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1號染色體替換野生小家鼠品系C57BL/6.松江3?Chr1的構(gòu)建的制作方法與工藝

文檔序號:12891160閱讀:538來源:國知局
1號染色體替換野生小家鼠品系C57BL/6.松江3?Chr1的構(gòu)建的制作方法與工藝
1號染色體替換野生小家鼠品系C57BL/6.松江3-Chr1的構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬小鼠品系的構(gòu)建領(lǐng)域,特別是涉及1號染色體替換野生小家鼠C57BL/6.松江3-Chr1的構(gòu)建。

背景技術(shù):
實驗小家鼠品系遺傳多樣性缺乏會對復(fù)雜性狀研究造成較大的障礙,這主要表現(xiàn)在兩個方面:首先,群體中各個基因座位的等位基因數(shù)量較少,在針對多基因相關(guān)性狀的研究時,會由于基因背景的類同而導(dǎo)致部分性狀相關(guān)基因信息的遺漏;其次,基因組連鎖不平衡程度較大,這對性狀相關(guān)基因的初步定位有利,但對精細(xì)定位造成很大的困難,導(dǎo)致耗費大量的時間和個體。野生小家鼠生存環(huán)境復(fù)雜多樣,且經(jīng)歷了漫長的進(jìn)化,小鼠遺傳多樣性的表現(xiàn)就是表型性狀豐富多樣:(1)野生小家鼠群體中存在更豐富的性狀差異,如野生小家鼠與實驗小鼠相比對病原體感染的易感性具有明顯差異。由于實驗小鼠生存的環(huán)境使之躲避了病原體的侵襲,野生小家鼠則經(jīng)歷了選擇,因此可以在野生小家鼠群體中找對特定病原體具有抗性的個體或群體,有些野生小家鼠群體本身就是某些病原體的天然宿主,這對研究人類病原體感染的免疫遺傳學(xué)機(jī)制具有重大意義。(2)野生小家鼠豐富的遺傳多樣性也體現(xiàn)在基因相互作用上。例如將野生小家鼠與實驗小鼠雜交可出現(xiàn)各種基因相互作用,在進(jìn)化上分化幾百萬年的基因產(chǎn)物表達(dá)于同一個體中,不可避免會發(fā)生強烈的基因相互作用。中國野生小家鼠大致分為兩個亞種,即北方的musculus亞種及南方的castaneus亞種,松江位于上海,位于長江以南。通過DNA測序技術(shù),對F1代小鼠1號染色體進(jìn)行連鎖不平衡分析得知,松江3(來源于上海松江)屬于M.m.musculus和castaneus混合亞種,其野生小家鼠毛色為灰色,因為松江位于長江流域周邊,處于中國的中間地帶,南北方人員流動更為密切,因此松江3含有的M.m.musculus和castaneus亞種各占一半。C57BL/6是第一個高質(zhì)量的小鼠基因組序列草圖是通過C57BL/6繪制的。其基因信息明確、生育力強,廣泛應(yīng)用于重大疾病的研究。鑒于C57BL/6小鼠基因信息明確,有必要以之作為背景,通過染色體替換試驗,來研究松江3小鼠各染色體及其上的基因的功能。目前對于松江3小鼠的研究較少,其遺傳學(xué)特性較為不清楚。因此,克服技術(shù)難度以獲得引進(jìn)了松江3小鼠染色體的C57BL/6小鼠品系是研究的關(guān)鍵。

技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供1號染色體替換野生小家鼠品系C57BL/6.松江3-Chr1的構(gòu)建。在本發(fā)明的第一方面,提供一種1號染色體替換實驗小鼠品系C57BL/6.松江3-Chr1的建立方法,所述方法包括:(1)以松江3品系雄性小鼠作為父本、C57BL/6品系雌性小鼠作為母本進(jìn)行雜交,獲得F1代小鼠;(2)將F1代雌性小鼠與C57BL/6品系雄性小鼠雜交,獲得回交一代小鼠;該雄性回交小鼠中,Y染色體和線粒體DNA已被替換為C57BL/6品系來源的;使用多核苷酸多態(tài)性位點鑒定雄性回交小鼠的1號染色體,選擇1號染色體多核苷酸多態(tài)性位點鑒定結(jié)果為松江3品系小鼠所特有的雄性回交小鼠;使用短串聯(lián)重復(fù)序列位點鑒定選擇到的雄性回交小鼠,選擇1號染色體短串聯(lián)重復(fù)序列位點鑒定結(jié)果為松江3品系小鼠所特有的回交小鼠;(3)將選擇到的雄性回交小鼠與C57BL/6品系雌性小鼠雜交,獲得下一代回交小鼠,該雄性回交小鼠中,X染色體已被替換為C57BL/6品系來源的;(4)使用多核苷酸多態(tài)性位點鑒定雄性回交小鼠的1號染色體,選擇1號染色體多核苷酸多態(tài)性位點鑒定結(jié)果為松江3品系小鼠所特有的雄性回交小鼠;使用短串聯(lián)重復(fù)序列位點鑒定選擇到的雄性回交小鼠,選擇1號染色體短串聯(lián)重復(fù)序列位點鑒定結(jié)果為松江3品系小鼠所特有的雄性回交小鼠;(5)重復(fù)步驟(3)~(4)5-50次;從而獲得染色體替代動物品系,其以C57BL/6品系小鼠為背景,且其1號染色體被松江3品系小鼠的1號染色體替換。另一優(yōu)選例中,所述的1號染色體的多核苷酸多態(tài)性位點包括:rs31426703,其在1號染色體上所處位置為chr1:12720994;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為C,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為T;rs32086848,其在1號染色體上所處位置為chr1:17643006;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A;rs31928308,其在1號染色體上所處位置為chr1:28659508;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G;rs32139742,其在1號染色體上所處位置為chr1:40806614;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A;rs31336640,其在1號染色體上所處位置為chr1:47136503;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A;rs6297658,其在1號染色體上所處位置為chr1:57382018;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G;rs6302815,其在1號染色體上所處位置為chr1:69463837;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G;rs30146639,其在1號染色體上所處位置為chr1:76144374;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A;rs32011713,其在1號染色體上所處位置為chr1:79917356;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為C,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A;rs6212353,其在1號染色體上所處位置為chr1:84131501;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為C,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A;rs32662004,其在1號染色體上所處位置為chr1:98333575;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A;rs32495825,其在1號染色體上所處位置為chr1:124737843;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A;rs31580048,其在1號染色體上所處位置為chr1:133446374;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A;rs30694738,其在1號染色體上所處位置為chr1:142191205;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G;rs30902647,其在1號染色體上所處位置為chr1:150127783;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