本專利申請針對2014年07月31日向韓國專利廳提出的韓國特許申請第10-2014-0098362號主張優(yōu)先權(quán)，上述專利申請的公開事項插入于本說明書作為參照。

本發(fā)明涉及具有破骨細胞分化及活性抑制能力的肽及其用途。

背景技術(shù)：

骨頭(bone)用于支撐人體的軟組織和體重，并包圍內(nèi)部器官來從外部沖擊保護內(nèi)部臟器。并且，不僅在結(jié)構(gòu)上支撐肌肉或臟器，而且是儲存體內(nèi)的鈣或其他必須無機質(zhì)，即儲存如磷或鎂等的物質(zhì)的人體的重要部分之一。因此，生長結(jié)束的成人的骨頭直到死亡為止不停地非常動態(tài)、持續(xù)地反復(fù)再生去除老骨頭并以新骨頭代替的生成和吸收過程，并保持均衡。將上述稱為骨重建(boneremodeling)。在去除老骨頭并以新骨頭代替的骨頭的循環(huán)(turnover)在恢復(fù)由生長和應(yīng)激而發(fā)生的骨頭的微細損傷，并適當?shù)乇３止穷^的功能中是必須的。

眾所周知，在骨重建中大致兩種細胞參與。在兩種細胞中一種為生成骨頭的造骨細胞(osteoblast)，另一種為破壞骨頭的破骨細胞(osteoclast)。造骨細胞生成核因子kb受體活化因子配體(receptoractivatorofnuclearfactor-κbligand)和作為它的誘餌受體(decoyreceptor)的骨保護素(opg，osteoprotegerin)。若核因子kb受體活化因子配體與作為位于破骨前體細胞(osteoclastprogenitorcells)的表面的受體的核因子kb受體活化因子相結(jié)合，則破骨前體細胞成熟(maturation)為破骨細胞，來發(fā)生骨吸收(boneresorption)。但是，若骨保護素與核因子kb受體活化因子配體相結(jié)合，則通過阻隔核因子kb受體活化因子配體和核因子kb受體活化因子之間的結(jié)合，來抑制破骨細胞的形成，并未發(fā)生必要以上的骨吸收。老骨頭的吸收或破壞通過在血液細胞(造血干細胞)中生成的破骨細胞實現(xiàn)，這是在骨頭中穿出孔來使少量的鈣向血流放出，從而適用于保持身體功能。另一方面，在骨細胞中生成的造骨細胞利用膠原質(zhì)填滿孔，并利用羥磷灰石(hydroxyapatite)覆蓋來重建結(jié)實的新的骨頭。從骨頭受到破壞其至再次形成為新的骨頭約需要100天左右。在幼兒中1年之內(nèi)更換100％的骨頭的鈣，但是在成人中，每年骨骼的約10～30％通過上述過程來再次形成，只有破骨速度和造骨速度相同，才可保持與以前相同的骨密度。如上所述，在重要的骨頭中破壞平衡的情況下，可導(dǎo)致很多疾病，尤其，代表性地是由骨質(zhì)疏松癥和癌細胞的骨轉(zhuǎn)移(bonemetastasis)引起的與骨損傷相關(guān)的疾病。

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)作為由各種原因使骨頭的質(zhì)量減少，因骨頭組織的微細結(jié)構(gòu)的退化骨折風險持續(xù)增加的疾病，是處于構(gòu)成骨頭的礦物質(zhì)(尤其鈣)和基質(zhì)減少的狀態(tài)，由于破壞骨重建的平衡，因而在破骨作用相比于造骨作用增加的狀態(tài)下發(fā)生。正常的骨頭內(nèi)部形成如網(wǎng)形成致密的結(jié)構(gòu)，但是在骨質(zhì)疏松癥的情況下結(jié)構(gòu)之間的間隔寬，因使微細結(jié)構(gòu)變薄來變?nèi)酰瑥亩栽谛⌒〉臎_擊下，還可使骨頭骨折的狀態(tài)進行。骨質(zhì)疏松癥與閉經(jīng)期的開始一同呈現(xiàn)急劇的骨損失(年2～3％)，在脊柱的壓迫及腕骨易骨折的風險增加的閉經(jīng)期后的骨質(zhì)疏松癥(postmenopausalosteoporosis)、70歲以上的男女老年人中逐漸發(fā)生(年0.5～1％)，并且分類為帶來髖骨(hipbone)和椎骨的漸進的骨損失的老年期的骨質(zhì)疏松癥(senileosteoporosis)及與年齡無關(guān)的疾病(內(nèi)分泌疾病、胃腸道疾病、惡性腫瘤)或藥物(腎上腺皮質(zhì)激素、抗癌化療法、甲狀腺激素、抗癲癇劑、抗凝固劑、甲氨蝶呤(methotrexate)、環(huán)孢霉素(cyclosporine)、促性腺激素釋放激素(gnrh)等)、由乙醇、吸煙及事故發(fā)生的第二次骨質(zhì)疏松癥(secondaryosteoporosis)。

