本發(fā)明涉及小麥條銹病抗性相關(guān)蛋白TaSPX-MFS及其編碼基因與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在漫長的進化過程中，植物產(chǎn)生了復(fù)雜的機制來識別病原菌的侵染并觸發(fā)自身有效的免疫反應(yīng)。植物先天免疫體系包括兩大分支，一個是PAMP(pathogen-associated molecular pattern)觸發(fā)的免疫系統(tǒng)(PAMP-triggered immunity，PTI)，它是通過跨膜的受體蛋白PRRs(pattern recognition receptors)與PAMP相互應(yīng)答而產(chǎn)生的早期對病原菌的抗性反應(yīng)；另一個是效應(yīng)子觸發(fā)的免疫系統(tǒng)(effector-triggered immunity，ETI)，它是通過植物抗性基因(R基因)編碼的R蛋白對由病原菌無毒基因(Avr基因)編碼的效應(yīng)子進行直接或間接的識別而產(chǎn)生的免疫反應(yīng)(Chisholm ST,Coaker G,Day B,Staskawicz BJ.(2006).Host-microbe interactions:shaping the evolution of the plant immune response.Cell 124:803-814；Nimchuk Z,Eulgem T,Holt III BF,Dangl JL.(2003).Recognition and response in the plant immune system.Annu.Rev.Genet.37:579-609)。

大麥條紋花葉病毒(Barley Stripe Mosaic Virus,BSMV)為由α、β、γ共3條鏈組成的3鏈RNA病毒。利用BSMV-based介導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)被成功用于大麥和小麥功能基因的研究上(Hein I,Barciszewska-Pacak M,Hrubikova K,Williamson S,Dinesen M,Soenderby IE,Sundar S,Jarmolowski A,Shirasu K,Lacomme C.(2005).Virus-Induced Gene Silencing-Based Functional Characterization of Genes Associated with Powdery Mildew Resistance in Barley.Plant Physiology 138:2155-2164；Zhou HB,Li SF,Deng ZY,Wang XP,Chen T,Zhang JS,Chen SY,Ling HQ,Zhang AM,Wang DW,Zhang XQ.(2007).Molecular analysis of three new receptor-like kinase genes from hexaploid wheat and evidence for their participation in the wheat hypersensitive response to stripe rust fungus infection.The Plant Journal 52,420–434.；Wang G,Wei X,Fan R,Zhou H,Wang X.Yu C,Dong L,Wang X,Kang Z,Ling H,Shen Q,Wang D,Zhang X.(2011)Molecular analysis of common wheat genes encoding three types of cytosolic heat shock protein 90(hsp90):functional involvment of ctosolic hsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance.New Phytol.,191:418-431)。

當(dāng)BSMV侵染植物時，植物通過DCL4和DCL2產(chǎn)生相應(yīng)的siRNA對病毒RNA進行剪接，由此抵御病毒的傷害。但病毒RNA中攜帶有外源基因片段時，其siRNA也會導(dǎo)致植物內(nèi)源基因的沉默，由此產(chǎn)生植物基因沉默的表型(Dekeris A.,Gallego-Bartolome J.,Bao J.,Kasschau K.,Carrington J.,Voinnet O.(2006).Hierarchical Action and Inhibition of Plant Dicer-Like Proteins in Antiviral Defense.Science.313(5783),68-71)。分子病毒學(xué)研究表明，在γb基因后插入外源片段時不影響其對植物的侵染活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)控植物條銹病抗性。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了與植物條銹病抗性相關(guān)蛋白，本發(fā)明所提供的與植物條銹病抗性相關(guān)蛋白的名稱為TaSPX-MFS，是如下a)-e)的蛋白質(zhì)：

a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；

b)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)；

c)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)；

d)在序列2所示或序列4或序列6所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

e)將序列2所示或序列4或序列6所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的另一個目的是提供與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。

本發(fā)明提供的與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：

A1)編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；

A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；

A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；

A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；

A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；

A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；

A10)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；

A11)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；

A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系。

上述相關(guān)生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)-5)所示的基因：

1)其編碼序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)其編碼序列是序列3所示的cDNA分子或DNA分子；

