本發(fā)明涉及一種(E)-2,4-二羥基-6-丙烯基苯甲醛及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
全世界約有1.5億人感染丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)，每年新增病例為300～400萬。感染HCV后，部分患者最終發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌。據(jù)估計，每年約有50萬人死于HCV感染及其相關(guān)疾病，因此開發(fā)抗HCV藥物迫在眉睫。HCV的NS3/4A蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，可以水解HCV前體蛋白NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B間的連接，決定病毒各功能蛋白的成熟，此外該蛋白酶還可通過切割相應(yīng)的宿主因子如β干擾素Toll樣受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(Toll/IL-1 receptor domain containing adaptor inducing IFN-β，TRIF)和線粒體抗病毒信號蛋白(Mitochondria antiviral signaling protein，MAVS)對抗宿主的天然免疫。因此，抑制NS3/4A蛋白酶可有效地抑制病毒前體蛋白成熟和病毒復(fù)制，具體參見文獻Moradpour D,Penin F.Hepatitis C virus proteins:from structure to function[J].Curr Top Microbiol Immunol,2013,369:113-142。目前已成功的開發(fā)了多種NS3/4A蛋白酶抑制劑，已上市的有特拉匹韋、波普瑞韋和司美匹韋，具體參見文獻De Luca A,Bianco C,Rossetti B.Treatment of HCV infection with the novel NS3/4A protease inhibitors[J].Curr Opin Pharmacol,2014,18:9-17。然而，由于NS3/4A蛋白酶抑制劑耐藥屏障低，易交叉耐藥，所以開發(fā)新的NS3/4A蛋白酶抑制劑十分必要。
微生物的代謝產(chǎn)物具有數(shù)目眾多、化合物的結(jié)構(gòu)多樣和成藥性好等優(yōu)點，是良好的先導(dǎo)化合物庫。迄今為止，已從微生物代謝產(chǎn)物中分離出許多抗菌、抗病毒、抗免疫排斥及抗癌的活性化合物，如埃博霉素，阿霉素等。此外，微生物藥物具有生產(chǎn)成本低、條件溫和、環(huán)境友好、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。
2,4-二羥基-6-[(1'E,3'E)-1',3'-戊二烯基]苯甲醛報道有促進CHO和HeLa細胞增殖的作用，但未見有抑制NS3/4A蛋白酶的活性，甚至未見抑制病毒的作用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種(E)-2,4-二羥基-6-丙烯基苯甲醛及其制備方法和用途。該化合物對丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶有一定的抑制作用；且該化合物的制備方法具有材料來源方便、制備周期短、綠色環(huán)保和工藝簡單的優(yōu)勢。
本發(fā)明提供了一種如式I所示的化合物(E)-2,4-二羥基-6-丙烯基苯甲醛，
本發(fā)明還提供了一種式I化合物的制備方法，包括以下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)土曲霉(Aspergillus terreus)PF26得到含式I化合物的發(fā)酵液，即可。
本發(fā)明所述的土曲霉(Aspergillus terreus)PF26菌株已于2011年8月31日遞交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.5208，該菌株已在CN 102827777A中公布。
本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)土曲霉(Aspergillus terreus)PF26菌株的發(fā)酵條件可采用本領(lǐng)域中土曲霉發(fā)酵培養(yǎng)的常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)條件，其中，發(fā)酵培養(yǎng)基較佳地為：葡萄糖30g/L，(NH4)2SO4 20g/L，酵母提取物10g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05g/L，水，pH 5.5，其中g(shù)/L是指各組分與發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比。所述的發(fā)酵培養(yǎng)土曲霉(Aspergillus terreus)PF26菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件中：培養(yǎng)溫度較佳地為25～35℃，更佳地為30℃；震蕩速度較佳地為150～250r/min，更佳地為220r/min；培養(yǎng)時間較佳地為120～180h，更佳地為168h。
