本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥與生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及O型口蹄疫病毒(FMDV)毒株(O/BY/CHA/2010)中結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP4的表位最小基序肽、擴(kuò)展肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
家畜口蹄疫是當(dāng)今世界上最為嚴(yán)重的家畜傳染病，主要危害豬、牛、羊等偶蹄類動(dòng)物,國際獸醫(yī)局將口蹄疫列為A類傳染病之首。多年來，口蹄疫在世界范圍內(nèi)大規(guī)模爆發(fā)和流行，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)免疫原性，口蹄疫病毒有A、O、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ及AsiaI共7個(gè)血清型及65個(gè)以上的亞型。免疫接種是發(fā)展中國家預(yù)防口蹄疫爆發(fā)的主要途徑。傳統(tǒng)的滅活苗具有免疫原性高、保護(hù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但可能會(huì)出現(xiàn)疫苗滅活不徹底或病毒逃逸，從而造成口蹄疫的爆發(fā)流行，具有潛在的危險(xiǎn)。因此，很多研究者轉(zhuǎn)向?qū)蚬こ桃呙绾投鄡r(jià)肽疫苗的研究。就后者重組多表位肽疫苗而言，理想的疫苗應(yīng)該同時(shí)包含線性B細(xì)胞表位(以下簡稱線性表位)和T細(xì)胞表位，前者在B細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)生成抗體，而后者則能刺激T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，促使B細(xì)胞分泌抗體。因此，兩者表位的篩選鑒定一直是病毒學(xué)和疫苗學(xué)研究領(lǐng)域中的重要研究內(nèi)容，例如，之前就有相關(guān)的抗原性肽的研究報(bào)道(如TangH,LiuXS,FangYZ,etal.TheEpitopesofFootandMouthDisease[J].AsianJournalofAnimalandVeterinaryAdvances,2012,7(12):1261-1265；BlancoE,McCulloughK,SummerfieldA,etal.Interspeciesmajorhistocompatibilitycomplex-restrictedThcellepitopeonfoot-and-mouthdiseaseviruscapsidproteinVP4[J].JVirol,2000,74:4902–4907；王加龍等。)。但是，盡管這方面的鑒定方法成百上千(吳敬和吳梧桐.B細(xì)胞蛋白質(zhì)抗原表位的研究方法進(jìn)展.藥物生物技術(shù),7(4)：239-242,2000；沈關(guān)心等譯.抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南.科學(xué)出版社，2002；王洪林等.B細(xì)胞表位定位的研究進(jìn)展.生命科學(xué),21:317-319,2009)，如以上列舉文獻(xiàn)所示，由于受線性(非構(gòu)象型)B細(xì)胞表位鑒定方法的限制，以往鑒定的都是未經(jīng)過抗體識(shí)別最小基序(通常由3～8個(gè)殘基組成)鑒定結(jié)果多是較長的16聚或更長的抗原性肽(antigenicpeptide)，而不是真正的表位肽。另外，在合成肽疫苗呈現(xiàn)向重組多表位肽疫苗發(fā)展的背景下(ShiYP,Hasnain,SE,SacciJB,etal.ImmunogenicityandinvitroprotectiveefficacyofarecombinantmultistagePlasmodiumfalciparumcandidatevaccine.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96,1615–162,1999；HeYP,XuWX,HongAZ,etal.Immunogeniccomparisonfortwodifferentrecombinantchimericpeptides(CP12andCP22)containingoneortwocopiesofthreelinearBcellepitopesfromβ-hCGsubunit.JBiotechnol,151:15-21,2011)，為了研制抗體有效的預(yù)防性靶病毒多表位肽疫苗，靶蛋白線性表位及其抗體識(shí)別最小基序的鑒定就顯得尤為重要。