為T,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為C;rs3678938,其在1號染色體上所處位置為chr1:158391632;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A;rs30776510,其在1號染色體上所處位置為chr1:168028380;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為T,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G;rs32297231,其在1號染色體上所處位置為chr1:183890447;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為G,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為A;rs32366433,其在1號染色體上所處位置為chr1:188750111;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為C,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為T;rs31145145,其在1號染色體上所處位置為chr1:192018789;在松江3品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為C,在C57BL/6品系小鼠染色體相應(yīng)位置的堿基為T。另一優(yōu)選例中,通過SNP位點引物PCR結(jié)合連接酶檢測反應(yīng)來確定1號染色體多核苷酸多態(tài)性位點鑒定結(jié)果。另一優(yōu)選例中,所述的1號染色體的短串聯(lián)重復(fù)序列位點包括:D1MIT64,其在1號染色體上所處位置為3.7cM;在松江3品系小鼠基因組和C57BL/6品系小鼠染色體中,相應(yīng)位置上基因序列長度差異20bp,松江3品系小鼠C57BL/6品系小鼠比少10個2bp堿基重復(fù);D1MIT236,其在1號染色體上所處位置為25.7cM;在松江3品系小鼠基因組和C57BL/6品系小鼠染色體中,相應(yīng)位置上基因序列長度差異10bp,松江3品系小鼠C57BL/6品系小鼠比少8個2bp堿基重復(fù);D1MIT303,其在1號染色體上所處位置為32cM;在松江3品系小鼠基因組和C57BL/6品系小鼠染色體中,相應(yīng)位置上基因序列長度差異20bp,松江3品系小鼠C57BL/6品系小鼠比多10個2bp堿基重復(fù);D1MIT49,其在1號染色體上所處位置為44cM;在松江3品系小鼠基因組和C57BL/6品系小鼠染色體中,相應(yīng)位置上基因序列長度差異18bp,松江3品系小鼠C57BL/6品系小鼠比少9個2bp堿基重復(fù);D1MIT387,其在1號染色體上所處位置為51.5cM;在松江3品系小鼠基因組和C57BL/6品系小鼠染色體中,相應(yīng)位置上基因序列長度差異6bp,松江3品系小鼠C57BL/6品系小鼠比少3個2bp堿基重復(fù);D1mit445,其在1號染色體上所處位置為58cM;在松江3品系小鼠基因組和C57BL/6品系小鼠染色體中,相應(yīng)位置上基因序列長度差異18bp,松江3品系小鼠C57BL/6品系小鼠比多9個2bp堿基重復(fù);D1MIT506,其在1號染色體上所處位置為71cM;在松江3品系小鼠基因組和C57BL/6品系小鼠染色體中,相應(yīng)位置上基因序列長度差異18bp,松江3品系小鼠C57BL/6品系小鼠比多9個2bp堿基重復(fù);D1MIT113,其在1號染色體上所處位置為79cM;在松江3品系小鼠基因組和C57BL/6品系小鼠染色體中,相應(yīng)位置上基因序列長度差異22bp,松江3品系小鼠C57BL/6品系小鼠比多11個2bp堿基重復(fù);D1MIT150,其在1號染色體上所處位置為81cM;在松江3品系小鼠基因組和C57BL/6品系小鼠染色體中,相應(yīng)位置上基因序列長度差異10bp,松江3品系小鼠C57BL/6品系小鼠比多5個2bp堿基重復(fù);D1MIT209,其在1號染色體上所處位置為96cM;在松江3品系小鼠基因組和C57BL/6品系小鼠染色體中,相應(yīng)位置上基因序列長度差異6bp,松江3品系小鼠C57BL/6品系小鼠比多3個2bp堿基重復(fù)。在本發(fā)明的另一方面,提供用于區(qū)分松江3品系小鼠和C57BL/6品系小鼠1號染色體的試劑盒,其中包括以下引物:rs31426703上游引物SEQIDNO:1和下游引物SEQIDNO:2;rs32086848上游引物SEQIDNO:3和下游引物SEQIDNO:4;rs31928308上游引物SEQIDNO:5和下游引物SEQIDNO:6;rs32139742上游引物SEQIDNO:7和下游引物SEQIDNO:8;rs31336640上游引物SEQIDNO:9和下游引物SEQIDNO:10;rs6297658上游引物SEQIDNO:11和下游引物SEQIDNO:12;rs6302815上游引物SEQIDNO:13和下游引物SEQIDNO:14;rs30146639上游引物SEQIDNO:15和下游引物SEQIDNO:16;rs32011713上游引物SEQIDNO:17和下游引物SEQIDNO:18;rs6212353上游引物SEQIDNO:19和下游引物SEQIDNO:20;rs32662004上游引物SEQIDNO:21和下游引物SEQIDNO:22;rs32495825上游引物SEQIDNO:23和下游引物SEQIDNO:24;rs31580048上游引物SEQIDNO:25和下游引物SEQIDNO:26;rs30694738上游引物SEQIDNO:27和下游引物SEQIDNO:28;rs30902647上游引物SEQIDNO:29和下游引物SEQIDNO:30;rs3678938上游引物SEQIDNO:31和下游引物SEQIDNO:32;rs30776510上游引物SEQIDNO:33和下游引物SEQIDNO:34;rs32297231上游引物SEQIDNO:35和下游引物SEQIDNO:36;rs32366433上游引物SEQIDNO:37和下游引物SEQIDNO:38;rs31145145上游引物SEQIDNO:39和下游引物SEQIDNO:40。另一優(yōu)選例中,所述試劑盒中還包括以下探針(位點特異性探針):用于鑒定rs31426703位點的SEQIDNO:41、SEQIDNO:42和SEQIDNO:43所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs32086848位點的SEQIDNO:44、SEQIDNO:45和SEQIDNO:46所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs31928308位點的SEQIDNO:47、SEQIDNO:48和SEQIDNO:49所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs32139742位點的SEQIDNO:50、SEQIDNO:51和SEQIDNO:52所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs31336640位點的SEQIDNO:53、SEQIDNO:54和SEQIDNO:55所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs6297658位點的SEQIDNO:56、SEQIDNO:57和SEQIDNO:58所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs6302815位點的SEQIDNO:59、SEQIDNO:60和SEQIDNO:61所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs30146639位點的SEQIDNO:62、SEQIDNO:63和SEQIDNO:64所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs32011713位點的SEQIDNO:65、SEQIDNO:66和SEQIDNO:67所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs6212353位點的SEQIDNO:68、SEQIDNO:69和SEQIDNO:70所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs32662004位點的SEQIDNO:71、SEQIDNO:72和SEQIDNO:73所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs32495825位點的SEQIDNO:74、SEQIDNO:75和SEQIDNO:76所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs31580048位點的SEQIDNO:77、SEQIDNO:78和SEQIDNO:79所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs30694738位點的SEQIDNO:80、SEQIDNO:81和SEQIDNO:82所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs30902647位點的SEQIDNO:83、SEQIDNO:84和SEQIDNO:85所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs3678938位點的SEQIDNO:86、SEQIDNO:87和SEQIDNO:88所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs30776510位點的SEQIDNO:89、SEQIDNO:90和SEQIDNO:91所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs32297231位點的SEQIDNO:92、SEQIDNO:93和SEQIDNO:94所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs32366433位點的SEQIDNO:95、SEQIDNO:96和SEQIDNO:97所示核苷酸序列的探針;用于鑒定rs31145145位點的SEQIDNO:98、SEQIDNO:99和SEQIDNO:100所示核苷酸序列的探針。另一優(yōu)選例中,所述試劑盒中還包括以下通用探針:SEQIDNO:101和SEQIDNO:102所示核苷酸序列的探針。另一優(yōu)選例中,所述試劑盒中還包括以下引物:D1MIT64上游引物SEQIDNO:103和下游引物SEQIDNO:104;D1MIT236上游引物SEQIDNO:105和下游引物SEQIDNO:106;D1MIT303上游引物SEQIDNO:107和下游引物SEQIDNO:108;D1mit49上游引物SEQIDNO:109和下游引物SEQIDNO:110;D1mit387上游引物SEQIDNO:111和下游引物SEQIDNO:112;D1mit445上游引物SEQIDNO:113和下游引物SEQIDNO:114;D1MIT506上游引物SEQIDNO:115和下游引物SEQIDNO:116;D1MIT113上游引物SEQIDNO:117和下游引物SEQIDNO:118;D1MIT150上游引物SEQIDNO:119和下游引物SEQIDNO:120;D1MIT209上游引物SEQIDNO:121和下游引物SEQIDNO:122。另一優(yōu)選例中,所述試劑盒中還包括:PCR擴(kuò)增試劑(包括但不限于:DNA聚合酶,PCR緩沖液,Q-Solution,dNTPmix);LDR反應(yīng)試劑(包括但不限于:TaqDNA連接酶,LDR反應(yīng)緩沖液);電泳試劑(如瓊脂糖凝膠電泳試劑);序列分析軟件(如GeneMapperIDv3.2);和/或使用說明書。在本發(fā)明的另一方面,提供所述的試劑盒的用途,用于鑒別松江3品系小鼠和C57BL/6品系小鼠的1號染色體。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容,對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。附圖說明圖1、回交遺傳效應(yīng)示意圖。按照圖示所標(biāo)記,(A)代表非輪回親本松江3雄,(B)代表輪回親本C57BL/6雌,(B’)代表C57BL/6雄,(C)代表F1雌,(D)代表C57BL/61.松江3-Chr1雄,(E)代表C57BL/62.松江3-Chr1雄,(F)代表C57BL/63.松江3-Chr1雄,(G)代表C57BL/610.松江3-Chr1雄,(H)代表1號染色體,(I)代表X染色體,(J)代表Y染色體,(K)代表線粒體。圖2、親本(C57BL/6,松江3)和染色體替換(C57BL/610.松江3-Chr1)小鼠圖。按照圖示所標(biāo)記,(A)C57BL/6小鼠,(B)松江3小鼠,(C)C57BL/610.松江3-Chr1小鼠。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究,構(gòu)建了一種新的染色體C57BL/6替代實驗小鼠品系,該小鼠品系的遺傳背景以C57BL/6小鼠為主,但其中1號染色體以松江3小鼠為主。本發(fā)明的染色體替換品系可用于研究在相同基因組背景下,由不同的1號染色體基因組帶來的性狀差異,是采用遺傳學(xué)方法研究染色體基因組功能的有用工具。如本文所用,所述的“單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphisms;SNP)”是指在基因組上單個核苷酸的變異形成的遺傳標(biāo)記。如本文所用,所述的“簡單重復(fù)序列”又稱為“串聯(lián)重復(fù)序列(ShortTandemRepeats,STR),或“微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)”,是指一種短序列,例如一種單、二、三、四、或五-核苷酸,其在某一特定的核苷酸序列中至少重復(fù)一次。如本文所用,所述的“連接酶檢測反應(yīng)(LigaseDetectionReaction,LDR)”是基于在DNA連接酶(如TaqDNA連接酶)的作用下,當(dāng)SNP位點上下游兩條寡核苷酸探針與目的DNA序列完全互補,并且兩條探針之間沒有空隙時才能發(fā)生連接反應(yīng)這一原理所形成的技術(shù)。通過熒光掃描片段長度,實現(xiàn)對SNP位點的檢測。SNP及STR位點對于采用SNP位點為遺傳標(biāo)記的種群遺傳學(xué)研究,選擇出合適的SNP位點顯得尤為重要。這些SNP位點及附近序列要具有高度特異性;這些SNP位點要存在于合適的位置,以便于制定檢測方案時引物、探針的設(shè)計;這些SNP位點之間要有合適的距離,以便于各自分別地被檢測到。因此,合適的SNP位點的選擇需要經(jīng)過大量的分析和試驗工作。對于采用STR位點為遺傳標(biāo)記的種群遺傳學(xué)研究,選擇出合適的STR位點也非常重要。首先,其單元結(jié)構(gòu)要求簡單,因為結(jié)構(gòu)復(fù)雜(重復(fù)的堿基多,或者有其非重復(fù)堿基的插入)將會對后續(xù)分析帶來一定的偏差;其次,微衛(wèi)星位點所在的位置應(yīng)該遠(yuǎn)離基因編碼區(qū),如果處于或接近基因編碼區(qū),這些位點就可能會在種群的傳代過程中丟失,不能真實地反映群體的遺傳特征;第三,所選取的微衛(wèi)星位點原始序列要具有高度的特異性。此外,在被研究樣本大小的選擇上也有很高的要求,如果選取的樣本數(shù)量太小,可能會失去一些等位基因,從而給樣本之間遺傳差異的計算帶來偏差。因此,合適的STR位點的選擇需要經(jīng)過大量的分析和試驗工作。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究后,確定了一系列適合于鑒別松江3小鼠和C57BL/6小鼠的1號染色體的SNP位點以及STR位點。這些位點均勻地分布在1號染色體上,可非常有效地用于鑒別來自兩種小鼠的1號染色體。針對所確定的鑒別1號染色體的SNP位點,本發(fā)明人還從簡化操作過程以及提高分析的準(zhǔn)確性出發(fā),設(shè)計了一系列基于“連接酶檢測反應(yīng)”的檢測原理的引物和探針。每一對引物擴(kuò)增100~400bp之間長度的片段,且該片段中包含一個SNP位點。