其中，在所述的發(fā)酵培養(yǎng)土曲霉(Aspergillus terreus)PF26菌株之前還可包括土曲霉(Aspergillus terreus)PF26菌株種子液的制備過程，其制備的步驟和條件可以參照本領(lǐng)域常規(guī)選擇，本發(fā)明較佳地包括以下步驟：將保藏在甘油管的土曲霉(Aspergillus terreus)PF26菌株孢子接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度30℃、轉(zhuǎn)速220r/min，振蕩培養(yǎng)12-36h，即可；其中，所述的種子培養(yǎng)基較佳地為：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，水，pH 5.5；其中，g/L是指各組分與種子培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比；所述的甘油管中為甘油水溶液，所述的甘油水溶液的濃度可為本領(lǐng)域常規(guī)的濃度，較佳地為40％的甘油水溶液，所述的百分比為體積百分比。在所述的種子液制備好之后，還可包括將所述的種子液接種至所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的過程，其中，所述的接種的方法和條件可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，所述的種子液與所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比可為本領(lǐng)域常規(guī)的體積比，本發(fā)明較佳地1:200。
本發(fā)明中在得到含式I化合物的發(fā)酵液后還可包括后處理過程，所述的后處理步驟可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，較佳地為：采用固液分離方法得到所述的發(fā)酵液的上清液。其中，所述的固液分離方法較佳地為離心方法；所述的離心方法的條件可參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，轉(zhuǎn)速較佳地3000～5000rpm，更佳地為4000rpm；時間為0.5～1h。在得到所述的發(fā)酵液的上清液后，還可進一步包括以下步驟：利用有機溶劑萃取所述的上清液，萃取液濃縮，得到所述的式I化合物粗品，即可；其中，所述的用有機溶劑為乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，丙酮，甲醇和乙醇中的一種或幾種；
所述的萃取中，所述的有機溶劑與所述的上清液的體積比可參照本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，本發(fā)明較佳地1:1；所述的萃取的次數(shù)可參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地3次。所述的濃縮可采用本領(lǐng)域常規(guī)濃縮條件，較佳地為減壓濃縮；所述的減壓濃縮條件可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地：溫度40～45℃，真空度758mmHg。
本發(fā)明還提供了一種式I化合物的分離純化方法，包括以下步驟：
(1)、將上述式I化合物粗品采用反相硅膠層析柱進行分離純化，依次以水、20％、40％、50％、60％、80％、100％的甲醇-水的混合液進行梯度洗脫，收集60％的甲醇-水混合液的洗脫液并濃縮；其中，所述的百分比為甲醇占甲醇-水混合液的體積比；
(2)、將步驟(1)所得產(chǎn)物采用正相硅膠色譜進行分離純化，流動相為氯仿，收集含式I化合物的洗脫液并濃縮。
(3)、將步驟(2)所得產(chǎn)物采用凝膠層析柱分離，流動相為50～100％的甲醇-水混合液，其中，所述的百分比為甲醇占甲醇-水混合液的體積比；收集含的式I化合物的洗脫液，濃縮。
步驟(1)中，在所述的分離純化前還可包括所述的式I化合物粗品溶解的過程，溶劑的選擇可參照本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，較佳地為甲醇；其中，所述的溶劑的用量可將所述的式I化合物粗品溶解即可，本發(fā)明中所述的溶劑與所述的步驟(1)所得產(chǎn)物的體積質(zhì)量比較佳地1.5。
步驟(1)中，所述的反相硅膠層析柱可參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，一般以十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS-C18)為填充劑。所述的ODS-C18市售可得，較佳地為YMC公司生產(chǎn)的批號為9955的ODS-C18。所述反相硅膠層析柱的填充物與步驟(1)所得產(chǎn)物的質(zhì)量比可參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地2:1～20:1，更佳地4:1～10:1。每個梯度洗脫液的用量與步驟(1)所得產(chǎn)物的體積質(zhì)量比可參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地30mL/g～100mL/g，更佳地50mL/g。流動相的流速可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地10～40mL/min，更佳地10mL/min。所述的濃縮可采用本領(lǐng)域常規(guī)濃縮技術(shù)，較佳地為減壓濃縮；所述的減壓濃縮的溫度較佳地為40～45℃。所述的減壓濃縮的真空度較佳地為700mmHg～800mmHg，更佳地為750mmHg。
