一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種銀耳多糖的提取及純化方法，包括：將銀耳粉碎，加水浸泡，打漿，加混合酶進(jìn)行酶解，然后將混合渣液置于循環(huán)超聲提取機(jī)中進(jìn)行提??；固液分離，濃縮；乙醇靜置沉淀，得銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物；銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物加水,超聲波輔助溶解，上D101樹脂進(jìn)行層析；最后將層析液過DEAE纖維素樹脂進(jìn)行分離，合并洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，得純化后的銀耳多糖。本發(fā)明可以實現(xiàn)銀耳多糖提取的連續(xù)化、規(guī)?；a(chǎn)；極大提高了銀耳多糖的產(chǎn)率及純度。
【專利說明】一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法，屬于生化工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 銀耳（Tremella)，生于溫帶和亞熱帶地區(qū)，是有隔擔(dān)子菌亞綱銀耳科銀耳的子 實體，又稱白木耳。作為一種珍貴的食用菌和重要藥材，銀耳平甘無毒，滋陰、潤肺、養(yǎng) 胃、生津，治療肺熱咳嗽、胃炎、大便下血、痢疾、面部面斑、癌癥腫瘤等病癥。
[0003] 銀耳多糖具有廣泛的藥理學(xué)作用。調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能是許多多糖的主要藥理學(xué)作 用之一，是多糖的共性。
[0004] 人體腸胃道非免疫系統(tǒng)主要為內(nèi)源微生物群。這些正常微生物是人體胃腸道中不 可缺少的組成部分，通常又分為有益微生物（如雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬）和有害微生物 群（如產(chǎn)氣莢膜梭菌屬、葡萄球菌屬）。有益微生物菌群通常覆蓋在胃腸道黏膜上皮表面， 阻止病原微生物在腸道黏膜組織上的定植。據(jù)目前的研究結(jié)果來看銀耳多糖可能具有果寡 糖、甘露寡糖、木糖的類似作用，能直接到達(dá)后腸作為雙歧桿菌和乳酸桿菌特異性的營養(yǎng) 物質(zhì)，促進(jìn)腸道理想微生物菌群的形成，增強人體對外源性病原菌的抵抗能力，改善腸 道的健康狀況，起到提高人體非免疫防御系統(tǒng)的作用。研究表明，銀耳多糖能增強小鼠 機(jī)體體液免疫。銀耳多糖可增強正常小鼠及改善免疫功能低下小鼠的體液免疫功能。銀耳 多糖-Fe (III)配合物能減緩膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和抑制鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的氧自由基 對紅細(xì)胞膜的損傷，起到對細(xì)胞膜的保護(hù)作用。銀耳多糖可明顯促進(jìn)正常小鼠和部分肝切 除小鼠的肝臟蛋白質(zhì)及核酸合成，且銀耳多糖可優(yōu)先促進(jìn)損傷肝臟的修復(fù)。銀耳多糖亦 可通過促進(jìn)核酸及蛋白質(zhì)的合成、增加肝微粒體細(xì)胞色素 P-450含量、增強機(jī)體免疫功能 而發(fā)揮抗衰老作用。銀耳多糖可明顯降低高脂血癥大鼠血清游離膽固醇、膽固醇脂、甘油三 酯、β-脂蛋白含量，降低高膽固醇血癥小鼠總膽固醇含量，并可預(yù)防小鼠高膽固醇血癥 的形成。銀耳多糖具有明顯的抗血栓形成作用。銀耳多糖可對抗環(huán)磷酰胺引起的小鼠骨髓 微核率增加，同時還可防止受照射動物的淋巴細(xì)胞染色體發(fā)生畸變。銀耳多糖對中樞神經(jīng) 系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及心、肝、腎等均無毒性作用，不影響小鼠的生殖能力和幼仔的 成活率。銀耳多糖亦不會引起急、慢性中毒，無三致作用，屬無毒性物質(zhì)。
