本發(fā)明涉及新型雜環(huán)衍生物及其藥物組合物，特別是作為CDK4/6或HDAC抑制劑的新型雜環(huán)衍生物及其藥物組合物。本發(fā)明還涉及這些化合物和組合物在治療過度增殖性紊亂如癌癥中的用途。
背景技術(shù)：
：周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependentkinase，CDK）是一類絲氨酸（Ser）/蘇氨酸（Thr）激酶，作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，和周期素（cyclin）形成的CDK-cyclin復(fù)合物，參與細(xì)胞的生長、增殖、休眠或者進(jìn)入凋亡。細(xì)胞周期的過程中，cyclins周期性連續(xù)的表達(dá)和降解，并分別結(jié)合到由它們瞬時(shí)活化的CDK上，通過CDK活性，催化不同底物磷酸化，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞周期不同時(shí)相的推進(jìn)和轉(zhuǎn)化作用。CDK4/6-CyclinD復(fù)合物的底物為pRb。G1期早期,pRb被磷酸化,繼而引起其與組蛋白脫乙?；鞍?HDAC)形成的復(fù)合物被破壞,其中的轉(zhuǎn)錄因子E2F-1和DP-1被釋放出來,正反饋調(diào)節(jié)某些基因的轉(zhuǎn)錄,這些基因的蛋白產(chǎn)物，都是細(xì)胞在S期進(jìn)程所必需的。在腫瘤細(xì)胞中，HDAC的過度表達(dá)導(dǎo)致去乙?；饔玫脑鰪?qiáng)，通過恢復(fù)組蛋白正電荷,從而增加DNA與組蛋白之間的引力,使松弛的核小體變得十分緊密,不利于一些腫瘤抑制基因的表達(dá)。CDK4/6的高度活化以及HDAC過度表達(dá)同時(shí)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖。靶向CDK4/6的同時(shí)靶向HDAC的抑制劑能夠更加有效地抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)入S期，阻滯在G1期。因此，同時(shí)靶向CDK4/6和HDAC的抑制劑具有更好的藥效，能夠降低耐藥性和毒副作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的化合物是CDK4/6或HDAC抑制劑，可用于治療受CDK4/6或HDAC介導(dǎo)的疾病和紊亂，例如癌癥、包括乳癌、肝癌、套細(xì)胞淋巴瘤、脂肉瘤、非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤、鱗狀細(xì)胞食管癌等。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的化合物或包含本發(fā)明的化合物的藥物組合物來治療與其有關(guān)的紊亂。本發(fā)明涉及新的具有式(I)的新型雜環(huán)衍生物及其鹽、包括可藥用鹽：其中：R1選自H、、、、、、、、、、烯基、炔基、雜環(huán)基、芳基、雜芳環(huán)，其中R4和R5分別是氫基、烴基、環(huán)烷基、雜原子環(huán)烷基、芳基或雜芳環(huán)；R2是C3-7烷基；任選被一個(gè)選自C1-6烷基和OH的取代基取代的C4-7環(huán)烷基；任選被一個(gè)選自C1-6烷基、C(CH3)2CN和OH的取代基取代的苯基；任選被一個(gè)環(huán)丙基或C1-6烷基取代的哌啶基；任選被一個(gè)環(huán)丙基或C1-6烷基取代的四氫吡喃基；或二環(huán)[2.2.1]庚烷基；R3選自取代或未取代的芳基，取代或未取代的吡啶基，取代或未取代的嘧啶基，取代或未取代的氧化嘧啶基，取代或未取代的吡嗪基，取代或未取代的吡咯基，取代或未取代的吡唑基，取代或未取代的咪唑基，取代或未取代吲哚基，取代或未取代異吲哚基，取代或未取代呋喃基，取代或未取代噻唑基，取代或未取代噁唑啉基，取代或未取代噻吩基；R4選自、、、、、、、、、、、、、、、、、、、其中n=3~7，A、D各自獨(dú)立選自價(jià)鍵、O、NH、NR7、CO、C(S)NH2、C(O)NH2、NH2C(O)、NH2C(S)、CH2或S(O)1~2，R5、R6、R7可各自獨(dú)立的選自H、OH、C1-C8烷烴、-(CH2)t(C6-C10烷烴)、-(CH2)t(C6-C10雜烷烴)、-(CH2)t(C3-C10)環(huán)烷烴)、-(CH2)t(C6-C10環(huán)雜烷烴)，其中t代表數(shù)字0-4，所有的烷烴可選擇被一個(gè)或更多的F或Cl取代；L是價(jià)鍵、O、NH、C(O)、C(S)NH2、C(O)NH2、NH2C(O)、NH2C(S)、CH2或S(O)1~2；X和Z各自獨(dú)立選自CH、N，當(dāng)Z選N時(shí)，R1為無取代基。