本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種功能蛋白POX08415及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：絲狀真菌可以將木質(zhì)纖維素類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為微生物可發(fā)酵的糖類，進一步發(fā)酵生產(chǎn)可增加附加值的生物液體燃料和生物基化學(xué)品。木質(zhì)纖維素類物質(zhì)是世界上含量最多，分布最廣泛的可再生生物資源(Kuhad，RC.，Singh，A.，Eriksson，KEL.Microorganismsandenzymesinvolvedinthedegradationofplantfibercellwalls[M].Biotechnologyinthepulpandpaperindustry.SpringerBerlinHeidelberg1997，45-125)，一直被認(rèn)為是最合適的解決能源危機的原料。天然絲狀真菌產(chǎn)纖維素酶量非常低，是限制木質(zhì)纖維素生物煉制產(chǎn)業(yè)化的最主要因素之一。遺傳工程技術(shù)可以有效的提高絲狀真菌的纖維素酶產(chǎn)量。對絲狀真菌的纖維素酶基因的表達(dá)調(diào)控機理研究可為遺傳工程技術(shù)改造絲狀真菌以提高酶產(chǎn)量提供理論指導(dǎo)，具有潛在的應(yīng)用價值。纖維素酶是一種將纖維素水解為葡萄糖的復(fù)合酶系，主要分為三類酶：內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，簡寫為EG)、外切葡聚糖酶[exo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91，又叫纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)，簡寫為CBH]和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21，簡寫為BGL)(Lynd，LR，Weimer，PJ，vanZyl，WH，Pretorius，IS.Microbialcelluloseutilization：fundamentalsandbiotechnology[J].MicrobiolMolBiolR2002，66(3)：506-577；Glass，NL.，Schmoll，M.，Cate，JH.，Coradetti，S.Plantcellwalldeconstructionbyascomycetefungi[J].AnnuRevMicrobiol2013，67：477-498)。EG作用于纖維素鏈分子內(nèi)部，隨機水解纖維素分子內(nèi)的β-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生短的纖維素鏈或可溶性纖維寡糖，暴露出新的纖維素鏈末端。CBH沿著纖維素鏈末端由外向里水解β-1，4-糖苷鍵，釋放纖維二糖。BGL將上述產(chǎn)生的纖維寡糖和纖維二糖水解成葡萄糖。通過這三種酶的協(xié)同作用，纖維素酶將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，葡萄糖可以被微生物利用產(chǎn)生生物化學(xué)品如被釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精(Wang，J.，Quirk，A.，Lipkowski，J.，Dutcher，J.R.，Clarke，A.J.Directinsituobservationofsynergismbetweencellulolyticenzymesduringthebiodegradationofcrystallinecellulosefibers[J].Langmuir2013，29(48)：14997-15005；Zhang，Y.H.P.，Himmel，M.E.，Mielenz，J.R.Outlookforcellulaseimprovement：screeningandselectionstrategies[J].BiotechnolAdv2006，24(5)：452-481；Dashtban，M.，Schraft，H.，Qin，W.Fungalbioconversionoflignocellulosicresidues：opportunityandperspectives[J].IntJBiolSci2009，5(6)：578-595)。目前，一些絲狀真菌纖維素酶和木聚糖酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子已被鑒定，主要集中在曲霉、木霉、青霉和粗糙脈胞菌中。例如，黑曲霉中的XlnR(Raulo，R.，Kokolski，M.，Archer，DB.TherolesofthezincfingertranscriptionfactorsXlnR，ClrAandClrBinthebreakdownoflignocellulosebyAspergillusniger.AMBexpress2016，6(1)：5)；里氏木霉中的Crel(Portnoy，T.，Margeot，A.，Linke，R.，Atanasova，L.，F(xiàn)ekete，E.，Sándor，E.，Hartl，L.，Karaffa，L.，Druzhinina，IS.，Seiboth，B.，LeCrom，S.，Kubicek，CP.TheCRE1carboncataboliterepressorofthefungusTrichodermareesei：amasterregulatorofcarbonassimilation[J].BMCgenomics，2011，12：269)、Xyr1(Lichius，A.，Bidard，F(xiàn).，Buchholz，F(xiàn).，LeCrom，S.，Martin，J.，Schackwitz，W.，Austerlitz，T.，Grigoriev，I.V.，Baker，S.E.，Margeot，A.，Seiboth，B.，Kubicek，C.P.GenomesequencingoftheTrichodermareeseiQM9136mutant1dentifiesatruncationofthetranscriptionalregulatorXYR1asthecauseforitscellulase-negativephenotype[J].BMCGenomics2015，16：326)和Acel(Saloheimo，A.，Aro，N.，Ilmén，M.，M.Isolationoftheace1geneencodingaCys2-His2transcriptionfactorinvolvedinregulationofactivityofthecellulasepromotorcbh1ofTrichodermareesei.JBioChem2000，275(8)：5817-5825)；粗糙脈胞菌中的Clr1和Clr2(Coradetti，ST.，Craig，J.P.，Xiong，Y.，Shock，T.，Tian，C.G.，Glass，N.L.Conservedandessentialtranscriptionfactorsforcellulasegeneexpressioninascomycetefungi[J].PNatlAcadSciUSA2012，109(19)：7397-7402)，以及草酸青霉中的ClrB和CreA(Li，H.，Yao，G.，Wu，R.，Gao，L.，Kan，Q.，Liu，M.，Yang，P.，Liu，G.，Qin，Y.