H5亞型禽流感疫苗候選株rS-156-/170+/181-及其構(gòu)建方法及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種通過反向遺傳技術(shù)對(duì)H5亞型禽流感病毒(AIV)HA蛋白糖基化位點(diǎn)進(jìn)行修飾構(gòu)建廣譜性H5亞型AIV疫苗的方法，主要涉及的AIV分布于2.3.4分枝、2.3.2.1分枝和7.2分枝中。

背景技術(shù)：
H5N1亞型高致病性禽流感可導(dǎo)致家禽的高發(fā)病率和高病死率，在中國、越南、印度尼西亞、印度、孟加拉國和埃及呈地方流行性(聯(lián)合國糧農(nóng)組織，http://www.fao.org)，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自1997年首次報(bào)道AIV能直接感染人以來，先后有H5N1、H9N2、H7N7和H7N9亞型AIV感染人類的報(bào)道。截止2013年10月8日為止，世界衛(wèi)生組織(WHO)(http://www.who.int)報(bào)道全世界已有641例人感染H5N1亞型AIV，其中380例死亡，死亡率接近60％。因此，高致病性H5亞型AIV既危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，又危害人類健康，是非常重要的人獸共患病。接種疫苗是防控流感病毒(Influenzavirus,IV)最有效的手段，但I(xiàn)V是分節(jié)段的RNA病毒，由于RNA聚合酶的復(fù)制保真性較低，故病毒基因組變異較快，需要使用匹配流行株的疫苗進(jìn)行疫病防控。當(dāng)前，在我國普遍使用的多為反向遺傳技術(shù)構(gòu)建的全病毒滅活疫苗，如Re-4、Re-5和Re-6。利用反向遺傳技術(shù)可快速替換當(dāng)前流行株表面糖蛋白構(gòu)建出疫苗候選株，進(jìn)行疫苗株的升級(jí)換代以應(yīng)付禽流感疫情。由于反向遺傳技術(shù)構(gòu)建的疫苗大多以PR8為骨架，因此在大流行時(shí)期可以用MDCK細(xì)胞大量生產(chǎn)疫苗株病毒，以緩解雞胚供應(yīng)的壓力。目前我國家禽中流行的H5N1亞型AIV主要分布于2.3分枝中的2.3.4和2.3.2分枝及7分枝中的7.2分枝，不同分枝病毒間交叉保護(hù)性較差。而且這些優(yōu)勢(shì)流行病毒又進(jìn)一步進(jìn)化出第四級(jí)分枝，抗原性和免疫原性發(fā)生進(jìn)一步變化，現(xiàn)有疫苗不能提供完全保護(hù)。顯然，依靠匹配流行株的疫苗研制速度永遠(yuǎn)跟不上病毒變異的速度。因此，廣譜性疫苗因其可以提供交叉保護(hù)性而受到廣泛關(guān)注。2008年，Chen等基于一段HA保守序列制備了一種DNA疫苗，攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明，該疫苗可對(duì)1分枝、2.2分枝及2.1分枝感染小鼠提供較好的保護(hù)。2012年，Janulikova等基于HA2蛋白的胞外區(qū)和融合肽段制備了偶聯(lián)多肽苗，此疫苗可在小鼠上抵擋H3或H7亞型流感病毒的攻擊。由此可見，多數(shù)研究者都致力于挖掘通用的抗原表位，并將其制備成疫苗。通過文獻(xiàn)調(diào)查可以發(fā)現(xiàn)，糖基化修飾會(huì)影響AIV的抗原性和免疫原性。Wang等(2009)以去糖基化修飾的HA蛋白作為免疫原，其攻毒保護(hù)性能明顯優(yōu)于野生型HA蛋白，且其血清顯示較強(qiáng)的交叉中和能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
高致病性H5亞型AIV給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的危害，病毒變異較頻繁且基因型較多，不同基因型間交叉保護(hù)性較差。因此，急需研制交叉保護(hù)性較好的新型廣譜性疫苗來應(yīng)對(duì)H5亞型禽流感疫情。本發(fā)明以2.3.4分枝的A/mallard/Huadong/S/2005(SY)株為母本，母本病毒的糖基化位點(diǎn)為S-156-/170+/181+，主要通過增加HA蛋白156位糖基化修飾，缺失其HA蛋白170和181位糖基化修飾，形成不同組合模式，利用反向遺傳技術(shù)拯救出6株H5亞型AIV疫苗候選株。病毒滅活后制成油佐劑疫苗免疫SPF雞制備血清，評(píng)價(jià)其對(duì)不同分枝H5亞型AIV交叉中和性，篩選出交叉中和能力好的疫苗候選株。制備滅活疫苗免疫動(dòng)物，通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)測(cè)定其免疫保護(hù)作用。