本發(fā)明涉及乳酸細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物抑制黃嘌呤氧化酶作用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：尿酸是體內(nèi)嘌呤代謝作用的最終產(chǎn)物。血中的高尿酸水平導(dǎo)致尿酸結(jié)晶的形成，其沉積在關(guān)節(jié)、腎臟及其它器官。當(dāng)血中尿酸濃度高于7毫克/分升時(shí)，即視為高尿酸血癥。高尿酸血癥是一種常見的代謝病癥，它與痛風(fēng)、高血壓、心血管疾病、糖尿病及腎臟疾病相關(guān)聯(lián)。據(jù)1993年至2008年在臺(tái)灣進(jìn)行的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，患有高尿酸血癥的男性與女性病患的百分比分別為21.6％與9.57％。黃嘌呤氧化酶是尿酸合成作用中的關(guān)鍵酶。因此，抑制黃嘌呤氧化酶活性可減少尿酸的產(chǎn)生。誠然，黃嘌呤氧化酶抑制劑亦即尿酸酶可有效降低血中的尿酸濃度。但尿酸酶并不是存在于人體內(nèi)的一種酶。其通常以重組型哺乳動(dòng)物蛋白的形式分離出來，通過靜脈注射的方式給藥。因此，其生產(chǎn)成本可能昂貴，在給藥上也可能困難。異嘌呤醇也是一種黃嘌呤氧化酶抑制劑。臨床上用該化合物來降低血清尿酸水平。然而，異嘌呤醇具有副作用，如過敏反應(yīng)、胃腸不適、白血球減少癥、血小板減少癥、肝炎、腎病及6-巰嘌呤中毒等，在上述的某些情況下甚至可能導(dǎo)致死亡。鑒于目前高尿酸血癥療法的缺點(diǎn)，許多生物制藥公司將重心放在開發(fā)新的降尿酸劑上。例如，izumida等人(j.antibiotics，第50期第916-918頁)指出已從海洋細(xì)菌橙黃農(nóng)桿菌(agrobacteriumaurantiacum)分離出可降低尿酸水平的化合物，其名稱為羥阿卡酮(hydroxyakalone)。其它微生物物種也表現(xiàn)出降尿酸能力，包括醋酸菌(acetobacteraceti)、巴斯德醋酸桿菌(acetobacterpasteurianus)、過氧化醋酸桿菌(acetobacterperoxydans)、脆壁克魯維酵母(kluyveromycesfragilis)、枯草桿菌(bacillussubtilis)、發(fā)酵乳酸桿 菌(lactobacillusfermentum)、戊糖乳酸桿菌(lactobacilluspentosus)、加氏乳酸桿菌(lactobacillusgasseri)、口乳酸桿菌(lactobacillusoris)、比菲德氏龍根菌(bifidobacteriumlongum)及啤酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)等菌株。具體見美國專利申請(qǐng)公開案2010/0316618、2011/0014168及2013/0330299；歐洲專利申請(qǐng)公開案2457576與1649863；中國專利申請(qǐng)公開案cn102370859；及韓國專利申請(qǐng)公開案kr20130099653與kr20130004456。目前研發(fā)容易生產(chǎn)、給藥安全、來自天然來源的新穎黃嘌呤氧化酶抑制劑仍然有不少需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開一種用于降低個(gè)體的尿酸水平的方法。該方法步驟包括：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)醋酸細(xì)菌以形成一種組成物，以及對(duì)于有需要的個(gè)體以所述組成物給藥，其劑量為有效降低該個(gè)體尿酸水平的劑量，其中所述醋酸細(xì)菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌(gluconacetobacterhansenii)或巴斯德醋酸桿菌(acetobacterpasteurianus)。本發(fā)明還公開一種用于抑制黃嘌呤氧化酶的方法。該方法的步驟包括：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)醋酸細(xì)菌，以形成一種組成物；以及將黃嘌呤氧化酶與所述組成物接觸。同樣的，所述醋酸細(xì)菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還公開一種用于生產(chǎn)組成物的方法，該組成物用于降低個(gè)體的尿酸水平。