[0005] 目前銀耳多糖的提取方法常用的有熱水浸提法、酸提取法、堿浸提法等。酸、堿的 添加對提取過程中已溶銀耳多糖的結(jié)構(gòu)有一定的破壞。銀耳多糖提取液黏度的大小與其濃 度的大小成正比，即提取液的濃度越大，其黏度也越大；熱力對銀耳多糖的結(jié)構(gòu)有一定 的破壞作用，提取液的溫度越高，其黏度越小；酸堿性的改變會導(dǎo)致提取液中銀耳多糖 的分解，使其提取液的黏度下降。
[0006] 銀耳多糖無甜味，易溶于熱水。銀耳多糖的種類較多，其中大多數(shù)是以α-(1， 3)連接的甘露糖為主鏈，目前分為五大類，分別為酸性雜多糖、中性雜多糖、胞壁多糖、 胞外多糖及酸性低聚糖五類。最具代表性的是銀耳酸性雜多糖，其結(jié)構(gòu)是以α-甘露聚糖 為主鏈，以β-(1，2)L_木糖、β-(1，2)葡萄糖醛酸和少量的巖藻為側(cè)鏈，其分子中 有典型的乙酰基結(jié)構(gòu)。
[0007] 銀耳多糖屬于大分子物質(zhì)，其分子量較大，而且它的理化性質(zhì)及生物活性較為復(fù) 雜。目前對于銀耳多糖的研究的一個非常重要的方面就是銀耳多糖的分子量及其分布，而 銀耳多糖的分子量又與其理化性質(zhì)及活性存在著一定的關(guān)系，且它也是多糖類藥物的一個 重要參數(shù)。由于分子量較大的多糖活性、結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，所以銀耳多糖的提取及純化至關(guān)重 要，提取不當(dāng)或純化不當(dāng)，銀耳多糖很容易失去活性。
[0008] 發(fā)明目的 本發(fā)明提供一種高效提取分離銀耳多糖的方法，既提高銀耳多糖的得率同時保持多糖 的生物活性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法，包括以下步驟： (1) 將銀耳粉碎至40?60目，加20?40倍水浸泡1?2h，打漿；向打漿液中加入混 合酶，30?40°C條件下攪拌酶解1. 5?2. 5 h，酶解結(jié)束后，將混合渣液置于循環(huán)超聲提取 機(jī)中進(jìn)行提??； (2) 循環(huán)超聲提取結(jié)束后，固液分離，上清液進(jìn)行濃縮；濃縮倍數(shù)為提取液體積的 1/6?1/8,優(yōu)選1/7 ;提取液濃縮后加85%乙醇進(jìn)行靜置沉淀，得銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物； (3) 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物加10?15倍去離子水，采用超聲波輔助溶解，超聲波功率為 100W，超聲時間為20?30min，溶解液上DlOl樹脂，采用去離子水進(jìn)行層析； (4) 將層析液過DEAE纖維素樹脂進(jìn)行分離，洗脫至流出液檢測不到多糖停止洗脫，合 并洗脫液。
[0010] (5)將洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，得純化后的銀耳多糖。
[0011] 步驟（1)中所述的混合酶為纖維素酶與蛋白酶的混合物，二者比例為纖維素酶： 蛋白酶=2:1，纖維素酶的酶活為200-500u/ml，蛋白酶的酶活為5-10萬u/g。
[0012] 進(jìn)一步地： 步驟（1)中所述的銀耳與水的比例為1:30~1:35,優(yōu)選1:32。
[0013] 步驟（1)中所述的循環(huán)超聲提取條件為：溫度30~35°C，優(yōu)選35°C ;超聲功率為 500~1000W，優(yōu)選900W ;循環(huán)攪拌轉(zhuǎn)速500~1000 rpm，優(yōu)選800rpm ;占空比1:2;超聲提取 時間2. 5~3. 5h，優(yōu)選3h。
[0014] 步驟（2)中濃縮方式可采用真空減壓濃縮或膜濃縮。
[0015] 步驟（4)中所述的DEAE纖維素樹脂為DE52或DE32中的一種，優(yōu)選DE52。