3)其編碼序列是序列5所示的cDNA分子或DNA分子；

4)與1)或2)或3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；

5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列雜交，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。

本發(fā)明還有一個目的是提供上述蛋白質(zhì)或與上述蛋白質(zhì)相關(guān)生物材料的新用途。

本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)或與上述蛋白質(zhì)相關(guān)生物材料在調(diào)控植物條銹病抗性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或與上述蛋白質(zhì)相關(guān)生物材料在培育條銹病抗性降低的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物，所述單子葉植物具體為小麥。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種培育條銹病抗性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明提供的培育條銹病抗性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括將抑制上述蛋白質(zhì)表達的物質(zhì)導(dǎo)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的條銹病抗性低于所述受體植物。

上述方法中，所述抑制上述蛋白質(zhì)表達的物質(zhì)為如下A)或B)：

A)BSMV病毒載體α、BSMV病毒載體β和含有序列3自5′端第255-442位所示的DNA分子的BSMV病毒載體γ；

B)BSMV病毒載體α、BSMV病毒載體β和含有序列3自5′端第2067-2250位所示的DNA分子的BSMV病毒載體γ。

上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物的條銹病抗性低于所述受體植物具體體現(xiàn)在如下a1)或a2)：

a1)轉(zhuǎn)基因植物的條銹菌絲比受體植物長；

a2)轉(zhuǎn)基因植物的條銹菌孢子堆比受體植物多。

上述方法中，所述受體植物為單子葉植物；所述單子葉植物具體為小麥。

本發(fā)明的最后一個目的是提供抑制上述蛋白質(zhì)表達的物質(zhì)。

本發(fā)明提供的抑制上述蛋白質(zhì)表達的物質(zhì)為如下A)或B)：

A)BSMV病毒載體α、BSMV病毒載體β和含有序列3自5′端第255-442位所示的DNA分子的BSMV病毒載體γ；

B)BSMV病毒載體α、BSMV病毒載體β和含有序列3自5′端第2067-2250位所示的DNA分子的BSMV病毒載體γ。

本發(fā)明從普通小麥(Triticum aestivum L.)品種小偃54中克隆到SPX基因，將其命名為TaSPX-MFS，并構(gòu)建了用于沉默小麥中TaSPX-MFS基因的病毒誘導(dǎo)性載體，降低TaSPX-MFS基因的表達，得到沉默TaSPX-MFS小麥。通過試驗證明：沉默TaSPX-MFS小麥接種條銹病CYR31后，小麥葉片上出現(xiàn)許多條銹菌孢子堆，小麥植株顯現(xiàn)明顯的條銹病抗性喪失表型。說明通過敲除或沉默等手段來抑制小麥中的 TaSPX-MFS基因在植物中的表達，可以降低小麥對條銹病的抗性，反之推測，在小麥中的過表達TaSPX-MFS基因可提高小麥對于條銹病的抗性，對于研究小麥條銹病，提供敏感型株系，為小麥抗病基因的研究作出貢獻。

附圖說明

圖1為BSMV-based VIGS系統(tǒng)載體結(jié)構(gòu)示意圖，以TaPDS基因為例作為外源基因片段反向插入γ鏈γb基因突變的終止子處。

圖2為基因沉默后TaSPX-MFS的表達情況。

圖3為病毒誘導(dǎo)TaSPX-MFS基因沉默后小偃54對條銹菌小種CYR31的抗性變化。

圖4為病毒誘導(dǎo)重組大麥條紋花葉病毒侵染植株后內(nèi)部條銹菌絲的生長及寄主細胞反應(yīng)觀察。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的普通小麥品種小偃54是2000年8月通過陜西省農(nóng)作物品種審定委員會審定品種，在文獻“吳會杰，魏學(xué)寧，周新力，曹雙河，李宏偉，王獻平，童一平，井金學(xué)，張相岐。小偃54和小偃81高溫抗條銹性及其與幾丁質(zhì)酶基因表達的關(guān)系。麥類作物學(xué)報，2007,27(6):1117-1122”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。