本發(fā)明所述新型雜環(huán)衍生物可以根據(jù)常規(guī)藥物配制技術(shù)與藥物載體或賦形劑(例如藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑)混合形成藥物制劑?？梢詫⑺鲂滦碗s環(huán)衍生物作為活性成分混合在任何常用的口服劑型中，所述口服劑型包括片劑、膠囊劑和液體制劑(例如酏劑和混懸劑)，其中包含著色劑、矯味劑、穩(wěn)定劑和掩蓋味道的物質(zhì)。對于混合口服劑型來說，所述新型雜環(huán)衍生物作為活性成分可以與各種普通片劑材料(例如淀粉、碳酸鈣、乳糖、蔗糖和磷酸二鈣)混合以助于壓片和裝入膠囊。可以將所述新型雜環(huán)衍生物在藥學(xué)上可接受的無菌液體載體例如無菌水、無菌有機(jī)溶劑或者兩者的混合物中溶解或混懸。液體載體可以是適合注射劑的載體，比如生理鹽水、丙二醇或者聚乙二醇水溶液。在其他情況下，還可以將微粉化的活性成分分散在淀粉或羧甲基纖維素鈉的水溶液中或分散在適當(dāng)?shù)挠?例如花生油)中來制得。液體藥物制劑(指無菌溶液或混懸劑)可以用于靜脈注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射或者皮下注射。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含至少一種作為活性成分的本發(fā)明所述新型雜環(huán)衍生物。除此之外，所述藥物組合物還可以包含一種或多種無機(jī)或有機(jī)、固體或液體的藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)給藥至動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物(例如人類)時(shí)生理學(xué)上可耐受且通常不會(huì)產(chǎn)生過敏或類似的不良反應(yīng)(例如頭暈等)的添加劑或組合物。藥物載體和賦形劑可以包括但不限于稀釋劑，例如乳糖、葡萄糖、甘露糖和/或甘油；潤滑劑；聚乙二醇；粘合劑，例如硅酸鋁鎂、淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮；并且，如果需要的話，還包括崩解劑，例如淀粉、瓊脂、海藻酸或其鹽如海藻酸鈉；和/或吸附劑、著色劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、矯味劑和甜味劑。具體實(shí)施方式下面對本發(fā)明的各個(gè)方面和特點(diǎn)作進(jìn)一步的描述。本文所用的縮略語通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，或者可以是根據(jù)基礎(chǔ)知識(shí)易于理解的。在本發(fā)明化合物的制備中所采用的起始原料是已知的、能夠根據(jù)已知方法制備的或者可商購獲得的。本發(fā)明還涉及新的中間體和/或起始原料。特別優(yōu)選與實(shí)施例中提到的那些相同或者相似的反應(yīng)條件和新中間體。中間體和終產(chǎn)物都可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行后處理和/或純化，所述常規(guī)方法包括調(diào)節(jié)pH、萃取、過濾、干燥、濃縮、色譜法、研磨、結(jié)晶等。另外，本發(fā)明化合物還可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法或者本文所述方法的變通方法進(jìn)行制備。下列實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明，不以任何方式對本發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例18-((4-((7-環(huán)戊基-6-(二甲氨基甲酰基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯的制備步驟1.1：8-((4-氨基苯胺)氨基)-8-氧代辛酸甲酯的制備在500mL單口瓶中加入辛二酸單甲酯（3.97g，21.3mmol），對苯二胺(2.31g,21.3mmol），DMF30mL及DIPEA(13mL,74.4mmol)。室溫?cái)嚢?分鐘。加入EDCI（4.5g，23.4mmol），室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)結(jié)束后緩慢滴加氯化銨水溶液（30g氯化銨，300mL水），滴畢，室溫?cái)嚢?h，過濾，收集固體，真空干燥，得粉紅色固體3.19g，產(chǎn)率=51%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.42(s,1H),7.19(d,J=8.5Hz,2H),6.47(d,J=8.5Hz,2H),4.82(s,2H),3.57(s,3H),2.29(t,J=7.4Hz,2H),2.19(t,J=7.4Hz,2H),1.53(h,J=7.4Hz,4H),1.35–1.19(m,4H)；步驟1.2：8-((4-((7-環(huán)戊基-6-(二甲氨基甲?