，Song，X.，Zhong，Y.，F(xiàn)ang，X.，Qu，Y.Synergisticanddose-controlledregulationofcellulasegeneexpressioninPenicilliumoxalicum[J].PLoSGenet2015，11：el005509)。基于鑒定的真菌調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建的基因工程菌株比野生型菌株明顯提高了纖維素酶的產(chǎn)量。例如，Yao等遺傳改造草酸青霉菌株114-2，通過缺失creA和bgl2，過量表達(dá)clrB，構(gòu)建突變株RE-10。菌株RE-10的纖維素酶產(chǎn)量比野生型的提高了20倍(Yao，G.，Li，Z.，Gao，L.，Wu，R.，Kan，Q.，Liu，G.，Qu，Y.RedesigningtheregulatorypathwaytoenhancecellulaseproductioninPenicilliumoxalicum[J].BiotechnolBiofuel2015，8：71)。但是，真菌纖維素酶的產(chǎn)量仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足木質(zhì)纖維素工業(yè)規(guī)模生物煉制的需求。近年來，研究發(fā)現(xiàn)草酸青霉可以產(chǎn)生完整的纖維素酶系及高活力的β-葡萄糖苷酶(Gusakov，AV.AlternativestoTrichodermareeseiinbiofuelproduction[J].TrendsBiotechnol2011，29(9)：419-425；Yao，G.S.，Li，Z.H.，Gao，L.W.，Wu，R.M.，Kan，Q.B.，Liu，G.D.，Qu，Y.B.RedesiginingtheregulatorypathwaytoenhancecellulaseproductioninPenicilliumoxalicum[J].BiotechnolBiofuel2015，8：71；Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，Xie，S.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，F(xiàn)eng，J.X.Comparativegenomic，transcriptomicandsecretomicprofilingofPenicilliumoxalicumHP71anditscellulaseandxylanasehyperproducingmutantEU2106，andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression.BiotechnolBiofuel2016，9：203)，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用。因此，鑒定草酸青霉中更多的、新的關(guān)鍵纖維素酶和木聚糖酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子具有潛在的應(yīng)用價值。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種功能蛋白POX08415及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自草酸青霉，命名為POX08415蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列1由494個氨基酸殘基組成，自N端第33-309位氨基酸殘基為GREB1功能域；第428-478位氨基酸殘基為ZnF-GATA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有四個半胱氨酸殘基，結(jié)合鋅離子后，可與DNA結(jié)合。為了使(a1)中的POX08415蛋白便于純化和檢測，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPolv-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(a2)中的POX08415蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達(dá)得到。上述(a2)中的POX08415蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述POX08415蛋白的基因(POX08415基因)也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因具體可為如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：(1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子；(2)序列表的序列3所示的DNA分子；(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼所述POX08415蛋白的DNA分子；(4)與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼所述POX08415蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。序列表的序列2是POX08415基因的CDS序列，由1485個堿基組成。序列表的序列3是POX08415基因的基因組DNA序列，自5′端的第29-130位堿基為POX08415基因的第一個內(nèi)含子，第1053-1349位堿基為POX08415基因的第二個內(nèi)含子，第1670-1755位為POX08415基因的第三個內(nèi)含子。含有所述POX08415基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還保護所述POX08415蛋白或POX08415基因的應(yīng)用，為如下(b1)-(b14)中的至少一種：(b1)調(diào)控微生物纖維素酶產(chǎn)量；(b2)調(diào)控微生物半纖維素酶產(chǎn)量；(b3)調(diào)控微生物羧甲基纖維素酶產(chǎn)量；(b4)調(diào)控微生物外切纖維素酶產(chǎn)量；(b5)調(diào)控微生物木聚糖酶產(chǎn)量；(b6)調(diào)控微生物β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量；(b7)調(diào)控微生物纖維素酶基因的表達(dá)量；(b8)調(diào)控微生物半纖維素酶基因的表達(dá)量；(b9)調(diào)控微生物內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因的表達(dá)量；(b10)調(diào)控微生物纖維二糖水解酶基因的表達(dá)量；(b11)調(diào)控微生物β-葡萄糖苷酶基因的表達(dá)量；(b12)調(diào)控微生物木聚糖酶基因的表達(dá)量；(b13)調(diào)控微生物纖維素酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)量；(b14)調(diào)控微生物木聚糖酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)量。所述(b1)-(b5)中，所述調(diào)控為正向調(diào)控；所述(b6)中，所述調(diào)控為負(fù)向調(diào)控。