本發(fā)明所述的一株H5亞型禽流感疫苗候選株，是rS-156-/170+/181-，它的結(jié)構(gòu)是以A/mallard/Huadong/S/2005株為母本骨架，缺失HA蛋白181位糖基化修飾。所述H5亞型禽流感疫苗候選株rS-156-/170+/181-的構(gòu)建方法，是以A/mallard/Huadong/S/2005株為母本骨架，缺失HA蛋白181位糖基化修飾而獲得。本發(fā)明還公開了所述H5亞型禽流感疫苗候選株rS-156-/170+/181-在制備廣譜性H5亞型AIV疫苗中的應(yīng)用。以對(duì)雞和鴨均為高致病性的H5N1亞型AIV2.3.4分枝中代表病毒SY株作為母本，通過點(diǎn)突變技術(shù)和反向遺傳技術(shù)構(gòu)建HA蛋白不同位點(diǎn)糖基化修飾缺失組合的重組AIV[156+/170-/181-，156-/170+/181-，156-/170-/181+，156+/170+/181-，156+/170-/181+，156+/170+/181+和156-/170+/181+(WT)]。以母本病毒作為對(duì)照，將各重組病毒滅活后免疫SPF雞制備血清，測(cè)定各血清對(duì)母本病毒及不同分枝H5N1亞型AIV的血凝抑制及中和抗體效價(jià)，并以其血凝抑制及中和抗體效價(jià)高的重組AIV作為滅活疫苗，通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)測(cè)定其免疫保護(hù)作用，篩選出一株對(duì)H5N1亞型不同分枝的AIV具有廣泛的交叉反應(yīng)性的重組病毒rS-156-/170+/181-，該疫苗可對(duì)多種H5N1亞型AIV攻毒的免疫雞提供保護(hù)和抑制機(jī)體排毒，克服臨床上現(xiàn)有疫苗只能保護(hù)單一基因型及交叉保護(hù)差的問題，為H5N1亞型高致病性AIV的防制提供新的方法。附圖說明圖1分段PCR擴(kuò)增結(jié)果M，Marker；1，156突變前段；2，156突變后段；3，170突變前段；4，170突變后段；5，181突變前段；6，181突變后段。圖2全長PCR擴(kuò)增結(jié)果M，Marker；1，156突變?nèi)L；2，170突變?nèi)L；3，181突變?nèi)L。具體實(shí)施方式本發(fā)明中所涉及的生物材料如下：A/mallard/Huadong/S/2005(SY)株(TangY,WuP,PengD,WangX,WanH,ZhangP,LongJ,ZhangW,LiY,WangW,ZhangX,LiuX.CharacterizationofduckH5N1influenzaviruseswithdifferingpathogenicityinmallard(Anasplatyrhynchos)ducks.AvianPathol.2009Dec；38(6):457-67.YanfangLi,SujuanChen,XiaojianZhang,QiangFu,ZhiyeZhang,ShaohuaShi,YinbiaoZhu,MinGu,DaxinPeng*,XiufanLiu*.A20-amino-aciddeletionintheneuraminidasestalkandafive-amino-aciddeletionintheNS1proteinbothcontributetothepathogenicityofH5N1avianinfluenza.Plosone.2014)。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：1.點(diǎn)突變和疫苗株的拯救1.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)A/mallard/Huadong/S/2005(SY)株病毒HA序列(Genebank序列號(hào)：EU195392.1，Tang,Y.,Wu,P.,Sun,Q.,Peng,D.,Zhang,W.,Li,Y.,Wang,W.,Long,J.,Zhang,P.,Liu,X.,2008,Roleofaminoacidresiduesatpositions322and329ofhemagglutinininvirulenceofH5N1avianinfluenzavirus.Chinesejournalofvirology24,340-344.)設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物(表1)，共涉及3個(gè)突變位點(diǎn)：TPS156NSS，NNT170NNA和NNT181NNA。