[0016] 步驟（5)中所述的洗脫液的干燥方式為冷凍干燥或噴霧干燥。銀耳多糖的干燥方 式為噴霧干燥的最優(yōu)條件為：進(jìn)風(fēng)溫度160~200°C，優(yōu)選180°C;出風(fēng)溫度為70~100°C，優(yōu)選 90°C ;進(jìn)料固形物含量為50~80%，優(yōu)選60%。銀耳多糖的干燥方式為冷凍干燥的最優(yōu)條件 為：冷凍溫度-20 ~ -80°C，優(yōu)選-40°C ;固形物含量為70~90%，優(yōu)選80%。
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)點在于： 1. 酶解過程將銀耳細(xì)胞壁進(jìn)行消化，細(xì)胞壁變薄，銀耳多糖在超聲波的作用下可以 很快進(jìn)入提取液中。
[0018] 2. 循環(huán)超聲提取較普通熱水提取銀耳多糖具有效率高，能耗低，多糖純度高等 優(yōu)點。
[0019] 3. 經(jīng)過優(yōu)化篩選，DlOl樹脂最適宜對銀耳多糖進(jìn)行純化，經(jīng)過超聲波的提取聯(lián) 合DlOl樹脂純化，銀耳多糖純度可達(dá)95%以上。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。

【具體實施方式】
[0021] 實施例1 (1)將銀耳粉碎至40目，加40倍水浸泡lh，打漿；向打漿液中加入混合酶，混合酶為纖 維素酶與蛋白酶的混合物，二者比例為纖維素酶：蛋白酶=2:1，纖維素酶的酶活為500u/ ml，蛋白酶的酶活為5u/g; 40°C條件下攪拌酶解1.5h，酶解結(jié)束后，將混合渣液置于循環(huán) 超聲提取機(jī)中進(jìn)行提??；循環(huán)超聲提取條件為：溫度35°C ;超聲功率為500W，循環(huán)攪拌轉(zhuǎn)速 1000 rpm，占空比1:2;超聲提取時間2. 5h。
[0022] (2 )循環(huán)超聲提取結(jié)束后，固液分離，上清液進(jìn)行濃縮；濃縮方式可采用真空減壓 濃縮或膜濃縮，濃縮倍數(shù)為提取液體積的1/6,提取液濃縮后加85%乙醇進(jìn)行靜置沉淀，得 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物； (3) 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物加15倍去離子水，采用超聲波輔助溶解，超聲波功率為100W， 超聲時間為20min，溶解液上DlOl樹脂，采用去離子水進(jìn)行層析； (4) 將層析液過DEAE纖維素樹脂進(jìn)行分離，洗脫至流出液檢測不到多糖停止洗脫，合 并洗脫液。DEAE纖維素樹脂為DE52。
[0023] (5)將洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，得純化后的銀耳多糖。銀耳多糖的干燥方式為噴霧干 燥的最優(yōu)條件為：進(jìn)風(fēng)溫度200°C，出風(fēng)溫度為KKTC ;進(jìn)料固形物含量為50%。
[0024] 銀耳多糖的得率為11. 23%，多糖純度為95. 2%。
[0025] 實施例2 (1)將銀耳粉碎至60目，加20倍水浸泡2h，打漿；向打漿液中加入混合酶，混合酶為纖 維素酶與蛋白酶的混合物，二者比例為纖維素酶：蛋白酶=2:1，纖維素酶的酶活為500u/ ml，蛋白酶的酶活為5u/g; 40°C條件下攪拌酶解1.5h，酶解結(jié)束后，將混合渣液置于循環(huán) 超聲提取機(jī)中進(jìn)行提取；循環(huán)超聲提取條件為：溫度35°C ;超聲功率為500W，循環(huán)攪拌轉(zhuǎn)速 800rpm;占空比1:2;超聲提取時間2.5h。