所述纖維素酶基因具體可為POX05587、POX04786、POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983、POX07535或POX06835。所述纖維二糖水解酶基因具體可為POX05587或POX04786。所述內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因具體可為POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983或POX07535。所述β-葡萄糖苷酶基因具體可為POX06835。所述半纖維素酶基因具體可為POX05916、POX06783或POX08484。所述木聚糖酶基因具體可為POX05916、POX06783或POX08484。所述纖維素酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子或所述木聚糖酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子具體可為PoxBrlA和PoxFlbD。本發(fā)明還保護一種抑制微生物生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力的方法，包括如下步驟：抑制所述微生物中POX08415基因的表達(dá)，得到生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力降低的微生物。本發(fā)明還保護一種抑制微生物生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力的方法，包括如下步驟：降低POX08415蛋白的表達(dá)量和/或活性，得到生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力降低的微生物。所述“抑制所述微生物中POX08415基因的表達(dá)”是通過向所述微生物中導(dǎo)入POX08415基因敲除盒實現(xiàn)的。本發(fā)明還保護一種制備重組微生物的方法，包括如下步驟：將抑制POX08415基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入出發(fā)微生物，得到生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力低于所述出發(fā)微生物的重組微生物。所述抑制POX08415基因表達(dá)的物質(zhì)具體可為POX08415基因敲除盒。所述抑制POX08415基因表達(dá)的物質(zhì)還可為干擾載體；所述干擾載體為含有POX08415基因敲除盒的重組載體。以上任一所述POX08415基因敲除盒具體為序列表的序列4所示的DNA分子。以上任一所述微生物或所述出發(fā)微生物可為青霉，具體可為草酸青霉，更具體可為草酸青霉HP7-1。以上任一所述微生物或所述出發(fā)微生物更具體可為以草酸青霉HP7-1為出發(fā)菌，敲除其Ku70基因得到的重組菌。以上任一所述微生物或所述出發(fā)微生物更具體可為草酸青霉Ku70基因敲除突變體ΔPoxKu70。本發(fā)明還保護采用以上任一所述方法制備得到的重組微生物。所述重組微生物具體可為實施例中的ΔPOX08415-1，又稱為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)ΔPOXO8415，已于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；郵編：100101)，保藏編號為CGMCCNO.12966。本發(fā)明通過同源重組的方法敲除草酸青霉突變體ΔPoxKu70中的POX08415基因(將所有敲除POX08415基因的重組菌均命名為突變株ΔPOX08415)。突變株ΔPOX08415具有如下特點：(1)在葡萄糖培養(yǎng)條件下，突變株ΔPOX08415能夠正常生長。(2)在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突變株ΔPOX08415的濾紙酶活力、羧甲基纖維素酶活力、pNPC酶活力、木聚糖酶活力均顯著降低。(3)在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突變株ΔPOX08415的pNPG酶活力顯著升高。(4)在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突變株ΔPOX08415中纖維素酶基因和木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低/升高。(5)在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突變株ΔPOX08415中已知關(guān)鍵纖維素酶基因和木聚糖酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。本發(fā)明提供了一種草酸青霉的功能蛋白POX08415，通過實驗證明POX08415在調(diào)控纖維素酶和木聚糖酶基因的表達(dá)過程中起關(guān)鍵性作用，在提高纖維素酶產(chǎn)量中具有應(yīng)用潛力。附圖說明圖1為構(gòu)建POX08415基因敲除盒的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖2為POX08415基因敲除盒的元件示意圖。圖3為突變株ΔPOX08415的PCR驗證電泳圖。圖4為突變株ΔPOX08415的Southern雜交驗證圖。圖5為突變株ΔPoxKu70和ΔPOX08415-1在葡萄糖培養(yǎng)條件下的生物量檢測結(jié)果。圖6為突變株ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9的濾紙酶產(chǎn)量檢測結(jié)果。圖7為突變株ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9的羧甲基纖維素酶產(chǎn)量檢測結(jié)果。圖8為突變株ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9的外切葡聚糖酶產(chǎn)量檢測結(jié)果。圖9為突變株ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9的木聚糖酶產(chǎn)量檢測結(jié)果。圖10為突變株ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量檢測結(jié)果。圖11為突變株ΔPOX08415相對ΔPoxKu70在Avicel誘導(dǎo)條件下不同纖維素酶和木聚糖酶基因的RT-PCR檢測結(jié)果。圖12為突變株ΔPOX08415相對ΔPoxKu70在Avicel誘導(dǎo)條件下已知轉(zhuǎn)錄因子PoxFlrD和PoxBrlA編碼基因的RT-PCR檢測結(jié)果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。質(zhì)粒pCPXG418：參考文獻：Chen，M.M.，JiangM.G.，Shang，J.J.，Lan，X.W.，YangF.，Huang，J.K.，Nuss，D.L.，Chen，B.S.CYP1，ahypovirus-regulatedcyclophilin，isrequiredforvirulenceinthechestnutblightfungus[J].MolPlantPathol2011，12(3)：239-246；質(zhì)粒pCPXG418在文獻中的名稱為“transformationvectorpCPXG418”，公眾可以從廣西大學(xué)獲得。