本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，本發(fā)明提供抗原性多肽，其可以用于產(chǎn)生能夠結(jié)合PCSK9衍生的分子的抗體。本發(fā)明還涉及以高親和力與PCSK9特異性結(jié)合的抗體或其功能性片段。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗體或其功能性片段的核酸分子，用于表達(dá)本發(fā)明抗體或其功能性片段的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，以及本發(fā)明抗體或其功能性片段的生產(chǎn)方法。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明抗體或其功能性片段的免疫綴合物以及藥物組合物，以及使用本發(fā)明的抗體或其功能性片段治療多種疾病(包括血脂異常及相關(guān)心血管疾病)的方法。
背景技術(shù)：
：家族性高膽固醇血癥(familialhypercholesterolemia,FH)是一種常染色體單基因顯性遺傳性疾病，有家族性的特征，具有多種臨床表現(xiàn)；FH是脂質(zhì)代謝單基因疾病中最嚴(yán)重的一種，又稱LDL受體病或高脂蛋白血癥IIa型，是兒童時期最常見的遺傳性高脂血癥，是冠狀動脈疾病的一種重要危險因素。低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的顯著提高是該疾病的重要標(biāo)志，因此，抑制肝細(xì)胞LDLR的降解，增強(qiáng)LDLR對LDL的攝取，可以延緩動脈粥樣硬化進(jìn)展，降低患病的風(fēng)險。在排除LDLR，apoB基因突變的ADH患者家族中檢測到PCSK9存在基因突變(S127R,F216L)，首次闡明了PCSK9對于脂質(zhì)代謝的影響(Abifadel,Varretetal.2003)。目前，PCSK9是血脂異常的新型治療靶點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌酶/kexin9(PCSK9)，又可稱為神經(jīng)凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶(NARC-1),屬于Kexin樣前轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶家族的第九個成員，由692個氨基酸殘基組成，主要存在于肝臟、腎臟及小腸等，由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞，及結(jié)腸表皮細(xì)胞等表達(dá)，并且作為一個分泌性蛋白存在于血液中(Seidah,Benjannetetal.2003)。PCSK9由PCSK9基因編碼，其基因位于人常染色體的lp33-p34.3，主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，其首先形成一個72KDa的非活性前體結(jié)構(gòu)，然后經(jīng)過自動催化，在第152位與第153位殘基處裂解，形成了14KDa的前體結(jié)構(gòu)域，以及包含催化結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域的57KDa成熟片段(Benjannet,Rhaindsetal.2004)。前體結(jié)構(gòu)域以非共價鍵形式結(jié)合于催化結(jié)構(gòu)域上，是成熟片段正確折疊并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中運(yùn)出所必需的。PCSK9基因突變可以分為功能獲得型(D347Y、S127R、F216L、L82X、Y142X等)和功能缺失型(R46L、Y142X、C679)(Abifadel,Varretetal.2003)，其中，功能獲得型突變體通過與不同蛋白的協(xié)同作用，改變了PCSK9的親和力或增強(qiáng)蛋白水解酶對PCSK9自身裂解的敏感度，增強(qiáng)PCSK9對LDLR的降解，從而導(dǎo)致血液中的LDL-c水平升高，誘導(dǎo)ADH或早發(fā)性動脈粥樣硬化性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9不僅對肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的分化具有重要影響(Seidah,Benjannetetal.2003)，同時調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體(LDLR)的表達(dá)，從而參與膽固醇的合成與代謝。研究發(fā)現(xiàn)將純化的PCSK9蛋白加入HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中，其細(xì)胞表面的LDLR減少，并呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)(Lagace,Curtisetal.2006)，而肝臟細(xì)胞過度表達(dá)PCSK9的小鼠，其LDLR的水平顯著降低，但LDLRmRNA表達(dá)水平并未降低(Lambert,Charltonetal.2009)，因此PCSK9是通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)節(jié)LDLR水平的。LDLR分子由5個主要的結(jié)構(gòu)域組成，首先是一個富含半胱氨酸的配體結(jié)合區(qū)，其次是一個表皮生長因子(EGF)前體同源結(jié)構(gòu)域，包括三個EGF樣重復(fù)序列(EGF-A,EGF-B,EGF-C)和一個β螺旋結(jié)構(gòu)，一個糖結(jié)構(gòu)域，一個跨膜結(jié)構(gòu)域，及胞質(zhì)尾區(qū)含有受體內(nèi)化所必需的序列。2007年，關(guān)于PCSK9介導(dǎo)LDLR降解的分子機(jī)制學(xué)研究取得了突破性進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9分泌至血漿，能夠與LDLR胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并內(nèi)化，促進(jìn)了后者在溶酶體中的降解(Zhang,Lagaceetal.2007)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞表面中性pH環(huán)境中，PCSK9能夠與LDLR胞外段的EGF-A結(jié)合，內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞低pH環(huán)境中，PCSK9的C端結(jié)構(gòu)域能夠與LDLR的配體結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而使LDLR在溶酶體中被降解，無法返回細(xì)胞膜(Fisher,Surdoetal.2007)。綜上所述，PCSK9目前已成為血脂異常及相關(guān)心血管疾病的重要靶點(diǎn)，而針對其的單克隆抗體具有廣闊的應(yīng)用前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的一個目的是，提供用于對血脂異常相關(guān)靶點(diǎn)的抗體和所述抗體的功能片段，使用所述抗體或抗體功能片段治療血脂異常的方法等。解決問題的手段為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人做了深入研究，由此他們發(fā)現(xiàn)了特異性地結(jié)合PCSK9并抑制了PCSK9與LDLR的結(jié)合，從而增加了LDL-c的吸收的抗體，并從而完成了本發(fā)明。即JS002，本發(fā)明包括以下發(fā)明。在一方面本發(fā)明提供了能夠結(jié)合前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌酶/kexin9(PCSK9)的抗PCSK9抗體及其功能性片段，其包含選自氨基酸序列SEQIDNO:4,5,6,10,11,12,16,17,18,22,23,24,28,29,30或任何所述序列之變體的重鏈CDR，和/或選自氨基酸序列SEQIDNO:1,2,3,7,8,9,13,14,15,19,20,21,25,26,27或任何所述序列之變體的輕鏈CDR。