[0026] (2 )循環(huán)超聲提取結(jié)束后，固液分離，上清液進(jìn)行濃縮；濃縮方式可采用真空減壓 濃縮或膜濃縮，濃縮倍數(shù)為提取液體積的1/8,提取液濃縮后加85%乙醇進(jìn)行靜置沉淀，得 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物； (3) 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物加10倍去離子水，采用超聲波輔助溶解，超聲波功率為100W， 超聲時間為30min，溶解液上DlOl樹脂，采用去離子水進(jìn)行層析； (4) 將層析液過DEAE纖維素樹脂進(jìn)行分離，洗脫至流出液檢測不到多糖停止洗脫，合 并洗脫液。DEAE纖維素樹脂為DE32。
[0027] (5)將洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，得純化后的銀耳多糖。銀耳多糖的干燥方式為噴霧干 燥的最優(yōu)條件為：進(jìn)風(fēng)溫度160°C，出風(fēng)溫度為70°C，進(jìn)料固形物含量為50%。
[0028] 銀耳多糖的得率為12. 51%，多糖純度為96. 3%。
[0029] 實施例3 (1)將銀耳粉碎至30目，加35倍水浸泡I. 5h，打漿；向打漿液中加入混合酶，混合酶 為纖維素酶與蛋白酶的混合物，二者比例為纖維素酶：蛋白酶=2:1，纖維素酶的酶活為 300u/ml，蛋白酶的酶活為7萬u/g;35°C條件下攪拌酶解2h，酶解結(jié)束后，將混合渣液置 于循環(huán)超聲提取機(jī)中進(jìn)行提??；循環(huán)超聲提取條件為：溫度32°C，超聲功率為600W，循環(huán)攪 拌轉(zhuǎn)速800 rpm;占空比1:2;超聲提取時間3h。
[0030] (2 )循環(huán)超聲提取結(jié)束后，固液分離，上清液進(jìn)行濃縮；濃縮方式可采用真空減壓 濃縮或膜濃縮，濃縮倍數(shù)為提取液體積的1/7 ;提取液濃縮后加85%乙醇進(jìn)行靜置沉淀，得 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物； (3) 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物加14倍去離子水，采用超聲波輔助溶解，超聲波功率為100W， 超聲時間為25min，溶解液上DlOl樹脂，采用去離子水進(jìn)行層析； (4) 將層析液過DEAE纖維素樹脂進(jìn)行分離，洗脫至流出液檢測不到多糖停止洗脫，合 并洗脫液。DEAE纖維素樹脂為DE52。
[0031] (5)將洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，得純化后的銀耳多糖。銀耳多糖的干燥方式為噴霧干 燥的最優(yōu)條件為：進(jìn)風(fēng)溫度180°C，出風(fēng)溫度為90°C ;進(jìn)料固形物含量為60%。
[0032] 銀耳多糖的得率為13. 51%，多糖純度為95. 6%。
[0033] 實施例4 (1)將銀耳粉碎至60目，加28倍水浸泡lh，打漿；向打漿液中加入混合酶，混合酶為纖 維素酶與蛋白酶的混合物，二者比例為纖維素酶：蛋白酶=2:1，纖維素酶的酶活為400u/ ml，蛋白酶的酶活為8萬u/g; 40°C條件下攪拌酶解2.5 h，酶解結(jié)束后，將混合渣液置于 循環(huán)超聲提取機(jī)中進(jìn)行提?。谎h(huán)超聲提取條件為：溫度35°C;超聲功率為900W ;循環(huán)攪拌 轉(zhuǎn)速700 rpm;占空比1:2;超聲提取時間3h。
[0034] ( 2 )循環(huán)超聲提取結(jié)束后，固液分離，上清液進(jìn)行濃縮；濃縮方式可采用真空減壓 濃縮或膜濃縮，濃縮倍數(shù)為提取液體積的1/7 ;提取液濃縮后加85%乙醇進(jìn)行靜置沉淀，得 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物； (3) 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物加10倍去離子水，采用超聲波輔助溶解，超聲波功率為100W， 超聲時間為20min，溶解液上DlOl樹脂，采用去離子水進(jìn)行層析； (4) 將層析液過DEAE纖維素樹脂進(jìn)行分離，洗脫至流出液檢測不到多糖停止洗脫，合 并洗脫液。DEAE纖維素樹脂為DE52。
