一種Bcr-Abl雙倍體抑制劑及其制備方法和用途技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種Bcr-Abl雙倍體抑制劑及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：
慢性粒細(xì)胞白血病是染色體產(chǎn)生基因突變[t(9:22)(q34；q11)]相互易位，染色體9位的ABL基因和染色體22位的BCR基因相融合產(chǎn)生BCR-ABL，此融合的基因編碼一種210kDa酪氨酸激酶Bcr-Abl，這種蛋白是導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的主要原因。c-Abl在正常細(xì)胞中是存在于胞漿里的單倍體酪氨酸激酶，與Bcr融合后形態(tài)發(fā)生變化，由單倍體變成四聚體，由此該激酶始終處于被激活狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Bcr蛋白序列中存在可以引起多聚化的氨基酸序列導(dǎo)致Bcr-Abl四聚化。由于c-Abl在心肌等正常細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用，如果開(kāi)發(fā)選擇性抑制致癌性Bcr-Abl而非Abl的抑制劑，則有望大大降低此類抑制劑的心臟毒性等廣泛的副作用。2001年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)第一個(gè)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)伊馬替尼(Imatinib)1上市，用于慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的治療。作為第一代Bcr-Abl抑制劑，伊馬替尼已成為治療CML的一線藥物。但大多數(shù)患者最終都對(duì)伊馬替尼出現(xiàn)耐藥。隨后研究表明，IM耐藥性的發(fā)生可能與G250E、Q252H、Y253F、Y253H、E255K、E355G、E255V、T315A、T315I、F317L、F317V、M351T、F359V、H396P、M244V等Abl激酶活性區(qū)的基因突變有關(guān)，基因突變導(dǎo)致伊馬替尼與Abl激酶的親和性下降。絕大多數(shù)基因突變使伊馬替尼的親和性下降5-30倍，這是產(chǎn)生耐藥性的主要原因。其中T315I比較特殊，降低最為明顯，IC50降至6400nM左右，最近開(kāi)發(fā)的坡那替尼不僅對(duì)T315I有效，對(duì)野生型與絕大多數(shù)突變株均有效。從伊馬替尼與Abl蛋白的激酶部分的x-Ray共晶結(jié)構(gòu)上看，結(jié)構(gòu)中的甲級(jí)哌嗪部分的氮甲基部分暴露在溶劑中，兩個(gè)抑制劑該氮原子之間的直線距離為24安左右。Bcr-Abl由于是四聚體，可以同時(shí)與4個(gè)抑制劑相結(jié)合，如果通過(guò)鏈條將兩個(gè)抑制劑連接起來(lái)，則有望大大提高對(duì)四聚化的Bcr-Abl的親和性，從而起到選擇性抑制Bcr-Abl的作用，而Abl由于是單倍體，只能與一個(gè)抑制劑相結(jié)合，雙倍體抑制劑對(duì)酶的親和性不會(huì)有大的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種Bcr-Abl雙倍體抑制劑及其制備方法和用途。本發(fā)明提供的式Ⅰ化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其結(jié)構(gòu)式如下所示：本發(fā)明中，Linker表示連接分子。進(jìn)一步的，式Ⅰ中，Linker為(Z1)a–(Z2)b–(Z3)c；其中，Z1、Z2、Z3分別獨(dú)立地選自C(O)(CH2)dNH、CO(CH2)eC(O)、(CH2CH2)fNHC(O)、(CH2CH2)g-C(O)NH、(CH2)hC(O)(OCH2CH2)iNHC(O)(CH2)jC(O)、NH(CH2)k(OCH2CH2)l-O(CH2)mNH、(CH2)nC(O)(OCH2CH2)ONH(C(O)(CH2)pNH)qC(O)-alkyl、C(O)NH(CH2)rNHC(O)-(CH2)sC(O)(NHCH2CH2)tNH(C(O)(CH2)uNH)v-C(O)-alkyl；a～v分別獨(dú)立地選自1～20中任一數(shù)值。進(jìn)一步的，其結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明還提供了制備上述式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的方法。本發(fā)明制備上述式Ⅰ化合物的方法，它包括如下操作步驟：進(jìn)一步的，它包括如下操作步驟：(1)制備化合物2：(2)制備化合物BGC，即為式Ⅰ化合物：進(jìn)一步的，它包括如下操作步驟：i、制備化合物2：化合物1、三乙胺、4-(氯甲基)苯甲酰氯在二氯甲烷中，于室溫下攪拌反應(yīng)18h，得到反應(yīng)液；對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分離、純化，得到化合物2；ii、制備化合物6：①、制備化合物4化合物3、三乙胺、戊二酰氯在二氯甲烷中，于室溫下攪拌反應(yīng)6小時(shí)，得到反應(yīng)液；對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分離、純化，得到化合物4；②、制備化合物6化合物4、1-羥基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-甲基嗎啉在二氯甲烷中，在冰浴條件下反應(yīng)0.5小時(shí)后，加入化合物5，于室溫下反應(yīng)完全，得到反應(yīng)液；對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分離、純化，得到化合物6；iii、制備化合物BGC化合物2、化合物6、碳酸鉀在N,N-二甲基甲酰胺中，于100℃攪拌反應(yīng)18h，得到反應(yīng)液；對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分離、純化，得到化合物BGC。