本發(fā)明屬于生物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從狼牙刺花中提取氧化槐果堿的方法。

背景技術(shù)：

狼牙刺又名白刺花, 為豆科槐屬多年生灌木, 多生于海拔400～1500m的陽坡或河谷地帶, 廣泛分布于我國華北、江蘇、浙江、湖北、河南、陜西、甘肅及西南等省。狼牙刺的根、莖、葉、花、果實和種子中都含有生物堿，包括氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿等多種生物堿。狼牙刺作為一種民間藥材被廣泛使用,氧化槐果堿是中草藥的主要有效成分，具有抗炎、保肝、抗腫瘤、抗心率失常、免疫調(diào)節(jié)、升高白細(xì)胞及殺菌、殺蟲、利尿、平喘、抗心律失常等作用，是研制多種人體用藥、洗滌用品及殺蟲類生物農(nóng)藥的重要原料。

目前，直接從植物中提取氧化槐果堿的提取率低，一般是采用先從植物中提取得到槐果堿，再利用工業(yè)制備方法將槐果堿制備成氧化槐果堿，此種方法過程復(fù)雜、成本高。中國專利（CN102786523 A）公開了一種從苦豆子中制備槐果堿的方法，利用苦豆子中各種生物堿極性不同的原理，將苦參堿、槐果堿與其他堿分離，再分離出槐果堿。但是，這種方法只能提取得到槐果堿。氧化槐果堿主要通過工業(yè)制備方法獲取，導(dǎo)致制備工藝繁瑣，例如，中國專利（CN1354181 A）是將槐果堿加入雙氧水中，然后將反應(yīng)液萃取或者減壓濃縮得到氧化槐果堿。

中國專利（CN 1473830A）公開了一種從白刺花中提取苦參堿的方法，是將白刺花的地上部分用鹽酸浸泡，然后經(jīng)過甲苯回流，煮沸，加還原劑，萃取，加酸制得苦參總堿后，將苦參總堿離心分離，經(jīng)過氫化、重結(jié)晶后制備得到苦參堿和槐定堿。但是，該工藝中制備得到的苦參總堿中，槐果堿和氧化槐果堿的提取率極低，而且該工藝中使用甲苯對人體有害，難以推廣應(yīng)用。

目前僅僅對狼牙刺種子進(jìn)行生物堿提取和系列產(chǎn)品開發(fā)利用，而狼牙刺結(jié)實率極低，僅有不到10%的花能夠成熟為種子，90%以上的花在生長過程中造成落花浪費；另外，狼牙刺種子的收集難度大且收集率低，而花朵收集率高且易收集。因此，對狼牙刺花進(jìn)行開發(fā)利用，提取其中的氧化槐果堿具有積極意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種從狼牙刺花中提取氧化槐果堿的方法，具有提取率高、純度高的優(yōu)點。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。

一種從狼牙刺花中提取氧化槐果堿的方法，包括以下步驟：

（1）預(yù)處理：稱取香菇，按照料液比1g：30 mL加入水，40-50℃加熱40-60min，冷卻后，過濾，香菇回收利用，得到的香菇濾液備用；將狼牙刺花和得到的香菇濾液按照料液比1:8混合，在3-6℃下浸泡2h，每隔20min翻動攪拌一次，過濾，得到預(yù)處理過的狼牙刺花；

（2）提?。簩⒉襟E（1）預(yù)處理過的狼牙刺花，按照料液比1g：8 mL加入至少含有一種有機溶劑的溶液，浸泡72h，過濾后收集濾液和濾渣，濾渣按照料液比1g：8 mL用至少含有一種有機溶劑的溶液繼續(xù)浸泡48 h，過濾后收集濾液和濾渣，合并2次得到的濾液，將濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得到氧化槐果堿粗提物浸膏；將濾渣按照料液比1g：10 mL加入質(zhì)量濃度為1%-5%的乙酸溶液，浸泡72h，過濾后收集濾液和濾渣，濾渣按照料液比1g：10 mL用質(zhì)量濃度為1%-5%的乙酸溶液繼續(xù)浸泡48 h，過濾后收集濾液，濾液經(jīng)過真空濃縮得到氧化槐果堿粗提物浸膏；合并2次得到的氧化槐果堿粗提物浸膏，備用；