步驟(1)所得產(chǎn)物的儲存條件一般為4℃下進行低溫保存。
步驟(2)中，拌樣硅膠與所述的步驟(1)所得產(chǎn)物的重量比可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地2～4:1；拌樣硅膠較佳地為200～300目硅膠。裝柱硅膠與所述的步驟(1)所得產(chǎn)物的重量比可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地10～60:1，更佳地10～20:1；裝柱硅膠較佳地為200～300目硅膠。硅膠柱的徑高比可參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地1:10～20。
步驟(2)中所述濃縮可為常規(guī)濃縮技術(shù)，較佳地為減壓濃縮，所述減壓濃縮的條件較佳地為：溫度40～50℃，真空度700～800mmHg。
步驟(3)中，所述的凝膠層析柱可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地Sephadex LH-20凝膠層析柱。在所述的凝膠層析柱分離之前還可包括將步驟(2)中的產(chǎn)物溶解的操作，溶劑可以參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地體積比為70％甲醇-水混合液；其中，所述的溶劑的用量可將步驟(2)所得產(chǎn)物溶解即可，本發(fā)明中所述的溶劑與所述的步驟(2)所得產(chǎn)物體積質(zhì)量比可參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，較佳地1:1。
步驟(3)中，上樣體積可參照本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，本發(fā)明中所述的上樣體積較佳地為所述的凝膠層析柱保留體積的5～20％，更佳地為10％。
步驟(3)中，所述的流動相較佳地為60～80％的甲醇-水混合液，更佳地為70％的甲醇-水混合液，其中，所述的百分比為甲醇占甲醇-水混合液的體積比。
步驟(3)中所述的收集較佳地為分管收集，每管收集的洗脫液的體積可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地1～5mL，更佳地3mL。
步驟(3)中所述濃縮可為常規(guī)濃縮技術(shù)，較佳地為減壓濃縮，所述減壓濃縮的條件可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)進行選擇，本發(fā)明較佳地為：溫度40～50℃，真空度700～800mmHg。
步驟(2)和步驟(3)中可以采用液相檢測洗脫液中是否含式I化合物，所述的液相檢測的檢測條件較佳地為：65％甲醇-水等度洗脫，檢測波長為210nm，柱溫為40℃，流速為1mL/min，所用的儀器是依利特高效液相色譜儀-DAD紫外檢測器，色譜柱為Ultimate AQ-C18(5μm)(14×150mm)，式I化合物在8～10min出峰，較佳地在8.83min出峰。
本發(fā)明還提供了一種式I化合物在制備丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種式I化合物在制備抗丙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含治療有效量的式I化合物和藥學(xué)可接受的輔料。
在不違背本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明提供的式Ⅰ化合物(E)-2,4-二羥基-6-丙烯基苯甲醛對丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶有一定的抑制作用；該化合物的制備方法具有材料來源方便、制備周期短、綠色環(huán)保和工藝簡單的優(yōu)勢。
具體實施方式
下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
下述實施例中的各原料的來源如下：
下述實施例1中的反相硅膠柱層析設(shè)備為島津公司的型號為SHIMADZU LC-20AP的高效液相色譜儀，該高效液相色譜儀中柱子的規(guī)格為月旭公司型號為Ultimate AQ C18的分析色譜柱(10×250mm,5μm)。
實施例1結(jié)構(gòu)如式I所示化合物(E)-2,4-二羥基-6-丙烯基苯甲醛的制備
1、土曲霉(Aspergillus terreus)PF26菌株的發(fā)酵培養(yǎng)：
將保藏在甘油管(40％的甘油水溶液，所述的百分比為體積百分比)中的土曲霉(Aspergillus terreus)PF26菌株孢子接種至含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角搖瓶中，溫度30℃，220r/min振蕩培養(yǎng)24h，作為種子液。
種子培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，實驗用水，pH 5.5。
接種1mL的種子液至750mL的三角搖瓶(含200mL發(fā)酵培養(yǎng)基)中，30℃，220r/min的條件下培養(yǎng)168h。共富集30L發(fā)酵液。