在另一方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供了能夠結(jié)合PCSK9的抗體或其功能性片段，其中所述重鏈CDR的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列選自以下各氨基酸序列或其變體的組中的一組：HCDR1HCDR2HCDR3ASEQIDNO:4SEQIDNO:5SEQIDNO:6BSEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12CSEQIDNO:16SEQIDNO:17SEQIDNO:18DSEQIDNO:22SEQIDNO:23SEQIDNO:24ESEQIDNO:28SEQIDNO:29SEQIDNO:30和/或所述輕鏈CDR的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列選自以下各氨基酸序列或其變體的組中的一組：LCDR1LCDR2LCDR3ASEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:3BSEQIDNO:7SEQIDNO:8SEQIDNO:9CSEQIDNO:13SEQIDNO:14SEQIDNO:15DSEQIDNO:19SEQIDNO:20SEQIDNO:21ESEQIDNO:25SEQIDNO:26SEQIDNO:27在另一方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合PCSK9的抗體或其功能性片段，其重鏈CDR1、CDR2和CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列選自以下各氨基酸序列或其變體的組中的一組：在另一方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合PCSK9的抗體或其功能性片段，其包含選自氨基酸序列SEQIDNO:32,34,36,38,40或任何所述序列之變體的重鏈可變區(qū)，和/或選自氨基酸序列SEQIDNO:31,33,35,37,39或任何所述序列之變體的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合PCSK9的抗體或其功能性片段，其中所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:32或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:31或其變體，或者所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:34或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:33或其變體，或者所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:36或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:35或其變體，或者所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:38或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:37或其變體，或者所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:40或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:39或其變體。在另一方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合PCSK9的抗體或其功能性片段，其為嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的能夠結(jié)合PCSK9的抗體或其功能性片段的分離的核酸分子，及包含所述核酸分子的表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明所述的能夠結(jié)合PCSK9的抗體或其功能性片段，編碼本發(fā)明的能夠結(jié)合PCSK9的抗體或其功能性片段的分離的核酸分子及表達(dá)載體或宿主細(xì)胞，或它們的任意組合，以及可藥用的載體。在另一方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合PCSK9的抗體或其功能性片段，或編碼其的核酸分子，或表達(dá)載體或宿主細(xì)胞在制備用于治療血脂異常及相關(guān)心血管疾病，包括高脂血癥或高膽固醇血癥等疾病的藥物中的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合PCSK9的抗體或其功能性片段，或編碼其的核酸分子，或表達(dá)載體或宿主細(xì)胞在制備用于促進(jìn)細(xì)胞對LDL吸收的藥物中的用途。(根據(jù)
背景技術(shù)：
的描述理解為：PCSK9能夠結(jié)合LDLR導(dǎo)致LDLR減少，進(jìn)而導(dǎo)致LDL被細(xì)胞的吸收變少，造成血脂升高，而PCSK9抗體可以中和PCSK9，從而逆轉(zhuǎn)此過程，促進(jìn)細(xì)胞對LDL吸收，降低血脂)在另一方面，本發(fā)明提供了一種免疫綴合物，其包含與治療劑偶聯(lián)的本發(fā)明所述的能夠結(jié)合PCSK9的抗體或其功能性片段，優(yōu)選地所述治療劑為毒素、放射性同位素、藥物或細(xì)胞毒劑。附圖說明圖1人PCSK9的SDS-PAGE電泳圖圖2Elisa檢測人PCSK9與LDLR的結(jié)合圖3FACS檢測人PCSK9與LDLR的結(jié)合圖4FACS驗(yàn)證人PCSK9與LDLR的結(jié)合圖5FACS檢測候選雜交瘤細(xì)胞與人PCSK9的結(jié)合圖6鼠源抗體與PCSK9D347Y結(jié)合實(shí)驗(yàn)(抗原包被)圖7鼠源抗體與PCSK9D347Y結(jié)合實(shí)驗(yàn)(抗體包被)圖8鼠源抗體于參照抗體競爭結(jié)合PCSKD347Y抗原表位實(shí)驗(yàn)圖9鼠源抗體對HepG2細(xì)胞LDL吸收的影響圖10嵌合抗體與人PCSK9的結(jié)合圖11嵌合抗體對HepG2細(xì)胞對LDL吸收的影響圖12人源化抗體與人PCSK9的結(jié)合圖13人源化抗體對HepG2細(xì)胞對LDL吸收的影響圖14人源化抗體能有效降低食蟹猴體內(nèi)的LDL-c水平具體實(shí)施方式除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的相同含義。關(guān)于本領(lǐng)域的定義及術(shù)語，專業(yè)人員具體可參考CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領(lǐng)域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標(biāo)準(zhǔn)3字母和/或1字母代碼。本發(fā)明提供了能夠結(jié)合前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌酶/kexin9(PCSK9)的抗PCSK9抗體及其功能性片段。本發(fā)明的抗體或其功能性片段具有以下特性的至少一種：能夠以高親和力阻斷PCSK9和LDLR的相互作用；能夠與PCSK9以高特異性結(jié)合。本發(fā)明還提供了人源化抗PCSK9抗體及其功能性片段。所述人源化抗體由免疫小鼠產(chǎn)生的鼠源抗體經(jīng)由計算機(jī)模擬設(shè)計并結(jié)合噬菌體展示技術(shù)而得到，并且根據(jù)其與不同物種的PCSK9蛋白的結(jié)合特性，其結(jié)合表位也相應(yīng)被鑒定。本發(fā)明所述的人源化抗PCSK9抗體及其功能性片段除具備上述抗PCSK9抗體及其功能性片段的有利特性外，不僅以高親和力結(jié)合人或食蟹猴PCSK9蛋白，還與鼠源PCSK9蛋白相互作用。在不實(shí)質(zhì)性影響抗體活性的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明的序列替換、添加和/或缺失一個或更多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個)氨基酸，以獲得所述抗體或其功能性片段之序列的變體。它們都被視為包括在本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。如在可變區(qū)將具有類似性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行替換。本發(fā)明所述變體的序列可以與其來源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本發(fā)明所述的序列一致性可以使用序列分析軟件測量。例如使用缺省參數(shù)的計算機(jī)程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本發(fā)明的抗體可以是全長的(例如，IgG1或IgG4抗體)或可僅包含抗原結(jié)合部分(例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2或scFv片段)，或可以被修飾以影響功能。本發(fā)明包括具有修飾的糖基化模式的抗PCSK9抗體。在一些應(yīng)用中，進(jìn)行修飾以除去不期望的糖基化位點(diǎn)可以是有用的，或在寡糖鏈上不存在巖藻糖部分以例如增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)功能的抗體。在另一些應(yīng)用中，可進(jìn)行半乳糖基化修飾以改變補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。本文所使用的術(shù)語“功能性片段”尤其是指抗體片段如Fv、scFv(sc指單鏈)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或者雙抗體(diabody)、或者通過化學(xué)修飾或通過摻入脂質(zhì)體中應(yīng)能夠增加半衰期的任何片段，所述化學(xué)修飾例如添加聚(亞烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化，PEG化”)(被稱為Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab')2-PEG或Fab'-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”為聚乙二醇)，所述片段具有EGFR結(jié)合活性。