本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種藥用真菌桑黃的活性成分多糖的提取方法。

背景技術(shù)：
桑黃又名鮑氏層孔菌(Phellinusigniarius)，是銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)的真菌，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、消炎、增強(qiáng)免疫等藥理活性。桑黃是目前國際公認(rèn)的生物抗癌領(lǐng)域中效果排在第一位的藥用菌，是國際醫(yī)藥界與保健品行業(yè)抗癌產(chǎn)品的生產(chǎn)原料，市場(chǎng)潛力巨大。桑黃在自然界中很難形成桑黃子實(shí)體，并且人工栽培技術(shù)還不成熟，這些都是影響桑黃產(chǎn)量的重要因素。目前，桑黃的液體發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)成熟，可以生產(chǎn)出大量的菌絲體用于獲得桑黃菌絲多糖。多糖作為桑黃真菌一種非常重要的活性物質(zhì)，其具有非常好的藥效作用。現(xiàn)代科學(xué)研究證實(shí)，桑黃多糖的藥理活性主要有抗腫瘤、抗癌、抗突變、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、抗衰老等。桑黃多糖作為活性物質(zhì)，在桑黃多糖的提取過程中，保持多糖的活性就尤為重要。目前提取桑黃多糖的方法主要有熱水浸提法、超聲破碎法、酶解法、超聲輔助復(fù)合酶法等，其中熱水浸提法的提取溫度一般為90～100℃，雖然可提高多糖得率，但得到的多糖活性明顯降低；超聲破碎法在合適的超聲功率條件下，可以破碎細(xì)胞壁從而提高多糖得率，但由于在操作過程中剪切力過大，往往導(dǎo)致部分多糖分子結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)而使多糖活性明顯降低；酶解法提取成本較高，不適合工業(yè)生產(chǎn)中大量提取多糖。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有桑黃多糖提取方法存在的桑黃多糖活性低的問題，提供一種操作簡單，能很好保持多糖活性的低溫低壓提取高活性桑黃多糖的方法。解決上述問題所采用的技術(shù)方案是：將桑黃菌絲體與水按料液比為1g:40～60mL混合均勻，在壓力為-0.04～-0.07MPa、溫度為50～60℃下提取1～3小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。本發(fā)明優(yōu)選將桑黃菌絲體與水按料液比為1g:50mL混合均勻，在壓力為-0.04～-0.07MPa、溫度為60℃下提取2小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。本發(fā)明最佳選擇將桑黃菌絲體與水按料液比為1g:50mL混合均勻，在壓力為-0.06MPa、溫度為60℃下提取2小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。本發(fā)明在低壓條件下進(jìn)行桑黃多糖提取，使得桑黃菌絲體細(xì)胞壁破裂溶出多糖，從而提高多糖產(chǎn)量，在此過程中，沒有物理剪切力破壞多糖結(jié)構(gòu)，又在較低的溫度環(huán)境中保護(hù)了多糖活性結(jié)構(gòu)，使得提取得到的桑黃多糖以最佳的活性結(jié)構(gòu)溶于提取液中，從而獲得了高活性的桑黃多糖。附圖說明圖1是葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2是Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。下面實(shí)施例中的桑黃菌絲體按下述方法制備而成：1、菌株活化配制一級(jí)種子培養(yǎng)基(2％葡萄糖、25％土豆、1％MgSO4、1％KH2PO4、1.3％蘆丁、0.2％CaCl2、0.2％硫酸亞鐵、pH值為6.5)，取保存的菌種斜面，挑取3～4塊桑黃菌絲塊接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中，250mL搖瓶裝液量50mL、溫度28℃、轉(zhuǎn)速160rpm，培養(yǎng)10天，得到一級(jí)種子；配制二級(jí)種子培養(yǎng)基(2％葡萄糖、25％土豆、1％MgSO4、1％KH2PO4、0.2％CaCl2、0.2％硫酸亞鐵、pH值為6.5)，取一級(jí)種子接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中，250mL搖瓶裝液量80mL、接種量10％、溫度28℃、轉(zhuǎn)速160rpm，培養(yǎng)6天，得到二級(jí)種子。2、桑黃菌絲發(fā)酵配制發(fā)酵培養(yǎng)基(5％葡萄糖、1.36％麥芽粉、0.24％天門冬氨酸、0.035％FeSO4、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、0.4％吐溫80、復(fù)合維生素0.5％，初始pH值為6.5)，將二級(jí)種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝液量150mL、接種量10％、溫度28℃、轉(zhuǎn)速160rpm，培養(yǎng)7天，9000rpm離心15分鐘，收集菌絲體，用清水反復(fù)沖洗菌絲體直至除去發(fā)酵液，然后用四層紗布過濾菌絲體，置于50℃恒溫烘箱中烘干，得到桑黃菌絲體，于-20℃冰箱保存。實(shí)施例1將10g桑黃菌絲體加入500mL去離子水中混合均勻，在壓力為-0.04MPa、溫度為60℃下提取2小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。實(shí)施例2將10g桑黃菌絲體加入500mL去離子水中混合均勻，在壓力為-0.05MPa、溫度為60℃下提取2小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。實(shí)施例3將10g桑黃菌絲體加入500mL去離子水中混合均勻，在壓力為-0.06MPa、溫度為60℃下提取2小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。