發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L，(NH4)2SO4 20g/L，酵母提取物10g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05g/L，實驗用水，pH 5.5。
2、化合物I的分離純化
A、富集得到30L發(fā)酵液后，4000r/min離心30min，獲取上清液。用乙酸乙酯萃取上清液三次，萃取時乙酸乙酯和上清液的體積比為1:1，獲取的萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度40～45℃，真空度758mmHg)至干，得到發(fā)酵上清液的乙酸乙酯萃取組分，共20g。
B、將步驟(1)所得產(chǎn)物用30mL甲醇溶解，采用反相硅膠柱層析(80g，ODS-C18)(YMC公司，批號：9955)分離。依次用0％、20％、40％、50％、60％、80％、100％甲醇-水混合液洗脫，流速10mL/min，每個梯度用1L洗脫液洗脫，將60％甲醇-水洗脫液減壓濃縮至1g(減壓濃縮的溫度為40℃～45℃。減壓濃縮的真空度為750mmHg)，低溫(4℃)保存，備用。
C、取步驟B所得的濃縮物1g，用10mL的甲醇溶解，拌入2g 200～300目硅膠，將溶劑揮干得到拌樣硅膠。另取20g 200～300目硅膠，濕法裝柱，徑高比為1:20。上樣后用800mL氯仿進行洗脫，前100mL的氯仿洗脫液直接舍棄，合并后700mL的氯仿洗脫液，得到濃縮物8mg。
D、將步驟C所得濃縮物8mg用70％甲醇-水混合液溶解，并用Sephadex LH-20凝膠色譜柱進行純化，上樣體積為凝膠柱保留體積的10％，采用70％甲醇-水混合液進行等度洗脫，洗脫液每管收集3mL，并進行液相檢測。液相檢測條件為：65％甲醇-水等度洗脫，檢測波長為210nm，柱溫為40℃，流速為1mL/min，所用的儀器是依利特高效液相色譜儀-DAD紫外檢測器和Ultimate AQ-C18(5μm)(14×150mm)的色譜柱。如式I所示化合物在上述條件下在8.83min出峰。收集含結(jié)構(gòu)如式I所示化合物并合并，得到濃縮物5mg，該濃縮物即為結(jié)構(gòu)如式I所示化合物的純品。
如式I所示化合物(E)-2,4-二羥基-6-丙烯基苯甲醛的純度檢查：
采用高效液相色譜的方法檢查純度。儀器：依利特高效液相色譜儀-DAD紫外檢測器。色譜柱：Ultimate AQ-C18(5μm)(14×150mm)，檢測波長：210nm，流動相：A)甲醇B)水，流速：1mL/min，柱溫：40℃，進樣：10μl，洗脫濃度：65％(體積比)甲醇。所得產(chǎn)物的出峰時間：8.83min。面積歸一化法測純度，得到結(jié)構(gòu)如式I所示化合物的純度為95％。
如式I所示化合物化合物(E)-2,4-二羥基-6-丙烯基苯甲醛的結(jié)構(gòu)鑒定：
如式I所示化合物(E)-2,4-二羥基-6-丙烯基苯甲醛為白色無定型粉末；分子式：C10H10O3；分子量：178；電噴霧離子質(zhì)譜(ESI-MS)：179[M+H]+，201[M+Na]+。1H(400MHz，CD3OD)和13C(100MHz，CD3OD)核磁共振數(shù)據(jù)見表。
表1 式I化合物的碳氫化學(xué)位移數(shù)據(jù)
效果實施例1：式I化合物體外抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性實驗
采用NS3/4A蛋白酶抑制劑篩選模型來檢測其對NS3/4A蛋白酶抑制活性，具體的NS3/4A蛋白酶抑制劑篩選模型參照文獻：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院.丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶及基因、檢測抑制劑活性的方法：中國，201510098364.2[P].2015-03-06。
式I化合物的NS3/4A蛋白酶抑制活性檢測方法：
將NS3/4A蛋白酶與底物P06221進行反應(yīng)，用式I所示化合物進行抑制實驗，實驗儀器為BioTek多功能酶標儀和96孔黑色酶標板。式I所示化合物用甲醇溶解，分別稀釋至10mg/mL、5mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.1mg/mL，在反應(yīng)體系中加入NS3/4A蛋白酶、底物，進行溫育，所述的反應(yīng)體系為：1μL待測抑制劑、94μLNS3/4A蛋白酶液，2.5μL底物，pH7.5條件下溫育60分鐘。30℃溫育后在490nm的激發(fā)光和512nm的發(fā)射光下檢測熒光強度的變化。抑制實驗結(jié)果如表2。
表2 式I化合物對NS3/4A蛋白酶的抑制率(％)
表2的結(jié)果說明，式I所示化合物的IC50值為5.57mg/mL，表明該化合物具有一定的NS3/4A蛋白酶抑制活性，有望成為治療丙型肝炎病毒感染的先導(dǎo)化合物。
其中，所述的底物P06221是一條多肽(Ac-Asp-Glu-Glu-Glu-Glu-Alg-Ala-Ser-Lys)，并用熒光劑EDANS和猝滅劑DABCUL標記(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
其中，所述的HCV NS3/4A蛋白酶的制備方法參考專利申請文件記載內(nèi)容(專利申請?zhí)枺?01510098364.2)，具體為：
1、構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-NS3