眾所周知，從靶蛋白上鑒定出一段可誘發(fā)抗體生成的抗原性肽發(fā)明具有新穎性和創(chuàng)造性，因此國內(nèi)外這樣的授權(quán)專利比比皆是。從靶蛋白上鑒定出每一個(gè)抗體所能識(shí)別的精細(xì)表位肽，亦或它(們)被包含在一段已公開的抗原性肽序列內(nèi)，它同樣具有新穎性和創(chuàng)造性，因?yàn)樗瑯邮菍?shí)際應(yīng)用的需要，如在研制基于表位最小基序肽的重組多表位肽的場合，就有可能盡可能多地組合線性表位肽(因?yàn)槌鲇跒檫m合如大腸桿菌和/或真核細(xì)胞高表達(dá)和研制成本考慮，設(shè)計(jì)的人工抗原肽長度有限，一般在200個(gè)氨基酸殘基左右，其中為確保所設(shè)計(jì)多表位肽具有強(qiáng)免疫原性，必須同時(shí)組合一般長度10～30個(gè)殘基的廣譜性強(qiáng)輔助性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位肽)，也能有助于產(chǎn)生特定所需有效的表位抗體(由于線性B細(xì)胞表位由最小3個(gè)殘基最大8個(gè)殘基組成，顯然長抗原性肽中就可能存在N個(gè)表位，就有可能產(chǎn)生N個(gè)表位抗體，而選用精細(xì)表位肽則能使N個(gè)表位數(shù)減少到最低，以利目的抗體生成，同時(shí)避免可能有害的其他抗體生成)?？傊b定發(fā)明靶蛋白上精細(xì)表位肽的意義和應(yīng)用益處是顯而易見的。需要指出的是，因?yàn)榭谔阋邔?duì)國家經(jīng)濟(jì)、貿(mào)易的重大影響，素有“政治經(jīng)濟(jì)病”之稱，所以對(duì)于口蹄疫病毒疫苗的研究由來已久，也是第一個(gè)成功鑒定抗原表位肽并實(shí)現(xiàn)基因合成肽疫苗的病毒(ref.)，尤其以對(duì)O型FMDV研究居多。Pfaff等人早在1982年就鑒定到FMDVO1K的VP1(144-159aa)LRGDLQVLAQKVARTL是一個(gè)主要的抗體結(jié)合位點(diǎn)(PfaffE,MussgayM,HO,SchulzGE,SchallerH.Antibodiesagainstapreselectedpeptiderecognizeandneutralizefootandmouthdiseasevirus.EMBOJ.1982；1(7):869-74.)；在同一年，Bittle等人發(fā)現(xiàn)FMDVO型，Kaufbeuren毒株的VP1(25-41aa)(200-213)是主要的B細(xì)胞抗原表位(BittleJL,HoughtenRA,AlexanderH,ShinnickTM,SutcliffeJG,LernerRA,RowlandsDJ,BrownF.Protectionagainstfoot-and-mouthdiseasebyimmunizationwithachemicallysynthesizedpeptidepredictedfromtheviralnucleotidesequence.Nature.1982Jul1；298(5869):30-3.)。但是由于受到表位鑒定方法的限制，難以開展最小基序鑒定。由于這3個(gè)肽段在FMDV各型之間或型內(nèi)都不具有保守性，加之FMDV毒株變異較快，一旦新疫情發(fā)生，必須重新組建針對(duì)性疫苗。此后，也有關(guān)于AsialI型外殼蛋白抗原表位的鑒定，VP1的(1-12aa),(17-29aa),(194-211aa)；VP2(40-50aa),VP3(26-39aa),VP4(30-41)，但同樣未對(duì)其進(jìn)行精細(xì)表位鑒定(ZhangZW1,ZhangYG,WangYL,PanL,FangYZ,JiangST,LüJL,ZhouP.ScreeningandidentificationofBcellepitopesofstructuralproteinsoffoot-and-mouthdiseasevirusserotypeAsia1.VetMicrobiol.2010Jan6；140(1-2):25-33.)。以上研究從一個(gè)側(cè)面反映靶蛋白表位掃描作圖和最小基序鑒定并非易事的同時(shí)，也證實(shí)本發(fā)明5個(gè)O型FMDV的表位精細(xì)鑒定確是實(shí)際應(yīng)用的需求，能體現(xiàn)創(chuàng)造性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供口蹄疫病毒(FMDV)O型毒株(O/BY/CHA/2010)中3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的精細(xì)抗原表位肽，以及這些表位最小基序肽的擴(kuò)展肽(8肽)或長于該短肽(8肽)的抗原；還提供所述最小基序肽、最小基序肽的擴(kuò)展短肽(8肽)或長于該短肽(8肽)的抗原的應(yīng)用。本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)一步具體描述如下。