DNA純化試劑盒：天根生化科技有限公司，貨號：DP214。溶菌酶：索萊寶公司，貨號：L8120。蝸牛酶：索萊寶公司，貨號：S8280。裂解酶：Sigma公司，貨號：L1412-5G。PDA培養(yǎng)基：BD公司，貨號：5056836。再生培養(yǎng)基：酸水解酪蛋白1.0g、酵母提取物1.0g、蔗糖342.0g、瓊脂17.0g，蒸餾水定容至1L，115℃滅菌20分鐘?；九囵B(yǎng)基：KH2PO44.0g、(NH4)2SO44.0g、MgSO4·7H2O0.6g、CaCl20.6g、FeSO4·7H2O0.005g、MnSO40.0016g、ZnCl20.0017g、CoCl20.002g、Tween801.0g，蒸餾水定容至1L，pH5.5；115℃滅菌20分鐘。葡萄糖液體培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中加入葡萄糖，葡萄糖在培養(yǎng)基中的終濃度為10g/L。Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中加入微晶纖維素(Avicel)，Avicel在培養(yǎng)基中的終濃度為20g/L。CM培養(yǎng)基：20×硝酸鹽50mL、微量元素混合液1mL、葡萄糖10.0g、蛋白胨2.0g、酵母提取物1.0g、酸水解酪蛋白1.0g，調(diào)pH至6.5；115℃滅菌20分鐘。20×硝酸鹽：NaNO3120g、KCl10.4g、MgSO4.7H2O10.4g、KH2PO430.4g，蒸餾水定容至1L；高壓滅菌后室溫保存。微量元素混合液：ZnSO4.7H2O2.2g、H3BO31.1g、MnCl2.4H2O0.5g、FeSO4.7H2O0.5g、CoCl2.6H2O0.17g、CuSO4.5H2O0.16g、Na2MoO4.2H2O0.15g、Na4EDTA5.0g，蒸餾水定容至100mL。酶解液：溶菌酶0.2g、蝸牛酶0.3g、裂解酶0.3g，溶于50mLOM溶液中；28℃，180rpm震蕩30分鐘后離心，將上清液過濾除菌，得到酶解液。OM溶液：MgSO4.7H2O73.92g、NaH2PO40.3g，溶于400mL去離子水；用1MNa2HPO4水溶液調(diào)節(jié)pH至5.8，蒸餾水定容至500mL。Trappingbuffer溶液：山梨醇36.4g、Tris6.05g，溶于400mL去離子水中，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，蒸餾水定容至500mL。STC溶液：山梨醇91g、Tris6g、CaCl25.55g，溶于400mL去離子水中，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，蒸餾水定容至500mL。PTC溶液：聚乙二醇335040g、Tris3g、CaCl22.25g，溶于200mL去離子水中，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，蒸餾水定容至250mL。0.1％吐溫80溶液：由吐溫80和水組成，吐溫80的體積百分含量為0.1％。實施例1、草酸青霉中功能蛋白POX08415及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)經(jīng)過對草酸青霉(Penicilliumoxalicum)菌株HP7-1的基因組及其在不同培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)錄組進行大量分析和功能驗證，發(fā)現(xiàn)了一個新蛋白及其編碼基因。草酸青霉菌株HP7-1的基因組序列分析的文獻如下：Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，XieS.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，F(xiàn)eng，J.X.Comparativegenomic，transcriptomicandsecretomicprofilingofPenicilliumoxalicumHP7-1anditscellulaseandxylanasehyper-producingmutantEU2106，andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression[J].BiotechnolBiofuel2016，9：203；草酸青霉菌株HP7-1在文獻中的名稱為“PenicilliumoxalicumstrainHP7-1”。草酸青霉菌株HP7-1保藏號為：CGMCC10781，公眾也可以從廣西大學(xué)獲得。將序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)命名為POX08415，由494個氨基酸殘基組成。將編碼POX08415的基因命名為POX08415基因，POX08415基因的CDS序列如序列表的序列2所示。POX08415基因的基因組DNA如序列表的序列3所示。實施例2、POX08415基因敲除盒的構(gòu)建1、提取草酸青霉菌株HP7-1的基因組DNA。2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用引物POX08415_left-arm-F和引物POX08415_left-arm-R組成的引物對進行PCR擴增，得到POX08415基因ORF上游的2850bpDNA片段(電泳結(jié)果見圖1的泳道1)，稱為POX08415左臂。POX08415_left-arm-F：5’-AGTGCCGATGTCGTCCTGTTCTC-3’；POX08415_left-arm-R：5’-GGTAATCCTTCTTTCTAGAATCGACGATCGGCGATTTGG-3’。3、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用引物POX08415_right-arm-F和引物POX08415_right-arm-R組成的引物對進行PCR擴增，得到POX08415基因ORF下游的3602bpDNA片段(電泳結(jié)果見圖1的泳道2)，稱為POX08415右臂。POX08415_right-arm-F：5’-CAATATCATCTTCTGTCGACTTTTGTCGATTTTGTTTCACTTTTCTTC-3’；POX08415_right-arm-R：5’-CTCGGATAGACAAGAAATAAGC-3’。4、以質(zhì)粒pCPXG418為模板，采用引物G418-F和引物G418-R組成的引物對進行PCR擴增，得到抗生素G418抗性基因的編碼序列(1890bp)(電泳結(jié)果見圖1的泳道3)。G418-F：5’-TCTAGAAAGAAGGATTACCTCTAAA-3’；G418-R：5’-GTCGACAGAAGATGATATTGAAG-3’。5、將步驟2、步驟3和步驟4得到的三個PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化，然后按照摩爾比1∶1∶1混合后，進行融合PCR擴增，得到PCR混合產(chǎn)物。融合PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性98℃3min；98℃30s，58℃15s，72℃2min，一共進行15個循環(huán)反應(yīng)；72℃10min。