實(shí)施例4將10g桑黃菌絲體加入500mL去離子水中混合均勻，在壓力為-0.07MPa、溫度為60℃下提取2小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。實(shí)施例5將10g桑黃菌絲體加入400mL去離子水中混合均勻，在壓力為-0.06MPa、溫度為60℃下提取1小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。實(shí)施例6將10g桑黃菌絲體加入400mL去離子水中混合均勻，在壓力為-0.05MPa、溫度為60℃下提取2小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。實(shí)施例7將10g桑黃菌絲體加入400mL去離子水中混合均勻，在壓力為-0.04MPa、溫度為60℃下提取3小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。實(shí)施例8將10g桑黃菌絲體加入600mL去離子水中混合均勻，在壓力為-0.06MPa、溫度為60℃下提取1小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。實(shí)施例9將10g桑黃菌絲體加入600mL去離子水中混合均勻，在壓力為-0.05MPa、溫度為60℃下提取2小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。實(shí)施例10將10g桑黃菌絲體加入600mL去離子水中混合均勻，在壓力為-0.04MPa、溫度為60℃下提取3小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到活性桑黃多糖。為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人將本發(fā)明實(shí)施例1～10的提取方法分別與熱水浸提法和超聲協(xié)助提取法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室對(duì)比試驗(yàn)，具體試驗(yàn)情況如下：熱水浸提法：將桑黃菌絲體與去離子水按料液比為1g:50mL混合均勻，分別在溫度為60、70、80、90、100℃下提取2小時(shí)，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到桑黃多糖。超聲協(xié)助提取法：將桑黃菌絲體與去離子水按料液比為1g:50mL混合均勻，在溫度為60℃下超聲提取2小時(shí)，超聲功率分別為500W、600W、700W，離心分離，上清液用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇水溶液在4℃下醇沉12小時(shí)，得到桑黃多糖。根據(jù)下述方法檢測(cè)不同提取方法對(duì)桑黃多糖得率和總抗氧化活性的影響，每種提取方法重復(fù)試驗(yàn)3次，試驗(yàn)結(jié)果見表1～3。桑黃多糖含量的測(cè)定：苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得470nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y＝0.0019x+0.0064，其中x為葡萄糖濃度，y為470nm處OD值，R2＝0.9904，見圖1。桑黃多糖得率計(jì)算：桑黃多糖得率＝桑黃多糖含量/提取菌絲量×100％桑黃多糖總抗氧化能力測(cè)定：使用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(ABTS法)，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得734nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y＝0.1403x+0.0289，其中x為Trolox的抗氧化能力，y為734nm處OD值，R2＝0.9965，見圖2。表1本發(fā)明提取方法的測(cè)定結(jié)果桑黃多糖得率(％)總抗氧化能力(mM)實(shí)施例15.41±0.036.16±0.02實(shí)施例25.55±0.056.43±0.03實(shí)施例35.58±0.036.48±0.01實(shí)施例45.52±0.046.21±0.02實(shí)施例55.27±0.016.18±0.02實(shí)施例65.35±0.036.33±0.04實(shí)施例75.42±0.036.28±0.03實(shí)施例85.31±0.026.26±0.02實(shí)施例95.46±0.046.44±0.02實(shí)施例105.53±0.036.37±0.01表2熱水浸提法的測(cè)定結(jié)果提取溫度(℃)桑黃多糖得率(％)總抗氧化能力(mM)603.98±0.044.03±0.05704.43±0.024.57±0.03805.12±0.054.62±0.04905.45±0.034.41±0.021005.57±0.044.34±0.03表3超聲協(xié)助提取法的測(cè)定結(jié)果提取溫度(℃)提取功率(W)桑黃多糖得率(％)總抗氧化能力(mM)605005.50±0.024.54±0.01606005.43±0.054.46±0.03607005.41±0.044.43±0.02對(duì)比表1和表2的試驗(yàn)結(jié)果可見，熱水浸提法的提取溫度為60℃時(shí)，桑黃多糖的得率僅為3.98％，雖然隨著提取溫度的升高桑黃多糖的得率逐漸升高，但桑黃多糖的活性普遍較低，總抗氧化性最大僅為4.62mM。而采用本發(fā)明提取方法，桑黃多糖的得率明顯高于熱水浸提法提取溫度為60℃的多糖得率，且隨著壓力的升高桑黃多糖的得率逐漸升高，最大得率可達(dá)到5.58％，更重要的是得到的桑黃多糖的活性明顯高于熱水浸提法，總抗氧化性可達(dá)到6mM以上。由此可見，本發(fā)明提取方法與熱水浸提法相比，既提高了桑黃多糖的得率，又提高了桑黃多糖的總抗氧化能力。對(duì)比表1和表3的試驗(yàn)結(jié)果可見，在提取溫度均為60℃下，本發(fā)明提取方法與超聲協(xié)助提取法的桑黃多糖得率基本相當(dāng)，但超聲協(xié)助提取法的桑黃多糖的活性較低，總抗氧化性僅為4.5mM左右，而采用本發(fā)明提取方法的桑黃多糖活性明顯高于超聲協(xié)助提取法，總抗氧化性均可達(dá)到6mM以上。由此可見，本發(fā)明提取方法與超聲協(xié)助提取法相比，雖然桑黃多糖的得率相當(dāng)，但得到的桑黃多糖的活性明顯提高了。