[0035] (5)將洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，得純化后的銀耳多糖。銀耳多糖的干燥方式為噴霧干 燥的最優(yōu)條件為：進(jìn)風(fēng)溫度170°C ;出風(fēng)溫度為95°C，進(jìn)料固形物含量為60%。
[0036] 銀耳多糖的得率為12. 98%，多糖純度為96. 1%。
[0037] 實施例5 (1)將銀耳粉碎至55目，加35倍水浸泡2h，打漿；向打漿液中加入混合酶，混合酶為纖 維素酶與蛋白酶的混合物，二者比例為纖維素酶：蛋白酶=2:1，纖維素酶的酶活為400u/ ml，蛋白酶的酶活為7萬u/g;35°C條件下攪拌酶解2. 4h，酶解結(jié)束后，將混合渣液置于 循環(huán)超聲提取機(jī)中進(jìn)行提?。谎h(huán)超聲提取條件為：溫度35°C ;超聲功率為670W ;循環(huán)攪 拌轉(zhuǎn)速850 rpm，占空比1:2;超聲提取時間3. 5h。
[0038] (2 )循環(huán)超聲提取結(jié)束后，固液分離，上清液進(jìn)行濃縮；濃縮方式可采用真空減壓 濃縮或膜濃縮，濃縮倍數(shù)為提取液體積的1/7 ;提取液濃縮后加85%乙醇進(jìn)行靜置沉淀，得 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物； (3) 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物加10倍去離子水，采用超聲波輔助溶解，超聲波功率為100W， 超聲時間為25min，溶解液上DlOl樹脂，采用去離子水進(jìn)行層析； (4) 將層析液過DEAE纖維素樹脂進(jìn)行分離，洗脫至流出液檢測不到多糖停止洗脫，合 并洗脫液。DEAE纖維素樹脂為DE52。
[0039] (5)將洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，得純化后的銀耳多糖。銀耳多糖的干燥方式為冷凍干 燥的最優(yōu)條件為：冷凍溫度_20°C ;固形物含量為80%。
[0040] 銀耳多糖的得率為13. 56%，多糖純度為96. 7%。
[0041] 實施例6 (1)將銀耳粉碎至55目，加35倍水浸泡lh，打漿；向打漿液中加入混合酶，混合酶為纖 維素酶與蛋白酶的混合物，二者比例為纖維素酶：蛋白酶=2:1，纖維素酶的酶活為400u/ ml，蛋白酶的酶活為6萬u/g;35°C條件下攪拌酶解1.5 h，酶解結(jié)束后，將混合渣液置于 循環(huán)超聲提取機(jī)中進(jìn)行提?。谎h(huán)超聲提取條件為：溫度30°C，超聲功率為700W，循環(huán)攪拌 轉(zhuǎn)速600 rpm，占空比1:2;超聲提取時間3. 4h。
[0042] ( 2 )循環(huán)超聲提取結(jié)束后，固液分離，上清液進(jìn)行濃縮；濃縮方式可采用真空減壓 濃縮或膜濃縮，濃縮倍數(shù)為提取液體積的1/6 ;提取液濃縮后加85%乙醇進(jìn)行靜置沉淀，得 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物； (3) 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物加10倍去離子水，采用超聲波輔助溶解，超聲波功率為100W， 超聲時間為30min，溶解液上DlOl樹脂，采用去離子水進(jìn)行層析； (4) 將層析液過DEAE纖維素樹脂進(jìn)行分離，洗脫至流出液檢測不到多糖停止洗脫，合 并洗脫液。DEAE纖維素樹脂為DE52。
[0043] (5)將洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，得純化后的銀耳多糖。銀耳多糖的干燥方式為冷凍干 燥的最優(yōu)條件為：冷凍溫度_80°C，固形物含量為90%。
[0044] 銀耳多糖的得率為12. 31%，多糖純度為95. 7%。