6、以步驟5得到的PCR混合產(chǎn)物為模板，采用引物POX08415_Nest-F和引物POX08415_Nest-R組成的引物對進行PCR擴增，得到5190bpPCR產(chǎn)物(電泳結(jié)果見圖1的泳道4)。POX08415_Nest-F：5’-CCGCCGTCTCATCCTCA-3’；POX08415_Nest-R：5’-GACCCAAACATACTGCTTCCA-3’。經(jīng)測序，得到的PCR產(chǎn)物如序列表的序列4所示。將序列表的序列4所示的DNA分子命名為POX08415基因敲除盒。序列4中，自5’端第1-1706位核苷酸為POX08415左臂區(qū)段，第1707-3596位核苷酸為G418抗性基因區(qū)段，第3597-5190位核苷酸為POX08415右臂區(qū)段。POX08415基因敲除盒的元件示意圖見圖2。實際應(yīng)用中，也可以直接人工合成序列4所示DNA分子。實施例3、草酸青霉POX08415基因缺失突變株ΔPOX08415的構(gòu)建與驗證1、以草酸青霉菌株HP7-1為出發(fā)菌，敲除其Ku70基因，得到草酸青霉突變體ΔPoxKu70。記載草酸青霉突變體ΔPoxKu70，以及敲除Ku70基因的具體步驟的文獻如下：Zhao，S.，Yan，Y.S.，He，Q.P.，Yang，L.，Yin，X.，Li，C.X.，Mao，L.C.，Liao，L.S.，Huang，J.Q.，XieS.B.，Nong，Q.D.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，Y.R.，Duan，C.J.，Liu，J.L.，F(xiàn)eng，J.X.Comparativegenomic，transcriptomicandsecretomicprofilingofPenicilliumoxalicumHP7-1anditscellulaseandxylanasehyper-producingmutantEU2106，andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression[J].BiotechnolBiofuel2016，9：203；草酸青霉突變體ΔPoxKu70在文獻中的名稱為“PenicilliumoxalicummutantΔPoxKu70”。草酸青霉突變體ΔPoxKu70保藏號為：CGMCC3.15650，公眾也可從廣西大學(xué)獲得。2、制備草酸青霉突變體ΔPoxKu70的原生質(zhì)體(1)將步驟1得到的草酸青霉突變體ΔPoxKu70接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃靜置培養(yǎng)6天后，用0.1％吐溫80溶液將平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液(1×108個孢子/mL)。(2)取2mL步驟(1)的孢子懸浮液，接種至200mLCM培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)8小時。(3)完成步驟(2)后，4℃、3500rpm離心，收集菌絲，用0.6MMgSO4水溶液洗滌2次。(4)取(3)得到的菌絲，用酶解液重懸，28℃、180rpm振蕩反應(yīng)2-3小時以進行酶解；用顯微鏡觀察到大部分菌絲形成原生質(zhì)體后，按每管12.5mL分裝到50mL離心管中，加入2倍體積的Trappingbuffer溶液，4℃、3500rpm離心30分鐘，觀察到明顯的分層現(xiàn)象。(5)用巴氏吸管小心地吸出步驟(4)中間層的原生質(zhì)體至新的50mL離心管中，加入2倍體積1M山梨醇水溶液漂洗2次，4℃、3500rpm離心15分鐘，再使用20mLSTC溶液漂洗2次后離心，棄上清，得到原生質(zhì)體。3、草酸青霉突變株ΔPOX08415的構(gòu)建及驗證(1)將4體積份的STC溶液和1體積份的PTC溶液混合，得到混合液，用混合液重懸步驟2得到的原生質(zhì)體，得到原生質(zhì)體溶液(調(diào)整濃度為1×107個/mL)。(2)用實施例2得到的POX08415基因敲除盒DNA轉(zhuǎn)化ΔPoxKu70原生質(zhì)體(方法參照文獻：Churchill，A.C.L.，Ciuffetti，L.M.，Hansen，D.R.，VanEtten，H.D.，VanAlfen，N.K.TransformationofthefungalpathogenCryphonectriaparasiticawithavarietyofheterologousplasmids[J].CurrGenetics1990，17：25-31)，具體步驟如下：①將5μgPOX08415敲除盒DNA和1μL100mM亞精胺溶液混合后加入到100μL步驟(1)制備的原生質(zhì)體溶液中，混合均勻，冰上反應(yīng)30分鐘；②反應(yīng)結(jié)束后向溶液中加入1mLPTC溶液，混合均勻，室溫放置25分鐘；③向混合液中加入2mLSTC溶液混合均勻，將混合液加入到30mL預(yù)熱的再生培養(yǎng)基中，混合均勻，將上述混合液倒入到無菌培養(yǎng)皿中(按每個培養(yǎng)皿分別倒入2-5mL)；待完全凝固后，室溫放置30分鐘，加入40mL含有G418(800μg/mL)與潮霉素(250μg/mL)的PDA培養(yǎng)基，覆蓋在再生培養(yǎng)基的表面，完全凝固后28℃倒置培養(yǎng)5天。④將步驟③的轉(zhuǎn)化雙層板的孢子用0.1％吐溫80溶液沖洗，放入到新的離心管中，用無菌水梯度稀釋孢子懸浮液，將每個稀釋梯度的孢子懸浮液涂在兩個含有G418(800μg/mL)與潮霉素(250μg/mL)的PDA平板上，28℃培養(yǎng)4天，挑選單菌落，隨機選取三個候選突變株(Δ1、Δ5和Δ9)，提取各候選突變株基因組DNA，采用引物POX08415基因F和引物POX08415基因R、引物POX08415-left-arm-F和G418抗性基因交叉驗證下游引物、G418抗性基因交叉驗證上游引物和引物POX08415-right-arm-R進行PCR驗證。POX08415基因F：5’-GCGTGTTCTGCGTGTCA-3’；POX08415基因R：5’-TTGCGAGTCAGTTTAGCG-3’G418抗性基因交叉驗證上游引物：5’-CGCTACTGCTTACAAGTGGGCTGAT-3’；G418抗性基因交叉驗證下游引物：5’-GTGAATGCTCCGTAACACCCAAT-3’。結(jié)果如圖3所示。圖3中，泳道M為1kbDNAMarker，泳道1為Δ1的鑒定結(jié)果，泳道2為Δ5的鑒定結(jié)果，泳道3為Δ9的鑒定結(jié)果，泳道4為突變體ΔPoxKu70對照，泳道5為ddH2O陰性對照。圖3A為用引物POX08415基因F和引物POX08415基因R擴增得到的擴增產(chǎn)物；圖3B為用引物POX08415-left-arm-F和G418抗性基因交叉驗證下游引物擴增得到的擴增產(chǎn)物；圖3C為用G418抗性基因交叉驗證上游引物和引物POX08415-right-arm-R擴增得到的擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，Δ1、Δ5和Δ9不能擴增出POX08415基因片段，而突變體ΔPoxKu70可以擴增出727bp的POX08415基因片段(圖3A)。同時，Δ1、Δ5和Δ9都擴增出2968bp的左臂DNA片段(圖3B)和3775bp的右臂DNA片段(圖3C)，而突變體ΔPoxKu70沒有G418抗性基因的存在，不能擴增出左臂和右臂基因片段(圖3B、圖3C)。上述結(jié)果表明菌株Δ1、Δ5和Δ9中POX08415基因已被敲除。⑤提取三個候選突變株(Δ1、Δ5和Δ9)和突變體ΔPoxKu70的基因組DNA，將基因組DNA用EcoRI酶切后進行Southern雜交分析，結(jié)果如圖4所示。