本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物化合物，尤其涉及一種靶向抗腫瘤藥物F16與苯丁酸氮芥的化合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

癌癥是嚴(yán)重危害人類健康的一大頑癥，現(xiàn)已成為僅次于心血管病的第二大殺手，所以尋找抗腫瘤藥物和研究其作用機(jī)理，具有重要意義。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器,在細(xì)胞代謝過程中扮演了重要角色,是生命體的“能量工廠”,參與了能量產(chǎn)生細(xì)胞凋亡、細(xì)胞癌變等多種代謝過程。線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變,不僅會干擾細(xì)胞的生長、代謝和增殖過程,還會引起細(xì)胞凋亡。因此，以線粒體為靶點(diǎn)的新型抗腫瘤藥物的研發(fā),已成為一大研究熱點(diǎn)。

F16是近年來發(fā)現(xiàn)的一種高度疏水的、DLC(delocalize lipid cationic)藥物，F(xiàn)16是由乙烯基將一個吡啶環(huán)銅一個吲哚環(huán)連接而成，其結(jié)構(gòu)如下所示：

F16能有效延長線粒體恢復(fù)周期，降低線粒體最大產(chǎn)熱量和線粒體活性 恢復(fù)期速率常數(shù)，F(xiàn)16對于線粒體的作用機(jī)制是通過打開舌頭轉(zhuǎn)換孔道，破壞線粒體質(zhì)子動力勢，從而干擾線粒體代謝產(chǎn)熱。

但是目前一些以線粒體為靶點(diǎn)治療癌癥的藥物化合物，普遍存在選擇性低和多耐藥性的問題，為此，開發(fā)一種基于F16的衍生型抗腫瘤藥物化合物即成為必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)在下文的描述中部分地陳述，或者可從該描述顯而易見，或者可通過實(shí)踐本發(fā)明而學(xué)習(xí)。

為克服現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提供一種靶向抗腫瘤藥物F16與苯丁酸氮芥合成的化合物及其制備方法，以線粒體為靶點(diǎn)治療癌癥，克服抗癌藥物選擇性低和多耐藥性的問題，達(dá)到通過細(xì)胞凋亡的途徑清除癌細(xì)胞的效果。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明提出以下的技術(shù)方案：

靶向抗腫瘤藥物F16與苯丁酸氮芥的化合物，具有通式Ⅰ：

其中，Y為NH、O、S；A、B、C、D、E為相同或不相同的氫基、鹵基、烷基、鹵仿基、烷氨基、醚基或巰醚基，n＝0,1～18。

本發(fā)明提供的通式Ⅰ的化合物，其烷基為-R，烷氨基為-NH-R，醚基為-O-R，巰醚基為-S-R；其中，R＝CH₃(CH₂)_m，m＝0,1～10。

本發(fā)明還提供一種制備上述通式Ⅰ化合物的方法，包括以下步驟：

S1、取化合物α，

與4-甲基吡啶反應(yīng)得到化合物β：

其中X為鹵基，n＝0,1～18

S2、化合物β經(jīng)二碳酸二叔丁酯保護(hù)得到化合物γ：

S3、化合物γ經(jīng)與化合物δ：

在哌啶作用下反應(yīng)得到化合物ε：

其中，Y為NH、O、S；A、B、C、D、E為氫基、鹵基、烷基、鹵仿基、烷氨基、醚基或巰醚基

S4、化合物ε經(jīng)鹽酸脫保護(hù)得到化合物η：

S5、化合物η經(jīng)與化合物θ：

縮合反應(yīng)得到通式Ⅰ的化合物。

上述制備方法中，在步驟S1中，化合物α與4-甲基吡啶在無水醇或醚溶劑中，加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)完全后，冷卻反應(yīng)體系至室溫，過濾，用上述溶劑洗滌；所述無水醇或醚溶劑是無水甲醇、無水乙醇或無水乙醚。

上述制備方法中，在步驟S2中，將化合物β、四氫呋喃、碳酸鈉溶于水，室溫攪拌后緩慢滴加二碳酸二叔丁酯，在25-30℃反應(yīng)4小時；過濾，將濾液旋干，然后加入反應(yīng)量體積的二氯甲烷與無水醇或醚進(jìn)行攪拌，再過濾，將濾液旋干得到化合物γ；所述無水醇或醚溶劑是無水甲醇、無水乙醇或無水乙醚。