針對每一SNP位點有三條探針,其中一條探針(modify)可與SNP位點的上游(5’端)第1個堿基及之前的一段序列互補;另兩條探針的3’末端分別帶有一個與相應(yīng)的SNP位點互補的堿基,該堿基之前的序列可與SNP位點的下游(3’端)第1個堿基及之后的一段序列互補,并且該兩條探針的長度是不同的,從而便于通過測序儀(如3730測序儀)和序列分析方便地區(qū)分和鑒定。更優(yōu)選地,為了實現(xiàn)通過一次試驗鑒定多個SNP位點的目的,本發(fā)明人在設(shè)計探針時,在保證探針與帶有SNP位點的擴(kuò)增片段互補的前提下,對探針的長度進(jìn)行調(diào)整,使得針對各SNP位點的探針在經(jīng)過連接酶反應(yīng)后,獲得的產(chǎn)物長度均不同,這就大大簡化了檢測的程序,一次檢測獲得多個SNP位點的檢測結(jié)果,無需重復(fù)勞動。1號染色體替換品系的獲得染色體替代品系是將某一小鼠品系的一對染色體作為供體,另一品系作為受體,兩個品系雜交后與受體品系回交,借助基因分型挑選出未發(fā)生重組的個體與受體品系反復(fù)回交,從而實現(xiàn)對特定染色體的替換構(gòu)建出一系列染色體替換品系。利用染色體替代實驗小鼠研究復(fù)雜性狀調(diào)控機(jī)制,在各染色體替代品系中分析性狀表型數(shù)據(jù)可快速將調(diào)控復(fù)雜性狀的QTL定位到特定染色體上。染色體替換品系是迅速大規(guī)模定位性狀疾病染色體調(diào)控區(qū)段的有力手段,針對每一個染色體替換品系都可以進(jìn)行廣泛的性狀研究,并能明確該替換染色體是否調(diào)控某一性狀。本發(fā)明人首先通過以松江3品系小鼠作為父本、C57BL/6品系小鼠作為母本進(jìn)行雜交,獲得F1代小鼠,之后將F1代雌性小鼠與C57BL/6品系雄性小鼠雜交,獲得回交一代小鼠;該回交小鼠中,Y染色體和線粒體DNA已被替換為C57BL/6品系來源的;這是由于線粒體DNA只能通過雌性動物的卵母細(xì)胞進(jìn)行傳代,藉由雌性的C57BL/6小鼠只能傳代C57BL/6品系的線粒體DNA。對上述獲得的回交小鼠,鑒定其1號染色體的SNP位點,選擇1號染色體SNP位點鑒定結(jié)果為松江3品系小鼠所特有的回交小鼠,將選擇到的雄性回交小鼠再用STR進(jìn)行鑒定,將選擇到的雄性回交小鼠與C57BL/6品系雌性小鼠雜交,獲得下一代回交小鼠,該雄性回交小鼠中,X染色體已被替換為C57BL/6品系來源的;選擇到的雄性小鼠與C57BL/6品系雌性小鼠雜交,獲得下一代回交小鼠,使用多核苷酸多態(tài)性位點和短串聯(lián)重復(fù)序列位點鑒定回交小鼠,鑒定選擇到的雌性小鼠或雄性小鼠都可用于傳代;經(jīng)過多代(一般多于5代,較佳地多于8代,更佳地多于10代)選擇后獲得以C57BL/6品系小鼠為背景且其1號染色體被松江3品系小鼠的1號染色體替換的染色體替代動物品系。作為一個實施例,所述方法包括:(i)回交:取松江3和C57BL/6兩種品系的小鼠,以松江3做父本,C57BL/6做母本雜交得F1代,在雜交F1代雌鼠中,已將松江3中的線粒體DNA替換為C57BL/6;將F1代雌鼠與C57BL/6雄鼠雜交得C57BL/61.松江3-Chr1,為回交一代,在C57BL/61.松江3-Chr1雄鼠中,已將松江3中的Y染色體替換為C57BL/6;將F2代雄鼠與C57BL/6母鼠雜交得C57BL/62.松江3-Chr1,在C57BL/62.松江3-Chr1雄鼠中,已將X染色體替換為C57BL/6,以此輪回雜交十代,得到回交十代的小鼠C57BL/610.松江3-Chr1。(ii)鑒定回交:(a)初篩:從NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)中選取平均覆蓋1號染色體的20個小鼠SNP(shorttandemrepeat)位點,設(shè)計引物和探針。以松江3、回交和C57BL/6小鼠DNA為模板,鑒定回交小鼠的基因組DNA。(b)復(fù)篩:從NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)中選取小鼠10個STR(shorttandemrepeat)位點,設(shè)計STR引物。以松江3、回交和C57BL/6小鼠DNA為模板,鑒定回交小鼠的基因組DNA。通過初篩和復(fù)篩,使目標(biāo)染色體的掃描分辨率達(dá)到3.33cM。染色體替代品系將某一野生小家鼠品系的染色體作為供體,本發(fā)明中供體為松江3小鼠;另一品系作為受體(本發(fā)明中為C57BL/6小鼠),兩個品系雜交后與受體品系回交,通過與輪回親本回交10代后,得到的小鼠1號染色體來源于松江3,其余背景跟受體品系是一致的。松江3小鼠和C57BL/6小鼠因遺傳背景不同,導(dǎo)致核苷酸差異,且1號染色體在所有染色體中最長,將松江3小鼠1號染色體替換到C57BL/6小鼠的基因組背景上,可以對一些基因的功能進(jìn)行更全面的研究,以及它們是否參與了某些性狀的調(diào)控。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:(1)1號染色體替換品系可以研究在相同基因組背景下,由不同的1號染色體基因組帶來的性狀差異,是用遺傳學(xué)方法研究染色體基因組功能的有用工具。(2)通過選擇特定的SNP位點以及STR位點分別進(jìn)行初篩和復(fù)篩,使目標(biāo)染色體的掃描分辨率達(dá)到約3.33cM,可精確地區(qū)分松江3品系小鼠和C57BL/6品系小鼠的染色體,排除1號染色體發(fā)生重組的動物。(3)操作方法簡便,避免重復(fù)操作,成本低廉。(4)本方面將來自松江的野生小家鼠與實驗小鼠C57BL/6J雜交構(gòu)建染色體替換系,將豐富多樣的野生小鼠引入實驗,為復(fù)雜性狀的研究提供了新資源。下面結(jié)合具體實施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1、染色體替換小鼠的構(gòu)建辦法松江3小鼠的胚胎獲自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,將含有冷凍胚胎的冷凍管從液氮中取出;開蓋,室溫30秒后,加入預(yù)熱的0.25M蔗糖溶液,小心吹打10次,將混合液移到培養(yǎng)皿中,然后用洗卵針將胚胎吸出,放入預(yù)熱的M2溶液中,靜止片刻,用M2溶液清洗5次,移入M16溶液,培養(yǎng)箱培養(yǎng)待用。將胚胎移植到母鼠子宮內(nèi),發(fā)育成與凍存胚胎基因型相同的小鼠。取松江3(獲自上海松江的野生小家鼠)和C57BL/6兩種品系的成年小鼠,以松江3做父本,C57BL/6做母本雜交得F1代;將F1代雌鼠與C57BL/6雄鼠雜交,獲得的雄性回交小鼠依次采用SNP和STR進(jìn)行鑒定(后續(xù)實施例中詳述);選擇1號染色體SNP位點鑒定結(jié)果為松江3品系小鼠所特有的雄性回交小鼠;使用STR位點進(jìn)一步鑒定SNP法選擇到的雄性回交小鼠,選擇1號染色體STR位點鑒定結(jié)果為松江3品系小鼠所特有的雄性回交小鼠,得C57BL/61.松江3-Chr1,為回交一代,在C57BL/61.松江3-Chr1雄鼠中,已將Y染色體和線粒體DNA替換為C57BL/6品系來源的(即該代小鼠中,不存在松江3中的Y染色體和線粒體DNA),但1號染色體為松江3品系來源的。將C57BL/61.松江3-Chr1雄鼠與C57BL/6母鼠雜交,獲得的雄性小鼠依次采用SNP和STR進(jìn)行鑒定,選擇1號染色體SNP和STR位點鑒定結(jié)果為松江3品系小鼠所特有的雄性回交小鼠;命名為C57BL/62.松江3-Chr1,在C57BL/62.松江3-Chr1雄鼠中,已將X染色體替換為C57BL/6。采用相同的雜交和篩選方法(每一代均采用的SNP位點和STR位點鑒定方法進(jìn)行1號染色體的鑒定),輪回雜交十代,得到回交十代的小鼠,命名為C57BL/610.松江3-Chr1,整個構(gòu)建過程的示意圖如圖1。實施例2、1號染色體基因組鑒定一、1號染色體基因組初篩鑒定針對松江3和C57BL/6兩種品系的小鼠1號染色體基因序列進(jìn)行比較(序列參照MGI(http://www.informatics.jax.org/)的公開信息),選擇代表性的、兩種品系不同的SNP位點,這些SNP位點均勻地分布于1號染色體,且易于設(shè)計操作。然后對這些SNP位點設(shè)計引物以擴(kuò)增帶有特點SNP位點的序列,將PCR擴(kuò)增片段的范圍設(shè)計在100~400bp之間,引物設(shè)計主要借助primer3在線軟件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)和Oligo6.0程序(MolecularBiologyInsightsInc.,USA)完成。