進(jìn)一步的，步驟i中，所述化合物1、三乙胺、4-(氯甲基)苯甲酰氯的摩爾比為18：35.6：21.3；所述化合物1與二氯甲烷的摩爾體積比為18：400mmol/ml；步驟ii的①中，所述化合物3、三乙胺、戊二酰氯的摩爾比為45.4：68.1：22.7；所述化合物3與二氯甲烷的摩爾體積比為45.4：300mmol/ml；步驟ii的②中，所述化合物4、1-羥基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-甲基嗎啉、化合物5的摩爾比為:1：1.2：1.2：3：2.1；所述化合物4與二氯甲烷的摩爾體積比為1：20mmol/ml；步驟iii中，所述化合物2、化合物6、碳酸鉀的摩爾比為0.28：0.09：2.69；所述化合物2與N,N-二甲基甲酰胺的摩爾體積比為0.28：20mmol/ml。發(fā)明還提供了上述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療細(xì)胞增殖疾病的藥物中的用途。上述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療細(xì)胞增殖疾病的藥物中的用途。進(jìn)一步的，所述藥物是酪氨酸激酶抑制劑。進(jìn)一步的，所述藥物是ABL抑制劑類藥物。進(jìn)一步的，所述藥物是BCR-ABL或其突變株抑制劑類藥物。進(jìn)一步的，所述BCR-ABL突變株為T315I突變株。進(jìn)一步的，所述細(xì)胞增殖疾病是癌癥。進(jìn)一步的，所述癌癥為慢性粒細(xì)胞白血病、腸間質(zhì)瘤、婦科瘤、隆突性皮膚纖維肉瘤、Ph+ALL。本發(fā)明提供的式Ⅰ化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，作為Bcr-Abl雙倍體抑制劑，能夠有效抑制酪氨酸激酶活性，可有效用于該類激酶異?；罨嚓P(guān)的疾病治療，對(duì)惡性腫瘤具有良好的治療作用，該類抑制劑的制備方法簡(jiǎn)便，成本低廉，具有良好的應(yīng)用前景。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說(shuō)明圖1、BGC對(duì)KBM5荷瘤鼠瘤體積的影響。具體實(shí)施方式本發(fā)明具體實(shí)施方式中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過(guò)購(gòu)買市售產(chǎn)品獲得?？s寫的中文名稱：HOBT：1-羥基苯并三唑；EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；NMM：N-甲基嗎啉；DMSO：二甲基亞砜。實(shí)施例1本發(fā)明化合物BGC的制備合成路線如下：(2)制備化合物BGC：具體合成步驟如下：a)制備化合物2將化合物1(5.0g,18.0mmol；生產(chǎn)廠家：上海旭剛生物科技有限公司)、三乙胺(3.6g,35.6mmol)溶解于二氯甲烷(400ml)中，將4-(氯甲基)苯甲酰氯(4.0g,21.3mmol)溶解于二氯甲烷(100ml)中，在0℃下，向反應(yīng)液中滴加，加畢后自然升至室溫?cái)嚢璺磻?yīng)18h，反應(yīng)瓶中析出固體，將反應(yīng)混合物過(guò)濾，收集到的固體用二氯甲烷、水洗滌，得到黃色固體化合物2(5.3g；收率68％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.23(s,1H),9.28(s,1H),8.97(s,1H),8.69(d,J＝4.4Hz,1H),8.52(m,2H),8.09(s,1H),7.97(d,J＝7.6Hz,2H),7.59-7.42(m,5H),7.22(d,J＝8.0Hz,1H),4.84(s,2H),2.23(s,3H).MS(ESI+)m/z:430[M+1]+。b)制備化合物4在室溫下，將化合物3(10.0g,45.4mmol；生產(chǎn)廠家：Sigma-Aldrich.)溶解于二氯甲烷(250ml)中，加入三乙胺(6.9g，68.1mmol)，再將戊二酰氯(3.8g,22.7mmol)溶解于二氯甲烷(50ml)中，并緩慢地向反應(yīng)液中滴加，加畢后在室溫下攪拌反應(yīng)6h，然后用水(200ml×2)洗滌反應(yīng)液，有機(jī)相用硫酸鈉干燥，真空濃縮蒸干溶劑。殘余物用硅膠柱層析法純化(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得到化合物4。(4.3g；收率35.4％)。c)制備化合物6在冰浴下，將化合物4(2.7g,5.0mmol)溶解于二氯甲烷(100ml)中，加入HOBT(0.81g,6.0mmol)、EDC(0.59g,6.0mmol)、NMM(1.52g,15mmol)反應(yīng)半小時(shí)，將化合物5(1.67g，10.5mmol，生產(chǎn)廠家：百靈威科技有限公司)分批加入到反應(yīng)液中，加畢后，逐漸升至室溫，反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)液用飽和氯化鈉水溶液(100ml×2)洗滌有機(jī)相，有機(jī)相用硫酸鈉干燥，真空濃縮蒸干溶劑，殘余物用硅膠柱層析法純化得到化合物6(1.3g；收率31.8％)。