在由如上所述的骨質(zhì)疏松癥及癌細胞的骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的骨損傷中利用如福善美(fosamax，成分名稱：阿侖膦酸鈉(alendronate))、安妥良(actonel，成分名稱：利塞膦酸鈉(risedronate))等雙磷酸鹽(bisphosphonate)類的治療劑。它們雙磷酸鹽制劑大部分使破壞骨頭的破骨細胞的功能弱化，并且誘導(dǎo)凋亡來使骨頭的損失緩慢或停止的作用。但是，這些藥不具有促進形成新骨的作用，最近，在服用雙磷酸鹽的患者中發(fā)生頜骨的壞死(骨壞死(osteonecrosis))、重癥心房顫動、骨頭或關(guān)節(jié)的無力化或筋骨骼的痛癥的事例年年增加。因此，相比于抑制骨吸收對促進骨的形成的骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防及治療劑的開發(fā)集中較多的關(guān)心。

本說明書全文中，參照多篇論文及專利文獻，并標示了其引用。所引用的論文及專利文獻的公開內(nèi)容，作為參照全部插入到本說明書中，從而更加明確地說明本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

要解決的問題

本發(fā)明人努力開發(fā)在生物學(xué)上具有有效的活性的優(yōu)秀的肽，其結(jié)果，查明由序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列形成的肽通過抑制破骨細胞的分化及活性，來對由骨破壞發(fā)生的多種骨疾病具有優(yōu)秀的預(yù)防及治療效果，從而完成了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明的目的在于，提供具有破骨細胞分化及活性抑制能力的肽。

本發(fā)明的另一目的在于，提供骨疾病的預(yù)防或治療用組合物。

根據(jù)發(fā)明的詳細說明、發(fā)明要求保護范圍及附圖更加明確本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點。

解決問題的方案

根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供由選自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列組成的組中的一種氨基酸序列形成的具有破骨細胞分化及活性抑制能力的肽。

本發(fā)明人努力開發(fā)在生物學(xué)上具有有效的活性的優(yōu)秀的肽，其結(jié)果，查明具有序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列的肽通過抑制破骨細胞的分化及活性，來對由骨破壞發(fā)生的多種骨疾病具有優(yōu)秀的預(yù)防及治療效果，從而完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的肽包含序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列。具體地，本發(fā)明的肽必須由選自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列組成的組中的一種的氨基酸序列構(gòu)成。

本發(fā)明的肽有效抑制破骨細胞的分化及活性。

在關(guān)節(jié)內(nèi)骨破壞隨著破骨細胞(osteoclast)得到活性化而呈現(xiàn)，在造血干細胞中分化的骨髓性前體細胞(myeloidprecursor)在炎性環(huán)境下分化為破骨細胞。在類風濕關(guān)節(jié)內(nèi)存在很多炎性細胞因子及趨化因子，并且通過上述物質(zhì)使對破骨細胞的分化需要的各種分子的表達增加，從而誘導(dǎo)破骨細胞的形成。認識到在類風濕關(guān)節(jié)炎的治療目標中重要的是通過抑制骨破壞來將關(guān)節(jié)損傷最小化。