；?-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯的制備在50mL兩口瓶中加入2-氯-7-環(huán)戊基-N，N-二甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-甲酰胺（504mg，1.71mmol），8-((4-氨基苯胺)氨基)-8-氧代辛酸甲酯(524mg,1.88mmol），醋酸鈀（10mg，0.045mmol）及BINAP(53mg，0.09mmol)及碳酸銫（616.8mg，1.88mmol）,充入氬氣，加入1,4-二氧六環(huán)7.5mL，加熱至100℃，反映過夜。反應(yīng)結(jié)束后，加入乙酸乙酯200mL稀釋，依次用飽和碳酸鈉水溶液，水及飽和食鹽水洗滌，干燥，過濾，除去有機(jī)溶劑，殘余物柱層析純化得476.2mg，產(chǎn)率=51.8%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.57(s,1H),7.77(s,1H),7.65–7.53(m,3H),7.37(d,J=8.4Hz,2H),6.36(s,1H),4.70(p,J=8.9Hz,1H),3.65(s,3H),3.14(s,6H),2.55(t,J=10.7Hz,2H),2.31(dt,J=11.1,7.5Hz,5H),2.08–1.93(m,5H),1.77–1.57(m,4H),1.36(dq,J=8.6,4.5Hz,4H)。實(shí)施例2N-1-(4-((7-環(huán)戊基-6-(二甲氨基甲酰基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)-N-8-羥氨氧代辛酸酰胺的制備在50mL兩口瓶中加入8-((4-((7-環(huán)戊基-6-(二甲氨基甲?；?-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（250mg，0.47mmol），羥胺水溶液（50%，2ml），甲醇5mL，加熱回流，反映過夜。反應(yīng)結(jié)束后，除去溶劑，殘余物柱層析純化得199mg，產(chǎn)率=79.4%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.34(s,1H),9.74(s,1H),9.44(s,1H),8.72(s,1H),7.81–7.65(m,2H),7.60–7.44(m,2H),6.57(s,1H),4.83–4.64(m,1H),3.06(s,6H),2.47(m,2H),2.27(t,J=7.4Hz,2H),2.20(t,J=7.3Hz,1H),1.97(dq,J=14.6,7.4Hz,5H),1.73–1.45(m,6H),1.34–1.26(m,4H)。實(shí)施例38-(4-{6-[(7-環(huán)戊基-6-二甲氨基甲?；?7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基]吡啶基-3-基}哌嗪基-1-基)-8-氧代辛酸甲酯在50mL兩口瓶中加入7-環(huán)戊基-N,N-二甲基-2-[[5-(1-哌嗪基)-2-吡啶]氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺（200mg,0.46mmol），DMF2mL，辛二酸單甲酯（109mg,0.55mmol），N,N-二異丙基乙胺（132mg,0.69mmol），及EDCI（134mg,0.69mmol)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加入乙酸乙酯100mL稀釋，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾，除去有機(jī)溶劑，殘余物通過柱層析純化得棕色固體134.5mg，產(chǎn)率=48%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.73(s,1H),8.43–8.34(m,1H),8.02(d,J=2.9Hz,1H),7.33(dd,J=9.1,3.0Hz,1H),6.43(d,J=1.4Hz,1H),4.78(t,J=8.9Hz,1H),3.79(t,J=5.1Hz,2H),3.65(s,5H),3.14(s,6H),3.13–3.07(m,4H),2.63–2.51(m,2H),2.39–2.33(m,2H),2.29(td,J=7.5,2.4Hz,2H),2.12–1.98(m,4H),1.74–1.59(m,6H),1.36(dd,J=7.3,3.7Hz,4H)。