[0045] 實施例7 (1)將銀耳粉碎至33目，加32倍水浸泡2h，打漿；向打漿液中加入混合酶，混合酶為纖 維素酶與蛋白酶的混合物，二者比例為纖維素酶：蛋白酶=2:1，纖維素酶的酶活為400u/ ml，蛋白酶的酶活為6萬u/g; 40°C條件下攪拌酶解1.5 h，酶解結(jié)束后，將混合渣液置于 循環(huán)超聲提取機(jī)中進(jìn)行提取；循環(huán)超聲提取條件為：溫度30 °C，超聲功率為600W，循環(huán) 攪拌轉(zhuǎn)速1000 rpm，占空比1:2;超聲提取時間2. 7h。
[0046] (2 )循環(huán)超聲提取結(jié)束后，固液分離，上清液進(jìn)行濃縮；濃縮方式可采用真空減壓 濃縮或膜濃縮，濃縮倍數(shù)為提取液體積的1/7 ;提取液濃縮后加85%乙醇進(jìn)行靜置沉淀，得 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物； (3) 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物加10倍去離子水，采用超聲波輔助溶解，超聲波功率為100W， 超聲時間為30min，溶解液上DlOl樹脂，采用去離子水進(jìn)行層析； (4) 將層析液過DEAE纖維素樹脂進(jìn)行分離，洗脫至流出液檢測不到多糖停止洗脫，合 并洗脫液。DEAE纖維素樹脂為DE32。
[0047] (5)將洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，得純化后的銀耳多糖。銀耳多糖的干燥方式為冷凍干 燥的最優(yōu)條件為：冷凍溫度-20，固形物含量為60%。
[0048] 銀耳多糖的得率為11. 23%，多糖純度為95. 5%。
[0049] 實施例8采用熱水提取銀耳多糖的對比試驗 按照實施例1的步驟進(jìn)行，所不同的是步驟（1)提取步驟不同。將銀耳粉碎至40目， 加40倍水浸泡lh，80°C條件下攪拌提取I. 5h。其與步驟相同。
[0050] 銀耳多糖的得率為8. 27%，多糖純度為62. 8%。
[0051] 實施例9采用熱水提取銀耳多糖的對比試驗 按照實施例2的步驟進(jìn)行，所不同的是步驟（1)提取步驟不同。將銀耳粉碎至60目， 加20倍水浸泡lh，90°C條件下攪拌提取2. 5h。其與步驟相同。
[0052] 銀耳多糖的得率為7. 42%，多糖純度為72. 5%。
[0053] 銀耳多糖的抗氧化實驗效果： (1)銀耳多糖清除羥自由基效果實驗 利用H2O2與Fe 2+混合產(chǎn)生OH在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在 510nm 下有最大吸收。反應(yīng)體系中含 8. 8mmol/L H2O2 lml,9mmol /LFeSO4 lmL，9mmol/L 水 楊酸-乙醇lml，不同濃度的多糖溶液Iml最后加 H2O2啟動反應(yīng)，37°C反應(yīng)0. 5小時，以蒸 餾水為參比，在510nm下測量各濃度的吸光度。考慮到多糖本身的吸收光值，以9 mmol /L FeSO4 lml，9mmol/L水楊酸-乙醇lml，不同濃度的多糖溶液Iml和Iml蒸饋水作為多糖的 本底吸收值。清除率計算公式為： 清除率（%) =[ (A。-(Ax -Axq )) /Atl ] X100% 式中：Atl為空白對照液的吸光度；AxS加入多糖溶液后的吸光度；Aro為不加顯色劑H 2O2 多糖溶液本底的吸光度。
[0054] (2 )銀耳多糖清除超氧陰離子自由基（02-)效果實驗 取4. 5mL，pH8. 2,50mmol/L Tris-HCl緩沖液，4. 2m 1蒸餾水.混勻后在25°C水浴中 保溫20m in，取出后立即加入在25°C預(yù)熱過的3mmol鄰苯三酚0. 3ml (以lOmmol/LHCl配 制，空白管用IOmmoVLHCl代替鄰苯三酚的HCl溶液），迅速搖勻后倒入比色杯，325nm 下每隔IOs測定吸光度，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加。