該方法的步驟包括將醋酸細(xì)菌接種到培養(yǎng)基中，以及在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該醋酸細(xì)菌。所述醋酸細(xì)菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。此外，本發(fā)明還提供一種用于降低個(gè)體的尿酸水平的組成物。該組成物中含有醋酸細(xì)菌的代謝產(chǎn)物。所述醋酸細(xì)菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。在如下的說明書、附圖及實(shí)例中，闡明本發(fā)明的一或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)。從數(shù)個(gè)實(shí)施例的詳細(xì)說明中以及從申請(qǐng)專利范圍中，將知悉本發(fā)明的其它特性、目標(biāo)及優(yōu)點(diǎn)。本申請(qǐng)案所引述的所有文獻(xiàn)與專利文件都在此完整地并入本案以為參考數(shù)據(jù)。附圖說明圖1為表示醋酸細(xì)菌菌株的黃嘌呤氧化酶抑制活性的條形圖；圖2為表示在不同的培養(yǎng)基中生長的巴斯德醋酸桿菌的ahu02菌株的黃嘌 呤氧化酶抑制活性的條形圖；圖3為表示在不同體積的培養(yǎng)基中生長一段特定時(shí)間的巴斯德醋酸桿菌的ahu02菌株的黃嘌呤氧化酶抑制活性的條形圖。具體實(shí)施方式如上所述，本發(fā)明公開一種用于降低個(gè)體的尿酸水平的方法，其步驟包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)醋酸細(xì)菌(漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌)，以形成一種組成物。醋酸細(xì)菌可選自巴斯德醋酸桿菌的ahu01與ahu02菌株，它們的保藏登記號(hào)分別為dsm28893與dsm28894?；蛘?，巴斯德醋酸桿菌菌株為ahu03與ahu04菌株。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，醋酸細(xì)菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌的ahu06菌株，其保藏登記號(hào)為dsm28902。培養(yǎng)步驟是在培養(yǎng)基中進(jìn)行。培養(yǎng)基可為但不限于m1a培養(yǎng)液、稻米萃取物、高粱萃取物、葡萄汁及梅汁。培養(yǎng)基中不含蘋果汁。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，該方法在培養(yǎng)之后、同時(shí)在所述組成物給藥之前，還包括從培養(yǎng)基中除去醋酸細(xì)菌的步驟。所述組成物可為醋或健康飲料。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，該方法包括將組成物冷凍干燥形成粉末的步驟。在實(shí)施例中，該組成物以口服方式給藥至個(gè)體。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，該個(gè)體罹患痛風(fēng)或高尿酸血癥。該組成物的給藥量，是有效降低該個(gè)體的尿酸水平的劑量。例如，熟悉該技術(shù)方案的人員可通過測(cè)量個(gè)體的血中尿酸濃度變化，輕易地確定該有效劑量。本發(fā)明還提供一種用于抑制黃嘌呤氧化酶的方法。如上所述，該方法需要在培養(yǎng)基中培養(yǎng)醋酸細(xì)菌，以形成一種組成物。醋酸細(xì)菌可為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。在一實(shí)施例中，醋酸細(xì)菌選自巴斯德醋酸桿菌的ahu01、ahu02、ahu03及ahu04菌株。在另一實(shí)施例中，該醋酸細(xì)菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌的ahu06菌株。如上所述，培養(yǎng)步驟是在培養(yǎng)基中進(jìn)行。培養(yǎng)基可為但不限于m1a培養(yǎng)液、稻米萃取物、高粱萃取物、葡萄汁及梅汁。培養(yǎng)基中不含蘋果汁。