實(shí)施例48-({6-[(7-環(huán)戊基-6-二甲氨基甲酰基-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基]吡啶基-3-基}氨基)-8-氧代辛酸甲酯在100mL兩口瓶中加入2-氯-7-環(huán)戊基-N，N-二甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-甲酰胺（322mg，1.1mmol），8-((6-氨基吡啶-3-基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯(279mg,1mmol），醋酸鈀（5.6mg，0.025mmol）及BINAP(31mg，0.05mmol)及碳酸銫（489mg，1.5mmol）,充入氬氣，加入1,4-二氧六環(huán)10mL，加熱至100℃，反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加入乙酸乙酯200mL稀釋，依次用飽和碳酸鈉水溶液，水及飽和食鹽水洗滌，干燥，過濾，除去有機(jī)溶劑，殘余物柱層析純化得244.3mg，產(chǎn)率=45.6%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.94(s,1H),9.61(s,1H),8.79(s,1H),8.49(s,1H),8.25(d,J=9.1Hz,1H),7.96(d,J=9.0Hz,1H),6.63(d,J=9.1Hz,1H),4.85–4.63(m,1H),3.57(s,3H),3.05(d,J=10.3Hz,6H),2.30(t,J=7.5Hz,4H),1.98(m,6H),1.71–1.47(m,6H),1.37–1.24(m,4H)。實(shí)施例58-((4-((9-環(huán)戊基-9H-嘌呤-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯步驟5.1：在250mL兩口瓶中加入2-氯-5-氨基-4-環(huán)戊胺基嘧啶（2.13g，10mmol），無水硫酸鎂（1.2g，10mmol），原甲酸三乙酯（10.4mL，100mmol）及DMF50ml。加熱至120℃，反應(yīng)過夜。TLC檢測，反應(yīng)完畢后加入乙酸乙酯500mL，依次用水，飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌2次，有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓除去有機(jī)溶劑，殘余物柱層析純化得棕黃色固體1.38g，產(chǎn)率=62%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.94(s,1H),8.13(s,1H),5.08–4.73(m,1H),2.38–2.22(m,2H),2.05–1.89(m,4H),1.86–1.73(m,2H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ154.07,153.20,150.03,144.33,133.45,56.14,32.73,23.85；步驟5.2：在100mL兩口瓶中加入2-氯-9-環(huán)戊基-9H-嘌呤（445mg，2mmol），8-((4-氨基苯胺)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（559mg，2mmol），醋酸鈀（11.2mg，0.05mmol），BINAP（62.3mg，0.1mmol），碳酸銫（717mg，2.2mmol），抽真空置換氬氣三次，然后加入二氧六環(huán)20mL，加熱至100℃，反應(yīng)過夜。TLC檢測，反應(yīng)完畢后加入乙酸乙酯300mL，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液，水，飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相干燥，過濾，減壓除去有機(jī)溶劑，殘余物通過柱層析純化，得類白色固體714.5mg，產(chǎn)率=76.9%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.74(s,1H),7.84(s,1H),7.82–7.67(m,2H),7.67–7.60(m,2H),7.53–7.47(m,2H),4.81(p,J=7.5Hz,1H),3.64(s,3H),2.29(ddt,J=19.5,12.2,6.6Hz,6H),2.12–1.99(m,2H),1.94(tt,J=6.9,3.7Hz,2H),1.85–1.65(m,4H),1.60(p,J=7.3Hz,2H),1.35(qd,J=8.1,5.1,4.6Hz,4H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ174.29,171.31,156.10,152.58,149.25,141.42,136.29,132.60,128.91,120.64,119.25,55.98,51.53,37.44,33.95,32.28,28.82,28.77,25.45,24.71,24.11。