下述實施例中的高保真Pyrobest Taq、Premix Ex Taq、RNA酶抑制劑、各種限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T Vector均購自大連寶生物(TaKaRa)公司；DNA純化回收試劑盒購自天根生物技術(shù)公司；轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

下述實施例中的BSMV病毒載體(包括BSMV病毒載體α、BSMV病毒載體β和BSMV病毒載體γ)是由Andy Jackson教授(University of California,Berkeley)饋贈，在文獻“Petty I,Hunter B,Wei N,Jackson A.(1989).Infectious barley stripe mosaicvirus RNA transcribed in vitro from full-length genomic cDNA clones.Virology,171,342-349”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。

下述實施例中的條銹菌小種CYR31在文獻“Li XH,Fan RC,Fu SL,Wei B,Feng J,Zheng Q,Wang XP,Han FP,Zhang XQ.(2015).Development of Triticum aestivum-Leymus mollis translocation lines and identification of resistance to stripe rust.Journal of Genetics and Genomic 42(3),129-132.”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所購得。

下述實施例中的GFP(BSMV:GFP)質(zhì)粒在文獻“Holzberg S.，Brosio P.，Gross C.，Pogue G.(2002)Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant.Plant J.,30:315-327”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。

下述實施例中的GKP Buffer含有50mM甘氨酸(glycine)、30mM K₂HPO₄1％(質(zhì)量百分比)膨潤土(bentonite)、1％(質(zhì)量百分比)硅藻土(celite)。

實施例1、TaSPX-MFS基因的獲得

1、cDNA的獲得

取生長7天的普通小麥品種小偃54幼苗葉片，洗凈后放入經(jīng)DEPC處理、滅菌后的研缽中，研磨粉碎，加入TRIzol(Invitrogen)研磨、勻漿，室溫放置5分鐘，加入氯仿抽提2次，取上清，用異丙醇沉淀總RNA，空氣干燥后，溶于適量DEPC水。以帶polyT的引物(TaKaRa)進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

2、PCR擴增

以步驟1獲得的cDNA為模板，采用正向引物TaSPX-MFS-F和反向引物TaSPX-MFS-R進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。引物序列如下：

TaSPX-MFS-F：5′-CGAAGTATTGTGCTTGAGTTGATTG-3′

TaSPX-MFS-R：5′-CCTGCTAGCATTTGCTAGCTTGATACCAC-3′；

上述PCR擴增反應(yīng)條件：94℃ 1min，然后94℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 2min 30個循環(huán)，最后72℃ 5min。

3、電泳和測序

將上述步驟2獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果表明，PCR擴增獲得了大小約2.3kb的片段，并將PCR擴增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(TaKaRa Biotech)上用于測序，采用DNAman軟件對測序結(jié)果進行序列拼接，結(jié)果表明：上述從普通小麥品種小偃54中共克隆得到3條不同的cDNA序列，3個基因序列相似性非常高，核苷酸同源性在96.6～98.3％，氨基酸序列相似性都在97.3-99％之間，因此將3個基因統(tǒng)稱為TaSPX-MFS基因，分別命名為TaSPX-MFS-6A基因、TaSPX-MFS-6B基因和TaSPX-MFS-6D基因，其中，TaSPX-MFS-6A基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，自5’端第1-2082為OFR，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列4所示；TaSPX-MFS-6B基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，自5’端第1-2082為OFR，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列5所示；TaSPX-MFS-6D基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示，自5’端第1-2082為OFR，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列6所示。

實施例2、沉默TaSPX-MFS小麥的獲得及其條銹病抗性分析

一、沉默TaSPX-MFS小麥的獲得

1、基因沉默片段的獲得

(1)以步驟1中TaSPX-MFS-6D基因作為模板，采用SPXdm-VF1：5’-TACGCTAGCCATACTCACGGAACATTCCG-3’；SPXdm-VR1：5’-CCTGCTAGCCACGAGTCGAGACGTAATAA-3’進行PCR擴增，擴增得到188bp的片段(自序列3的5′端第255-442位核苷酸)，將其命名為SPXdm-VR1；