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，該方法在培養(yǎng)之后，同時(shí)在該組成物與黃嘌呤氧化酶接觸之前，包括從培養(yǎng)基中除去醋酸細(xì)菌的步驟。在一實(shí)施例中，接觸步驟可在試管內(nèi)進(jìn)行。例如，可將黃嘌呤氧化酶的制劑 與該組成物一起置于容器中。在另一實(shí)施例中，通過口服方式將該組成物給藥至具有黃嘌呤氧化酶的個(gè)體，完成該接觸步驟。如上述的一種用于降低個(gè)體的尿酸水平的組成物的生產(chǎn)方法，該方法的步驟包括將醋酸細(xì)菌接種至培養(yǎng)基的步驟。所述醋酸細(xì)菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌。在一實(shí)施例中，醋酸細(xì)菌選自巴斯德醋酸桿菌的ahu01、ahu02、ahu03及ahu04菌株。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，該醋酸細(xì)菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌的ahu06菌株。該方法的步驟還包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述醋酸細(xì)菌，以形成組成物。培養(yǎng)基可為但不限于m1a培養(yǎng)液、稻米萃取物、高粱萃取物、葡萄汁及梅汁。培養(yǎng)基中不含蘋果汁。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，該方法在培養(yǎng)之后、同時(shí)在該組成物給藥之前，還包括從培養(yǎng)基中除去醋酸細(xì)菌的步驟。在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，在除去醋酸細(xì)菌的步驟之前，醋酸細(xì)菌的培養(yǎng)密度為1×107至1×108個(gè)細(xì)胞/毫升。按上述方式所生成的組成物可為醋或健康飲料。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，該方法包括將組成物冷凍干燥形成粉末的步驟。本發(fā)明公開一種用于降低個(gè)體的尿酸水平的組成物，組成物中含有漢氏葡糖酸醋酸桿菌或巴斯德醋酸桿菌的代謝產(chǎn)物。如上所述，醋酸細(xì)菌可選自巴斯德醋酸桿菌的ahu01、ahu02、ahu03及ahu04菌株。在一實(shí)施例中，所述醋酸細(xì)菌為漢氏葡糖酸醋酸桿菌的ahu06菌株。所述組成物可為粉末形式。在一實(shí)施例中，所述組成物還含有食品配料，如添加劑、防腐劑、著色劑及調(diào)味劑。在另一實(shí)施例中，所述組成物包括一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，所述組成物是一種食品。無需進(jìn)一步詳盡說明，熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，最大限度實(shí)施本發(fā)明。因此，應(yīng)理解下列特定實(shí)例僅用于說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明未公開內(nèi)容。實(shí)例實(shí)施例1：醋酸細(xì)菌產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶抑制活性將51株的醋酸細(xì)菌菌株分別接種至m1a平皿(2.5％甘露糖醇、0.5％酵母萃取物、0.3％蛋白胨及2％瓊脂)上，并于該平皿上在30℃溫度下培養(yǎng)2天，以 形成菌落。黃嘌呤氧化酶抑制活性的測(cè)量方法如下所述。首先，從m1a平皿刮取10微升的不同菌株，添加至96孔式平皿的孔中。然后在每個(gè)孔中添加150微升的50mm磷酸鹽緩沖型食鹽水(pbs)及80微升的150m黃嘌呤。在孔中添加10微升的黃嘌呤氧化酶(0.1單位)之前，測(cè)定在290奈米的初始吸光度數(shù)值(od之前)。之后，在25℃溫度下平皿培養(yǎng)30分鐘，再測(cè)定其在290奈米的吸光度數(shù)值(od之后)。依據(jù)下列公式計(jì)算不同試樣的黃嘌呤氧化酶抑制活性：結(jié)果見圖1。在所檢測(cè)的51株不同的醋酸細(xì)菌菌株中，僅7株菌株對(duì)于黃嘌呤氧化酶的抑制作用超過30％。