[0055] 抑制率（%) = [( Λ A0 - Λ A) / Λ A0 ] X 100% 式中：AAtj為鄰苯三酚的自氧化速率；ΛΑ為加入多糖溶液后鄰苯三酚的自氧化速 率。
[0056] 表1實施例1制備所得銀耳多糖清除自由基的測定

【權(quán)利要求】
1. 一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將銀耳粉碎至40?60目，加20?40倍水浸泡1?2h，打漿；向打漿液中加入混 合酶，30?40°C條件下攪拌酶解1. 5?2. 5 h，酶解結(jié)束后，將混合渣液置于循環(huán)超聲提取 機(jī)中進(jìn)行提?。? (2) 循環(huán)超聲提取結(jié)束后，固液分離，上清液進(jìn)行濃縮；濃縮倍數(shù)為提取液體積的 1/6?1/8,優(yōu)選1/7 ;提取液濃縮后加85%乙醇進(jìn)行靜置沉淀，得銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物； (3) 銀耳胞內(nèi)多糖沉淀物加10?15倍去離子水，采用超聲波輔助溶解，超聲波功率為 100W，超聲時間為20?30min，溶解液上D101樹脂，采用去離子水進(jìn)行層析； (4) 將層析液過DEAE纖維素樹脂進(jìn)行分離，洗脫至流出液檢測不到多糖停止洗脫，合 并洗脫液； (5) 將洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，得純化后的銀耳多糖， 步驟（1)中所述的混合酶為纖維素酶與蛋白酶的混合物，二者比例為纖維素酶：蛋白 酶=2:1，纖維素酶的酶活為200-500u/ml，蛋白酶的酶活為5-10萬u/g。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法，其特征在于：步驟（1)中 所述的銀耳與水的比例為1:30~1:35,優(yōu)選1:32。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法，其特征在于：步驟（1)中 所述的循環(huán)超聲提取條件為：溫度30~35°C，優(yōu)選35°C ;超聲功率為500~1000W，優(yōu)選900W ; 循環(huán)攪拌轉(zhuǎn)速500~1000 rpm，優(yōu)選800rpm;占空比1:2;超聲提取時間2. 5~3. 5h，優(yōu)選3h。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法，其特征在于：步驟（2)中 濃縮方式可采用真空減壓濃縮或膜濃縮。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法，其特征在于：步驟（4)中 所述的DEAE纖維素樹脂為DE52或DE32中的一種，優(yōu)選DE52。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法，其特征在于：步驟（5)中 所述的洗脫液的干燥方式為冷凍干燥或噴霧干燥。
7. 如權(quán)利要求6所述的一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法，其特征在于：銀耳多 糖的干燥方式為噴霧干燥的最優(yōu)條件為：進(jìn)風(fēng)溫度160~200°C，優(yōu)選180°C ;出風(fēng)溫度為 70~100°C，優(yōu)選90°C ;進(jìn)料固形物含量為50~80%，優(yōu)選60%。
8. 如權(quán)利要求6所述的一種銀耳胞內(nèi)多糖分離、純化的方法，其特征在于：銀耳多糖 的干燥方式為冷凍干燥的最優(yōu)條件為：冷凍溫度-20 ~ _80°C，優(yōu)選-40°C;固形物含量 為 70~90%，優(yōu)選 80%。
【文檔編號】C08B37/00GK104497157SQ201410796766
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】周鷺紅, 黃永恒, 付立忠, 諶奇?zhèn)? 魏善龍 申請人:綠雅（江蘇）食用菌有限公司