實(shí)施例6N1-(4-((9-環(huán)戊基-9H-嘌呤-2-基)氨基)苯基)-N8-羥氨氧代辛酸酰胺在50mL兩口瓶中加入8-((4-((9-環(huán)戊基-9H-嘌呤-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（350mg，0.75mmol），羥胺水溶液（50%，5ml），甲醇5mL，加熱回流，反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，除去溶劑，殘余物柱層析純化得白色固體156.9mg，產(chǎn)率=33.7%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.35(s,1H),9.75(s,1H),9.53(s,1H),8.73(d,J=35.5Hz,2H),8.26(s,1H),7.73(d,J=8.4Hz,2H),7.50(d,J=8.6Hz,2H),4.99–4.73(m,1H),2.37–2.00(m,6H),2.00–1.81(m,4H),1.71(s,2H),1.53(d,J=31.4Hz,4H),1.28(s,4H)。13CNMR(101MHz,DMSO)δ171.15,169.56,156.47,152.46,149.46,142.99,136.75,133.46,128.80,119.91,119.03,55.87,36.74,32.72,31.90,28.92,28.89,25.59,25.52,24.22。實(shí)施例78-((4-((3-環(huán)戊基-3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶-5-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯步驟7.1；在50mL兩口瓶中加入2-氯-5-氨基-4-環(huán)戊胺基嘧啶（2.13g，10mmol）和濃鹽酸（20mL），放入0℃下攪拌10分鐘，將亞硝酸鈉（828mg，12mmol）溶于水5ml中，緩慢滴加到反應(yīng)瓶中。加入完畢后攪拌30分鐘后移至室溫?cái)嚢?小時(shí)。TLC檢測，反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液倒入飽和碳酸氫鈉水溶液中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，有機(jī)相依次用水，飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌1次，有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓除去有機(jī)溶劑，殘余物柱層析純化得白色固體1.45g，產(chǎn)率=65%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.34(s,1H),5.32(p,J=7.1Hz,1H),2.40–2.18(m,J=6.5Hz,4H),2.10–1.96(m,2H),1.90–1.66(m,2H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ158.34,153.04,150.47,135.13,59.53,32.70,24.42；步驟7.2；在100mL兩口瓶中加入5-氯-3-環(huán)戊基-3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶（335.7mg，1.5mmol），8-((4-氨基苯胺)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（462.4mg，1.65mmol），醋酸鈀（8.6mg，0.038mmol），BINAP（47.1mg，0.08mmol），碳酸銫（538mg，1.65mmol），抽真空置換氬氣三次，然后加入二氧六環(huán)15mL，加熱至100℃，反應(yīng)過夜。TLC檢測，反應(yīng)完畢后加入乙酸乙酯300mL，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液，水，飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相干燥，過濾，減壓除去有機(jī)溶劑，殘余物通過柱層析純化，得黃色固體516mg，產(chǎn)率=73.9%。