1HNMR(400MHz,D2O)3.62(30H,m),3.53(14H,m),3.21(8H,q,J＝7,2Hz).2.77(4H,t,J＝6.8Hz).2.21(4H,t,J＝7.6Hz).1.82(2H,m)。d)制備化合物BGC將化合物6(72mg,0.09mmol)、化合物2(120mg,0.28mmol)、K2CO3(350mg,2.69mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(20ml)加入到圓底燒瓶中，在100℃攪拌反應(yīng)18h，待反應(yīng)液冷卻至室溫后，將反應(yīng)液倒入劇烈攪拌的冰水中，析出固體，過(guò)濾，收集固體，殘余物通過(guò)制備高效液相純化得到橙色固體BGC(18mg；收率12％)。1HNMR(400MHz,D2O):δ9.40(s,2H),9.12(d,J＝8Hz，2H,),8.87(d,J＝5.2Hz,2H),8.50(bs,2H),8.13(t,J＝6.8Hz,2H),7.95(d,J＝7.6Hz,4H),7.90(s,2H),7.65(d,J＝8Hz,4H),7.45(d,J＝5.2Hz,2H),7.36(d,J＝8Hz,2H),7.24(d,J＝7.6Hz,2H),4.43(s,4H),3.66-3.44(m,44H),3.28(t,J＝6.8Hz,4H),3.22(t,J＝6.8Hz,4H),2.78(t,J＝6.8Hz,4H),2.26(s,6H),2.22(t,J＝7.2Hz,4H),1.87-1.70(m,10H).MS(ESI+)m/z:1604[M+1]+。以下通過(guò)試驗(yàn)例具體說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例1本發(fā)明化合物的藥用活性1、酪氨酸激酶抑制作用參照：AmyCardetal.,JournalofBiomolecularScreening14(1)2009；JudeDunneetal.,Assay&DrugDevelopmentTechnologiesVol.2,No.2,2004。利用MobilityShiftAssay的方法，對(duì)體外激酶Abl進(jìn)行本發(fā)明化合物BGC的篩選，化合物BGC濃度由100μM三倍稀釋法用100％DMSO依次稀釋至0.005μM，共10個(gè)濃度點(diǎn)，進(jìn)行檢測(cè)(2復(fù)孔)，采用化合物staurosporine作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，設(shè)溶媒對(duì)照(10％DMSO)和陰性對(duì)照(EDTA)。在384孔反應(yīng)板上通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)，檢測(cè)各濃度的化合物BGC對(duì)激酶Abl的抑制情況，Caliper上讀取轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)，并把轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化成抑制率。Percentinhibition＝(max-conversion)/(max-min)*100。其中max是指DMSO對(duì)照的轉(zhuǎn)化率，min是指無(wú)酶活對(duì)照的轉(zhuǎn)化率。根據(jù)每個(gè)濃度的抑制率計(jì)算化合物BGC對(duì)酪氨酸激酶Abl的半數(shù)抑制濃度IC50。抑制結(jié)果如下：化合物BGC的IC50：0.02μM；試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明化合物BGC對(duì)c-Abl酪氨酸激酶具有較強(qiáng)的抑制活性。2、本發(fā)明化合物BGC對(duì)KBM5(Bcr-Abl陽(yáng)性)腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制試驗(yàn)用ATP法測(cè)定本發(fā)明BGC系列化合物的細(xì)胞毒性，將KBM5細(xì)胞調(diào)整合適的細(xì)胞密度，以每孔140ul細(xì)胞懸液接種96孔板，每種細(xì)胞的接種密度為：2000-6000個(gè)；上述細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)箱中放置24小時(shí)使其完全附著在孔壁上，采用三倍稀釋法將本發(fā)明化合物BGC分別配制成合適的不同濃度，加入到預(yù)先接種了細(xì)胞的96孔板相應(yīng)的孔中，每孔10μL，使其最終濃度分別為：100μM、33.3μM、11.1μM、3.70μM、1.23μM、0.41μM、0.14μM、0.046μM、0.015μM。每個(gè)濃度分別設(shè)三個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)后，ATP法測(cè)定各孔細(xì)胞增殖情況，計(jì)算每個(gè)藥物濃度對(duì)KBM5細(xì)胞增殖的半數(shù)致死濃度IC50。試驗(yàn)結(jié)果：化合物BGC對(duì)KBM5(人源野生型Bcr-Abl)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性如下：化合物BGC的IC50：9μM；試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明化合物BGC在體外細(xì)胞水平上具有較強(qiáng)的抑制活性。