優(yōu)選地，所述功能片段將由其來源抗體的重或輕可變鏈的部分序列構(gòu)成或者包含它們，所述部分序列足以保留與其來源抗體相同的結(jié)合特異性和充分的親和力，對于PCSK9，優(yōu)選至少等于其來源抗體親和力的1/100，在更優(yōu)選方式中至少等于1/10。這種功能片段將包含最少5個氨基酸，優(yōu)選其來源的抗體序列的10、15、25、50和100個連續(xù)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將編碼本發(fā)明所述抗PCSK9抗體的DNA分子克隆到載體中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供了一種重組DNA載體，其含有編碼本發(fā)明所述抗PCSK9抗體的DNA分子。優(yōu)選地，所述重組DNA載體是一種表達(dá)載體，本領(lǐng)域技術(shù)人員將所述抗體的DNA分子克隆到表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，通過誘導(dǎo)表達(dá)獲得抗體。本發(fā)明的表達(dá)載體含有編碼抗PCSK9抗體的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)和/或恒定區(qū)的DNA序列。然而，也可有分別構(gòu)建兩種表達(dá)載體，一種含有重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)，另一種含有輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)，共同轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體進(jìn)一步含有啟動子和編碼分泌信號肽的DNA序列，以及至少一種用于篩選的抗藥基因。本發(fā)明所述宿主細(xì)胞可以為其為原核宿主細(xì)胞、真核宿主細(xì)胞或噬菌體。，所述原核宿主細(xì)胞可以為大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌或奇異變形菌等。所述真核宿主細(xì)胞，可以為如巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，如草地粘蟲等昆蟲細(xì)胞，如煙草等植物細(xì)胞，如BHK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞等哺乳動物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選BHK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞或COS細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“藥物組合物”表示組合在一起以實(shí)現(xiàn)某種特定目的的至少一種藥物以及任選地可藥用載體或輔料的組合。在某些實(shí)施方案中，所述藥物組合物包括在時間和/或空間上分開的組合，只要其能夠共同作用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。例如，所述藥物組合物中所含的成分(例如根據(jù)本發(fā)明的抗體、核酸分子、核酸分子組合和/或綴合物)可以以整體施用于對象，或者分開施用于對象。當(dāng)所述藥物組合物中所含的成分分開地施用于對象時，所述成分可以同時或依次施用于對象。優(yōu)選地，所述可藥用載體是水、緩沖水溶液、等滲鹽溶液如PBS(磷酸鹽緩沖液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鎂、0.3％甘油、透明質(zhì)酸、乙醇或聚亞烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可藥用載體的類型尤其依賴于根據(jù)本發(fā)明的組合物是否配制為用于口服、鼻、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈施用。根據(jù)本發(fā)明的組合物可包含潤濕劑、乳化劑或緩沖液物質(zhì)作為添加劑。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可通過任何適宜的途徑施用，例如可口服、鼻、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。在一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供了為抗PCSK9抗體與第二治療劑的組合的藥物組合物。在一個實(shí)施方案中，所述第二治療劑是有利地與抗PCSK9抗體組合的任意試劑。可有利地與抗PCSK9抗體組合的示例性試劑包括但不限于抑制PCSK9活性的其他試劑(包括其他抗體或其抗原結(jié)合片段、肽抑制劑、小分子拮抗劑等)和/或干擾PCSK9上游或下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑。本文使用的術(shù)語“通過消除、抑制或降低PCSK9活性來預(yù)防或治療疾病或病癥”旨在表示由PCSK9表達(dá)所導(dǎo)致或者以PCSK9表達(dá)為癥狀/特征的疾病或病癥。在一些實(shí)施方案中，所述疾病或病癥選自高脂血癥或高膽固醇血癥。本文使用的“治療有效量”是指足以顯示其對于所施用對象益處的劑量。施用的實(shí)際量，以及施用的速率和時間過程會取決于所治療者的自身情況和嚴(yán)重程度。治療的處方(例如對劑量的決定等)最終是全科醫(yī)生及其它醫(yī)生的責(zé)任并依賴其做決定，通?？紤]所治療的疾病、患者個體的情況、遞送部位、施用方法以及對于醫(yī)生來說已知的其它因素。本文所使用的術(shù)語“對象”是指哺乳動物，如人類，但也可以是其它動物，如野生動物(如蒼鷺、鸛、鶴等)，家畜(如鴨、鵝等)或?qū)嶒?yàn)動物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。一方面，本發(fā)明的抗體或其功能性片段包含選自氨基酸序列SEQIDNO:4,5,6,10,11,12,16,17,18,22,23,24,28,29,30或任何所述序列之變體的重鏈CDR，和/或選自氨基酸序列SEQIDNO:1,2,3,7,8,9,13,14,15,19,20,21,25,26,27或任何所述序列之變體的輕鏈CDR。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體或其功能性片段的重鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列選自以下各氨基酸序列或其變體的組中的一組：HCDR1HCDR2HCDR3ASEQIDNO:4SEQIDNO:5SEQIDNO:6BSEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12CSEQIDNO:16SEQIDNO:17SEQIDNO:18DSEQIDNO:22SEQIDNO:23SEQIDNO:24ESEQIDNO:28SEQIDNO:29SEQIDNO:30和/或其輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列選自以下各氨基酸序列或其變體的組中的一組：LCDR1LCDR2LCDR3ASEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:3BSEQIDNO:7SEQIDNO:8SEQIDNO:9CSEQIDNO:13SEQIDNO:14SEQIDNO:15DSEQIDNO:19SEQIDNO:20SEQIDNO:21ESEQIDNO:25SEQIDNO:26SEQIDNO:27在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體或其功能性片段的重鏈CDR1、CDR2和CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列選自以下各氨基酸序列或其變體的組中的一組：在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體或其功能性片段包含選自氨基酸序列SEQIDNO:32,34,36,38,40或任何所述序列之變體的重鏈可變區(qū)，和/或選自氨基酸序列SEQIDNO:31,33,35,37,39或任何所述序列之變體的輕鏈可變區(qū)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:32或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:31或其變體。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:34或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:33或其變體。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:36或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:35或其變體。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:38或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:37或其變體。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:40或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:39或其變體。