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.09(s,1H),7.93(s,1H),7.66(d,J=8.8Hz,3H),7.59–7.51(m,2H),5.21(p,J=7.3Hz,1H),3.65(s,3H),2.35(t,J=7.5Hz,2H),2.29(q,J=6.4,5.5Hz,6H),2.09–1.95(m,3H),1.86–1.66(m,4H),1.61(p,J=7.3Hz,2H),1.36(dt,J=8.5,5.1Hz,4H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ174.32,171.40,158.02,152.57,150.11,135.07,133.60,132.23,120.59,120.04,58.87,51.56,37.47,33.95,32.25,28.81,28.76,25.42,24.70,24.66。實(shí)施例8N1-(4-((3-環(huán)戊基-3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶-5-基)氨基)苯基)-N8-羥氨氧代辛酸酰胺在50mL兩口瓶中加入8-((4-((3-環(huán)戊基-3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶-5-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（150mg，0.32mmol），羥胺水溶液（50%，3ml），乙醇3mL，加熱回流，反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，除去溶劑，殘余物柱層析純化得白色固體48.4mg，產(chǎn)率=32.3%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.96(s,1H),10.16(s,1H),9.82(s,1H),9.31(s,1H),7.76(d,J=8.6Hz,2H),7.56(d,J=8.7Hz,2H),5.24(p,J=7.3Hz,1H),2.34–2.15(m,8H),2.01–1.85(m,2H),1.76(p,J=7.8,5.6Hz,2H),1.54(dt,J=32.4,7.0Hz,4H),1.40–1.24(m,4H)。13CNMR(101MHz,DMSO)δ175.02,171.31,158.48,153.36,149.97,135.36,134.68,131.90,120.11,119.80,58.71,36.76,34.15,32.11,28.90,28.82,25.52,24.89,24.76。實(shí)施例97-環(huán)戊基-2-((4-(8-羥基辛酰胺)苯基)氨基)-N,N-二甲胺-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺在25mL兩口瓶中加入8-((4-((7-環(huán)戊基-6-(二甲氨基甲?；?-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（268mg,0.5mmol)及四氫呋喃5mL，-10℃下攪拌5分鐘。小心緩慢加入四氫鋰鋁（29mg,0.75mmol)，加料完畢后，升溫至0℃，反應(yīng)2小時(shí)。TLC檢測反應(yīng)結(jié)束后加入2NNaOH(0.03mL)和水(0.1mL)。攪拌30分鐘，硅藻土過濾，用二氯甲烷洗滌。濾液分層，有機(jī)相用水及飽和食鹽水洗滌一次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾減壓除去有機(jī)溶劑，殘余物柱層析純化得淡黃色固體144.1mg，產(chǎn)率57%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.82–9.64(m,1H),9.54–9.36(m,1H),8.71(q,J=5.5,4.6Hz,1H),7.84–7.66(m,2H),7.50(d,J=7.2Hz,2H),6.56(q,J=6.1,5.0Hz,1H),4.70(q,J=9.4,8.7Hz,1H),4.34(d,J=6.8Hz,1H),3.03(s,6H),2.48(s,2H),2.25(d,J=8.1Hz,2H),1.96(dd,J=13.7,7.3Hz,4H),1.60(d,J=30.4Hz,4H),1.39(s,2H),1.27(d,J=8.2Hz,6H)。13CNMR(101MHz,DMSO)δ171.18,163.37,156.02,152.57,151.71,136.75,133.40,131.80,119.78,118.92,111.72,101.19,61.15,57.39,36.78,35.14,32.99,30.02,29.25,29.22,25.89,25.65,24.64。實(shí)施例108-((4-((7-環(huán)戊基-6-(二甲氨基甲酰胺)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸在25mL兩口瓶中加入8-((4-((7-環(huán)戊基-6-(二甲氨基甲?；?-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸甲酯（536mg,1mmol)及四氫呋喃/甲醇/水各5mL，室溫?cái)嚢?