作為在骨髓性前體細胞分化成破骨細胞中必須的物質(zhì)在前體細胞表面中誘導(dǎo)核因子kb受體活化因子(rank，receptoractivatorofnuclearfactorκb)，并且提供作為對此的配體的核因子kb受體活化因子配體(receptoractivatorofnuclearfactorκbligand)的細胞相結(jié)合的所謂核因子kb受體活化因子-核因子kb受體活化因子配體的相互作用是必須的。并且，巨噬細胞集落刺激因子(m-csf，macrophagecolonystimulatingfactor)也在破骨細胞成熟且分化中起到重要的作用。作為破骨細胞分化的主要的信號傳遞途徑核因子kb受體活化因子-核因子kb受體活化因子配體相互作用和巨噬細胞集落刺激因子是必須的，但是通過在于前體細胞表面的多種免疫球蛋白樣受體(ig-likereceptor)，來與作為細胞內(nèi)信號傳遞物質(zhì)的dap12或fcrγ相連接，來提供共刺激信號(co-stimulatorysignal)。成為最中心的信號傳遞途徑是在形成核因子kb受體活化因子配體-核因子kb受體活化因子相互結(jié)合后，通過作為細胞內(nèi)信號傳遞物質(zhì)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6(traf6，tnf-receptor-associatedfactor6)，來經(jīng)過核因子kb(nf-kb)的活性化，使在破骨細胞形成中必須的基因轉(zhuǎn)錄增加而形成。然后，眾所周知，巨噬細胞集落刺激因子也是在分化為破骨細胞中必須的物質(zhì)，并且與如屬于受體酪氨酸激酶超家族的cfms等特異受體相結(jié)合后，構(gòu)成細胞質(zhì)內(nèi)src-pyk2復(fù)合體，來通過上述誘導(dǎo)如核因子κb等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物質(zhì)，或通過整合蛋白，來執(zhí)行細胞內(nèi)信號傳遞作用。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，本發(fā)明的肽使與破骨細胞分化相關(guān)的抗酒石酸鹽酸性磷酸酶(tartrateresistantalkalinephosphatase)及組織蛋白酶k(cathepsink)的表達減少，通過抑制nf-κb的核內(nèi)移動，來最終抑制破骨細胞的分化及活性。

在本說明書中，所使用的術(shù)語“肽”是指通過肽鍵來由多個氨基酸殘基互相結(jié)合而成的線性分子。本發(fā)明的肽可通過本領(lǐng)域中公知的化學(xué)合成方法，例如，固相合成技術(shù)(solid-phasesynthesistechniques:merrifield,j.amer.chem.soc.85:2149-54(1963)；stewart,etal.,so]idphasepeptidesynthesis,2nd.ed.,piercechem.co.:rockford,111(1984))或液相合成技術(shù)(美國登錄專利第5516891號)來制備而成。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，上述肽的n-末端或c-末端可與選自由乙酰基、芴甲氧羰基、甲?；?、棕櫚酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基及聚乙二醇(peg)組成的組中的保護基相結(jié)合。

上述的氨基酸的變形起到大大提高本發(fā)明的肽的穩(wěn)定性的作用。在本發(fā)明中提及的術(shù)語“穩(wěn)定性”不僅是指“體內(nèi)”穩(wěn)定性，還指儲存穩(wěn)定性(例如，常溫儲存穩(wěn)定性)。上述保護基起到從生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)切割酶的攻擊保護本發(fā)明的肽的作用。

根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，本發(fā)明提供骨疾病的預(yù)防或治療用組合物，上述骨疾病的預(yù)防或治療用組合物包含由選自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列組成的組中的一種氨基酸序列形成的肽作為有效成分。

本發(fā)明的組合物包含由上述的本發(fā)明的由序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列形成的肽作為有效成分，因此為了避免本說明書過于復(fù)雜，省略共同的記載內(nèi)容。

如在以下實施例中得到證明，由本發(fā)明的序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列形成的肽抑制破骨細胞的分化及活性，因此在與骨破壞相關(guān)的骨疾病的預(yù)防或治療中非常有效。

本發(fā)明的骨疾病的預(yù)防或治療用組合物可適用于在破骨作用過度的情況下發(fā)生的全部疾病，例如可使用于骨損傷、骨質(zhì)疏松癥、軟骨癥、佝僂病、纖維性骨炎、無力性骨病或代謝性骨疾病等。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，本發(fā)明的組合物可制備成藥劑學(xué)組合物，上述藥劑學(xué)組合物包含：(a)上述的本發(fā)明的肽的藥劑學(xué)有銷量；以及(b)藥劑學(xué)上接受的載體。