（3）水沉除雜：將步驟（2）最終得到的氧化槐果堿粗提物浸膏中加入3-5倍質(zhì)量的水，用氨水調(diào)節(jié)pH至11，室溫下靜置48 h后過濾，收集濾液；

（4）將步驟（3）得到的濾液經(jīng)過真空濃縮得到濃縮膏、濃縮膏真空干燥后、采用甲醇和二氯甲烷為洗脫液進(jìn)行硅膠柱分離、加入乙醚進(jìn)行結(jié)晶分離、加入丙酮重結(jié)晶后進(jìn)行干燥，即得到氧化槐果堿純品。

優(yōu)選地，步驟（1）中所述至少含有一種有機溶劑的溶液為甲醇、乙醇、氯仿或二氯甲烷中的任意一種。

優(yōu)選地，步驟（1）中所述至少含有一種有機溶劑的溶液為體積比為（85-95）：（5-15）的甲醇和氯仿的混合物、體積比為9:1的甲醇和乙酸的混合物、或者體積比為（30-50）：（50-70）的濃氨水和氯仿的混合物中的任意一種。

優(yōu)選地，上述濃氨水的質(zhì)量濃度為27%。

優(yōu)選地，步驟（2）和步驟（4）中所述的真空濃縮為：將濾液在60-65℃、真空度-0.075至-0.081MPa下真空濃縮20-25min，得到濃縮膏。

優(yōu)選地，上述真空干燥為：將真空濃縮得到的濃縮膏在55℃-60℃、壓力-0.081至-0.085MPa條件下真空干燥6-8h，得到粉末狀氧化槐果堿粗品。

優(yōu)選地，上述采用甲醇和二氯甲烷為洗脫液進(jìn)行硅膠柱分離的具體操作為：按照質(zhì)量比為1：（2-3），將氧化槐果堿粗品與200目的硅膠拌樣上柱，采用甲醇和二氯甲烷為洗脫液，先按照甲醇：二氯甲烷的質(zhì)量比為2：3進(jìn)行洗脫，去除脂溶性色素、脂類等雜質(zhì)，同時用薄層層析法檢識洗脫液中的氧化槐果堿，當(dāng)檢測到洗脫液中氧化槐果堿呈陽性時，再按照甲醇：二氯甲烷的質(zhì)量比為2：6進(jìn)行洗脫，直至檢測到洗脫液中氧化槐果堿呈陰性時，收集洗脫液；將收集的洗脫液減壓分段蒸餾回收二氯甲烷和甲醇，當(dāng)洗脫液蒸餾至干時，按照氧化槐果堿粗品與二氯甲烷的料液比為1g:1mL加入二氯甲烷，得到二氯甲烷-氧化槐果堿溶液。

優(yōu)選地，上述加入乙醚進(jìn)行結(jié)晶分離的具體操作為：按照體積比1:1，向二氯甲烷-氧化槐果堿溶液中加入乙醚，過濾，得到濾液，按照濾液與乙醚的體積比為1:（3-5），向濾液中加入乙醚，靜置結(jié)晶12h，過濾，得到氧化槐果堿結(jié)晶產(chǎn)品，濾液經(jīng)減壓分段蒸餾回收二氯甲烷和乙醚。

優(yōu)選地，上述加入丙酮重結(jié)晶后進(jìn)行干燥的具體操作為：按照料液比1g:（3-5）mL，向氧化槐果堿結(jié)晶產(chǎn)品中加入丙酮，重結(jié)晶得到氧化槐果堿單體，然后在100-105℃下干燥3-4h，得到氧化槐果堿成品。采用液相色譜進(jìn)行氧化槐果堿成品含量測試。