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供口蹄疫病毒(FMDV)O型毒株3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的精細(xì)抗原表位肽的目的，我們通過改良生物合成肽法，利用豚鼠抗FMDVO型標(biāo)準(zhǔn)血清，對(duì)流行的FMDVO型毒株O/BY/CHA/2010的3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行了線性表位掃描作圖研究。在覆蓋VP1、VP2和VP4三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白全長序列的重疊18聚肽中，鑒定能與豚鼠抗FMDVO型標(biāo)準(zhǔn)血清發(fā)生免疫印跡反應(yīng)的抗原性肽；針對(duì)抗原性肽進(jìn)一步設(shè)計(jì)重疊8肽序列，通過免疫印跡反應(yīng)進(jìn)而確定其精細(xì)抗原表位及氨基酸序列。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：通過改良生物合成肽法和豚鼠抗FMDVO型標(biāo)準(zhǔn)血清有效地鑒定出了口蹄疫病毒O型毒株(O/BY/CHA/2010)所含有的3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的精細(xì)抗原表位肽。本發(fā)明提供口蹄疫病毒O型毒株(O/BY/CHA/2010)中VP1、VP2和VP4三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的表位最小基序肽，其用豚鼠抗FMDVO型標(biāo)準(zhǔn)血清鑒定，共有5個(gè)表位，其氨基酸序列分別為：SEQ.IDNO.1、SEQ.IDNO.2、SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.4和SEQ.IDNO.5所示。其中，VP1結(jié)構(gòu)蛋白的最小表位基序肽的氨基酸序列為SEQ.IDNO.1和SEQ.IDNO.2所示，依次記為FMDV:VP1142-147、FMDV:VP1204-208；VP2結(jié)構(gòu)蛋白的最小表位基序肽的氨基酸序列為SEQ.IDNO.3和SEQ.IDNO.4所示，依次記為FMDV:VP28-13、FMDV:VP214-18；VP4結(jié)構(gòu)蛋白的最小表位基序肽的氨基酸序列為SEQ.IDNO.5所示，記為FMDV:VP422-27。本發(fā)明還提供上述5個(gè)最小表位基序肽的擴(kuò)展短肽，其氨基酸序列依次為SEQ.IDNo.6～SEQ.IDNo.10所示，當(dāng)化學(xué)合成或融合表達(dá)蛋白使用時(shí)，擴(kuò)展的殘基部分可增刪或替代。本發(fā)明還提供所述的最小表位基序肽在重組多表位肽疫苗制備、藥物或制備檢測抗體方面的應(yīng)用。本發(fā)明還提供表位最小基序肽的擴(kuò)展短肽單獨(dú)或組合在制備口蹄疫流行病診斷的血清識(shí)別表位標(biāo)志物的應(yīng)用。上述的口蹄疫病毒O型毒株(O/BY/CHA/2010)結(jié)構(gòu)蛋白的精細(xì)抗原表位肽，在其他FMDV(O型、A型、AsialI型、C型、SATI、SATII、SATIII)流行毒株也存在，即構(gòu)建這樣的重組多表位肽疫苗對(duì)其他型口蹄疫病毒毒株也有效。附圖說明圖1是VP1的21個(gè)18肽融合表達(dá)的SDS-PAGE分析結(jié)果；圖1A：泳道1：BL21(DE3)空菌表達(dá)的總蛋白，泳道2：pXXGST-1質(zhì)粒表達(dá)的截短GST188蛋白，泳道3～14：表達(dá)的覆蓋結(jié)構(gòu)蛋白VP1全長度相互重疊10個(gè)殘基的18聚肽P1～P12融合蛋白，泳道15：蛋白分子量Marker；圖1B：泳道1：BL21(DE3)空菌表達(dá)的總蛋白，泳道2：pXXGST-1質(zhì)粒表達(dá)的截短GST188蛋白，泳道3～11：表達(dá)的VP1結(jié)構(gòu)蛋白18聚肽P13～P21融合蛋白，泳道12：蛋白分子量Marker。目的條帶位于25kDa處對(duì)應(yīng)的位置，截短GST188載體蛋白略小于重組目的蛋白。1B圖泳道5中目的條帶也是18聚肽，可能氨基酸組成及一級(jí)結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致遷移率較低。圖2是表達(dá)VP2結(jié)構(gòu)蛋白26個(gè)相互重疊10個(gè)殘基的18聚肽融合蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果；圖2A泳道1：pXXGST-1質(zhì)粒表達(dá)的截短GST188蛋白，泳道2～14：表達(dá)的VP2結(jié)構(gòu)蛋白18聚肽P1～P13融合蛋白，泳道15：蛋白分子量Marker；圖2B：泳道1：pXXGST-1質(zhì)粒表達(dá)的GST188蛋白，泳道2～14：表達(dá)的VP2結(jié)構(gòu)蛋白18聚肽P14～P26融合蛋白，泳道15：蛋白分子量Marker。