上述制備方法中，所述二氯甲烷與無水醇或醚的體積比為[8～15]:1。

上述制備方法中，在步驟S3中，將化合物γ、化合物δ、無水醇或醚溶劑、哌啶升溫至50℃反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)體系旋干過柱，然后加入反應(yīng)量體積的二氯甲烷與無水醇或醚進(jìn)行攪拌，再過濾，將濾液旋干得到化合物ε；所述無水醇或醚溶劑是無水甲醇、無水乙醇或無水乙醚。

上述制備方法中，所述二氯甲烷與無水醇或醚溶劑的體積比為[25～35]:1。

上述制備方法中，在步驟S4中，在化合物ε中添加甲醇，室溫滴加濃鹽酸，室溫反應(yīng)2～7小時，將反應(yīng)體系旋干得到化合物η。

上述制備方法中，在步驟S5中，將化合物η、N,N-二甲基甲酰胺、 N,N-二異丙基乙胺在室溫下攪拌，然后加入化合物θ、以及2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，在20-25℃反應(yīng)，向反應(yīng)體系中加入水，用二氯甲烷萃取，有機(jī)相再用水洗滌，干燥，濃縮過柱，制得通式Ⅰ化合物。

通過閱讀說明書，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將更好地了解這些技術(shù)方案的特征和內(nèi)容。

【附圖說明】

下面通過參考附圖并結(jié)合實(shí)例具體地描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和實(shí)現(xiàn)方式將會更加明顯，其中附圖所示內(nèi)容僅用于對本發(fā)明的解釋說明，而不構(gòu)成對本發(fā)明的任何意義上的限制，在附圖中：

圖1為本發(fā)明所提供的通式Ⅰ化合物的合成路徑圖。

圖2-1所示是本發(fā)明實(shí)施一所制得化合物對CEM細(xì)胞的抑制曲線圖；

圖2-2所示是本發(fā)明實(shí)施一所制得化合物對Romas細(xì)胞的抑制曲線圖；

圖2-3所示是本發(fā)明實(shí)施一所制得化合物對HepG2細(xì)胞的抑制曲線圖；

圖2-4所示是本發(fā)明實(shí)施一所制得化合物對HeLa細(xì)胞的抑制曲線圖；

圖2-5所示是本發(fā)明實(shí)施一所制得化合物對L-O2細(xì)胞的抑制曲線圖；

圖3-1所示是本發(fā)明實(shí)施一所制得化合物的線粒體定位激光共聚焦顯微鏡圖；

圖3-2所示是對比化合物的線粒體定位激光共聚焦顯微鏡圖；

圖3-3所示是另一對比化合物的線粒體定位激光共聚焦顯微鏡圖；

圖3-4所示是再一對比化合物的線粒體定位激光共聚焦顯微鏡圖。

【具體實(shí)施方式】

本發(fā)明提供一種具有通式I的靶向抗腫瘤藥物F16與苯丁酸氮芥合成 的化合物：

其中，Y為NH、O、S；A、B、C、D、E為相同或不同的氫基、鹵基、烷基、鹵仿基、烷氨基、醚基或巰醚基，n＝0,1～18。

本發(fā)明提供的通式Ⅰ的化合物中，其烷基為-R，烷氨基為-NH-R，醚基為-O-R，巰醚基為-S-R；其中，R＝CH₃(CH₂)_m，m＝0,1～10。

更具體地說，在上述通式I中：Y代表NH、O、S中的任意一種；A、B、C、D、E則代表X、R、YR、CX_3、中的任意一種；其中X代表氫或鹵素，即H、F、Cl、Br、I中的任意一種；R為烷基CH₃(CH₂)_m，m＝0,1～10。

請參照圖1，本發(fā)明還提供一種制備上述通式Ⅰ化合物的方法，包括以下步驟：

S1、取化合物α：與4-甲基吡啶反應(yīng)得到化合物β：

其中X為鹵基，n＝0,1～18；化合物α與4-甲基吡啶在無水醇或醚溶劑中，加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)完全后，冷卻反應(yīng)體系至室溫，過濾，再用少量無水醇或醚溶劑洗滌。