本發(fā)明的優(yōu)點：

本發(fā)明采用狼牙刺花為原料提取氧化槐果堿，可以將落花浪費的狼牙刺花進(jìn)行回收利用，原料來源廣而且收取成本低，操作過程簡單，直接提取即可得到氧化槐果堿，提取率高，產(chǎn)品純度高，能達(dá)到99%以上。

具體實施方式

實施例1

原料狼牙刺花中氧化槐果堿的含量檢測

（1）標(biāo)品溶液的配制：精密稱取氧化槐果堿標(biāo)品10.0 mg,用超純水溶解后定容至10 mL容量瓶中, 制成含氧化槐果堿1.00 mg/mL 的標(biāo)品母液；

（2）樣品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取狼牙刺花樣品0.5 g , 置于100 mL三角瓶中, 加入10mL分析純濃氨水使之濕潤, 再加入30mL分析純氯仿, 振搖提取30 min，靜置4h后，過濾，濾渣連續(xù)提取3 次, 合并提取液, 然后80℃回收氯仿，得到干燥物，干燥物用超純水定容至25 mL , 經(jīng)0.5μm 微孔濾膜過濾后，收集濾液為樣品溶液，備用；

（3）色譜條件：選用ZORBAXC18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；檢測波長220 nm；流動相為0.04 mol/ L 的磷酸-甲醇溶液(體積比90：10，分析純)；流速1.0 mL/min ；柱溫20 ℃條件下，精密吸取標(biāo)品溶液和樣品溶液10μL分別進(jìn)樣測定。

（4）檢測指標(biāo)：經(jīng)以上方法檢測，樣品原料狼牙刺花中氧化槐果堿的含量為2.4%。

實施例2

一種從狼牙刺花中提取氧化槐果堿的方法，包括以下步驟：

（1）預(yù)處理：稱取香菇，按照料液比1g：30 mL加入水， 50℃加熱40min，冷卻后，過濾，香菇回收利用，得到的香菇濾液備用；將50g狼牙刺花和上述得到的香菇濾液按照料液比1:8混合，在3℃下浸泡2h，每隔20min翻動攪拌一次，過濾，得到預(yù)處理過的狼牙刺花；

（2）提?。簩⒉襟E（1）預(yù)處理過的狼牙刺花，按照料液比1g：8 mL加入400mL甲醇溶液，浸泡72h，過濾后收集濾液和濾渣，濾渣按照料液比1g：8 mL用400mL甲醇溶液繼續(xù)浸泡48 h，過濾后收集濾液和濾渣，合并2次得到的濾液，將濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得到氧化槐果堿粗提物浸膏；將濾渣按照料液比1g：10 mL加入500mL質(zhì)量濃度為1%的乙酸溶液，浸泡72h，過濾后收集濾液和濾渣，濾渣按照料液比1g：10 mL用500mL質(zhì)量濃度為1%的乙酸溶液繼續(xù)浸泡48 h，過濾后收集濾液，濾液在60℃、真空度-0.081 MPa下真空濃縮20min得到氧化槐果堿粗提物浸膏；合并2次得到的氧化槐果堿粗提物浸膏，備用；

（3）水沉除雜：將步驟（2）最終得到的氧化槐果堿粗提物浸膏中加入3倍質(zhì)量的水，用氨水調(diào)節(jié)pH至11，室溫下靜置48 h后過濾，收集濾液；