本發(fā)明的抗體或其功能性片段可以是嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。本發(fā)明的抗體或其功能性片段可以是人源化的。制備人源化抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，可以通過將本發(fā)明的CDR序列轉(zhuǎn)移至人抗體可變區(qū)中來制備本發(fā)明的人源化抗PCSK9抗體。所述人源化抗體不會產(chǎn)生抗抗體反應(yīng)(AAR)和人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)，不會因被抗抗體中和而被快速清除，并且具有免疫效應(yīng)功能。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗PCSK9抗體或其功能性片段包含選自氨基酸序列SEQIDNO:32,34,36,38,40或任何所述序列之變體的重鏈可變區(qū)，和/或選自氨基酸序列SEQIDNO:31,33,35,37,39或任何所述序列之變體的輕鏈可變區(qū)。在本發(fā)明人源化抗體或其功能性片段的一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:32或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:31或其變體。在本發(fā)明人源化抗體或其功能性片段的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:34或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:33或其變體。在本發(fā)明人源化抗體或其功能性片段的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:36或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:35或其變體。在本發(fā)明人源化抗體或其功能性片段的又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:38或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:37或其變體。在本發(fā)明人源化抗體或其功能性片段的又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:40或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:39或其變體。在本發(fā)明人源化抗體或其功能性片段的又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:47或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:45或其變體。在本發(fā)明人源化抗體或其功能性片段的又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:49或其變體并且所述輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:45或其變體。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗體或其功能性片段的分離的核酸分子。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQIDNO:48、50和/或46所示的核苷酸序列或其組合。本發(fā)明還提供了包含所述核酸分子的表達(dá)載體以及包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供了產(chǎn)生抗PCSK9抗體或其功能性片段的方法，其包括：在允許產(chǎn)生所述抗體或其功能性片段的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的上述宿主細(xì)胞，以及回收因此產(chǎn)生的所述抗體或其功能性片段。在另一方面，本發(fā)明涉及包含與治療劑綴合的本發(fā)明抗體或其功能性片段的免疫綴合物。所述治療劑優(yōu)選地為毒素、放射性同位素、藥物或細(xì)胞毒劑。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明抗體或其功能性片段以及可藥用載體的藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了用于通過消除、抑制或降低PCSK9活性來預(yù)防或治療疾病或病癥的方法，其包括向有此需要的對象施用治療有效量的本發(fā)明抗體或其功能性片段，核酸，表達(dá)載體，宿主細(xì)胞，免疫綴合物或藥物組合物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗體或其功能性片段、核酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、免疫綴合物或藥物組合物在制備用于治療疾病或病癥的藥物中的用途。提供了以下實(shí)施例以證明并進(jìn)一步解釋本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施方式和方面，不應(yīng)被解釋為限制其范圍。實(shí)施例實(shí)施例1.克隆人PCSK9胞外區(qū)及LDLR胞外區(qū)入真核表達(dá)系統(tǒng)以已知序列的人PCSK9基因cDNA(北京義翹神舟)為模板(模板序列如下)，上游引物5'-GTACACTAGTCACCATGGGCACCGTCAGCTC-3',下游引物為5'-GATCCTCGAGCCTGGAGCTCCTGGGAGG-3',PCR擴(kuò)增人PCSK9胞外片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)speI和XhoI雙酶切后，克隆到自主構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)(pSecCAGA2ECD)中。以此質(zhì)粒通過PEI轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞，6天后，收集培養(yǎng)基上清液，通過親和層析純化人PCSK9胞外區(qū)蛋白。以此類似，分別以上游引物5‘-GTACGCTAGCCACCATGGGGCCCTGGGGCTG-3’SEQIDNO:43,下游引物5'-GATCCTCGAGCCCTCACGCTACTGG-3'SEQIDNO:44,PCR擴(kuò)增LDLR胞外片段，擴(kuò)增產(chǎn)物在經(jīng)NheI和XhoI雙酶切后，克隆到自主構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)中。以此質(zhì)粒，通過PEI轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞，6天后，收集培養(yǎng)基上清液，純化LDLR胞外區(qū)。如圖1所示：人PCSK9胞外區(qū)蛋白的SDS-PAGE電泳圖。人PCSK9胞外區(qū)核苷酸序列：SEQIDNO:41ATGGGCACCGTCAGCTCCAGGCGGTCCTGGTGGCCGCTGCCACTGCTGCTGCTGCTGCTG61CTGCTCCTGGGTCCCGCGGGCGCCCGTGCGCAGGAGGACGAGGACGGCGACTACGAGGAG121CTGGTGCTAGCCTTGCGTTCCGAGGAGGACGGCCTGGCCGAAGCACCCGAGCACGGAACC181ACAGCCACCTTCCACCGCTGCGCCAAGGATCCGTGGAGGTTGCCTGGCACCTACGTGGTG241GTGCTGAAGGAGGAGACCCACCTCTCGCAGTCAGAGCGCACTGCCCGCCGCCTGCAGGCC301CAGGCTGCCCGCCGGGGATACCTCACCAAGATCCTGCATGTCTTCCATGGCCTTCTTCCT361GGCTTCCTGGTGAAGATGAGTGGCGACCTGCTGGAGCTGGCCTTGAAGTTGCCCCATGTC421GACTACATCGAGGAGGACTCCTCTGTCTTTGCCCAGAGCATCCCGTGGAACCTGGAGCGG481ATTACCCCTCCACGGTACCGGGCGGATGAATACCAGCCCCCCGACGGAGGCAGCCTGGTG541GAGGTGTATCTCCTAGACACCAGCATACAGAGTGACCACCGGGAAATCGAGGGCAGGGTC601ATGGTCACCGACTTCGAGAATGTGCCCGAGGAGGACGGGACCCGCTTCCACAGACAGGCC661AGCAAGTGTGACAGTCATGGCACCCACCTGGCAGGGGTGGTCAGCGGCCGGGATGCCGGC721GTGGCCAAGGGTGCCAGCATGCGCAGCCTGCGCGTGCTCAACTGCCAAGGGAAGGGCACG781GTTAGCGGCACCCTCATAGGCCTGGAGTTTATTCGGAAAAGCCAGCTGGTCCAGCCTGTG841GGGCCACTGGTGGTGCTGCTGCCCCTGGCGGGTGGGTACAGCCGCGTCCTCAACGCCGCC901TGCCAGCGCCTGGCGAGGGCTGGGGTCGTGCTGGTCACCGCTGCCGGCAACTTCCGGGAC961GATGCCTGCCTCTACTCCCCAGCCTCAGCTCCCGAGGTCATCACAGTTGGGGCCACCAAT1021GCCCAGGACCAGCCGGTGACCCTGGGGACTTTGGGGACCAACTTTGGCCGCTGTGTGGAC1081CTCTTTGCCCCAGGGGAGGACATCATTGGTGCCTCCAGCGACTGCAGCACCTGCTTTGTG1141TCACAGAGTGGGACATCACAGGCTGCTGCCCACGTGGCTGGCATTGCAGCCATGATGCTG1201TCTGCCGAGCCGGAGCTCACCCTGGCCGAGTTGAGGCAGAGACTGATCCACTTCTCTGCC1261AAAGATGTCATCAATGAGGCCTGGTTCCCTGAGGACCAGCGGGTACTGACCCCCAACCTG1321GTGGCCGCCCTGCCCCCCAGCACCCATGGGGCAGGTTGGCAGCTGTTTTGCAGGACTGTG1381TGGTCAGCACACTCGGGGCCTACACGGATGGCCACAGCCATCGCCCGCTGCGCCCCAGAT1441GAGGAGCTGCTGAGCTGCTCCAGTTTCTCCAGGAGTGGGAAGCGGCGGGGCGAGCGCATG1501GAGGCCCAAGGGGGCAAGCTGGTCTGCCGGGCCCACAACGCTTTTGGGGGTGAGGGTGTC1561TACGCCATTGCCAGGTGCTGCCTGCTACCCCAGGCCAACTGCAGCGTCCACACAGCTCCA1621CCAGCTGAGGCCAGCATGGGGACCCGTGTCCACTGCCACCAACAGGGCCACGTCCTCACA1681GGCTGCAGCTCCCACTGGGAGGTGGAGGACCTTGGCACCCACAAGCCGCCTGTGCTGAGG1741CCACGAGGTCAGCCCAACCAGTGCGTGGGCCACAGGGAGGCCAGCATCCACGCTTCCTGC1801TGCCATGCCCCAGGTCTGGAATGCAAAGTCAAGGAGCATGGAATCCCGGCCCCTCAGGAG1861CAGGTGACCGTGGCCTGCGAGGAGGGCTGGACCCTGACTGGCTGCAGTGCCCTCCCTGGG1921ACCTCCCACGTCCTGGGGGCCTACGCCGTAGACAACACGTGTGTAGTCAGGAGCCGGGAC1981GTCAGCACTACAGGCAGCACCAGCGAAGAGGCCGTGACAGCCGTTGCCATCTGCTGCCGG2041AGCCGGCACCTGGCGCAGGCCTCCCAGGAGCTCCAGTGALDLR胞外區(qū)核苷酸序列：SEQIDNO:42ATGGGGCCCTGGGGCTGGAAATTGCGCTGGACCGTCGCCTTGCTCCTCGCCGCGGCGGGGACTGCAGTGGGCGACAGATGCGAAAGAAACGAGTTCCAGTGCCAAGACGGGAAATGCATC121TCCTACAAGTGGGTCTGCGATGGCAGCGCTGAGTGCCAGGATGGCTCTGATGAGTCCCAG181GAGACGTGCTTGTCTGTCACCTGCAAATCCGGGGACTTCAGCTGTGGGGGCCGTGTCAAC241CGCTGCATTCCTCAGTTCTGGAGGTGCGATGGCCAAGTGGACTGCGACAACGGCTCAGAC301GAGCAAGGCTGTCCCCCCAAGACGTGCTCCCAGGACGAGTTTCGCTGCCACGATGGGAAG361TGCATCTCTCGGCAGTTCGTCTGTGACTCAGACCGGGACTGCTTGGACGGCTCAGACGAG421GCCTCCTGCCCGGTGCTCACCTGTGGTCCCGCCAGCTTCCAGTGCAACAGCTCCACCTGC481ATCCCCCAGCTGTGGGCCTGCGACAACGACCCCGACTGCGAAGATGGCTCGGATGAGTGG541CCGCAGCGCTGTAGGGGTCTTTACGTGTTCCAAGGGGACAGTAGCCCCTGCTCGGCCTTC601GAGTTCCACTGCCTAAGTGGCGAGTGCATCCACTCCAGCTGGCGCTGTGATGGTGGCCCC661GACTGCAAGGACAAATCTGACGAGGAAAACTGCGCTGTGGCCACCTGTCGCCCTGACGAA721TTCCAGTGCTCTGATGGAAACTGCATCCATGGCAGCCGGCAGTGTGACCGGGAATATGAC781TGCAAGGACATGAGCGATGAAGTTGGCTGCGTTAATGTGACACTCTGCGAGGGACCCAAC841AAGTTCAAGTGTCACAGCGGCGAATGCATCACCCTGGACAAAGTCTGCAACATGGCTAGA901GACTGCCGGGACTGGTCAGATGAACCCATCAAAGAGTGCGGGACCAACGAATGCTTGGAC961AACAACGGCGGCTGTTCCCACGTCTGCAATGACCTTAAGATCGGCTACGAGTGCCTGTGC1021CCCGACGGCTTCCAGCTGGTGGCCCAGCGAAGATGCGAAGATATCGATGAGTGTCAGGAT1081CCCGACACCTGCAGCCAGCTCTGCGTGAACCTGGAGGGTGGCTACAAGTGCCAGTGTGAG1141GAAGGCTTCCAGCTGGACCCCCACACGAAGGCCTGCAAGGCTGTGGGCTCCATCGCCTAC1201CTCTTCTTCACCAACCGGCACGAGGTCAGGAAGATGACGCTGGACCGGAGCGAGTACACC1261AGCCTCATCCCCAACCTGAGGAACGTGGTCGCTCTGGACACGGAGGTGGCCAGCAATAGA1321ATCTACTGGTCTGACCTGTCCCAGAGAATGATCTGCAGCACCCAGCTTGACAGAGCCCAC1381GGCGTCTCTTCCTATGACACCGTCATCAGCAGGGACATCCAGGCCCCCGACGGGCTGGCT1441GTGGACTGGATCCACAGCAACATCTACTGGACCGACTCTGTCCTGGGCACTGTCTCTGTT1501GCGGATACCAAGGGCGTGAAGAGGAAAACGTTATTCAGGGAGAACGGCTCCAAGCCAAGG1561GCCATCGTGGTGGATCCTGTTCATGGCTTCATGTACTGGACTGACTGGGGAACTCCTGCC1621AAGATCAAGAAAGGGGGCCTGAATGGTGTGGACATCTACTCGCTGGTGACTGAAAACATT1681CAGTGGCCCAATGGCATCACCCTAGATCTCCTCAGTGGCCGCCTCTACTGGGTTGACTCC1741AAACTTCACTCCATCTCAAGCATCGATGTCAACGGGGGCAACCGGAAGACCATCTTGGAG1801GATGAAAAGAGGCTGGCCCACCCCTTCTCCTTGGCCGTCTTTGAGGACAAAGTATTTTGG1861ACAGATATCATCAACGAAGCCATTTTCAGTGCCAACCGCCTCACAGGTTCCGATGTCAAC1921TTGTTGGCTGAAAACCTACTGTCCCCAGAGGATATGGTTCTCTTCCACAACCTCACCCAG1981CCAAGAGGAGTGAACTGGTGTGAGAGGACCACCCTGAGCAATGGCGGCTGCCAGTATCTG2041TGCCTCCCTGCCCCGCAGATCAACCCCCACTCGCCCAAGTTTACCTGCGCCTGCCCGGAC2101GGCATGCTGCTGGCCAGGGACATGAGGAGCTGCCTCACAGAGGCTGAGGCTGCAGTGGCC2161ACCCAGGAGACATCCACCGTCAGGCTAAAGGTCAGCTCCACAGCCGTAAGGACACAGCAC2221ACAACCACCCGACCTGTTCCCGACACCTCCCGGCTGCCTGGGGCCACCCCTGGGCTCACC2281ACGGTGGAGATAGTGACAATGTCTCACCAAGCTCTGGGCGACGTTGCTGGCAGAGGAAAT2341GAGAAGAAGCCCAGTAGCGTGAGGG實(shí)施例2.ELISA檢測人PCSK9重組蛋白與LDLR的結(jié)合2.1生物素標(biāo)記人PCSK9重組蛋白將人PCSK9重組蛋白與溶解于DMSO中的生物素-xx-NHS以1：10比例混合，4攝氏度放置2小時，將反應(yīng)混合物通過10kD的超濾柱以分離生物素標(biāo)記的人PCSK9和游離的生物素。2.2ELISA檢測生物素標(biāo)記人PCSK9與LDLR的結(jié)合為檢驗(yàn)人PCSK9與LDLR的結(jié)合能力，在96孔酶標(biāo)板上，鋪板1μg/ml的LDLR在包被緩沖液中，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次。然后加入含有2％牛奶的PBS溶液封閉60分鐘。用洗滌緩沖液洗3次后加入100μl不同濃度的生物素標(biāo)記的人PCSK9，室溫孵育1小時后用洗滌緩沖液沖洗3次，用洗滌緩沖液以1比10000倍稀釋HRP交聯(lián)羊抗小鼠抗體，室溫孵育1小時，經(jīng)洗滌緩沖液沖洗3次后，加入50μlTMB底物溶液顯色，室溫反應(yīng)8分鐘后，以100μl2M的鹽酸溶液終止反應(yīng)并在450nm處讀出吸光度。從圖2可以看出，人PCSK9重組蛋白能特異性地與LDLR結(jié)合，且呈現(xiàn)劑量依賴性。實(shí)施例3.細(xì)胞水平檢測PCSK9與LDLR的結(jié)合3.1構(gòu)建293F-LDLR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株將構(gòu)建的帶puromycin篩選體系的LDLR全長序列的真核表達(dá)質(zhì)粒通過PEI轉(zhuǎn)染至293F貼壁細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24h后，通過puromycin(2μg/ml)進(jìn)行篩選，直至形成293F-LDLR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞庫。同時通過有限稀釋法，按每孔0.8個細(xì)胞，鋪96孔板，15天后，挑選出293F-LDLR單克隆，并進(jìn)行傳代，形成293F-LDLR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。3.2生物素標(biāo)記的人PCSK9D347Y與293F-LDLR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的結(jié)合將不同濃度生物素標(biāo)記的人PCSK9D347Y重組蛋白和293F-LDLR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞混合，在4攝氏度孵育15分鐘。以FACSbuffer(20mMTris,100mMNaCl,2mMCa2+,1％FBS,pH7.4)洗脫3次后，加入straptavidinallophycocyanin(SA-APC，2μg/ml)在4攝氏度孵育20分鐘。以FACSbuffer洗脫3次后上細(xì)胞流式儀檢測。如圖3所示，構(gòu)建的人PCSK9D347Y重組蛋白能夠特異性地與293F-LDLR細(xì)胞上的LDLR結(jié)合，并且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。3.3生物素標(biāo)記的人PCSK9與HepG2細(xì)胞上LDLR的結(jié)合為進(jìn)一步驗(yàn)證hPCSK9與LDLR的結(jié)合能力，將不同濃度生物素標(biāo)記的人PCSK9D347Y重組蛋白和HepG2細(xì)胞混合，在4攝氏度孵育15分鐘。以PBS洗脫3次后，加入straptavidinallophycocyanin(SA-APC2μg/ml)在4攝氏度孵育20分鐘。以FACSbuffer洗脫3次后上細(xì)胞流式儀檢測。如圖4所示，與上述結(jié)果一致，人PCSK9重組蛋白能特異性結(jié)合HepG2細(xì)胞上的LDLR。實(shí)施例4.抗PCSK9鼠源抗體的制備4.1免疫動物將人PCSK9重組蛋白作為抗原與等量免疫佐劑(福氏佐劑)混合，取5只6周大雌性FVB小鼠進(jìn)行免疫。在初次免疫以后，每周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行四次免疫。4.2細(xì)胞融合在最后一針加強(qiáng)免疫后，取小鼠大腿根處淋巴結(jié)，在生理鹽水中碾磨后取富含淋巴細(xì)胞的懸浮液，按常規(guī)電轉(zhuǎn)方法將其與SP20細(xì)胞融合。將融合細(xì)胞分配于96孔中，在含有HAT的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于5％CO2，37攝氏度條件下培養(yǎng)。實(shí)施例5.配體和受體封閉實(shí)驗(yàn)在20000個不同單克隆雜交瘤細(xì)胞中，通過酶標(biāo)反應(yīng)，篩選出1220個分泌的抗體可結(jié)合人PCSK9蛋白的克隆。在這1220個抗體中，其中有15個具備抑制生物素標(biāo)記的人PCSK9與HepG2上LDLR的結(jié)合的能力。我們集中在抑制能力前五個進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將上述五株雜交瘤細(xì)胞的上清與生物素標(biāo)記的人PCSK9(400ng/ml)混合，室溫孵育20分鐘。然后將混合物與293F-LDLR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株在37攝氏度孵育15分鐘，以PBS洗脫3次后，加入0.2μg/ml的SA-APC并在4攝氏度孵育15分鐘。以PBS洗脫3次后，通過流式細(xì)胞儀檢測以驗(yàn)證雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體是否可以抑制人PCSK9與293F-LDLR細(xì)胞表面的LDLR結(jié)合。以此類似，以參照抗體-抗PCSK9單克隆抗體(merck)為對照，按4μg/ml的濃度進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。如圖5，流式結(jié)果顯示，與參照抗體一致，候選五株單克隆候選抗體3G12,1A5及1B5，1B11及2B12均能夠有效結(jié)合人PCSK9，從而抑制其對LDLR的降解。實(shí)施例6.與不同種屬PCSK9間的交叉反應(yīng)通過ELISA檢測單克隆鼠源候選抗體3G12,1A5及1B5，1B11及2B12與人源PCSK9、鼠源PCSK9及食蟹猴源PCSK9之間的交叉反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與其他公司報導(dǎo)的抗PCSK9抗體不同，我們制備的抗PCSK9鼠源抗體能夠與不同種屬的PCSK9產(chǎn)生交叉反應(yīng)，這將有利于動物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，節(jié)約時間成本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示：表1樣品3G121A51B51B112B12種屬交叉結(jié)合h/m/cyh/m/cyh/m/cyh/cyh/m/cyh:人源；m:鼠源；cy:食蟹猴源實(shí)施例7.與人PCSK9重組蛋白的結(jié)合常數(shù)測定如表2所示，通過ForteBio儀器測定不同的鼠源抗體與hPCSK9之間的結(jié)合常數(shù)。說明制備的鼠源抗體能夠特異性結(jié)合人PCSK9。表2樣品3G121A51B51B112B12KD(nM)0.280.910.904.70.49實(shí)施例8.鼠源候選抗體與人PCSK9的結(jié)合96孔酶標(biāo)板鋪板，4μg/ml的streptavidin包被，37攝氏度恒溫孵育90分鐘。然后棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，加入含有2％牛奶的PBS溶液封閉60分鐘。用洗滌緩沖液洗3次后100μl每孔加入2ug/ml生物素標(biāo)記的人PCSK9，37攝氏度孵育1小時后用洗滌緩沖液沖洗3次，然后加入不同稀釋倍數(shù)的嵌合抗體，37攝氏度孵育1小時，經(jīng)洗滌緩沖液沖洗三次后，用洗滌緩沖液以1：5000倍稀釋HPR標(biāo)記的mouseanti-humanIgG(H+L)，室溫孵育1小時，經(jīng)洗滌緩沖液沖洗3次后，加入100μlTMB底物溶液顯色，室溫反應(yīng)10分鐘后，以100μl2M的鹽酸溶液終止反應(yīng)并在450nm處讀出吸光度。從圖6可以看出，鼠源抗體能特異性地與人PCSK9結(jié)合，且與參照抗體相比，2B12，3G12具有更好的結(jié)合力。為進(jìn)一步驗(yàn)證抗體與人PCSK9的特異性結(jié)合，與上述實(shí)驗(yàn)類似，將抗體(1μg/ml)鋪板在96孔中，37攝氏度孵育60分鐘，然后棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次。然后加入含有2％牛奶的PBS溶液封閉60分鐘。用洗滌緩沖液洗3次后加入100μl不同濃度的生物素標(biāo)記的PCSK9，37攝氏度孵育1小時，經(jīng)洗滌緩沖液沖洗三次后，用洗滌緩沖液以1比5000倍稀釋的HRP-strep，室溫孵育1小時，經(jīng)洗滌緩沖液沖洗3次后，加入100μlTMB底物溶液顯色，室溫反應(yīng)10分鐘后，以100μl2M的鹽酸溶液終止反應(yīng)并在450nm處讀出吸光度。結(jié)果如圖7所示，鼠源抗體與人PCSK9的結(jié)合情況與上一實(shí)驗(yàn)一致。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步設(shè)計實(shí)驗(yàn)比較了不同鼠源抗體結(jié)合人PCSK9抗原表位的異同：4μg/ml的streptavidin包被，37攝氏度恒溫孵育90分鐘。然后棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，加入含有2％牛奶的PBS溶液封閉60分鐘。用洗滌緩沖液洗3次后100μl每孔加入2ug/ml生物素標(biāo)記的人PCSK9，37攝氏度孵育1小時后用洗滌緩沖液沖洗3次，然后加入以200ng/ml參照單克隆抗體進(jìn)行稀釋的不同稀釋倍數(shù)的嵌合抗體，37攝氏度孵育90min，經(jīng)洗滌緩沖液沖洗三次后，用洗滌緩沖液以1：5000倍稀釋HPR標(biāo)記的goatanti-humanIgG-Fc，室溫孵育1小時，經(jīng)洗滌緩沖液沖洗3次后，加入100μlTMB底物溶液顯色，室溫反應(yīng)10分鐘后，以100μl2M的鹽酸溶液終止反應(yīng)并在450nm處讀出吸光度。如圖8所示，1B11、2B12不能顯著競爭參照抗體結(jié)合人PCSK9的抗原表位，而1A5、1B5、3G12能顯著競爭結(jié)合人PCSK上參照單克隆抗體結(jié)合的抗原表位，說明1A5、1B5、3G12競爭結(jié)合力(IC50值)顯著強(qiáng)于對照抗體。實(shí)施例9.對HepG2細(xì)胞的LDL吸收的影響將不同稀釋倍數(shù)的抗體與生物素標(biāo)記的人PCSK9-D347Y(2.5μg/ml)在室溫孵育1小時，然后與FL-LDL(5μg/ml)混合后加入到HepG2細(xì)胞中，37攝氏度孵育3小時，PBS洗三次，然后用TecanSafire2進(jìn)行熒光檢測(Ex514nm/Em570nm)。