特別是，巴斯德醋酸桿菌的ahu01菌株對(duì)于黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用達(dá)73.6％。按照布達(dá)佩斯條約的條款，本案申請(qǐng)人于2014年6月5日將巴斯德醋酸桿菌的ahu01與ahu02菌株保藏于德國布倫瑞克d-38124因荷夫街(inhoffenstr.)7b的國際菌株寄存機(jī)構(gòu)萊布尼茲研究所dsmz-德國微生物與細(xì)胞培養(yǎng)保存中心。巴斯德醋酸桿菌的ahu01與ahu02菌株的保藏登記號(hào)分別為dsm28893與dsm28894。本案申請(qǐng)者還于2014年6月5日將漢氏葡糖酸醋酸桿菌的ahu06菌株寄存于上述儲(chǔ)存庫，其保藏登記號(hào)為dsm28902。實(shí)施例2：培養(yǎng)基對(duì)醋酸細(xì)菌的黃嘌呤氧化酶抑制作用的影響將巴斯德醋酸桿菌的ahu02菌株接種在m1a平皿上，于30℃溫度下培養(yǎng)4天。用7毫升的無菌m1a種菌培養(yǎng)液清洗平皿。將含有細(xì)胞的種菌培養(yǎng)液(1毫升)接種到50毫升的位于250毫升的三角燒瓶中的不同培養(yǎng)基中。在125rpm轉(zhuǎn)速振蕩下，接種后的培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)7天。如上述方法分析不同培養(yǎng)基的試樣對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性。結(jié)果如圖2所示。巴斯德醋酸桿菌的ahu02菌株產(chǎn)生最高的黃嘌呤氧化酶抑制活性水平，其抑制作用達(dá)到60％。相反地，當(dāng)巴斯德醋酸桿菌的ahu02菌株在蘋果汁中生長之后，未檢測(cè)到其對(duì)于黃嘌呤氧化酶活性有抑制作用。當(dāng)巴斯德醋酸桿菌的ahu02菌株在高粱、葡萄汁、稻米萃取物及梅汁中培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生從15％至50％的中等水平的抑制活性。實(shí)施例3：培養(yǎng)時(shí)間和體積對(duì)醋酸細(xì)菌的黃嘌呤氧化酶抑制作用的影響如上文的實(shí)施例2中所述，制備含有巴斯德醋酸桿菌的ahu02菌株的種菌培養(yǎng)液。種菌培養(yǎng)液是按照2％體積/體積添加至位于1公升的三角振蕩瓶中的200、300及400毫升的sps培養(yǎng)基(1％蔗糖、1％蛋白胨、1％大豆蛋白胨及0.2％硝酸鈉)中，并在125rpm轉(zhuǎn)速振蕩下，于30℃培養(yǎng)3至10天。如上文的實(shí)施例1中所述方法測(cè)量黃嘌呤氧化酶的抑制作用。結(jié)果如圖3所示。和在300毫升或400毫升的培養(yǎng)基中生長的巴斯德醋酸桿菌的ahu02菌株相比，在200毫升的培養(yǎng)體積中生長的菌株在所有時(shí)間點(diǎn)所產(chǎn)生的黃嘌呤氧化酶抑制活性水平最高。已知培養(yǎng)體積越小，在培養(yǎng)期間的培養(yǎng)加氧作用的效率越高。在不受限于理論的前提下，巴斯德醋酸桿菌很可能需要高的氧氣水平，才能有效率地產(chǎn)生氧化酶抑制活性。當(dāng)巴斯德醋酸桿菌的ahu02菌株在200毫升的體積中培養(yǎng)3天之后，所獲得的黃嘌呤氧化酶抑制活性水平最高。該水平隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而降低，在培養(yǎng)10天之后降低將近65％。在300毫升與400毫升的培養(yǎng)中，觀察到黃嘌呤氧化酶抑制活性也有隨時(shí)間降低的類似現(xiàn)象。實(shí)施例4：葡萄糖濃度對(duì)醋酸細(xì)菌所產(chǎn)生的黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響如上文的實(shí)施例2中所述，制備含有巴斯德醋酸桿菌的ahu01菌株的種菌培養(yǎng)液。在一個(gè)250毫升的三角燒瓶中，將0.5毫升的種菌培養(yǎng)液接種至50毫升的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基分別含有自8％至16％(重量/體積)的不同葡萄糖濃度。除了葡萄糖之外，培養(yǎng)基還含有1.5％大豆蛋白胨和3％酵母萃取物。在150rpm轉(zhuǎn)速振蕩之下，將培養(yǎng)物于30℃培養(yǎng)7天。