并針對這些SNP位點設(shè)計位點特異探針,LDR探針連接產(chǎn)物長度為80~130bp。針對松江3和C57BL/6小鼠的染色體SNP位點如表1。表1、本發(fā)明中選定的SNP位點針對上述SNP位點設(shè)計的引物為:(1)rs31426703rs31426703-上游引物:GCTCATGTGCACACACACAC(SEQIDNO:1);rs31426703-下游引物:CGTCTAAAACTCGGGAAGCA(SEQIDNO:2);(2)rs32086848rs32086848-上游引物:CAGCCCTAATTCTATGTCAATTCTG(SEQIDNO:3);rs32086848-下游引物:GGAGGCAAGAGGATGGGTAT(SEQIDNO:4);(3)rs31928308rs31928308-上游引物:CTGCCTGGATAGCTGACACA(SEQIDNO:5);rs31928308-上游引物:GCCATACTTCCCCATCTGAA(SEQIDNO:6);(4)rs32139742rs32139742-上游引物:TGGCAGAAGTGATAGCCAGA(SEQIDNO:7);rs32139742-下游引物:TTATCAGGGGCATTCCTGAG(SEQIDNO:8);(5)rs31336640rs31336640-上游引物:GCAGAGCAGGAGCAGGTATC(SEQIDNO:9);rs31336640-下游引物:CAGAACATGGTGGGTGTGAG(SEQIDNO:10);(6)rs6297658rs6297658-上游引物:TGTCACAAGAAATGCAAGGA(SEQIDNO:11);rs6297658-下游引物:AACTGAGACGTCTGCCCATC(SEQIDNO:12);(7)rs6302815rs6302815-上游引物:TGGATCCACTTCATGTGTGC(SEQIDNO:13);rs6302815-下游引物:GTCCAATTCCCATTGACACC(SEQIDNO:14);(8)rs30146639rs30146639-上游引物:AAGAACTTGGAGGGCAGGAT(SEQIDNO:15);rs30146639-下游引物:GAGCCAACTTGTGGAAAGGA(SEQIDNO:16);(9)rs32011713rs32011713-上游引物:GCAGACATCACTGCCAAGAA(SEQIDNO:17);rs32011713-下游引物:GAAAACCAACCCAAGAGCAG(SEQIDNO:18);(10)rs6212353rs6212353-上游引物:AACTGGTTCCCACCTGTCAC(SEQIDNO:19);rs6212353-下游引物:TGGCATTGAGCTCTCTTGGT(SEQIDNO:20);(11)rs32662004rs32662004-上游引物:TGCATTAGTCCTTGGCTCCT(SEQIDNO:21);rs32662004-下游引物:GGCACTCCCTAATTCCACAA(SEQIDNO:22);(12)rs32495825rs32495825-上游引物:AATGTAGGAGGGAGGGAAGC(SEQIDNO:23);rs32495825-下游引物:GGCCAGAATATTGGTGTCCA(SEQIDNO:24);(13)rs31580048rs31580048-上游引物:GGACTTCTTCTTGGCTTTGG(SEQIDNO:25);rs31580048-下游引物:GGGGTAACCTGGAAACTGGT(SEQIDNO:26);(14)rs30694738rs30694738-上游引物:CCACTCTTCTCCTCTTTAACATCC(SEQIDNO:27);rs30694738-下游引物:ATAAATTTTGCGGCATGGTT(SEQIDNO:28);(15)rs30902647rs30902647-上游引物:GGAAAAAGCAGTTTGCTTGG(SEQIDNO:29);rs30902647-下游引物:ATAATGGTTTTGCTATACTTACCTTGT(SEQIDNO:30);(16)rs3678938rs3678938-上游引物:GAGTGCTGCAAGGTGACAAG(SEQIDNO:31);rs3678938-下游引物:GAGGTCAGAAGAGGGCACTG(SEQIDNO:32);(17)rs30776510rs30776510-上游引物:GGAGAGGCCAGAATCACAAC(SEQIDNO:33);rs30776510-下游引物:CTGTCACCAAAGGCCCTCTA(SEQIDNO:34);(18)rs32297231rs32297231-上游引物:TTGTATCCTGGGCAGCATCT(SEQIDNO:35);rs32297231-下游引物:CCTCACTGTCCAGACACAGC(SEQIDNO:36);(19)rs32366433rs32366433-上游引物:CTGCACTGGGTTCAACAAGA(SEQIDNO:37);rs32366433-下游引物:CTGCACAGAGAGCAAACAGC(SEQIDNO:38);(20)rs31145145rs31145145-上游引物:CTCCTTGGCACTGGACTCTC(SEQIDNO:39);rs31145145-下游引物:GTTACAGCCCCATTCGTCAT(SEQIDNO:40)。針對上述SNP位點設(shè)計的探針為:(1)rs31426703rs31426703_modify:CTTGTTCACCCTAGGAATGTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:41);rs31426703_C:TGATGCTGGAGAATGAATGGAGGG(SEQIDNO:42);rs31426703_T:TTTGATGCTGGAGAATGAATGGAGGA(SEQIDNO:43);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為80bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為82bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(2)rs32086848rs32086848_modify:CTAGTATGGTGGAAATAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:44);rs32086848_A:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTTTGAAAAGATGATGCTAT(SEQIDNO:45);rs32086848_G:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTTTGAAAAGATGATGCTAC(SEQIDNO:46);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為120bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為118bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(3)rs31928308rs31928308_modify:TATGGAAATTTCCTCCCTGTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:47);rs31928308_A:TAGTGTGATATTGGATGCAAAGGT(SEQIDNO:48);rs31928308_G:TTTAGTGTGATATTGGATGCAAAGC(SEQIDNO:49);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為80bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為82bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(4)rs32139742rs32139742_modify:ACAGACAGTGATAAATTCCTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