(2)以步驟1中TaSPX-MFS-6D基因片段作為模板，采用3UTR-VF1：5’-TACGCTAGCTTATAACACCCTGTACTGAC-3’；3UTR-VR1:5’-CCTGCTAGCATTTGCTAGCTTGATACCAC-3’，擴增得到184bp的片段(自序列3的5′端第2067-2250位核苷酸)將其命名為3UTR-VR1。

2、BSMV重組病毒載體的構(gòu)建

按照常規(guī)分子生物學(xué)手段，參見“精編分子生物學(xué)實驗指南，2001，科學(xué)出版社，顏子穎，王海林譯”中的方法進行載體構(gòu)建。具體步驟如下：

將上述步驟1獲得的SPXdm-VR1插入BSMV病毒載體γ的NheI酶切位點間，且保持BSMV病毒載體γ的其他序列不變，得到重組載體VIGS-SPXdm。

將上述步驟1獲得的3UTR-VR1插入BSMV病毒載體γ的NheI酶切位點間，且保持BSMV病毒載體γ的其他序列不變，得到重組載體VIGS-3UTR(圖1，以TaPDS為例說明外源基因片段插入位置及方向)。

BSMV病毒載體α、β和BSMV:GFP共同構(gòu)成了病毒系統(tǒng)BSMV:GFP病毒載體。

BSMV病毒載體α、β和重組載體VIGS-SPXdm共同構(gòu)成了可沉默TaSPX-MFS基因的病毒系統(tǒng)BSMV:SPXdm病毒載體。

BSMV病毒載體α、β和重組載體VIGS-3UTR共同構(gòu)成了可沉默TaSPX-MFS基因的病毒系統(tǒng)BSMV:3UTR病毒載體。

3、BSMV體外轉(zhuǎn)錄

(1)用MluI酶切BSMV病毒載體α、BSMV:GFP、VIGS-SPXdm，VIGS-3UTR，用SpeI酶切BSMV病毒載體β，分別得到酶切產(chǎn)物。

(2)以(1)中的酶切產(chǎn)物為模板進行體外轉(zhuǎn)錄，分別得到體外轉(zhuǎn)錄的BSMV病毒載體α、體外轉(zhuǎn)錄的BSMV病毒載體β、體外轉(zhuǎn)錄的BSMV:GFP、體外轉(zhuǎn)錄的VIGS-SPXdm和體外轉(zhuǎn)錄的VIGS-3UTR。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照AmpliCap-MaxTM T7High Yield Message Maker Kit(Epicentre)說明書進行操作：RNase-free water XμL，線性化質(zhì)粒1.5μg，10×Transcription Buffer 2μL，Cap/NTP PreMix 8μL，100mM DTT2μL，Amplicap-Max^TM T7Enzyme Solution 2μL，反應(yīng)總體積20μL，42℃反應(yīng)2.5h， 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、BSMV接種

待小偃54生長至二葉期時，將8μl BSMV病毒混合液(滅菌超純水稀釋3倍后體外轉(zhuǎn)錄的BSMV病毒載體α、體外轉(zhuǎn)錄的BSMV病毒載體β、體外轉(zhuǎn)錄的BSMV:GFP等量混合，加入等體積的2×GKP Buffer)涂抹接種于植株平展的第二葉上，10分鐘后用滅菌超純水噴施葉面，覆保鮮膜保濕24小時，之后轉(zhuǎn)為正常條件培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)BSMV:GFP株系。

待小偃54生長至二葉期時，將8μl BSMV病毒混合液(滅菌超純水稀釋3倍后體外轉(zhuǎn)錄的BSMV病毒載體α、體外轉(zhuǎn)錄的BSMV病毒載體β、體外轉(zhuǎn)錄的VIGS-SPXdm等量混合，加入等體積的2×GKP Buffer)涂抹接種于植株平展的第二葉上，10分鐘后用滅菌超純水噴施葉面，覆保鮮膜保濕24小時，之后轉(zhuǎn)為正常條件培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)BSMV:SPXdm株系。