按照下列步驟，通過hplc測(cè)量黃嘌呤氧化酶的抑制活性。在反應(yīng)試管中，將880微升的黃嘌呤(于100mmpbs中的濃度為50微克/毫升)、40微升的50mmpbs或40微升的培養(yǎng)上清液預(yù)先混合，再添加80微升的黃嘌呤氧化酶(0.1單位)引發(fā)反應(yīng)。在30℃溫度下反應(yīng)培養(yǎng)30分鐘，之后加入等體積的無水乙醇終止反應(yīng)。將終止后的反應(yīng)液通過0.22微米的薄膜過濾器過濾，再用hplc分析該反應(yīng)中的黃嘌呤含量。如下計(jì)算試樣的黃嘌呤氧化酶抑制活性：結(jié)果示如表1所示：表1.黃嘌呤氧化酶的抑制活性葡萄糖濃度黃嘌呤氧化酶抑制作用8a32.74b1041.971255.841668.12a數(shù)值表示培養(yǎng)基中之葡萄糖的重量/體積％。b數(shù)值表示對(duì)于黃嘌呤氧化酶活性的抑制百分比。在生長培養(yǎng)基的葡萄糖含量與在該培養(yǎng)基中生長的巴斯德醋酸桿菌所產(chǎn)生的黃嘌呤氧化酶活性水平之間，存在明確的相關(guān)性。實(shí)施例5治療尿酸血癥的實(shí)驗(yàn)將巴斯德醋酸桿菌的ahu01菌株接種到一個(gè)m1a平皿上，于30℃溫度下培養(yǎng)2天。用7毫升的無菌水清洗該平皿，以無菌水作為種菌培養(yǎng)液。將0.5毫升的種菌培養(yǎng)液接種到裝有50毫升的訂制培養(yǎng)基(1％大豆蛋白胨、0.2％酵母萃取物、3％葡萄糖、0.2％麥芽萃取物及3％果糖)的250毫升的三角燒瓶中；及在150rpm轉(zhuǎn)速振蕩下，于30℃培養(yǎng)7天。然后收集培養(yǎng)基，于3000rpm離心15分鐘。在離心之后，收集上清液，進(jìn)行冷凍干燥，得到固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物，以供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之用。以icr小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。使用一種尿酸酶抑制劑即氧嗪酸鉀，在小鼠中引發(fā)高血清尿酸水平。讓小鼠禁食1小時(shí)，然后經(jīng)由喂食管喂食食鹽水或氧嗪酸鉀(400毫克/公斤)。1小時(shí)之后，給經(jīng)氧嗪酸鉀喂食的小鼠喂食鹽水、異嘌呤醇(10毫克/公斤)或如上述所制備的巴斯德醋酸桿菌的ahu01菌株發(fā)酵產(chǎn)物(每只小鼠喂食懸浮于食鹽水中的150毫克或200毫克的發(fā)酵產(chǎn)物)。在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中各使用10只動(dòng)物。1小時(shí)之后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分析它們的血清尿酸水平。結(jié)果見表2。表2.巴斯德醋酸桿菌的ahu01菌株的發(fā)酵產(chǎn)物可降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血清尿酸水平實(shí)驗(yàn)組a血清尿酸濃度食鹽水對(duì)照組3.51±0.02毫克/分升氧嗪酸鉀(400毫克/公斤)4.91±0.08毫克/分升氧嗪酸鉀+異嘌呤醇(10毫克/公斤)2.82±0.28毫克/分升氧嗪酸鉀+150毫克發(fā)酵產(chǎn)物2.98±0.13毫克/分升氧嗪酸鉀+200毫克發(fā)酵產(chǎn)物2.94±0.12毫克/分升a喂食食鹽水或化合物的小鼠(每種條件的n＝10)以總體積為200微升顯示其它實(shí)施例在本說明書中所公開的所有特性可按任何組合方式進(jìn)行組合。在本說明書中所公開的各項(xiàng)特性可由供相同、等效或類似目的所用的替代特性所置換。因而，所公開的各項(xiàng)特性僅為一通用系列的等效或類似特性中之一實(shí)例，除非另有明確說明。從上述說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易了解本發(fā)明的本質(zhì)特性，并可進(jìn)行本發(fā)明的各種修改與修飾，使其適合各種用途與條件，而不偏離本發(fā)明的精神與范圍。因此，其它實(shí)施例亦涵蓋在本申請(qǐng)專利范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12