表1引物設(shè)計(jì)引物名稱引物序列(5’-3’)HA-1bTATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGTT(SEQIDNO.1)HA-2bATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG(SEQIDNO.2)156-FCCTTACCAGGGAAACTCCTCCTTTTTCACa(SEQIDNO.3)156-RGTGAAAAAGGAGGAGTTTCCCTGGTAAGGa(SEQIDNO.4)170-FAAAAGAACAATGCATACCCAACAATAAAGAGAAGCa(SEQIDNO.5)170-RTTGTTGGGTATGCATTGTTCTTTTTGATAAGCCATAa(SEQIDNO.6)181-FCAATAAAGAGAAGCTACAATAATGCCAACCAGGAAGa(SEQIDNO.7)181-RCTTCCTGGTTGGCATTATTGTAGCTTCTCTTTATTGa(SEQIDNO.8)a突變堿基用下劃線標(biāo)出。bSY株HA基因全長PCR擴(kuò)增引物上游和下游。1.2Overlapping-PCR定點(diǎn)突變以SY株全病毒核酸(Tang,Y.,Wu,P.,Sun,Q.,Peng,D.,Zhang,W.,Li,Y.,Wang,W.,Long,J.,Zhang,P.,Liu,X.,2008,Roleofaminoacidresiduesatpositions322and329ofhemagglutinininvirulenceofH5N1avianinfluenzavirus.Chinesejournalofvirology24,340-344.)為模板，全長引物(HA-1和HA-2)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增HA基因，采用25μL體系：10×Buffer2.5μL，Mg2+1.5μL，dNTP0.2μL，引物HA-1和156-R、156-F和HA-2、HA-1和170-R、170-F和HA-2、HA-1和181-R、181-F和HA-2各0.5μL(濃度均為25μmol/μL)，TaqDNA聚合酶(1U/μL)1.5μL，DNA模板2μL，用無菌的超純水補(bǔ)齊到25μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min，94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。將PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后加到1％的瓊脂糖凝膠中，以1000bpmarker為標(biāo)準(zhǔn)參照，用80伏電壓跑1h后，染色后觀察結(jié)果，SY株HA基因片段全長為1704bp(堿基)。將PCR產(chǎn)物條帶切下后，用凝膠純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，測(cè)定濃度，并將其克隆至vector(購自Invitrogen公司)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑斑小提質(zhì)粒，質(zhì)粒送金斯瑞生物工程有限公司測(cè)序驗(yàn)證，陽性質(zhì)粒命名為pCR2.1-SY-HA。以pCR2.1-SY-HA為模板，全長引物與突變引物組合后分別PCR擴(kuò)增HA的上下兩段，其中156突變擴(kuò)增出480bp和1320bp的條帶，170突變擴(kuò)增出568bp和1260bp的條帶，181突變擴(kuò)增出600bp和1200bp的條帶(圖1)。經(jīng)凝膠純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，測(cè)定濃度，將前后兩段按1:1混合后作為模板PCR擴(kuò)增HA全長基因。所有樣品均擴(kuò)增出1800bp的條帶(圖2)。將PCR產(chǎn)物條帶切下后，用凝膠純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，測(cè)定濃度，并將其克隆至vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑斑小提質(zhì)粒，質(zhì)粒送金斯瑞生物工程有限公司測(cè)序驗(yàn)證，陽性質(zhì)粒分別命名為pCR2.1-156+/170-/181-、pCR2.1-156-/170+/181-、pCR2.1-156-/170-/181+、pCR2.1-156+/170+/181-、pCR2.1-156+/170-/181+、pCR2.1-156-/170+/181+、pCR2.1-156+/170+/181+，-20℃保存?zhèn)溆谩?.3表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BsaI(購自NEB公司)將HA片段從陽性質(zhì)粒(pCR2.1-156+/170-/181-、pCR2.1-156-/170+/181-、pCR2.1-156-/170-/181+、pCR2.1-156+/170+/181-、pCR2.1-156+/170-/181+、pCR2.1-156-/170+/181+、pCR2.1-156+/170+/181+)上消化下來，與BsmBI(購自NEB公司)消化的pHW2000(Hoffmann,E.,Neumann,G.,Kawaoka,Y.,Hobom,G.,Webster,R.G.,2000,ADNAtransfectionsystemforgenerationofinfluenzaAvirusfromeightplasmids.