待小偃54生長至二葉期時，將8μl BSMV病毒混合液(滅菌超純水稀釋3倍后體外轉(zhuǎn)錄的BSMV病毒載體α、體外轉(zhuǎn)錄的BSMV病毒載體β、體外轉(zhuǎn)錄的VIGS-3UTR等量混合，加入等體積的2×GKP Buffer)涂抹接種于植株平展的第二葉上，10分鐘后用滅菌超純水噴施葉面，覆保鮮膜保濕24小時，之后轉(zhuǎn)為正常條件培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)BSMV:3UTR株系。

以接種1×GKP(buffer模擬接種)為對照，獲得了MOCK(對照)。

轉(zhuǎn)BSMV:SPXdm和轉(zhuǎn)BSMV:3UTR株系即為本發(fā)明條銹病抗性降低的沉默TaSPX-MFS的小麥株系。

5、沉默TaSPX-MFS小麥的鑒定

通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)BSMV:SPXdm和轉(zhuǎn)BSMV:3UTR株系中的TaSPX-MFS基因沉默的情況。具體方法如下所述：

(1)分別提取步驟4中病毒接種后獲得的MOCK(對照)、轉(zhuǎn)BSMV:GFP株系、轉(zhuǎn)BSMV:SPXdm和轉(zhuǎn)BSMV:3UTR株系的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

(2)以上述步驟(1)獲得的cDNA為模板，采用如下引物進行RT-PCR，分別檢測小麥TaSPX-MFS-6A、TaSPX-MFS-6B和TaSPX-MFS-6D的表達量。以Actin為內(nèi)參基因，引物序列如下：

SPX-MFS-6A：qTaSPX-MFS-6A-F：5′-CTTCCGGTCAACGTCATCGTT-3′；

qTaSPX-MFS-6A-R：5′-CGACACGACGTACTGAGCTT-3′；

SPX-MFS-6B：qTaSPX-MFS-6B-F：5′-CTCCATCGCCGCGACGTTT-3′；

qTaSPX-MFS-6B-R：5′-GCTAGCTTGATACCACAAGCC-3′；

SPX-MFS-6D：qTaSPX-MFS-6D-F：5′-TCCGGTCAACGTCATCGTG-3′；

qTaSPX-MFS-6D-R：5′-ACAGGTTGACCCCTTCAAGA-3′；

Actin：qActin-F:5′-CGAGCTCCGTGTCGCA 3′；

qActin-R:5′-GAGGAAGCGTGTATCCCTCATAG-3′。

結(jié)果如圖2所示：MOCK(對照)和轉(zhuǎn)BSMV:GFP株系中三個TaSPX-MFS基因(TaSPX-MFS-6A基因、TaSPX-MFS-6B基因和TaSPX-MFS-6D基因)的表達沒有明顯變化，而轉(zhuǎn)BSMV:SPXdm和轉(zhuǎn)BSMV:3UTR株系中三個TaSPX-MFS基因(TaSPX-MFS-6A基因、TaSPX-MFS-6B基因和TaSPX-MFS-6D基因)的表達得到了明顯的抑制，達到基因沉默的效果。

二、沉默TaSPX-MFS小麥的條銹病抗性分析

1、條銹菌小種CYR31的接種

MOCK(對照)、轉(zhuǎn)BSMV:GFP株系、轉(zhuǎn)BSMV:SPXdm株系、轉(zhuǎn)BSMV:3UTR株系接種BSMV病毒混合液，培養(yǎng)20天后開始接種條銹菌小種CYR31。具體步驟如下：將待接種的小麥苗放到接種桶內(nèi)，用0.1％(體積百分含量)的Toween20溶液將小麥苗及接種桶周圍均勻噴濕，然后進行CYR31小種的掃抹接種，之后再用0.1％的Toween20均勻噴濕，用塑料紙將桶口封嚴(yán)保濕。接種后，幼苗進行低溫(10℃)黑暗處理24h，以保證條銹菌的成功侵染。第二天再移至人工氣候室生長，白天溫度為15-18℃，晚上11-14℃，濕度為80％左右，光照強度為6000Lux，光照時間為16h/d。15天后觀察表型。