（4）真空濃縮：將步驟（3）得到的濾液在60℃、真空度-0.081 MPa下真空濃縮20min，得到濃縮膏，密度為1.45g/mL；

（5）真空干燥：將步驟（4）的濃縮膏在55℃、壓力-0.085MPa條件下真空干燥6h，得到粉末狀氧化槐果堿粗品；

（6）采用甲醇和二氯甲烷為洗脫液進(jìn)行硅膠柱分離：按照質(zhì)量比為1：2，將氧化槐果堿粗品與200目的硅膠拌樣上柱，采用甲醇和二氯甲烷為洗脫液，先按照甲醇：二氯甲烷的質(zhì)量比為2：3進(jìn)行洗脫，去除脂溶性色素、脂類等雜質(zhì)，同時用薄層層析法檢識洗脫液中的氧化槐果堿，當(dāng)檢測到洗脫液中氧化槐果堿呈陽性時，再按照甲醇：二氯甲烷的質(zhì)量比為2：6進(jìn)行洗脫，直至檢測到洗脫液中氧化槐果堿呈陰性時，收集洗脫液；將收集的洗脫液減壓分段蒸餾回收二氯甲烷和甲醇，當(dāng)洗脫液蒸餾至干時，按照氧化槐果堿粗品與二氯甲烷的料液比為1g:1mL加入二氯甲烷，得到二氯甲烷-氧化槐果堿溶液；

（7）加入乙醚進(jìn)行結(jié)晶分離：按照體積比1:1，向二氯甲烷-氧化槐果堿溶液中加入乙醚，過濾，得到濾液，按照濾液與乙醚的體積比為1:3，向濾液中加入乙醚，靜置結(jié)晶12h，過濾，得到氧化槐果堿結(jié)晶產(chǎn)品，濾液經(jīng)減壓分段蒸餾回收二氯甲烷和乙醚；

（8）加入丙酮重結(jié)晶后進(jìn)行干燥：按照料液比1g:3mL，向氧化槐果堿結(jié)晶產(chǎn)品中加入丙酮，重結(jié)晶得到氧化槐果堿單體，然后在105℃下干燥3h，得到氧化槐果堿成品。

所用試劑全部為化學(xué)純。

實施例3

一種從狼牙刺花中提取氧化槐果堿的方法，包括以下步驟：

（1）預(yù)處理：稱取香菇，按照料液比1g：30 mL加入水，40℃加熱60min，冷卻后，過濾，香菇回收利用，得到的香菇濾液備用；將50g狼牙刺花和上述得到的香菇濾液按照料液比1:8混合，在6℃下浸泡2h，每隔20min翻動攪拌一次，過濾，得到預(yù)處理過的狼牙刺花；

（2）提?。簩⒉襟E（1）預(yù)處理過的狼牙刺花，按照料液比1g：8 mL加入400mL甲醇溶液，浸泡72h，過濾后收集濾液和濾渣，濾渣按照料液比1g：8 mL用400mL甲醇溶液繼續(xù)浸泡48 h，過濾后收集濾液和濾渣，合并2次得到的濾液，將濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得到氧化槐果堿粗提物浸膏；將濾渣按照料液比1g：10 mL加入500mL質(zhì)量濃度為5%的乙酸溶液，浸泡72h，過濾后收集濾液和濾渣，濾渣按照料液比1g：10 mL用500mL質(zhì)量濃度為5%的乙酸溶液繼續(xù)浸泡48 h，過濾后收集濾液，濾液在65℃、真空度-0.075MPa下真空濃縮25min得到氧化槐果堿粗提物浸膏；合并2次得到的氧化槐果堿粗提物浸膏，備用；

（3）水沉除雜：將步驟（2）最終得到的氧化槐果堿粗提物浸膏中加入5倍質(zhì)量的水，用氨水調(diào)節(jié)pH至11，室溫下靜置48 h后過濾，收集濾液；