:50);rs32139742_A:TGAAATAAAATAACATCACCCTTT(SEQIDNO:51);rs32139742_G:TTTGAAATAAAATAACATCACCCTTC(SEQIDNO:52);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為90bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為88bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(5)rs31336640rs31336640_modify:TTTAAGGGAAAAGGGCAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:53);rs31336640_A:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGGGAATCTAAGGAACTTTTTT(SEQIDNO:54);rs31336640_G:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGGGAATCTAAGGAACTTTTTC(SEQIDNO:55);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為116bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為114bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(6)rs6297658rs6297658_modify:CAAGCTTTGTGTCACTTCTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:56);rs6297658_A:TTTTTGAGCATCCCTGCGTGTGAATAT(SEQIDNO:57);rs6297658_G:TTTTTTTGAGCATCCCTGCGTGTGAATAC(SEQIDNO:58);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為88bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為90bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(7)rs6302815rs6302815_modify:TCTAAAAGTTAAACGGTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:59);rs6302815_A:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGAATTGGTTTGGCAATTTCTT(SEQIDNO:60);rs6302815_G:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGAATTGGTTTGGCAATTTCTC(SEQIDNO:61);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為122bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為124bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(8)rs30146639rs30146639_modify:CCTAAGGCCGAATTCCAAGTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:62);rs30146639_A:TTTTTTTTTTAAAGAAATGAGGCCAAGACAAT(SEQIDNO:63);rs30146639_G:TTTTTTTTTTTTAAAGAAATGAGGCCAAGACAAC(SEQIDNO:64);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為98bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為96bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(9)rs32011713rs32011713_modify:GTGACAGTTAAGGGCCATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:65);rs32011713_A:TTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGGTTCTAGTTATTGTGAGTT(SEQIDNO:66);rs32011713_C:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGGTTCTAGTTATTGTGAGTG(SEQIDNO:67);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為112bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為110bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(10)rs6212353rs6212353_modify:ACAGGCTAAGATTCAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:68);rs6212353_A:TTTTTTTTTTTTGAAAATGTGGCTCCTGTAACTT(SEQIDNO:69);rs6212353_C:TTTTTTTTTTTTTTTGAAAATGTGGCTCCTGTAACTG(SEQIDNO:70);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為102bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為100bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(11)rs32662004rs32662004_modify:TACCTGCAAGGACCCCTATTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:71);rs32662004_A:TTTTTTTGATTCTACCTTTTTAACTCAT(SEQIDNO:72);rs32662004_G:TTTTTTTTTGATTCTACCTTTTTAACTCAC(SEQIDNO:73);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為90bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為88bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(12)rs32495825rs32495825_modify:AGGATGGTGATGTATCATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:74);rs32495825_A:TTTTTTTTTTTTTTTGAAAAACTTAGATACGTCTTTT(SEQIDNO:75);rs32495825_G:TTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAAACTTAGATACGTCTTTC(SEQIDNO:76);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為110bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為108bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(13)rs31580048rs31580048_modify:ATGACACCAAAGCCAAGAATTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:77);rs31580048_A:TTAGTATCTGGTCCTAAAGTTTCT(SEQIDNO:78);rs31580048_G:TTTTAGTATCTGGTCCTAAAGTTTCC(SEQIDNO:79);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為94bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為92bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(14)rs30694738rs30694738_modify:TGTTTGTCATTATTTGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:80);rs30694738_A:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTAACAAAACATAAGTGGGT(SEQIDNO:81);rs30694738_G:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTAACAAAACATAAGTGGGC(SEQIDNO:82);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為126bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為128bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(15)rs30902647rs30902647_modify:CTTTAAATCCAAGCAAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:83);rs30902647_C:TTTTTTTTTTTTTTTCTGTACAATTACTTAATGACG(SEQIDNO:84);rs30902647_T:TTTTTTTTTTTTTTTTTCTGTACAATTACTTAATGACA(SEQIDNO:85);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為106bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為104bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(16)rs3678938rs3678938_modify:AGTCTGGCCTTCAGTAAGCTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:86);rs3678938_A:TTTGCAGTACTCAGAATTGTAAAGTT(SEQIDNO:87);rs3678938_G:TTTTTGCAGTACTCAGAATTGTAAAGTC(SEQIDNO:88);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為86bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為84bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(17)rs30776510rs30776510_modify:AATGAGACCCAGGTGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:89);rs30776510_G:TTTTTTTTTTTTTTTTTGTTCTCTTCATTGAGGTTTCGC(SEQIDNO:90);rs30776510_T:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTCTCTTCATTGAGGTTTCGA(SEQIDNO:91);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為114bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為112bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(18)rs32297231rs32297231_modify:ACCAAAAAATCCACGTATCTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:92);rs32297231_A:TTTAGCCTCTGATCTCCTGTTTCTCT(SEQIDNO:93);rs32297231_G:TTTTTAGCCTCTGATCTCCTGTTTCTCC(SEQIDNO:94);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為86bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為84bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(19)rs32366433rs32366433_modify:AAAAAGAAAACCTGTCAATTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:95);rs32366433_C:TTTGCAAGGATTAAATTGTTGCCG(SEQIDNO:96);rs32366433_T:TTTTTGCAAGGATTAAATTGTTGCCA(SEQIDNO:97);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為96bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為98bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(20)rs31145145rs31145145_modify:ACCCATGAAGGTCTGGCCTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC(SEQIDNO:98);rs31145145_C:TCCTACACAGTAAGAGACCAGGAG(SEQIDNO:99);rs31145145_T:TTTCCTACACAGTAAGAGACCAGGAA(SEQIDNO:100);該組探針配合的相應(yīng)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為112bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為114bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。通用探針為:UT:CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG(SEQIDNO:101);UF:p-GCATCACTCAGAGGG-FAM(SEQIDNO:102);通用探針用于與SNP位點特異性探針的互補,從而使得探針產(chǎn)生熒光。以松江3,回交和C57BL/6小鼠DNA為模板,分別以上述SNP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系如表2。表2、PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)程序如表3。表3、PCR反應(yīng)程序分別利用各組位點特異探針及通用探針,以PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行LDR連接,LDR反應(yīng)體系如表4,將表中除模板外其余各組分依次加入EP管中,混勻后再分裝到各PCR管中,再把以上得到的PCR產(chǎn)物分別加入各PCR管中,放入PCR儀上運行。表4、LDR反應(yīng)體系采用LDR方案進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物用3730型測序儀分析。