1)從NCBI網(wǎng)站獲得所有報道的丙型肝炎1b亞型的全基因序列共計164條，利用http://www.drive5.com/uclust軟件進行聚類分析，選擇相似度達到90％以上的、最具有代表性的序列作為研究對象，即序列HCV-1b/US/BID-V130/1994(GenBank：EU155330.2)。選取其中的編碼NS3/4A的全部序列，該序列的核酸全長為2055bp，編碼685個氨基酸。為了增加NS3/4A蛋白酶的體外活性及穩(wěn)定性，對基因序列進行密碼子優(yōu)化。對優(yōu)化后的基因采用化學(xué)合成的方法進行全基因合成(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，把合成的全長基因連接到載體pGH(購自上海捷瑞生物工程有限公司)上，獲得克隆載體pGH-NS3，測序驗證序列完全正確(由上海捷瑞生物工程有限公司測序驗證)。
2)設(shè)計用于PCR擴增NS3/4A蛋白酶基因的引物，上游引物S3-up的序列為5’-AAACATATGGCGCCTATCACGGCTTACTC-3’，下游引物S4A-down的序列為5’-AAAGGATCCTTATTACTTCTTCTTTCC-3’。
3)以含有密碼子優(yōu)化的NS3/4A蛋白酶序列的克隆載體pGH-NS3為模板，利用引物S3-up和S4A-down在(TaKaRa)的催化下進行PCR擴增，獲得2.1Kb的NS3/4A蛋白酶序列。擴增的程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2.5min，共30個循環(huán)，72℃再延伸5min。
4)用BamH I和Nde I分別對PCR擴增獲得的NS3/4A蛋白酶基因的核苷酸序列和大腸桿菌表達載體pET28a(購自上海捷瑞生物工程有限公司)進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，利用T4連接酶(購自TaKaRa)于4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，利用含有30μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12h。
5)挑取抗性平板上生長的單菌落接種5mL含有30μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200rpm 37℃下過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行BamHI和NdeI雙酶切鑒定，得到含有NS3/4A蛋白酶基因的核苷酸序列的重組質(zhì)粒pET28a-NS3。對酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進行測序驗證。
2、構(gòu)建重組菌株、誘導(dǎo)表達及蛋白純化。
1)將重組質(zhì)粒pET28a-NS3轉(zhuǎn)化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布含有30μg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12h。挑取抗性平板上生長的單菌落接種于5mL含有30μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200rpm 37℃下過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行Bam HI和NdeI雙酶切鑒定，即獲得重組菌株。保存驗證正確的菌株。
2)接50μL步驟(1))所述驗證正確的單菌落于5mL LB中，200rpm 37℃下震蕩過夜，得過夜培養(yǎng)物。接500μL過夜培養(yǎng)物于50mL LB中，200rpm 37℃下震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6時，添加0.5mM IPTG進行誘導(dǎo)，18℃，200rpm下誘導(dǎo)培養(yǎng)22h后收集菌液。
3)將步驟(2))獲得的收集菌液4℃7000～8000g離心10min，收集沉淀的菌體。將1g菌體加20mL裂解緩沖液(包括4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)25mM、NaCl 300mM、咪唑(Imidazole)10mM、EDTA 1mM、甘油10％和Triton X-100)，在冰上混合，渦旋震蕩混勻。將細胞懸浮起來，加入溶菌酶(0.3mg/mL)，混勻，冰上靜置30min。加入10％TritonX-100，使Triton的終濃度為0.05％，所述的百分比為體積百分比，充分混勻，超聲破碎細胞，4℃8000g離心30min，取上清。在上清中加入1mL Resin(上海生工)4℃震蕩過夜，充分結(jié)合，過親和層析柱空柱，依次用15mL緩沖液(包括Hepes 25mM、NaCl 300mM、Imidazole 10mM、EDTA 1mM、甘油10％和Triton X-100)、15mL沖洗緩沖液(包括Hepes 25mM、NaCl 300mM、Imidazole 20mM、EDTA 1mM、甘油10％和Triton X-100)洗脫，得洗脫液。洗脫液中含有目的蛋白NS3/4A蛋白酶，將目的蛋白進行透析，用1L的透析液(包括Hepes 25mM、NaCl 150mM、甘油10％、Triton X-1000.1％和二硫蘇糖醇(DTT)10mM，PH7.5)4℃透析過夜后得純化的目的蛋白，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純化的目的蛋白的大小及純度。后在純化的目的蛋白中加入10mM的DTT，分裝，-70℃保存。