（4）真空濃縮：將步驟（3）得到的濾液在65℃、真空度-0.075MPa下真空濃縮25min，得到濃縮膏，密度為1.38g/mL；

（5）真空干燥：將步驟（4）的濃縮膏在60℃、壓力-0.081MPa條件下真空干燥8h，得到粉末狀氧化槐果堿粗品；

（6）采用甲醇和二氯甲烷為洗脫液進(jìn)行硅膠柱分離：按照質(zhì)量比為1：3，將氧化槐果堿粗品與200目的硅膠拌樣上柱，采用甲醇和二氯甲烷為洗脫液，先按照甲醇：二氯甲烷的質(zhì)量比為2：3進(jìn)行洗脫，去除脂溶性色素、脂類等雜質(zhì)，同時用薄層層析法檢識洗脫液中的氧化槐果堿，當(dāng)檢測到洗脫液中氧化槐果堿呈陽性時，再按照甲醇：二氯甲烷的質(zhì)量比為2：6進(jìn)行洗脫，直至檢測到洗脫液中氧化槐果堿呈陰性時，收集洗脫液；將收集的洗脫液減壓分段蒸餾回收二氯甲烷和甲醇，當(dāng)洗脫液蒸餾至干時，按照氧化槐果堿粗品與二氯甲烷的料液比為1g:1mL加入二氯甲烷，得到二氯甲烷-氧化槐果堿溶液；

（7）加入乙醚進(jìn)行結(jié)晶分離：按照體積比1:1，向二氯甲烷-氧化槐果堿溶液中加入乙醚，過濾，得到濾液，按照濾液與乙醚的體積比為1:5，向濾液中加入乙醚，靜置結(jié)晶12h，過濾，得到氧化槐果堿結(jié)晶產(chǎn)品，濾液經(jīng)減壓分段蒸餾回收二氯甲烷和乙醚；

（8）加入丙酮重結(jié)晶后進(jìn)行干燥：按照料液比1g:5mL，向氧化槐果堿結(jié)晶產(chǎn)品中加入丙酮，重結(jié)晶得到氧化槐果堿單體，然后在100℃下干燥4h，得到氧化槐果堿成品。

所用試劑全部為化學(xué)純。

實施例4

一種從狼牙刺花中提取氧化槐果堿的方法，包括以下步驟：

（1）預(yù)處理：稱取香菇，按照料液比1g：30 mL加入水，45℃加熱50min，冷卻后，過濾，香菇回收利用，得到的香菇濾液備用；將50g狼牙刺花和上述得到的香菇濾液按照料液比1:8混合，在4℃下浸泡2h，每隔20min翻動攪拌一次，過濾，得到預(yù)處理過的狼牙刺花；

（2）提?。簩⒉襟E（1）預(yù)處理過的狼牙刺花，按照料液比1g：8 mL加入400mL甲醇溶液，浸泡72h，過濾后收集濾液和濾渣，濾渣按照料液比1g：8 mL用400mL甲醇溶液繼續(xù)浸泡48 h，過濾后收集濾液和濾渣，合并2次得到的濾液，將濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得到氧化槐果堿粗提物浸膏；將濾渣按照料液比1g：10 mL加入500mL質(zhì)量濃度為3%的乙酸溶液，浸泡72h，過濾后收集濾液和濾渣，濾渣按照料液比1g：10 mL用500mL質(zhì)量濃度為3%的乙酸溶液繼續(xù)浸泡48 h，過濾后收集濾液，濾液在63℃、真空度-0.077MPa下真空濃縮23min，得到氧化槐果堿粗提物浸膏；合并2次得到的氧化槐果堿粗提物浸膏，備用；

（3）水沉除雜：將步驟（2）最終得到的氧化槐果堿粗提物浸膏中加入4倍質(zhì)量的水，用氨水調(diào)節(jié)pH至11，室溫下靜置48 h后過濾，收集濾液；