由圖9和表3結(jié)果可見，不同的鼠源單克隆抗體能與人PSCK9結(jié)合，從而抑制其對LDL吸收的影響。其IC50值在1μg/mL左右。表3sample3G12參照抗體IC50(nM)5.59.9實(shí)施例10.候選抗體可變區(qū)序列的獲得培養(yǎng)候選雜交瘤細(xì)胞，1000rpm離心收集細(xì)胞，并以Trizol提取總RNA。以此為模板，合成第一鏈cDNA后，以第一鏈cDNA為后續(xù)模板擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞所對應(yīng)的可變區(qū)DNA序列(JonesandBendig1991)。在50μl反應(yīng)體系中,分別加入cDNA1μl,10×PCR緩沖液5μl,上游及下游引物各1μl(25pmol),dNTP1μl,25mmolPLMgCl21μl,H2O39μl,95℃預(yù)變性10min,加Taq酶1μl,進(jìn)入溫度循環(huán),進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃變性1min,58℃退火1min,72℃延伸15s,共32個循環(huán),然后72℃保溫10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，得到候選雜交瘤重鏈和輕鏈可變區(qū)序列為：1A5LCSEQIDNO:31DIQMTQSPSSLSASLGDKVTITCKASQDINKYIDWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCVQYDDLWTFGGGTKLEIKSEQIDNO:1LCDR1：KASQDINKYIDSEQIDNO:2LCDR2：YTSTLQPSEQIDNO:3LCDR3：VQYDDLWT1A5HCSEQIDNO:32QVQLKQSGPSLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGSTDYNAAFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCANHRDWGQGTLVTVSASEQIDNO:4HCDR1：SYGVHSEQIDNO:5HCDR2：VIWRGGSTDYNAAFMSSEQIDNO:6HCDR3：HRD3G12LCSEQIDNO:33DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIDWYQHKPGKSPRLLIHYASTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDDLWTFGGGTKLEIKSEQIDNO:7LCDR1：KASQDINKYIDSEQIDNO:8LCDR2：YASTLQPSEQIDNO:9LCDR3：LQYDDLWT3G12HCSEQIDNO:34QVQLKQSGPSLLQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGIHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGITDYNAPFMSRLNITKDNSKNQVFFKMNSLQVDDTAIYYCANHRDWGQGTLVTVSASEQIDNO:10HCDR1：SYGIHSEQIDNO:11HCDR2：VIWRGGITDYNAPFMSSEQIDNO:12HCDR3：HRD1B5LCSEQIDNO:35DIVLTQSPASLVVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYTTSNQGSGVRARLSGSGCGTDFSLNIHPMEEDDSAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIKSEQIDNO:13LCDR1：RASESVDNYGISFMNSEQIDNO:14LCDR2：TTSNQGSSEQIDNO:15LCDR3：QQSKEVPYT1B5HCSEQIDNO:36DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKVEWMGYISYSGSSSYNPSLKGRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARFYYRFDAYFDSWGQGTTLTVSSSEQIDNO:16HCDR1：SDYAWNSEQIDNO:17HCDR2：YISYSGSSSYNPSLKGSEQIDNO:18HCDR3：FYYRFDAYFDS2B12LCSEQIDNO:37DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYGTSLMHWYQHKPGQTPKLLIYSGSNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSREVPSTFGGGTKLEIKSEQIDNO:19LCDR1：RASESVEYYGTSLMHSEQIDNO:20LCDR2：SGSNVESSEQIDNO:21LCDR3：QQSREVPST2B12HCSEQIDNO:38DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGFSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGTTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLHLNSVITEDTATYYCARREGHYSWFPYWGQGTLVTVSASEQIDNO:22HCDR1：SDYAWNSEQIDNO:23HCDR2：YISYSGTTNYNPSLKSSEQIDNO:24HCDR3：REGHYSWFPY1B11LCSEQIDNO:39DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQENSPQLLVYNAYTLADGVPSRFSGSGSGTQFSLKIISLQPEDFGNYYCQHHYRTPPTFGGGTKLEIKSEQIDNO:25LCDR1：RASENIYSYLASEQIDNO:26LCDR2：NAYTLADSEQIDNO:27LCDR3：QHHYRTPPT1B11HCSEQIDNO:40QVQLQQSGAVLVRPGTSIKVSCKASGYAFTNYLIEWIKKRPGQGLEWIGMINPGSGDTNFNEKFKAKATLTADKSSTTAYMQLNSLTFDDSAVYFCARSSQLGLPYWGQGTLVTVSASEQIDNO:28HCDR1：NYLIESEQIDNO:29HCDR2：MINPGSGDTNFNEKFKASEQIDNO:30HCDR3：SSQLGLPY實(shí)施例11.構(gòu)建嵌合抗體表達(dá)載體從人血細(xì)胞(北京血液研究所)中克隆重鏈恒定區(qū)Fc片段和輕鏈k/￡恒定區(qū)，聯(lián)入pCDNA3.1質(zhì)粒以加以改造。上述重鏈和輕鏈序列片段由Genscript公司合成，重鏈經(jīng)BspqI酶切，輕鏈片段經(jīng)BspqI酶切后，聯(lián)入相對應(yīng)改造的pCDNA3.1質(zhì)粒中，并經(jīng)測序確定正確克隆。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)材料均由此系列質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，提存獲得。與上述實(shí)驗(yàn)類似，將重鏈和輕鏈克隆到含老鼠的重鏈恒定區(qū)Fc片段和輕鏈k/￡恒定區(qū)的改造的pCDNA3.1質(zhì)粒中。實(shí)施例12.嵌合抗體與人PCSK9的結(jié)合96孔酶標(biāo)板上鋪板，4μg/ml的streptavidin包被，37攝氏度恒溫孵育90分鐘。然后棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，加入含有2％牛奶的PBS溶液封閉60分鐘。用洗滌緩沖液洗3次后100μl每孔加入2ug/ml生物素標(biāo)記的PCSK9，37攝氏度孵育1小時后用洗滌緩沖液沖洗3次，然后加入不同稀釋倍數(shù)的嵌合抗體，37攝氏度孵育1小時，經(jīng)洗滌緩沖液沖洗三次后，用洗滌緩沖液以1：5000倍稀釋HPR標(biāo)記的mouseanti-humanIgG(H+L)，室溫孵育1小時，經(jīng)洗滌緩沖液沖洗3次后，加入100μlTMB底物溶液顯色，室溫反應(yīng)10分鐘后，以100μl2M的鹽酸溶液終止反應(yīng)并在450nm處讀出吸光度。如圖10所示，3G12嵌合抗體和鼠源抗體均能特異性結(jié)合人PCSK9。實(shí)施例13.嵌合抗體對HepG2細(xì)胞LDL吸收的影響將構(gòu)建的嵌合抗體(10μg/ml)與生物素標(biāo)記的人PCSK9(400ng/ml)混合室溫孵育60分鐘。然后將混合物加入到HepG2細(xì)胞中，隨后加入FL-LDL(5μg/ml)，在37攝氏度孵育3小時，以PBS洗脫3次后，將樣品上流式細(xì)胞儀檢測。如圖11所示，構(gòu)建的3G12嵌合抗體能夠抑制人PCSK9對LDL吸收的影響。實(shí)施例14抗體的人源化改造根據(jù)上述獲得的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體的可變區(qū)序列，進(jìn)行人源化改造。簡言之，人源化改造過程涉及以下步驟：A、把各雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體的基因序列與人胚胎系抗體基因序列進(jìn)行比對，找出同源性高的序列；B、分析考察HLA-DR親和性，選出親和力低的人胚胎系框架序列；C、利用計算機(jī)模擬技術(shù)，應(yīng)用分子對接分析可變區(qū)及其周邊的框架氨基酸序列，考察其空間立體結(jié)合方式。