結(jié)果如圖3所：接種和反應(yīng)型分級標(biāo)準(zhǔn)按Li and Shang描述的方法(Li ZQ,Shang HS.(1989).Wheat rusts and their control.Shanghai Science and Technology Press,Shanghai,China.)，0-2級為抗病，3-4級為感病。轉(zhuǎn)BSMV:SPXdm株系和轉(zhuǎn)BSMV:3UTR株系接種條銹菌CYR31后，小麥葉片上出現(xiàn)許多條銹菌孢子堆(3級)，而MOCK(對照)和轉(zhuǎn)BSMV:GFP株系上則出現(xiàn)了許多壞死斑(0級)，產(chǎn)生了超敏反應(yīng)(HR)，MOCK(對照)和轉(zhuǎn)BSMV:GFP株系的條銹病的抗性高于轉(zhuǎn)BSMV:SPXdm株系和轉(zhuǎn)BSMV:3UTR株系。上述結(jié)果說明，TaSPX-MFS參與了小麥對條銹病原菌CYR31的抗性過程。

2、菌絲的形態(tài)觀察

為了更好地理解TaSPX-MFS參與小偃54高溫誘導(dǎo)抗條銹性的植物病理組織學(xué)機制，利用熒光顯微鏡對接種CYR314天后的MOCK(對照)、轉(zhuǎn)BSMV:GFP株系、轉(zhuǎn)BSMV:SPXdm株系、轉(zhuǎn)BSMV:3UTR株系葉片材料中條銹菌的生長擴展情況和寄主葉肉細胞反應(yīng)進行了觀察，并對菌絲長度進行了統(tǒng)計。研究材料為接菌4天的葉片，葉片處理參照“Wang CF,Huang LL,Buchenauer H,Han QM,Zhang HC,Kang ZS.(2007)Histochemical stidies on the accumulation of reactive oxygen species(O2-and H2O2)in the incompatible and compatible interaction of wheat-Puccinia striiformis f.sp.tritici.Physiol.& Mol.Plant Pathol.,71:230-239”中的方法。具體步驟如下：

剪取的2厘米長的葉段放入95％的乙醇溶液中固定、脫色，觀察前轉(zhuǎn)到飽和水合氯醛溶液中過夜。隨后，在50％甘油溶液中保存。觀察與統(tǒng)計方法參照“Wang XJ,Tang CL,Zhang HC,Xu JR,Liu B,Lv J,Han DJ,Huang LL,Kang ZS.(2011)TaDAD2,a negative regulator of programmed cell death,is important for the interaction between wheat and the stripe rust fungus.Mol.Plant Microbe Interact.,24:79-90”中的方法。脫色后的葉段用Olympus BX-51微分干涉差顯微鏡(differential interference contrast microscope,DIC)對條銹菌侵染點和入侵菌絲的長度進行觀察，記錄。利用熒光顯微鏡觀察壞死葉肉細胞的自發(fā)熒光，并記錄壞死點面積。

結(jié)果如圖4所示：在轉(zhuǎn)BSMV:SPXdm株系、轉(zhuǎn)BSMV:3UTR株系的葉肉細胞壞死很少，沒有限制條銹菌絲的擴展，條銹菌產(chǎn)生了次生菌絲(圖4-c,d)，菌絲長度顯著長于MOCK(對照)、轉(zhuǎn)BSMV:GFP株系中菌絲的長度(圖4-e)。在MOCK(對照)、轉(zhuǎn)BSMV:GFP株系葉片中，條銹菌絲較短，在與初生菌絲接觸的位點，寄主葉肉細胞產(chǎn)生壞死，限制了菌絲的擴展(圖4-a,b)。