圖4中，泳道M為1kbDNAMarker，泳道1為突變體ΔPoxKu70的對照，泳道2為Δ1的鑒定結(jié)果，泳道3為Δ5的鑒定結(jié)果，泳道4為Δ9的鑒定結(jié)果。結(jié)果表明，Δ1、Δ5和Δ9均得到大小為3346bp的雜交帶，突變體ΔPoxKu70得到1462bp的雜交帶，與預(yù)計結(jié)果一致，表明Δ1、Δ5和Δ9中POX08415基因已被敲除。以上結(jié)果表明，將POX08415基因敲除盒導(dǎo)入草酸青霉突變體ΔPoxKu70得到的三個轉(zhuǎn)化子(Δ1、Δ5和Δ9)均為POX08415基因被敲除的突變菌株，分別命名為ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9。將敲除POX08415基因的該3個突變菌株均命名為突變株ΔPOX08415。實施例4、草酸青霉突變株ΔPOX08415在葡萄糖液體培養(yǎng)基中生物量的測定待測菌株為：ΔPOX08415-1和ΔPoxKu70。1、將待測菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃靜置培養(yǎng)6天。2、完成步驟1后，用0.1％吐溫80溶液將PDA平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液(1×108個孢子/mL)。3、將1mL步驟2得到的孢子懸浮液接種至100mL葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)60小時。分別于培養(yǎng)的第12小時、24小時、36小時、48小時和60小時收集培養(yǎng)體系中的所有菌絲體，50℃烘干至恒重，測定生物量(菌絲體干重)。結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，ΔPOX08415-1在葡萄糖液體培養(yǎng)基中的生物量與ΔPoxKu70菌株的生物量沒有顯著差異，表明菌株ΔPoxKu70中POX08415基因的敲除不影響草酸青霉的基本代謝，ΔPOX08415-1能利用葡萄糖正常生長。實施例5、草酸青霉突變株ΔPOX08415纖維素酶和木聚糖酶活力的測定待測菌株為：ΔPoxKu70、ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9。1、將待測菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃靜置培養(yǎng)6天。2、完成步驟1后，用0.1％吐溫80溶液將平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液(1×108個孢子/mL)。3、將1mL步驟2得到的孢子懸浮液接種至100mL葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)24小時，離心收集菌體，用無菌水洗滌2-3次。4、取步驟3得到的菌體(濕重為1g)，轉(zhuǎn)接到100mLAvicel誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)4天。分別于培養(yǎng)的第2天、3天和第4天取樣，8000rpm離心10min，收集上清液，即為粗酶液。5、檢測步驟4得到的粗酶液的如下各項酶活：濾紙酶活力、羧甲基纖維素酶活力(CMC酶活力)、外切纖維素酶活力(pNPC酶活力)、β-葡萄糖苷酶活力(pNPG酶活力)和木聚糖酶活力。檢測方法參照文獻：Ghose，T.K.Measurementofcellulaseactivities[J].PureandAppliedChemistry1959，(59)：257-268；Gokhale，D.V.，Puntambekar，U.S.，Deobagkar，D.N.，Peberby，J.F.ProductionofcellulolyticenzymesbymutantsofAspergillusnigerNCIM1207[J].EnzymeMicrobialTechnol1988.10：442-445。6.提取步驟4得到的菌體中的胞內(nèi)蛋白。方法參照以下步驟：①將步驟4得到菌體放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮迅速研磨成粉末。②將步驟①得到的粉末轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加入15mL蛋白提取液，再加入5g直徑為0.25mm以及1g直徑為3mm的玻璃珠。③將步驟②的混合液在旋渦振蕩器上振蕩1min，再放置冰上30s。重復(fù)8-10次。④將步驟③得到的混合液在7000rpm，4℃，離心20min，收集上清液，即為菌體胞內(nèi)蛋白。胞內(nèi)蛋白濃度檢測方法參照文獻：Zor，T.，Selinger，Z.LinearizationoftheBradfordproteinassayincreaseitssensitivity：theoreticalandexperimentalstudies[J].AnalBiochem1996，236：302-308。草酸青霉菌株酶產(chǎn)量(U/g胞內(nèi)蛋白)＝酶活力(U)/胞內(nèi)蛋白(g)。結(jié)果如圖6-圖10所示。與ΔPoxKu70相比，三株突變株(ΔPOX08415-1、ΔPOX08415-5和ΔPOX08415-9)的濾紙酶產(chǎn)量、羧甲基纖維素酶產(chǎn)量、外切纖維素酶產(chǎn)量和木聚糖酶產(chǎn)量均顯著降低(圖6-圖9)，說明POX08415為菌株生產(chǎn)濾紙酶、羧甲基纖維素酶、外切纖維素酶和木聚糖酶的正調(diào)控蛋白；相反，與ΔPoxKu70相比，三株突變株β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量顯著升高(圖10)，說明POX08415為菌株生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的負(fù)調(diào)控蛋白。實施例6、POX08415基因的缺失對草酸青霉纖維素酶基因和其它已知調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的影響待測菌株為：ΔPOX08415-1和ΔPoxKu70。1、將待測菌株接種于無菌PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)6天。2、用0.1％吐溫80溶液將PDA平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液并將濃度調(diào)整到1×108個/mL。3、將1mL步驟2得到的孢子懸浮液接種至100mL葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm培養(yǎng)24小時，收集菌絲體；將菌絲體轉(zhuǎn)接至100mLAvicel誘導(dǎo)培養(yǎng)基，28℃、180rpm培養(yǎng)。分別收集、提取誘導(dǎo)培養(yǎng)第4小時、第12小時、第24小時、第48小時的待測菌株總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進行定量RT-PCR檢測，檢測關(guān)鍵纖維素酶基因(2個CBH基因：POX05587和POX04786；7個EG基因：POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983和POX07535；1個BGL基因：POX06835)和木聚糖酶基因(3個XYN基因：POX05916、POX06783和POX08484)的表達(dá)情況。