S2、化合物β經(jīng)二碳酸二叔丁酯保護(hù)得到化合物γ：

具體為，將化合物β、四氫呋喃、無水碳酸鈉溶于水，室溫攪拌后緩慢滴加二碳酸二叔丁酯，在25-30℃反應(yīng)4小時；過濾，將濾液旋干，然后加入適量體積的二氯甲烷與無水醇或醚溶劑進(jìn)行攪拌，再過濾，將濾液再旋干得到化合物γ；其中，二氯甲烷與無水醇或醚溶劑的體積比為[8～15]:1。

S3、化合物γ經(jīng)與化合物δ：在哌啶作用下反應(yīng)得到 化合物ε：

具體為，將化合物γ、化合物δ、無水甲醇、哌啶升溫至50℃反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)體系旋干過柱，然后加入適量體積的二氯甲烷與甲醇進(jìn)行攪拌，再過濾，將濾液再旋干得到化合物ε；其中，氯甲烷與甲醇的體積比為[25～35]:1。

其中，Y為NH、O、S；A、B、C、D、E為相同或不相同的氫基、鹵基、烷基、鹵仿基、烷氨基、醚基或巰醚基。

S4、化合物ε經(jīng)鹽酸脫保護(hù)得到化合物η：

具體為，在化合物ε中添加甲醇，室溫滴加濃鹽酸，室溫反應(yīng)2至7小時，將反應(yīng)體系旋干得到化合物η。

S5、化合物η經(jīng)與化合物θ：

縮合反應(yīng)，即得到通式Ⅰ的化合物。具體為，將化合物η、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二異丙基乙胺在室溫下攪拌，然后加入化合物θ、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，在20-25℃反應(yīng)，向反應(yīng)體系中加入水，用二氯甲烷萃取，有機(jī)相再用水洗滌，干燥，濃縮過柱得到通式Ⅰ的化合物。

下面通過具體的實(shí)施例，進(jìn)一步闡述制備通式I化合物的方法：

實(shí)施例1

首先，取化合物1(3-溴丙胺氫溴酸鹽)與4-甲基吡啶反應(yīng)，化合物1結(jié)構(gòu)如下所示：

具體實(shí)施時，在反應(yīng)瓶中分別加入4-甲基吡啶(2g),3-溴丙胺氫溴酸鹽(1.0eq),無水甲醇(或無水乙醇、無水乙醚)10ml，然后加熱回流反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全，冷卻反應(yīng)體系至室溫，過濾，用少量甲醇洗滌，干燥得到白色固體即化合物2(5.0g)；本實(shí)施例中，化合物2的結(jié)構(gòu)如下所示：

緊接著，在反應(yīng)瓶中加入化合物2(2.27g)、四氫呋喃20ml、無水碳酸鈉(2.0eq)溶于水20ml，室溫攪拌30min，然后緩慢滴加二碳酸二叔丁酯(1.1eq)溶于四氫呋喃10ml，在25-30℃反應(yīng)4小時。過濾，將濾液旋干，然后加入適量體積的二氯甲烷與甲醇(體積比8:1～15:1，優(yōu)選10:1)攪拌一段時間，過濾，濾液再旋干得到淺粉色油狀物即化合物3(2.31g)，化合物3的結(jié)構(gòu)如下所示：

隨后，將化合物3與化合物4(吲哚-3-甲醛)反應(yīng)，

其具體步驟為：在反應(yīng)瓶中分別加入化合物3(2.31g)、吲哚-3-甲醛(1.0eq)、無水甲醇50ml，然后加入哌啶(0.9eq)、升溫至50℃反應(yīng)過 夜。反應(yīng)完全，將反應(yīng)體系旋干過柱，然后加入適量體積的二氯甲烷與甲醇(體積比25:1～35:1，優(yōu)選30:1)進(jìn)行攪拌，再過濾，將濾液再旋干得到深紅色半固狀物即化合物5(1.27g)，化合物5的結(jié)構(gòu)如下所示：

再接著，在反應(yīng)瓶中加入化合物5(1.27g)、甲醇10ml，室溫滴加濃鹽酸5ml，室溫反應(yīng)5小時，將反應(yīng)體系旋干得到深紅色半固狀物即化合物6(1.0g)，化合物6的結(jié)構(gòu)如下所示：