在本說明書中使用的術(shù)語“藥劑學(xué)有銷量”是指達成與上述的肽的功效或活性的充分量。

包含于本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的藥劑學(xué)上接受的載體作為制劑時通常利用的載體，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但不局限于此。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物除了上述成分之外，還可包含潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、調(diào)味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。適當?shù)乃巹W(xué)上接受的載體及制劑詳細地記載于remington’pharmaceuticalsciences(19thed.，1995)。

本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物能夠以口服或非口服的方式進行給藥，在以非口服的方式給藥的情況下，可通過靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部給藥、經(jīng)皮給藥等的方式進行給藥。

本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適當?shù)慕o藥量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態(tài)、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏度等的因素而多樣地進行處方。另一方面，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的1天給藥量為0.0001～200μg。

并且，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物根據(jù)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易實施的方法，利用藥劑學(xué)上接受的載體和/或賦形劑來進行制劑化，從而可制備成單位容量形態(tài)或裝入多容量容器內(nèi)來制備。此時，劑型還可以為油性或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳化液形態(tài)或浸膏劑、粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或凝膠(例如，水凝膠)形態(tài)，還可包含分散劑或穩(wěn)定劑。

發(fā)明的效果

歸納本發(fā)明的特征及優(yōu)點如下。

(i)本發(fā)明的由選自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列組成的組中的一種的氨基酸序列形成的肽具有破骨細胞分化及活性抑制能力，并且對與骨破壞相關(guān)的骨疾病的預(yù)防或治療非常有效。

(ii)本發(fā)明的肽通過使與破骨細胞分化相關(guān)的抗酒石酸鹽酸性磷酸酶及組織蛋白酶k(cathepsink)的表達減少，并抑制核因子κb的核內(nèi)移動，來最終抑制破骨細胞的分化。

(iii)本發(fā)明提供包含上述肽的骨疾病的預(yù)防或治療用組合物。

附圖說明

圖1a、圖1b及圖1c為通過抗酒石酸鹽酸性磷酸酶染色確認當基于本發(fā)明的肽處理的破骨細胞分化時，所表達的的抗酒石酸鹽酸性磷酸酶蛋白質(zhì)的表達程度變化的結(jié)果。圖1a為序列表中序列1的肽、圖1b為序列表中序列2的肽及圖1c為序列表中序列3的肽。

圖2a、圖2b及圖2c為通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)確認當基于本發(fā)明的肽處理的破骨細胞分化時，所表達的抗酒石酸鹽酸性磷酸酶及組織蛋白酶k的信使核糖核酸(mrna)的水平的結(jié)果。圖2a為序列表中序列1的肽、圖2b為序列表中序列2的肽、圖2c為序列表中序列3的肽。

圖3a、圖3b及圖3c為通過蛋白質(zhì)印跡法確認當基于本發(fā)明的肽處理的破骨細胞分化時，所促進的核因子κb的核內(nèi)移動變化的結(jié)果。圖3a為序列表中序列1的肽、圖3b為序列表中序列2的肽、圖3c為序列表中序列3的肽。

圖4a、圖4b及圖4c通過免疫化學(xué)染色確認為當基于本發(fā)明的肽處理的破骨細胞分化時，所表達的抗酒石酸鹽酸性磷酸酶的表達程度的結(jié)果。圖4a為序列表中序列1的肽、圖4b為序列表中序列2的肽及圖4c為序列表中序列3的肽。

圖5a、圖5b及圖5c為通過免疫化學(xué)染色確認當基于本發(fā)明的肽處理的破骨細胞分化時，所表達的組織蛋白酶k的表達程度的結(jié)果。圖5a為序列表中序列1的肽、圖5b為序列表中序列2的肽及圖5c為序列表中序列3的肽。

具體實施方式

以下，通過實施例更加詳細說明本發(fā)明。這種實施例只用于更加詳細說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的要旨，本發(fā)明的范圍不局限于這些實施例，這對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。