采用actin基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR檢測引物如下所示(5’→3’)：actin-F：CTCCATCCAGGCCGTTCTG；actin-R：CATGAGGTAGTCGGTCAAGTCAC；POX05587-F：GTACTTGCGATCCTGATGGG；POX05587-R：CCACGGTGAAGGGAGACTTG；POX04786-F：TACTACGCTTCCGAGGTTCAGAGPOX04786-R：GTGTCCAGCCAAACGAAGG；POX01166-F：CGATACTACGGCAACATCATCAC；POX01166-R：AGGCACCAGTCCACGAGTTT；POX07535-F：CGACTACTTGACCCAGCACCA；POX07535-R：CTAGTACACGCTCGCAGACCA；POX06983-F：GATCAACCACCAGGGTCTCAA；POX06983-R：CAAACAACAGCCACGGAGTAAG；POX06147-F：CACAATTACGCTCGCTGGAA；POX06147-R：GGCTCGTTCATCACACCAAA；POX02740-F：GTTCAGTTCCTGATGGAAAGATTG；POX02740-R：CATAACCGCCTGCTTGAGTG；POX0413_7-F：CGGCACTCTCGGCAAGGATTA；POX0413_7-R：CATCAGGAAGGGGACACGGAA；POX05571-F：AACCTGGAAGAACGGCACC；POX05571-R：CCTTGTCACAGTCATCGGAGC；POX06835-F：GTGCTGGATGGGAACAGGA；POX06835-R：TACGAACGCCGAGAGGAGA；POX08484-F：ACAAGCACACGCAGGTCAA；POX08484-R：CGCTGAAGTGGTTGGCAGT；POX06783-F：TGAGCCCAGGACCATCAACTT；POX06783-R：TACCCTTGCTTTTGCCGCC：POX05916-F：ATCGAGAATCAGGGCACAAAG；POX05916-R：ATCCGCCAACGAAGGTGT。結(jié)果如圖11所示，其中差異表達(dá)量表示的是突變株ΔPOX08415-1中纖維素酶基因或木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄水平減去ΔPoxKu70中同樣基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，在Avicel誘導(dǎo)第4小時時，ΔPOX08415-1中1個EG基因(POX06983)與2個XYN基因(POX08484和POX05916)的轉(zhuǎn)錄水平相對于ΔPoxKu70中這些基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，上調(diào)程度介于79.11％-489.71％之間，相反，其它大部分纖維素酶基因顯著下調(diào)，下調(diào)程度介于40.90％-89.84％之間。在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)第12小時、第24小時和第48小時時，ΔPOX08415-1中除了POX05196外幾乎所有纖維素酶基因與木聚糖酶基因顯著下調(diào)，下調(diào)程度介于37.46％-99.00％之間。進一步檢測已知調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因PoxBrlA和PoxFlbD的相對表達(dá)水平。采用actin基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR檢測引物如下所示(5’→3’)：PoxBrlA-F：CCAGTTGCCTGTTTCGTCAG；PoxBrlA-R：GGTAAGGGAATGTCGGGTGTT；PoxFlbD-F：AACACATGCACTATCGCTCTCC；PoxFlbD-R：CTTGCCCATCTCATTCACCA；結(jié)果如圖12所示，其中差異表達(dá)量表示的是突變株ΔPOX08415-1中已知調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平減去ΔPoxKu70中這些基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，在Avicel為誘導(dǎo)碳源的培養(yǎng)條件下，相比ΔPoxKu70，ΔPOX08415-1中，除了PoxFlbD在誘導(dǎo)第12小時和PoxBrlA在誘導(dǎo)第4小時時沒有顯著性差異外，其余所有條件下的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，上調(diào)程度介于75.72％-1519.44％之間。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子POX08415在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，對草酸青霉關(guān)鍵纖維素酶基因與木聚糖酶基因的表達(dá)，以及已知重要的纖維素酶基因和木聚糖酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)起關(guān)鍵調(diào)控作用。將上述實施例中的ΔPOX08415-1，又稱為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)ΔPOXO8415，于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；郵編：100101)，保藏編號為CGMCC_NO.12966。<110>廣西大學(xué)<120>功能蛋白POX08415及其編碼基因與應(yīng)用<160>4<210>1<211>494<212>PRT<213>草酸青霉<400>1MetGlySerLeuGluAlaValSerArgHisArgAspProLeuProAla151015IleGlyPheLeuSerLysAspAsnLeuGlyGlyTyrThrSerLysHis202530SerSerHisAlaGlySerProAsnProSerGlnAlaSerSerAsnMet354045TyrThrSerGlnSerLeuSerTyrSerTyrAlaProThrThrSerAla505560ProSerGlnProGlyTyrLeuProProSerGluProArgArgLeuVal65707580AspAspAspLysAspLysSerAlaGlyArgGlnSerLeuProSerIle859095HisGluAlaLeuGlyAsnAspAsnHisLeuProTyrProSerSerAla100105110SerAlaProProSerGlnSerGlyHisSerAlaProProProProPro115120125GlnHisLeuLeuGlyArgAlaGlyValGluGlyProSerGlyProPro130135140AsnProPheSerAsnGlyAlaAlaSerThrSerLeuMetArgGluPro145150155160ThrTyrProSerHisProThrGlnLeuHisThrGluThrSerSerArg165170175ThrSerLeuProSerValAsnThrGlnAspSerArgAsnAlaSerLeu