通過計算靜電力，范德華力，親疏水性和熵值，分析各雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體基因序列中可與PD-1作用以及維護(hù)空間構(gòu)架的關(guān)鍵氨基酸個體，將其嫁接回已經(jīng)選擇的人胚胎系基因框架，并在此基礎(chǔ)上標(biāo)配出必須保留的框架區(qū)氨基酸位點(diǎn)，合成隨機(jī)引物，自制噬菌體文庫，篩選人源化抗體文庫(Pini,A.等,etal.(1998).DesignandUseofaPhageDisplayLibrary:HUMANANTIBODIESWITH10SUBNANOMOLARAFFINITYAGAINSTAMARKEROFANGIOGENESISELUTEDFROMATWO-DIMENSIONALGEL.,JournalofBiologicalChemistry,273(34):21769-21776)。在此基礎(chǔ)上我們得到了以下多個人源化抗體。其中包括以下克隆，32和77。其中32和77的輕鏈?zhǔn)窍嗤摹?2/77-LC(SEQIDNO:45，輕鏈氨基酸序列)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINKYIDWYQHKPGKAPKLLIHYASTLQPGVPSRFSGSGSGRDYTFTISSLQPEDIATYYCLQYDDLWTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:46，輕鏈核苷酸序列)GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCCAGGCCAGCCAGGACATCAACAAGTACATCGACTGGTACCAGCACAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCCACTACGCCAGCACCCTGCAGCCCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCAGAGACTACACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTACGACGACCTGTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG32-HC(SEQIDNO:47，重鏈氨基酸序列)QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSISSYGIHWIRQSPGKGLEWIGVIWRGGITDYNAPFMSRVTISKDNSKNQVSFKLSSVTAADTAVYYCANHRDWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:48，重鏈核苷酸序列)CAGGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCATTAGCAGCTATGGCATTCATTGGATTCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGATTGGCGTGATTTGGCGCGGCGGCATTACCGATTATAACGCGCCGTTTATGAGCCGCGTGACCATTAGCAAAGATAACAGCAAAAACCAGGTGAGCTTTAAACTGAGCAGCGTGACCGCGGCGGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAACCATCGCGATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC77-HC(SEQIDNO:49，重鏈氨基酸序列)QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSISSYGVHWIRQSPGKGLEWIGVIWRGGSTDYNAAFMSRVTISKDNSKNQVSFKLSSVTAADTAVYYCANHRDWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:50，重鏈核苷酸序列)CAGGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCATTAGCAGCTATGGCGTGCATTGGATTCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGATTGGCGTGATTTGGCGCGGCGGCAGCACCGATTATAACGCGGCGTTTATGAGCCGCGTGACCATTAGCAAAGATAACAGCAAAAACCAGGTGAGCTTTAAACTGAGCAGCGTGACCGCGGCGGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAACCATCGCGATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC實(shí)施例15人源化抗體與人PCSK9的結(jié)合96孔酶標(biāo)板上鋪板，0.1μg/ml的streptavidin包被，37攝氏度恒溫孵育60分鐘。然后棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，加入含有2％BSA的PBS溶液封閉60分鐘。用洗滌緩沖液洗3次后100μl每孔加入0.2ug/ml生物素標(biāo)記的人PCSK9，37攝氏度孵育30分鐘后用洗滌緩沖液沖洗3次，然后加入不同稀釋倍數(shù)的人源化抗體，37攝氏度孵育1小時，經(jīng)洗滌緩沖液沖洗三次后，用洗滌緩沖液以1：10000倍稀釋HPR標(biāo)記的mouseanti-humanIgG(H+L)，室溫孵育1小時，經(jīng)洗滌緩沖液沖洗3次后，加入100μlTMB底物溶液顯色，室溫反應(yīng)30分鐘后，以100μl2M的鹽酸溶液終止反應(yīng)并在450nm處讀出吸光度。如圖12所示，人源化之后，并未改變其與人源PCSK9的結(jié)合能力，其結(jié)合的EC50值在5ng/ml左右。實(shí)施例16人源化抗體能有效促進(jìn)HepG2細(xì)胞對LDL的吸收將不同濃度梯度稀釋的人源化抗體及參照抗體(起始濃度為10ug/ml,2倍濃度梯度稀釋)與HuPCSK9-D347Y(2.5μg/ml)室溫孵育30min，加入到HepG2細(xì)胞中，37℃，7％C02孵育1h。隨后加入Dil-LDL(5μg/ml)，37℃，7％C02，孵育5小時，PBS洗四次，TecanM1000Pro進(jìn)行熒光檢測(Ex554nm/Em571nm)。如圖13所示，人源化抗體能夠有效抑制PCSK9與LDLR的結(jié)合，從而促進(jìn)HepG2細(xì)胞對LDL的吸收，其IC50值在1ug/ml左右。實(shí)施例17人源化抗體能有效降低食蟹猴體內(nèi)的LDL-c以食蟹猴為模型，通過皮下注射，單次給藥，在不同給藥時間點(diǎn)，觀察不同給藥劑量條件下(3，10，30mg/kg),其血清中LDL-c的變化，及其抗體濃度的變化。如圖14所示，通過檢測，可以看出不同的給藥劑量，其血清中的LDL-c的含量明顯降低，在給藥后D7，其LDL-c的水平降低了70％。同時與嵌合抗體相比，人源化抗體的半衰期明顯增加。參考文獻(xiàn)Abifadel,M.,etal.(2003)."MutationsinPCSK9causeautosomaldominanthypercholesterolemia."NatGenet34(2):154‐156.Abifadel,M.,etal.(2003)."MutationsinPCSK9causeautosomaldominanthypercholesterolemia."NatGenet34(2):154‐156.Benjannet,S.,etal.(2004)."NARC‐1/PCSK9anditsnaturalmutantszymogencleavageandeffectsonthelowdensitylipoprotein(LDL)receptorandLDLcholesterol."JournalofBiologicalChemistry279(47):48865‐48875.Fisher,T.S.,etal.(2007)."EffectsofpHandLowDensityLipoprotein(LDL)onPCSK9‐dependentLDLReceptorRegulation."JournalofBiologicalChemistry282(28):20502‐20512.Jones,S.T.andM.M.Bendig(1991)."RapidPCR‐cloningoffull‐lengthmouseimmunoglobulinvariableregions."Bio/Technology9(1):88‐89.Lagace,T.A.,etal.(2006)."SecretedPCSK9decreasesthenumberofLDLreceptorsinhepatocytesandinliversofparabioticmice."JournalofClinicalInvestigation116(11):2995‐3005.Lambert,G.,etal.(2009)."MolecularbasisofPCSK9function."Atherosclerosis203(1):1‐7.Seidah,N.G.,etal.(2003)."Thesecretoryproproteinconvertaseneurala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