（4）真空濃縮：將步驟（3）得到的濾液在63℃、真空度-0.077MPa下真空濃縮23min，得到濃縮膏，密度為1.40g/mL；

（5）真空干燥：將步驟（4）的濃縮膏在58℃、壓力-0.083Mpa條件下真空干燥7h，得到粉末狀氧化槐果堿粗品；

（6）采用甲醇和二氯甲烷為洗脫液進(jìn)行硅膠柱分離：按照質(zhì)量比為1：3，將氧化槐果堿粗品與200目的硅膠拌樣上柱，采用甲醇和二氯甲烷為洗脫液，先按照甲醇：二氯甲烷的質(zhì)量比為2：3進(jìn)行洗脫，去除脂溶性色素、脂類等雜質(zhì)，同時用薄層層析法檢識洗脫液中的氧化槐果堿，當(dāng)檢測到洗脫液中氧化槐果堿呈陽性時，再按照甲醇：二氯甲烷的質(zhì)量比為2：6進(jìn)行洗脫，直至檢測到洗脫液中氧化槐果堿呈陰性時，收集洗脫液；將收集的洗脫液減壓分段蒸餾回收二氯甲烷和甲醇，當(dāng)洗脫液蒸餾至干時，按照氧化槐果堿粗品與二氯甲烷的料液比為1g:1mL加入二氯甲烷，得到二氯甲烷-氧化槐果堿溶液；

（7）加入乙醚進(jìn)行結(jié)晶分離：按照體積比1:1，向二氯甲烷-氧化槐果堿溶液中加入乙醚，過濾，得到濾液，按照濾液與乙醚的體積比為1:4，向濾液中加入乙醚，靜置結(jié)晶12h，過濾，得到氧化槐果堿結(jié)晶產(chǎn)品，濾液經(jīng)減壓分段蒸餾回收二氯甲烷和乙醚；

（8）加入丙酮重結(jié)晶后進(jìn)行干燥：按照料液比1g:4mL，向氧化槐果堿結(jié)晶產(chǎn)品中加入丙酮，重結(jié)晶得到氧化槐果堿單體，然后在105℃下干燥4h，得到氧化槐果堿成品。

所用試劑全部為化學(xué)純。

實施例5

稱取10份狼牙刺花樣品，每份50g，分別用乙醇、氯仿、二氯甲烷、體積比95:5、90:10、85:15的甲醇和氯仿的混合液、體積比為9:1的甲醇和乙酸的混合液、體積比為30:70、40:60、50:50的濃氨水（質(zhì)量濃度為27%）和氯仿的混合液，代替步驟（2）中的甲醇，進(jìn)行提取，其他同實施例4，10份樣品分別記為對比例5（1）、對比例5（2）、對比例5（3）、對比例5（4）、對比例5（5）、對比例5（6）、對比例5（7）、對比例5（8）、對比例5（9）、對比例5（10）。

對比例1

采用中國專利（CN 1473830A）實施例1的方法，檢測其步驟（三）中B得到的苦參堿粗品中氧化槐果堿的含量。

對比例2

稱取3份狼牙刺花樣品，每份50g，省略步驟（1），不采用預(yù)處理，直接從步驟（2）開始提取，其他步驟分別同實施例2、3、4，3份樣品分別記為對比例2（1）、對比例2（2）、對比例2（3）。

采用實施例1的檢測方法，采用液相色譜進(jìn)行檢測氧化槐果堿成品含量，得到氧化槐果堿成品的純度。對不同實施例得到的氧化槐果堿檢測結(jié)果見表1，提取率按照以下公式計算得到：狼牙刺花氧化槐果堿提取率(％)＝(樣品中氧化槐果堿凈質(zhì)量÷原料狼牙刺花氧化槐果堿質(zhì)量)×100％。

表1 不同實施例氧化槐果堿的檢測結(jié)果

由表1可知，實施例2-4采用甲醇先對狼牙刺花進(jìn)行浸泡提取，將濾液減壓濃縮得到粗提物濃縮膏，再采用質(zhì)量濃度1-5%的乙酸對濾渣浸泡提取，乙酸濃度在3%時，氧化槐果堿的提取率和純度相對較高；當(dāng)采用其他溶劑代替甲醇，濃氨水和氯仿的混合液提取時，氧化槐果堿的提取率和純度相對較高；而采用對比例1的方法，檢測苦參堿粗品中氧化槐果堿的含量時，其純度為0，采用該方法提取不能得到氧化槐果堿；采用對比例2的方法，不對狼牙刺花進(jìn)行預(yù)處理，直接進(jìn)行提取時，其氧化槐果堿的提取率和純度明顯低于對狼牙刺花先采用預(yù)處理然后進(jìn)行提取的方法。