LDR反應(yīng)程序如表5。表5、LDR反應(yīng)程序根據(jù)LDR連接產(chǎn)物用3730型測序儀分析后得到的結(jié)果,選擇SNP位點為表1中松江3相應(yīng)位點的動物,推定其1號染色體保留有松江3染色體的動物,排除1號染色體來自于C57BL/6的動物以及1號染色體發(fā)生重組的動物。并且,進(jìn)一步還通過復(fù)篩來鑒定。二、1號染色體基因組STR復(fù)篩鑒定從NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)得到這些STR位點的序列,然后對這些STR位點進(jìn)行引物設(shè)計。引物設(shè)計主要借助Oligo6.0程序完成。篩選得到的針對松江3和C57BL/6小鼠的染色體STR位點如表6。表6、本發(fā)明中選定的STR位點針對上述STR位點設(shè)計的引物為:(1)D1MIT64D1MIT64-上游引物:FAM-CATCAGAAGTACATCCCATTTCC(SEQIDNO:103);D1MIT64-下游引物:GAAAGTATTTAAGAAACATC(SEQIDNO:104);該對引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為206bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為236bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(2)D1MIT236D1MIT236-上游引物:FAM-CGCAAACCTGTACGCAGCATGAGGACTTGAGTTAGGA(SEQIDNO:105);D1MIT236-下游引物:CCCTCTGAGTGATGCCCCACCTAGCCTTTGTATAGGA(SEQIDNO:106);該對引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為213bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為223bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(3)D1MIT303D1MIT303-上游引物:FAM-TGTTCCTCCCAAATGGTTTC(SEQIDNO:107);D1MIT303-下游引物:CCACCTACTGGGCATACTGG(SEQIDNO:108);該對引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為255bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為235bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(4)D1mit49D1mit49-上游引物:FAM-CGCAAACCTGTACGCTCCAGTGTTGCTCTCTGACA(SEQIDNO:109);D1mit49-下游引物:CCCTCTGAGTGATGCTGATTATGTGAATGAGGGACCTT(SEQIDNO:110);該對引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為75bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為93bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(5)D1mit387D1mit387-上游引物:FAM-GTGCCACTTTGCGATCTCTT(SEQIDNO:111);D1mit387-下游引物:CAGTTTGGTGAATCCCTGCT(SEQIDNO:112);該對引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為315bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為321bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(6)D1mit445D1mit445-上游引物:FAM-GTACACAGGCGCACACATTC(SEQIDNO:113);D1mit445-下游引物:CCGTGAGCACACAGTACCAC(SEQIDNO:114);該對引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為334bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為316bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(7)D1MIT506D1MIT506-上游引物:FAM-GGAGAACTGCACCCCCTATT(SEQIDNO:115);D1MIT506-下游引物:CATTGGTTACACCAGGCTCA(SEQIDNO:116);該對引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為367bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為349bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(8)D1MIT113D1MIT113-上游引物:FAM-TCTTTCCTCCTCAAAATCAGG(SEQIDNO:117);D1MIT113-下游引物:AGGAAAATCCACTTCTAATCTGG(SEQIDNO:118);該對引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為123bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為101bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(9)D1MIT150D1MIT150-上游引物:FAM-TAAGGCTTCCTCTGGTGTCC(SEQIDNO:119);D1MIT150-下游引物:TGATTGCAATATACCAGGTTTCC(SEQIDNO:120);該對引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為157bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為147bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。(10)D1MIT209D1MIT209-上游引物:FAM-AAACTGAGAGGTGGCTTGGA(SEQIDNO:121);D1MIT209-下游引物:CCATGTCTGCTCTCTCCACA(SEQIDNO:122);該對引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為323bp的代表相應(yīng)動物保留了松江3特點,而擴(kuò)增產(chǎn)物長度為317bp的代表相應(yīng)動物保留了C57BL/6品系特點。以松江3,回交和C57BL/6小鼠DNA為模板,分別以上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系如表2,PCR反應(yīng)程序如表3。采用多重PCR方案進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物用3730型測序儀分析。結(jié)果,經(jīng)過10代回交,成功培育以C57BL/6為背景的包含松江3的1號染色體的染色體替換品系,該品系的遺傳背景已純合至95%以上,具有完全的來自C57BL/6J的線粒體和Y染色體,其1號染色體來自于松江3品系。從表型上看,10代回交獲得的小鼠與C57BL/6非常相近。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣羅于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
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