸鹽(酯)20g/L)中并在35℃下溫育4天。然后將第一營養(yǎng)階段(vegetative stage)轉移到400mL的第二階段營養(yǎng)介質(葡萄糖40g/L、酵母提取物40g/L、DL-乳酸鹽(酯)40g/L、碳酸鈣10g/L、氯化鈷20mg/L、泛酸鹽(酯)10mg/L)中并溫育4天，同時用氫氧化鈉連續(xù)中和pH值。然后將整個第二階段轉移到最終的生物反應器中。

ii)耐受的酵母接種物制備

也在兩個階段中制備耐受的酵母的接種物。將酵母DSM 28271的0.5mL儲備懸浮液接種到250mL愛倫美氏瓶中的50mL的第一營養(yǎng)介質(酵母提取物40g/L、蛋白胨40g/L和葡萄糖10g/L)中，并在220RPM下在旋轉搖瓶機上在35℃下溫育2天。然后將第一營養(yǎng)階段轉移到1000mL愛倫美氏瓶中的200mL相同介質中，并在220RPM下在旋轉搖瓶機上在35℃下培養(yǎng)2天。

iii)發(fā)酵

用補充有酵母提取物(5g/L)和氯化鈷(20mg/L)的4L酸乳清(COD是80.000mg O₂/L)填充7L工作體積的生物反應器，并在121℃下滅菌1小時。冷卻至35℃之后，添加泛酸鹽(酯)(10mg/L)并用丙酸桿菌的種菌培養(yǎng)物接種生物反應器。培養(yǎng)溫度是35℃以及攪動速率是100RPM。用CO₂氣體噴射生物反應器中的內容物(10mL/min)，并將pH保持在6.5(用NaOH)。90小時之后，乳酸鹽(酯)和乳糖已經被耗盡，以及產生大約8和15g/L的乙酸和丙酸。這時，添加20mg/L的5,6-二甲基苯并咪唑，將攪動速率增加至500RPM并以1vvm引入通風，以及用5％耐受的酵母接種生物反應器。將pH值保持在6.5(用H₂SO₄)。48小時之后，酵母消耗了所有的有機酸并停止發(fā)酵。該過程產生15mg/L的維生素B12。通過離心除去由丙酸桿菌和酵母組成的生物質，且得到的上清液的COD值是12.000mg O₂/L，降低了85％。

圖3示出了示例性過程的示意性流程圖。

實施例4-丙酸桿菌和酵母(乳酸克魯維酵母ABLMKL6)的有效共同培養(yǎng)

i)丙酸桿菌接種物制備

在兩個階段中制備丙酸桿菌的接種物。將費氏丙酸桿菌ABLM2475(可以使用任何其他的產生維生素B12的菌株如費氏丙酸桿菌ATCC6207)的0.5mL的儲備懸浮液接種到50mL的第一營養(yǎng)介質(酵母提取物20g/L和DL-乳酸鹽(酯)20g/L)中并在35℃下溫育4天。然后將第一營養(yǎng)階段轉移到400mL的第二階段營養(yǎng)介質(葡萄糖40g/L、酵母提取物40g/L、DL-乳酸鹽(酯)40g/L、碳酸鈣10g/L、氯化鈷20mg/L、泛酸鹽(酯)10mg/L)中并培養(yǎng)4天，同時用氫氧化鈉連續(xù)中和pH值。然后將整個第二階段轉移到最終的生物反應器中。

ii)耐受的酵母接種物制備

也在兩個階段中制備耐受的酵母的接種物。將耐受的酵母乳酸克魯維酵母ABLMKL6的0.5mL儲備懸浮液接種到250mL愛倫美氏瓶中的50mL的第一營養(yǎng)介質(酵母提取物40g/L、蛋白胨40g/L和葡萄糖10g/L)中，并在220RPM下在旋轉搖瓶機上在35℃下溫育2天。然后將第一營養(yǎng)階段轉移道1000mL愛倫美氏瓶中的200mL相同介質中，并在220RPM下在旋轉搖瓶機上在35℃下培養(yǎng)2天。

iii)發(fā)酵

用補充有酵母提取物(5g/L)和氯化鈷(20mg/L)的4L酸乳清(COD是80.000mg O₂/L)填充7L工作體積的生物反應器，并在121℃下滅菌1小時。冷卻至35℃之后，添加泛酸鹽(酯)(10mg/L)并用丙酸桿菌的種菌培養(yǎng)物接種生物反應器。培養(yǎng)溫度是35℃以及攪動速率是100RPM。用CO₂氣體(10mL/min)噴射生物反應器中的內容物，并將pH保持在6.5(用NaOH)。112小時之后，乳酸鹽(酯)和乳糖已經被耗盡，以及產生大約4和14g/L的乙酸和丙酸。這時，添加20mg/L的5,6-二甲基苯并咪唑，將攪動速率增加至500RPM并以1vvm引入通風，以及用5％耐受的酵母接種生物反應器。將pH值保持在6.5(用H₂SO₄)。72小時之后，酵母消耗了所有的有機酸并停止發(fā)酵。該過程產生16mg/L的維生素B12。通過離心除去由丙酸桿菌和酵母組成的生物質，且得到的上清液的COD值是14.500mg O₂/L，降低了81％。