，加入氫氧化鈉（60mg，1.5mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)結(jié)束后用乙酸乙酯50mL稀釋，倒入到飽和氯化銨水溶液中，用乙酸乙酯30mL*2萃取，合并有機(jī)相，用水及飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓除去有機(jī)溶劑。殘余物用乙醇和甲苯重結(jié)晶得桔黃色固體484.1g，產(chǎn)率=92.7%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.01(s,1H),9.75(s,1H),9.46(s,1H),8.71(s,1H),7.75(d,J=8.4Hz,2H),7.52(d,J=8.5Hz,2H),6.55(s,1H),4.72(p,J=8.9Hz,1H),3.04(d,J=7.5Hz,6H),2.50–2.39(m,2H),2.27(t,J=7.4Hz,2H),2.20(t,J=7.3Hz,2H),2.02–1.90(m,4H),1.70–1.54(m,4H),1.55–1.46(m,2H),1.35–1.25(m,4H)。13CNMR(101MHz,DMSO)δ174.47,170.66,162.89,155.54,152.04,151.24,136.28,132.92,131.31,119.33,118.44,111.24,100.69,56.91,36.25,34.55,33.61,29.55,28.43,28.34,25.06,24.38,24.16。實(shí)施例11N1-(4-((7-環(huán)戊基-6-(二甲氨基甲酰胺)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)-N8，N8-二甲基辛酰胺在50mL兩口瓶中加入8-((4-((7-環(huán)戊基-6-(二甲氨基甲酰胺)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基)氨基)-8-氧代辛酸（110mg，0.21mmol），HOBT（34mg，0.045m.mol），DIPEA(54mg，0.42mmol)及四氫呋喃（5mL），加入EDCI(61mg,0.32mmol），攪拌5分鐘后加入二甲胺（0.21mL，0.42mmol，2M/THF），室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)結(jié)束后，加入乙酸乙酯50mL稀釋，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液，水及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓除去有機(jī)溶劑，殘余物通過柱層析純化得土黃色固體70.2mg，產(chǎn)率=60.5%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.76(s,1H),9.46(s,1H),8.71(s,1H),7.74(d,J=8.5Hz,2H),7.52(d,J=8.5Hz,2H),6.56(s,1H),4.72(p,J=8.8Hz,1H),3.04(s,6H),2.92(s,3H),2.78(s,3H),2.49–2.41(m,2H),2.26(q,J=8.0Hz,4H),2.04–1.88(m,4H),1.72–1.52(m,4H),1.48(t,J=7.3Hz,2H),1.35–1.21(m,4H)。13CNMR(101MHz,DMSO)δ172.32,171.17,163.38,156.04,152.54,151.73,136.76,133.42,131.81,119.79,118.91,111.73,101.18,57.40,37.12,36.76,35.19,35.06,32.74,30.03,29.07,25.59,25.02,24.65。生物學(xué)測定。HDAC1酶活性測定。體外檢測化合物HDAC1酶的生物學(xué)活性是在384孔板進(jìn)行的。實(shí)驗(yàn)中，使用全長的HDAC1蛋白，在Km的濃度下，于熒光標(biāo)記的多肽Ac-peptide-AMC（Ac：乙酰基，AMC：7-氨基-4-甲基香豆素）中孵化。在Tris-based測定緩沖液中反應(yīng)，隨后在去乙?；负鸵鹊鞍酌缸饔孟?，底物釋放熒光團(tuán)7-氨基-4-甲基香豆素，使用多標(biāo)記微孔板檢測儀進(jìn)行熒光檢測(355nm激發(fā),460nm發(fā)射)。數(shù)據(jù)進(jìn)行熒光隨時(shí)間的線性分析。軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理計(jì)算IC50值。實(shí)驗(yàn)材料：HDAC1(BPSBioscience,USA,Cat.No.50051)；384-wellplate(fromPerkinElmer,Cat.No.6007279)。