目的條帶位于25kDa處偏下一點(diǎn)的位置，截短GST188載體蛋白略小于重組目的蛋白。圖3是表達(dá)VP4結(jié)構(gòu)蛋白10個(gè)18聚肽融合蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果：泳道1：pXXGST-1質(zhì)粒表達(dá)的GST188蛋白，泳道2～11：表達(dá)VP4結(jié)構(gòu)蛋白18聚肽P1～P10融合蛋白，泳道12：蛋白分子量Marker。目的條帶位于25kDa處偏下一點(diǎn)的位置，截短GST188載體蛋白略小于重組目的蛋白。圖4FMDVO/BY/CHA/2010毒株3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白18聚肽的免疫印跡鑒定；圖4A：泳道1為BL21(DE3)空菌總蛋白對(duì)照，泳道2為pXXGST-1表達(dá)GST188蛋白對(duì)照，泳道3～11依次為VP1結(jié)構(gòu)蛋白18聚肽P13～P21融合蛋白，泳道12為蛋白分子量Marker；圖4B：泳道1為pXXGST-1質(zhì)粒表達(dá)GST188蛋白對(duì)照，泳道2～14依次為VP2結(jié)構(gòu)蛋白P1～P13，泳道15為蛋白分子量Marker；圖4C：泳道1為GST188蛋白對(duì)照，泳道2～11依次為VP4結(jié)構(gòu)蛋白P1～P10融合蛋白，泳道12為蛋白分子量Marker。圖5VP1141aa-160aa的8肽克隆構(gòu)建及表達(dá)注：1為pXXGST-1對(duì)照，2～14依次為重組8肽，15為Marker。目的條帶位于25kDa～15kDa之間比較明顯的蛋白條帶，截短GST188載體蛋白略小于重組目的蛋白。圖6VP1-14的8肽克隆構(gòu)建及表達(dá)；其中：1為pXXGST-1對(duì)照，2～11依次為VP1-14-1～VP1-14-10，12為Marker。圖7VP1-20的8肽克隆構(gòu)建及表達(dá)；其中：1為pXXGST-1對(duì)照，2～12依次為VP1-20-1～VP1-20-11，13為Marker。圖8VP1-21的8肽克隆構(gòu)建及表達(dá)；其中：1為pXXGST-1對(duì)照，2～7依次為VP1-21-1～VP1-21-6，8為Marker。圖9VP2-1的8肽克隆構(gòu)建及表達(dá)；其中：1～11依次為VP2-1-1～VP2-1-11，12為Marker。圖10VP2-2的8肽克隆構(gòu)建及表達(dá)；其中：1為pXXGST-1對(duì)照，2～9依次為VP2-2-1～VP2-2-8，10為Marker。圖11VP4-3的8肽克隆構(gòu)建及表達(dá)；其中：1為BL21(DE3)空菌對(duì)照，2為pXXGST-1對(duì)照，3～13依次為VP4-3-1～VP4-3-11，14為Marker。圖12VP1141-160的8肽免疫印跡鑒定；其中：1為pXXGST-1對(duì)照，2～14依次為VP1-N～VP1-Z，15為Marker。圖13VP1-14，VP1-20，VP1-21的8肽免疫印跡鑒定；其中：圖13A：1為pXXGST-1對(duì)照，2～11依次為VP1-14-1～VP1-14-10，12為Marker；圖13B：1為pXXGST-1對(duì)照，2～12依次為VP1-20-1～VP1-20-11，13為Marker；圖13C：1為pXXGST-1對(duì)照，2～6依次為VP1-21-2～VP1-21-6，7為Marker。圖14VP2-1和VP2-2的8肽免疫印跡鑒定；其中：圖14A：1為pXXGST-1對(duì)照，2～12依次為VP2-1-1～VP2-1-11，13為Marker；圖14B：1為pXXGST-1對(duì)照，2～9依次為VP2-2-1～VP2-2-8，10為Marker。圖15VP4-3的8肽免疫印跡鑒定；其中：1為pXXGST-1對(duì)照，2～13依次為VP4-3-1～VP4-3-11，14為Marker。具體實(shí)施方式本發(fā)明可進(jìn)一步通過下列實(shí)例描述。列舉實(shí)例并不意味限制本發(fā)明所涉及的范圍，該范圍在之前的描述中已被充分陳述闡明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均按照常規(guī)條件以及[美]J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾編著黃培堂等翻譯的第三版“分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊”(科學(xué)出版社，2002)和[美]E.