1.Midkine低表達(dá)的LM3穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)從載體pSM2上擴(kuò)增對(duì)應(yīng)Midkine基因的shRNA片斷，將其克隆到含有tGFP報(bào)告基因的慢病毒載體pLenti上，構(gòu)建pLenti-MDKshRNA重組質(zhì)粒；
(2)在100mm培養(yǎng)皿中接種HEK293T細(xì)胞；采用慢病毒轉(zhuǎn)染體系，將步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pVSVG按照10：9：1質(zhì)量比例添加到Opti-MEM基本培養(yǎng)基中，然后將轉(zhuǎn)染試劑添加到上述培養(yǎng)基中，混合均勻后全部添加到HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)基中，將該細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48小時(shí)以后，收集含有MDK shRNA病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，無菌過濾并收集含有病毒的濾出液；將上述病毒濾出液添加到預(yù)先接種LM3細(xì)胞的培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)；最后添加Puromycin抗生素篩選陽性細(xì)胞系，最終獲得Midkine穩(wěn)定低表達(dá)的LM3細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，pLenti-MDKshRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建過程包括如下步驟：
(1)以pSM2為模板，采用PCR方法擴(kuò)增Midkine shRNA基因片斷，PCR引物序列為，
Forward primer：5'-AAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCT-3'
Reverse primer：5'-ACTGGTGAAACTCACCCAGGGATT-3'
(2)將步驟(1)所得PCR產(chǎn)物電泳檢測、純化，測定OD值；
(3)采用Mlu I和Xho I酶對(duì)慢病毒載體pLenti進(jìn)行雙酶切，切膠回收線性載體；
(4)利用T4 DNA連接酶將步驟(2)中PCR片斷與步驟(3)中線性載體pLenti于16℃過夜連接；
(5)采用熱轉(zhuǎn)化方法，將上述連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli.DH5a感受態(tài)細(xì)胞，于37℃過夜培養(yǎng)16小時(shí)以上；次日收集菌體，從細(xì)菌培養(yǎng)液中提取質(zhì)粒pLenti-MDKshRNA，進(jìn)行Mlu I和Xho I雙酶切鑒定。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，低表達(dá)Midkine的LM3穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建，其特征在于：
(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前一天，在100mm培養(yǎng)皿中接種0.5×106～1×106cells個(gè)HEK293T細(xì)胞，次日細(xì)胞匯合度達(dá)到50～70％；
(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法，將構(gòu)建好的pLenti-MDKshRNA重組質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pVSVG按照10：9：1質(zhì)量比例混合(所有質(zhì)粒質(zhì)量總和6μg)，添加到580μl Opti-MEM基本培養(yǎng)基中，然后添加12μl轉(zhuǎn)染試劑到上述培養(yǎng)基中，混勻、室溫靜止20分鐘后，將上述含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基逐滴添加到接種HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；6小時(shí)后補(bǔ)充含有體積濃度10％胎牛血清和終濃度1×P/S(Penicillin-Streptomycin)的DMEM培養(yǎng)基，然后放入培養(yǎng)箱里繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；
(3)病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前一天，在6孔板中接種LM3細(xì)胞，1×105～2×105cells/孔，將LM3細(xì)胞培養(yǎng)在含有體積濃度10％胎牛血清和終濃度1×P/S(Penicillin-Streptomycin)的DMEM培養(yǎng)基，次日LM3細(xì)胞匯合度達(dá)到50～70％；
(4)病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，收集步驟(2)中獲得的含有Midkine shRNA病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，使用0.45μm低吸附無菌濾膜過濾并保留濾液；除去LM3細(xì)胞培養(yǎng)液，將含有病毒的濾液添加到LM3細(xì)胞培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)；培養(yǎng)24小時(shí)以后，除去含有病毒的培養(yǎng)液，更換含有10％胎牛血清和終濃度1×P/S的DMEM培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48～72小時(shí)；
(5)陽性細(xì)胞系篩選；上述細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加終濃度為2μg/ml的Puromycin進(jìn)行陽性細(xì)胞系篩選，每三天更換一次含終濃度為2μg/ml Puromycin的新鮮培養(yǎng)基；待細(xì)胞匯合度達(dá)到80～90％時(shí)傳代；當(dāng)細(xì)胞傳至第七代以后時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察幾乎全部細(xì)胞都發(fā)出綠色熒光，取出部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定；將第八代以后的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存細(xì)胞，最終獲得陽性克隆細(xì)胞系。
4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于：將上述步驟獲得的陽性細(xì)胞系，取出部分細(xì)胞提取總RNA，采用RT-qPCR方法檢測Midkine基因表達(dá)量；取出另一部分細(xì)胞提取蛋白，采用Western Blot方法檢測Midkine蛋白表達(dá)量。
5.一種權(quán)利要求1～4任一所述構(gòu)建方法獲得的Midkine穩(wěn)定低表達(dá)的 LM3細(xì)胞系。