3、本發(fā)明化合物BGC的體內(nèi)白血病皮下異種移植增殖抑制試驗(yàn)根據(jù)體外增殖抑制試驗(yàn)的結(jié)果，評(píng)估BGC在C57BL/6(Es-1c)裸鼠皮下移植人源白血病KBM5細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果。本發(fā)明化合物BGC的給藥劑量分別為：80mg/Kg、160mg/Kg、350mg/Kg，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(160mg/Kg的伊馬替尼Imatinib)和空白對(duì)照組(生理鹽水)，荷瘤鼠分組后每日給藥一次，連續(xù)給藥兩周后，檢測(cè)腫瘤的體積?？疾炷[瘤生長(zhǎng)是否可以被抑制、延緩或治愈。每周兩次或隔天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑。腫瘤體積的計(jì)算公式為：V＝0.5a×b2，a和b分別表示腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑。數(shù)據(jù)分析：T檢驗(yàn)用于兩組間比較；三組或多組間比較用one-wayANOVA。如果F值有顯著性差異，應(yīng)在ANOVA分析之后再進(jìn)行多重比較。two-wayANOVA用于分析聯(lián)合給藥組潛在的協(xié)同作用。用SPSS17.0進(jìn)行所有數(shù)據(jù)分析；p<0.05認(rèn)為有顯著性差異。試驗(yàn)結(jié)果：本發(fā)明化合物BGC對(duì)KBM5細(xì)胞皮下移植腫瘤模型的體內(nèi)藥效學(xué)研究結(jié)果，見(jiàn)圖1。在皮下瘤模型下，本發(fā)明化合物BGC具有抗腫瘤藥效，在350mg/kg劑量下與伊馬替尼160mg/kg的抑制效果相當(dāng)。4、本發(fā)明化合物BGC的初步藥代動(dòng)力學(xué)研究雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠單劑量靜脈受試本發(fā)明化合物BGC后，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法定量測(cè)定其在主要組織中的濃度及血藥濃度，考察受試藥物在雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠體內(nèi)血液與主要組織中的分布差異；以伊馬替尼作為對(duì)比。實(shí)驗(yàn)方法與過(guò)程如下：雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠，體重18-25g，6-8周齡，另外，3只雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠用于采集空白樣品，配制分析所需的標(biāo)準(zhǔn)曲線。靜脈注射給藥劑量為1mg/kg，給藥體積均為5mL/kg。靜脈注射給藥溶媒：DMSO:SolutolHS15:Saline＝5:5:90,v/v/v。建立LC-MS/MS方法，用內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定受試藥物血藥濃度及組織濃度，線性范圍1～1000ng/mL，定量下限范圍一般為1ng/mL。雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠經(jīng)靜脈注射給藥后在0.25h，2h，8h和24h單次從小鼠尾靜脈采集全血約20μL，用K2EDTA抗凝，按照體積比加入3倍的重蒸水得到稀釋后的血樣，保存于-70℃中直至分析。同時(shí)采集心，肝，脾，肺，腎，胃，小腸，胰腺等組織樣品，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱重并記錄，然后保存于-70℃中直至分析。將稱重過(guò)的臟器組織解凍后，心，肝，脾，肺，腎，胃，小腸，胰腺加入3倍PBS緩沖鹽用Beadbeater勻漿；骨髓樣品采集時(shí)采用0.3mL的PBS緩沖鹽沖洗，然后12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，移去0.25mL上清液，剩余的細(xì)胞樣品加入150mL的PBS緩沖液勻漿。數(shù)據(jù)分析：采用WinNonlin(版本6.2)軟件，按非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明化合物BGC的半衰期(t1/2)為3.5小時(shí)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于伊馬替尼的半衰期(t1/2為1.5h)；與伊馬替尼相比，本發(fā)明化合物BGC在經(jīng)過(guò)靜脈注射后的藥代動(dòng)力學(xué)特性上具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。綜上所述，本發(fā)明提供的式Ⅰ化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，作為Bcr-Abl雙倍體抑制劑，能夠有效抑制酪氨酸激酶活性，可有效用于該類激酶異?；罨嚓P(guān)的疾病治療，對(duì)惡性腫瘤具有良好的治療作用，該類抑制劑的制備方法簡(jiǎn)便，成本低廉，具有良好的應(yīng)用前景。