再后，將化合物6與化合物7(苯丁酸氮芥)反應(yīng)，

其具體步驟為：在反應(yīng)瓶中加入化合物6(100mg)、N,N-二甲基甲酰胺10ml、N,N-二異丙基乙胺(3.0eq)，室溫攪拌20min，然后加入苯丁酸氮芥(1.2eq)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.2eq)，在20-25℃反應(yīng)過夜。向反應(yīng)體系中加入水20ml，用二氯甲烷20ml×3萃 取，有機(jī)相再用水20ml×2洗滌，干燥，濃縮過柱得到100mg黃色泡沫狀固體即F16與苯丁酸氮芥合成的化合物8，其結(jié)構(gòu)式如下：

實(shí)施例2

制備化合物3的方式與實(shí)施例1中相同，在此不再贅述。

取化合物3與化合物9(6-氟吲哚-3-甲醛)反應(yīng)，

其具體步驟為：在反應(yīng)瓶中分別加入化合物3(1.0g)、6-氟吲哚-3-甲醛(1.0eq)、無水甲醇30ml，然后加入哌啶(0.9eq)，升溫至50℃反應(yīng)過夜，反應(yīng)完全，將反應(yīng)體系旋干過柱，然后加入適量體積的二氯甲烷與甲醇(35:1)進(jìn)行攪拌，再過濾，將濾液再旋干得到深紅色半固狀物即化合物10(0.7g)，化合物10的結(jié)構(gòu)如下所示：

然后，在反應(yīng)瓶中加入化合物10(0.5g)、甲醇5ml(或乙醇、乙醚)，室溫滴加濃鹽酸2.5ml，室溫反應(yīng)3小時。將反應(yīng)體系旋干得到深紅色半固狀物即化合物11(0.4g)，化合物11的結(jié)構(gòu)如下所示：

取化合物11與化合物7(苯丁酸氮芥)反應(yīng)，其具體步驟為：在反應(yīng)瓶中加入化合物11(100mg)、N,N-二甲基甲酰胺10ml、N,N-二異丙基乙胺(3.0eq)，室溫攪拌20min，然后加入苯丁酸氮芥(1.2eq)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.2eq)，在20-25℃反應(yīng)過夜。向反應(yīng)體系中加入水20ml，用二氯甲烷20ml×3萃取，有機(jī)相再用水20ml×2洗滌，干燥，濃縮過柱得到96mg黃色泡沫狀固體即F16與苯丁酸氮芥合成的化合物12，其結(jié)構(gòu)式如下：

實(shí)施例3

制備化合物3的方式與實(shí)施例1中相同，在此不再贅述。

取化合物3與化合物13(5-氟吲哚-3-甲醛)反應(yīng)，

其具體步驟為：在反應(yīng)瓶中分別加入化合物3(1.0g)、5-氟吲哚-3-甲醛(1.0eq)、無水甲醇30ml，然后加入哌啶(0.9eq)，升溫至50℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全，將反應(yīng)體系旋干過柱，然后加入適量體積的二氯甲烷與甲醇(25:1)進(jìn)行攪拌，再過濾，將濾液再旋干得到深紅色半固狀物即化合物14(0.75g)，化合物14的結(jié)構(gòu)如下所示：

隨后，在反應(yīng)瓶中加入化合物14(0.5g)、甲醇5ml，室溫滴加濃鹽酸2.5ml，室溫反應(yīng)3小時，將反應(yīng)體系旋干得到深紅色半固狀物即化合物15(0.42g)，化合物15的結(jié)構(gòu)如下所示：

最后取化合物15與化合物7反應(yīng)，其具體步驟為：在反應(yīng)瓶中加入化合物15(100mg)、N,N-二甲基甲酰胺10ml、N,N-二異丙基乙胺(3.0eq)， 室溫攪拌20min，然后加入苯丁酸氮芥(1.2eq)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.2eq)，在20-25℃反應(yīng)過夜。向反應(yīng)體系中加入水20ml，用二氯甲烷20ml×3萃取，有機(jī)相再用水20ml×2洗滌，干燥，濃縮過柱得到100mg黃色泡沫狀固體即F16與苯丁酸氮芥合成的化合物16，其結(jié)構(gòu)式如下：