實(shí)驗(yàn)方法：首先準(zhǔn)備1x實(shí)驗(yàn)緩沖液(Tris緩沖液)；將溶于DMSO中的抑制劑，四倍連續(xù)稀釋加入到多孔板中；準(zhǔn)備酶溶液:在1x實(shí)驗(yàn)緩沖液中準(zhǔn)備酶溶液；準(zhǔn)備底物溶液：在1x實(shí)驗(yàn)緩沖液中加入胰蛋白酶和乙?；揎椀亩嚯牡孜铮粚?5μL的酶溶液加入到多孔板中；室溫孵化15分鐘；每個(gè)孔中加入10μL底物溶液，反應(yīng)開始；室溫孵化60分鐘。在SynergyMX儀上，355nm激發(fā)和460nm發(fā)射波長下讀板。在Excel中使用下列公式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理計(jì)算抑制率(1)公式(1):抑制率%=(最大值-讀數(shù))/(最大值-最小值)*100使用軟件GraphPadPrismV5.0和公式（2）處理數(shù)據(jù)得到IC50值(2)，公式(2):Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*面積闕值))。Y是抑制率%，X是化合物濃度。CDK4/6酶活性測定。采用CaliperMobilityShiftAssay方法測試化合物對CDK4/6酶的抑制活性，該技術(shù)將毛細(xì)管電泳的基本理念應(yīng)用到微流體環(huán)境中，在不加入中止試劑的情況下檢測酶學(xué)實(shí)驗(yàn)。用于實(shí)驗(yàn)的底物是帶有熒光標(biāo)記的多肽，在反應(yīng)體系中酶的作用下，底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，其所帶的電荷也發(fā)生了相應(yīng)的變化，Mobility-ShiftAssay利用底物和產(chǎn)物所帶電荷的不同，將二者進(jìn)行分離，并分別進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)材料：CDK4/CycD3(Carna,Cat.No04-105,Lot.No10CBS-0429C,GST-CDK4(1-303end)/GSTCycD3(1-292end));PeptideFAM-P8(GLBiochem,Cat.No.112396,Lot.No.P100804-XZ112396);ATP(Sigma,Cat.No.A7699-1G,CASNo.987-65-5);DMSO(Sigma,Cat.No.D2650,Lot.No.474382)；EDTA(Sigma,Cat.No.E5134,CASNo.60-00-4);96-wellplate(Corning,Cat.No.3365,Lot.No.22008026);384-wellplate(Corning,Cat.No.3573,Lot.No.12608008)。實(shí)驗(yàn)方法：測定MobilityShift上的ATP表觀Km,384微孔板中加入5μL/孔的2×enzyme&peptide混合液。加入5μL/孔三倍梯度稀釋的2×ATP溶液，啟動(dòng)反應(yīng)。室溫離心1min，放入23°C培養(yǎng)箱反應(yīng)60min后，加入5uL/孔3×stopbuffer（100mMHEPES,pH7.5；0.015%Brij-35；0.2%CoatingReagent#3；50mMEDTA）終止反應(yīng)，置于CaliperEZReaderI上進(jìn)行檢測；在96微孔板中對化合物在5μM濃度進(jìn)行4倍梯度稀釋,加入100μL,100％DMSO作為無化合物無激酶對照組，取10μL化合物加入到一個(gè)新的96孔微孔板，再加入90μL,1×kinasebasebuffer(20mMHEPES,pH7.5;0.01%TritonX-100;10mMMgCl2;2mMDTT)，將該板放置在搖床上10分鐘以將化合物混勻；每孔取5μL混合液加入到384孔微孔板中。384孔微孔板各孔中加10μL，2.5×enzymesolution。室溫下孵育10分鐘后再在各孔中再加10μL,2.5×的多肽溶液(1×kinasebasebuffer中加入FAM-labeledpeptide和ATP）。激酶反應(yīng)，指定時(shí)間停止，孵育30℃。加25μLstopbuffer終止反應(yīng)。置于CaliperEZReaderI上進(jìn)行檢測。表1為化合物對HDAC1激酶的抑制效力表2為化合物對CDK4激酶的抑制效力表1實(shí)施例編號(hào)HDAC1(μM)實(shí)施例編號(hào)HDAC1(μM)1>57>520.002280.4333>59>54>510>55>511>560.0026表2實(shí)施例編號(hào)CDK4(μM)實(shí)施例編號(hào)CDK4(μM)10.01270.85720.008881.14030.01390.0140.047100.0185>5110.0166>5當(dāng)前第1頁1 2 3