實施例

合成例1：肽合成

將700mg的氯三苯甲基氯樹脂(chlorotritylchlorideresin；ctlresin，novabiochemcatno.01-64-0021)放入反應(yīng)容器中，并加入10ml的二氯甲烷(mc)來攪拌了3分鐘。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(dmf)來攪拌3分鐘后，重新去除了溶劑。將10ml的二氯甲烷(dcm)溶液放入反應(yīng)器中，并放入200mmole的fmoc-arg(pbf)-oh(瑞士巴亨公司(bachem，swiss))及400mmole的二異丙基乙胺(diea)后，攪拌并均勻溶解，攪拌1小時并進行反應(yīng)。反應(yīng)后清洗，將甲醇和二異丙基乙胺(2：1)溶解于二氯甲烷中，反應(yīng)10分鐘，并用過量的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(1：1)進行清洗。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺來攪拌3分鐘后，重新去除了溶劑。將10ml的脫保護溶液(20％的哌啶(piperidine)/二甲基甲酰胺)放入反應(yīng)容器中，并在常溫條件下攪拌10分鐘后，去除了溶液。放入同量的脫保護溶液，并重新維持10分鐘反應(yīng)后，去除溶液，并分別以3分鐘的方式用二甲基甲酰胺清洗2次、用二氯甲烷清洗1次、用二甲基甲酰胺清洗1次，來制備了arg(pbf)-ctl樹脂。

在新的反應(yīng)器中放入10ml的二甲基甲酰胺溶液，并加入200mmole的fmoc-leu-oh(bachem，swiss)、200mmole的羥基苯并三唑(hobt)及200mmole的苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(bop)后，攪拌來均勻溶解。在反應(yīng)器中，經(jīng)過2次以分餾的方式放入400mmole的n，n-二異丙基乙胺(diea，n，n-diisopropylethylamine)后，攪拌至所有固體溶解為止至少5分鐘。將溶解的氨基酸混合溶液放入具有脫保護的樹脂的反應(yīng)容器中，在常溫條件下攪拌1小時并進行反應(yīng)。去除反應(yīng)液，并用二甲基甲酰胺溶液每次攪拌5分鐘，并攪拌3次后去除。取少量的反應(yīng)樹脂，并利用茚三酮測試(nihydrintest)檢查了反應(yīng)程度。使用脫保護溶液，以與上述方法相同的方法進行2次脫保護反應(yīng)，來制備了leu-arg(pbf)-ctl樹脂。使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分清洗，并重新執(zhí)行一次茚三酮測試，接著以與上述方法相同的方法執(zhí)行了以下氨基酸附著實驗。

根據(jù)選定的氨基酸序列，按fmoc-phe、fmoc-glu(otbu)、fmoc-val、fmoc-pro、fmoc-ser(tbu)的順序進行連鎖反應(yīng)。利用脫保護溶液使fmoc-保護基以10分鐘的方式反應(yīng)2次后，清洗干凈并去除。利用二甲基甲酰胺、二氯甲烷及甲醇，分別將放入乙酸酐、n，n-二異丙基乙胺、羥基苯并三唑(hobt，hydroxybenzotriazole)乙?；?小時后制備的肽基樹脂清洗3次，使氮氣慢慢流入來干燥后，在五氧化二磷(phosphoruspentoxide，p2o5)條件下，減壓成真空狀態(tài)，來完全干燥后，放入30ml的泄漏溶液[95％的三氟乙酸(tfa，trifluroaceticacid)、2.5％的蒸餾水、2.5％的苯甲硫醚(thioanisole)]，接著，在常溫條件下微動一下，并保持2小時反應(yīng)。通過過濾對樹脂進行過濾，并利用少量的溶液清洗樹脂后，與母液進行混合。利用減壓蒸餾至剩有總?cè)莘e的一半左右的容積，并加入50ml的涼的醚誘導(dǎo)沉淀后，進行離心分離來收集沉淀，并利用更涼的醚清洗2次。去除母液，并在氮條件下充分干燥，來合成了0.80g的純化前ser-pro-val-glu-phe-leu-arg肽1(序列1)(收率：88.8％)。當利用分子量測定儀測定時，可得到的分子量為846.7(理論值：846.9)。以如上所述的方法還合成了ile-thr-leu-gln-glu-ile-ile-arg-thr肽2(序列表中序列2)及ala-cys-ile-his-thr-leu-ser-leu-leu-cys肽3(序列表中序列3)(收率：分別86.4％及83.2％)。當利用分子量測定儀測定時，可分別得到分子量為1086.3(理論值：1086.3)及1073.0(理論值：1073.3)的值。