實(shí)施例4

制備化合物3的方式與實(shí)施例1中相同，在此不再贅述。

取化合物3與化合物17(5-甲氧基吲哚-3-甲醛)反應(yīng)，

其具體步驟為：在反應(yīng)瓶中分別加入化合物3(1.0g)、5-甲氧基吲哚-3-甲醛(1.0eq)、無水甲醇30ml，然后加入哌啶(0.9eq)，升溫至50℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全，將反應(yīng)體系旋干過柱，然后加入適量體積的二氯甲烷與甲醇(30:1)進(jìn)行攪拌，再過濾，將濾液再旋干得到深紅色半固狀物即化合物18(0.80g)，化合物18的結(jié)構(gòu)如下所示：

隨后，在反應(yīng)瓶中加入化合物18(0.5g)、甲醇5ml，室溫滴加濃鹽酸2.5ml，室溫反應(yīng)3小時，將反應(yīng)體系旋干得到深紅色半固狀物即化合物19(0.45g,)，化合物19的結(jié)構(gòu)如下所示：

最后，取化合物19與化合物7反應(yīng)，其具體步驟為：在反應(yīng)瓶中加入化合物19(100mg)、N,N-二甲基甲酰胺10ml、N,N-二異丙基乙胺(3.0eq)，室溫攪拌20min，然后加入苯丁酸氮芥(1.2eq)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.2eq)，在20-25℃反應(yīng)過夜。向反應(yīng)體系中加入水20ml，用二氯甲烷20ml×3萃取，有機(jī)相再用水20ml×2洗滌，干燥，濃縮過柱得到100mg黃色泡沫狀固體即即F16與苯丁酸氮芥合成的化合物20，其結(jié)構(gòu)式如下：

藥物性能評價

1.體外抗腫瘤效應(yīng)評價

針對前述實(shí)施例一所制得的化合物8的進(jìn)行體外抗腫瘤效應(yīng)評價。鑒于苯丁酸氮芥是廣譜抗癌烷化劑，本實(shí)施例采用CEM、Romas、HeLa和HepG2細(xì)胞對其進(jìn)行藥效評價，同時LO2肝臟細(xì)胞對其進(jìn)行毒性檢測。

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞的大小接種4～40×103個于96孔板上，待生長24小時后，棄上清，然后按以下分組給藥：腫瘤細(xì)胞設(shè)不加藥組和加藥組(濃度2.5～160μM對腫瘤細(xì)胞，濃度50～800μM對LO2細(xì)胞),F為化合物6，CBL為化合物7(苯丁酸氮芥)，F(xiàn)+CBL為F和CBL等濃度的組合，F(xiàn)CBL為合成化合物8。每組設(shè)4～6個復(fù)孔，培養(yǎng)24或72小時，棄上清，加入100μl含0.5mg/ml的MTT(四氮唑鹽)無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)4h，加入100μl DMSO(二甲亞砜)，放置于微型振蕩儀上振蕩10min，再置于酶標(biāo)儀上570nm處檢測OD值。正常人細(xì)胞系LO2做對照。每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加，與相應(yīng)不加藥對照組比較，細(xì)胞增殖活性分別下降，說明化合物呈濃度依賴性抑制腫瘤細(xì)胞細(xì)胞增殖。而對正常肝細(xì)胞系L-O2細(xì)胞的增殖活性未有變化，顯示出該化合物對正常細(xì)胞具有低毒特性(如表1，圖2-1至圖2-5所示)。

表1 不同細(xì)胞的IC50值(24h)及不同化合物IC50比值

2.線粒體定位確證

對化合物8的線粒體進(jìn)行定位確證。將Hela接板光學(xué)培養(yǎng)皿后，將線粒體定位試劑Mitotracker和化合物8一塊與細(xì)胞進(jìn)行孵育1-2小時，激光共聚焦顯微鏡(600X)觀察拍照，紅色和綠色熒光進(jìn)行觀察共定位；同時將對比化合物也進(jìn)行相應(yīng)的定位，然后同等條件下觀察拍照，得到的結(jié)果如圖3-1到3-4所示。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。