180185190GlnSerLeuSerThrGlyArgSerProThrGlnSerAlaLysThrAla195200205MetThrSerIleThrGlySerGlnAsnSerThrTyrAspTyrSerAla210215220ProProSerAlaGlySerIleAlaSerProValGlyHisGlyGlnPhe225230235240ProSerAsnTyrSerPheAsnProSerGlnGlnProHisProProPro245250255AlaHisLeuProAsnGlySerSerTyrHisProSerGlnTyrAspGly260265270ArgAlaTyrSerGlyValProArgMetAspAspGlyLysAsnGlyPhe275280285AlaSerArgProHisProProGlnProHisSerGluSerValLysArg290295300HisLeuAspIleTyrAspValGluThrSerLeuAsnGluIleSerGlu305310315320PheSerThrArgThrLeuAspPheSerArgArgTyrAlaAlaLeuAla325330335HisGlnThrGlnArgAlaGlyProLeuLeuGlySerLeuProThrLeu340345350AsnGluValGluGluIleLeuHisLeuGlnArgArgAsnGlnAspAla355360365LeuIleArgIleArgThrAlaIleValAsnGlnGluGlnAlaMetAla370375380GluGlnMetAlaGlnArgLysAlaTyrLysSerGlyAspAspAspHis385390395400MetAlaMetTyrGlnAspAspTyrLysGlySerGlyGlyPheAlaGly405410415GlyAspAlaLysLysArgArgGlyLysAlaAlaProProGlyArgCys420425430HisSerCysAsnArgAlaGluThrProGluTrpArgArgGlyProAsp435440445GlyAlaArgThrLeuCysAsnAlaCysGlyLeuHisTyrAlaLysLeu450455460ThrArgLysMetGlyAlaAsnLysAlaAlaThrMetGlySerAsnLeu465470475480LysProLysValAlaHisGluSerAlaSerProValThrArg485490<210>2<211>1485<212>DNA<213>草酸青霉<400>2atggggtctttggaagccgtgtcccggcacagagaccctttgcccgccatcggtttcctc60agcaaggacaacctgggaggatatacttccaaacactcctctcacgccggctcccccaat120ccttctcaagcgtccagcaacatgtacacctcccagtccctttcctattcttacgcgccg180accaccagtgcaccgtcacaaccgggctacctccctccctcagaaccacgtcggctcgtc240gacgatgacaaggacaaatcggccggtcgccaatccttgccctccatccacgaggctctc300ggtaacgacaatcatctgccatatccttcgtccgcgtctgcgccgccctcgcaatcagga360cattccgcaccaccccctcctccccaacacctcctcggccgggcgggtgtcgaagggcct420tccgggcctcccaatcccttctccaatggcgccgcttcaacctcactgatgcgggaaccg480acatatccttcgcatccgacccagcttcacaccgaaacctcctcgcggaccagtctcccc540tcggtcaatacgcaagactcccgcaacgcctctctgcaatcgctcagtaccggtcgatcg600ccgacccaaagtgcgaaaacggcaatgacatcgatcacagggtcacaaaactcgacctac660gattacagtgcgccgccgtccgccgggagcatcgcttcgcccgtgggccatggccagttc720ccatccaactactccttcaacccgtcgcaacaaccccatccaccaccagcgcatcttcca780aacggctcgtcctatcatccctctcaatatgacggtcgtgcatactcgggtgtaccccgg840atggacgatgggaaaaatggatttgccagccgaccacacccccctcaacctcattcagaa900tcggtgaagagacatcttgatatctacgatgtggagacatcactcaatgagatttctgaa960tttagcacccgcaccttggacttttcaagacgatatgctgcactcgcgcatcagacgcaa1020cgcgctggacctctgttggggtccttgcccactttgaacgaagtcgaagagatccttcac1080ctgcagcgtcgaaaccaagacgcgctgatccgaattcgaacagccatcgtcaatcaagag1140caggcaatggccgagcagatggcgcaacgaaaagcgtacaagtcgggggatgatgatcac1200atggccatgtatcaggacgactacaaagggtccggtggctttgccgggggtgatgctaaa1260aaacgacgaggaaaagcggctccccctggccgctgtcacagctgtaaccgtgccgaaact1320cccgagtggcggcgtggcccagatggtgctcgaacgctgtgcaacgcctgtgggctccat1380tacgctaaactgactcgcaaaatgggtgccaacaaagcagcaaccatgggatccaatctc1440aagcccaaggtggctcacgagtctgcctcgcctgtcacccgctaa1485<210>3<211>1968<212>DNA<213>草酸青霉<400>3atggggtctttggaagccgtgtcccggcacaggtaagctggtcgtcctcgtcctcatcat60cacccatcgtcaaacccgtgcggcgcaaccggtcccgatcacaatgctaaccttgcgctc120gccctcttccacagagaccctttgcccgccatcggtttcctcagcaaggacaacctggga180ggatatacttccaaacactcctctcacgccggctcccccaatccttctcaagcgtccagc240aacatgtacacctcccagtccctttcctattcttacgcgccgaccaccagtgcaccgtca300caaccgggctacctccctccctcagaaccacgtcggctcgtcgacgatgacaaggacaaa360tcggccggtcgccaatccttgccctccatccacgaggctctcggtaacgacaatcatctg420ccatatccttcgtccgcgtctgcgccgccctcgcaatcaggacattccgcaccaccccct480cctccccaacacctcctcggccgggcgggtgtcgaagggccttccgggcctcccaatccc540ttctccaatggcgccgcttcaacctcactgatgcgggaaccgacatatccttcgcatccg600acccag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