表1

實施例1：抗酒石酸鹽酸性磷酸酶染色

通過染色確認當破骨細胞分化時，所表達的抗酒石酸鹽酸性磷酸酶蛋白質(zhì)的程度，并觀察了當處理肽時所減少的傾向。

以1×10⁴細胞/孔的方式在48-孔板中播種raw264.7的巨噬細胞后，同時按濃度對肽(獨立的肽或同時處理50ng/ml核因子kb受體活化因子配體)進行處理，并且培養(yǎng)5天來誘導(dǎo)了分化。使用西格瑪奧德里奇(sigmaaldrich)公司的酸性磷酸酶試劑盒(acidphosphatasekit)來執(zhí)行了抗酒石酸鹽酸性磷酸酶的染色。添加固定緩沖液后反應(yīng)30秒鐘，并利用蒸餾水進行了清洗。每孔放入200μl的染色溶液，在37℃反應(yīng)30分鐘后利用蒸餾水進行了清洗。干燥一天后利用顯微鏡進行了觀察。

與通過核因子kb受體活化因子配體處理誘導(dǎo)細胞分化，來抗酒石酸鹽酸性磷酸酶的表達增加的對照組相比，在處理序列1至序列3的肽的組中可觀察到抗酒石酸鹽酸性磷酸酶的表達以濃度依賴性的方式減少(圖1a至圖1c)。

實施例2：與抗酒石酸鹽酸性磷酸酶及組織蛋白酶k(cathepsink)相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)確認當破骨細胞分化時，所表達的抗酒石酸鹽酸性磷酸酶及組織蛋白酶k(cathepsink)的信使核糖核酸水平(mrnalevel)，并觀察了當處理肽時所減少的傾向。

以1×10⁴細胞/孔的細胞密度在48-孔板中播種raw264.7的巨噬細胞。同時按濃度(10μg/ml、50μg/ml)處理50ng/ml的核因子kb受體活化因子配體和肽，并且在37℃的培養(yǎng)器中培養(yǎng)了5天?；厥战Y(jié)束培養(yǎng)的細胞后通過處理核糖核酸提取液(rnaextractionsolution)(easyblue、內(nèi)含子(intron))來準備核糖核酸后，使用反義預(yù)混合液(rtpremix)(內(nèi)含子)來合成了互補脫氧核糖核酸(cdna)。通過使用對各個標記因子(組織蛋白酶k、抗酒石酸鹽酸性磷酸酶)的引物和聚合酶鏈式反應(yīng)預(yù)混合液(pcrpremix)(內(nèi)含子)，來執(zhí)行了聚合酶鏈式反應(yīng)。在1％的瓊脂糖凝膠中以每次5ul的方式裝載聚合酶鏈式反應(yīng)的結(jié)果物來進行電泳后，在凝膠(gel)-doc中確認了帶。觀察到了通過核因子kb受體活化因子配體處理誘導(dǎo)的破骨細胞分化標記、抗酒石酸鹽酸性磷酸酶及組織蛋白酶k的表達根據(jù)序列1至序列3的肽處理減少(圖2a至圖2c)。

實施例3：利用蛋白質(zhì)印跡法分析核因子κb的位置移動

為了確認當破骨細胞分化時，所促進的核因子κb的核內(nèi)移動，分離和蛋白質(zhì)，并觀察基于核因子kb受體活化因子配體處理的核內(nèi)核因子κb的水平增加后觀察了基于肽處理的減少傾向。

以5×10⁵細胞/孔的方式在6-孔板中播種小鼠巨噬細胞株raw264.7巨噬細胞。培養(yǎng)一天后利用無血清培養(yǎng)基進行更換，來培養(yǎng)了6小時。按濃度處理50ng/ml的核因子kb受體活化因子配體和原材料，并培養(yǎng)了30分鐘。在結(jié)束處理的細胞中提取核蛋白質(zhì)，并進行二喹啉甲酸(bca)后，準備樣品來在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sds-page)中進行了電泳。利用硝酸纖維素膜進行轉(zhuǎn)移后使用5％的脫脂乳阻斷了1小時。以1：1000在阻斷溶液中稀釋第一次抗體抗-核因子κbp65，來在冷藏中培養(yǎng)了一宿。利用pbst，15分鐘清洗3次后，使用第二次抗體抗-兔(rabbit)igg-hrp來在常溫條件下培養(yǎng)了1小時。利用pbst，15分鐘清洗3次后，利用ecl溶液進行了發(fā)色。