哈洛和D.萊恩編著沈關(guān)心等翻譯的“抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南”(科學(xué)出版社，2002)中所述的步驟，或按照生產(chǎn)銷售商建議的條件進(jìn)行。實(shí)施例1本實(shí)施例為FMDVO型毒株O/BY/CHA/20104個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白精細(xì)抗原表位的鑒定：(1)靶蛋白系列18/8聚肽編碼DNA片段設(shè)計(jì)依據(jù)GenBank中FMDVO型毒株O/BY/CHA/2010的VP1、VP2、VP4三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列(GenBank登錄號(hào)JN998085.1)，對(duì)其進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化后，設(shè)計(jì)覆蓋三個(gè)蛋白基因全長序列相互重疊10個(gè)aa殘基的18/8聚肽編碼DNA片段，并在其兩端分別加上BamHI和TAA-SalI粘性末端序列，化學(xué)合成各短肽編碼DNA正負(fù)鏈片段。在完成第一輪18聚肽掃描作圖后，就反應(yīng)性肽段設(shè)計(jì)系列相互重疊7個(gè)殘基的8聚肽，同時(shí)針對(duì)之前發(fā)現(xiàn)的抗原表位VP1(21-40)和VP1(141-160)設(shè)計(jì)系列8聚肽，開展第二輪抗體識(shí)別表位最小基序鑒定。(2)系列短肽融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選及鑒定按分子克隆方法，將合成的18/8聚肽正負(fù)鏈編碼DNA片段兩兩進(jìn)行退火，然后通過DNA連接酶將它們分別與經(jīng)BamHI和SalI雙酶切的載體pXXGST-1連接過夜，次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)菌株，涂布在加Amp的LB平板上。挑單菌落接種于3mL加有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，220r/min，30℃搖菌16～18h后，將菌液按2％比例轉(zhuǎn)接到新的3mL加有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)220r/min，30℃培養(yǎng)4h，直至菌體密度OD600吸光值達(dá)到0.6，然后于42℃誘導(dǎo)表達(dá)5h；取1mL菌液離心收集菌體，加入50μL的ddH2O懸浮菌體后，再加入50μL的2×上樣Buffer混勻，沸水中放置5min，14000r/min離心10min，取10μL上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳(15％分離膠)，陰性對(duì)照為用載體對(duì)照pXXGST-1轉(zhuǎn)化菌。圖1-圖3為18肽的SDS-PAGE結(jié)果；圖5-圖11為8肽克隆構(gòu)建及表達(dá)。取短肽融合蛋白大于載體蛋白對(duì)照1～2kDa的重組克隆菌進(jìn)行DNA測序，驗(yàn)證各化學(xué)合成短肽編碼片段序列的正確性。(3)抗原反應(yīng)性18/8聚肽的免疫印跡鑒定對(duì)DNA測序正確的系列18/8聚肽克隆菌進(jìn)行熱誘導(dǎo)表達(dá)，收集細(xì)菌總蛋白直接進(jìn)行的免疫印跡鑒定，即，將電泳結(jié)束后SDS-PAGE凝膠上的各誘導(dǎo)菌總蛋白電轉(zhuǎn)移到孔徑0.2μm的醋酸纖維素膜上，用5％的脫脂牛奶(用PBST配制)封閉2h；加入豚鼠抗FMDVO型標(biāo)準(zhǔn)血清(用5％的脫脂牛奶按其效價(jià)進(jìn)行稀釋)孵育1h；用PBST洗3次，5min/次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豚鼠IgG(用5％的脫脂牛奶按其效價(jià)進(jìn)行稀釋)孵育1h；用洗滌液洗3次，5min/次；用曝光儀對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測(用ECL底物發(fā)光試劑盒)。圖4為18聚肽的免疫印跡鑒定結(jié)果；圖12-圖15為8肽克隆的免疫印跡鑒定結(jié)果。(4)抗原表位最小基序的確定篩選到的反應(yīng)性8聚肽如表1所示，表1免疫印跡反應(yīng)篩選到的18聚肽和8聚肽及精細(xì)表位的確定依據(jù)它們的共有序列確定出精細(xì)抗原表位VP1142-147(PNVRGD)，VP1204-208(KIVAP)，VP28-13(TLLEDR)，VP214-18(ILTTR)，VP422-27(INNYYM)。