觀察到了通過核因子kb受體活化因子配體處理誘導(dǎo)的核因子κb的核內(nèi)移動、通過序列1至序列3的肽的處理減少(圖3a至圖3c)。

實施例4：與抗酒石酸鹽酸性磷酸酶相關(guān)的免疫化學(xué)染色

通過熒光染色更明確地確認作為當破骨細胞分化時，所表達的標記的抗酒石酸鹽酸性磷酸酶的表達程度，并觀察了基于肽處理的表達減少傾向。

以2×10⁴細胞/孔的方式在48-孔板中播種raw264.7巨噬細胞，同時按濃度對原材料進行了處理。分化誘導(dǎo)5天后，在細胞中放入4％的多聚甲醛，并在常溫條件下培養(yǎng)20分鐘來進行了固定。利用磷酸鹽緩沖液(pbs)清洗3次后，放入0.3％的tritonx-100(在磷酸鹽緩沖液(inpbs))，并在常溫條件下培養(yǎng)了15分鐘。之后，利用磷酸鹽緩沖液清洗了3次。放入2％的牛血清白蛋(bsa)(在磷酸鹽緩沖液)，并在常溫條件下培養(yǎng)1小時來進行了阻斷。在2％的牛血清白蛋中以1：100稀釋第一次抗體(抗酒石酸鹽酸性磷酸酶)后，在常溫條件下培養(yǎng)了2小時。利用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，在2％的牛血清白蛋中以1：100稀釋德克薩斯紅-融合第二次抗體，在常溫條件下培養(yǎng)了1小時。利用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，利用含有4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)的裝片溶液進行裝片，第二天利用顯微鏡進行了觀察。

與通過核因子kb受體活化因子配體處理誘導(dǎo)破骨細胞分化，來抗酒石酸鹽酸性磷酸酶的表達增加的對照組相比，在處理序列1至序列3的肽的組中可觀察到rap的表達以濃度依賴性的方式減少(圖4a至圖4c)。

實施例5：與組織蛋白酶k相關(guān)的免疫化學(xué)染色

通過熒光染色更明確地確認作為當破骨細胞分化時，所表達的標記的組織蛋白酶k的表達程度，并觀察了基于肽處理的表達減少傾向。

以2×10⁴細胞/孔的方式在48-孔板中播種raw264.7巨噬細胞，同時按濃度對原材料進行了處理。分化誘導(dǎo)5天后，在細胞中放入4％的多聚甲醛，并在常溫條件下培養(yǎng)20分鐘來進行了固定。利用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，放入0.3％的tritonx-100(在磷酸鹽緩沖液)，并在常溫條件下培養(yǎng)了15分鐘，并利用磷酸鹽緩沖液清洗了3次。放入2％的牛血清白蛋(在磷酸鹽緩沖液)，并在常溫條件下培養(yǎng)1小時來進行了阻斷。在2％的牛血清白蛋中以1：100稀釋第一次抗體(組織蛋白酶k)后，在常溫條件下培養(yǎng)了2小時。利用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，在2％的牛血清白蛋中以1：100稀釋異硫氰酸熒光素(fitc)-融合第二次抗體，在常溫條件下培養(yǎng)了1小時。利用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，利用含有4’，6-二脒基-2-苯基吲哚的裝片溶液進行裝片，第二天利用顯微鏡進行了觀察。

與通過核因子kb受體活化因子配體處理誘導(dǎo)破骨細胞分化，來組織蛋白酶k的表達增加的對照組相比，在處理序列1至序列3的肽的組中可觀察到組織蛋白酶k的表達以濃度依賴性的方式減少(圖5a至圖5c)。

以上，對本發(fā)明的特定部分進行詳細記述，而對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，這些具體記述僅僅是優(yōu)選實施例，本發(fā)明的范圍不會由此受到限制是顯而易見的。因此，本發(fā)明的實質(zhì)范圍應(yīng)視為根據(jù)發(fā)明要求保護范圍和其等同技術(shù)方案進行定義。