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,6108-6113.)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并在氨芐平板上篩選重組子。鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pHW-156+/170-/181-、pHW-156-/170+/181-、pHW-156-/170-/181+、pHW-156+/170+/181-、pHW-156+/170-/181+、pHW-156-/170+/181+、pHW-156+/170+/181+，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后用QIAGEN質(zhì)粒純化試劑盒提取高純度陽性重組質(zhì)粒，與含S株其他7個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒(pHW251-PB2,pHW252-PB1,pHW253-PA,pHW254-HA,pHW255-NP,pHW256-NA,pHW257-M,andpHW258-NS)(Tang,Y.,Wu,P.,Sun,Q.,Peng,D.,Zhang,W.,Li,Y.,Wang,W.,Long,J.,Zhang,P.,Liu,X.,2008,Roleofaminoacidresiduesatpositions322and329ofhemagglutinininvirulenceofH5N1avianinfluenzavirus.Chinesejournalofvirology24,340-344.)一起用于轉(zhuǎn)染。測(cè)定質(zhì)粒各自的濃度，并將其都調(diào)整為200ng/μL以用于轉(zhuǎn)染。1.4病毒拯救病毒拯救參照Hoffmann等方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前一天，取等量的293T和MDCK細(xì)胞混合后加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞覆蓋面積達(dá)80％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取8種質(zhì)粒各1μL加入到50μL無抗生素?zé)o血清DMEM培養(yǎng)基中并輕輕混勻。使用前輕輕混勻LipofectamineTM2000(購自Invitrogen公司)，取10μL稀釋到50μL無抗生素?zé)o血清DMEM培養(yǎng)基中并輕輕混勻。將質(zhì)粒稀釋液與LipofectamineTM2000(購自Invitrogen公司)稀釋液混合，并輕輕混勻，在室溫下作用20min。作用完畢，將混合液逐滴加入到細(xì)胞表面，轉(zhuǎn)染后72h收集細(xì)胞上清，接種10日齡SPF雞胚，每日觀察雞胚死亡情況，收集雞胚尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，陽性雞胚尿囊液置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。反向遺傳拯救的重組病毒分別命名為rS-156-/170+/181+(wild-type,WT)、rS-156-/170-/181+、rS-156-/170+/181-、rS-156+/170+/181+、rS-156+/170-/181+、rS-156+/170+/181-、rS-156+/170-/181-。2.病毒滅活及血清制備取出重組病毒(rS-156-/170+/181+(wild-type,WT)、rS-156-/170-/181+、rS-156-/170+/181-、rS-156+/170+/181+、rS-156+/170-/181+、rS-156+/170+/181-、rS-156+/170-/181-)尿囊液，先以8000rpm離心5min后取上清測(cè)定各病毒血凝效價(jià)(HA)，再以43:7的比例在尿囊液中加入1/50預(yù)稀釋的甲醛溶液，此過程需逐滴加入滅活液，并且不斷混勻防止滅活不完全，滅活液加完后將病毒移至4℃放置，每隔兩小時(shí)混勻一次，在4℃滅活總時(shí)間超過24h。取出滅活的病毒尿囊液，測(cè)定其血凝效價(jià)(>24才滿足要求)。將滅活的病毒尿囊液與弗氏完全佐劑1:1混合后充分乳化制成疫苗，取0.2mL疫苗注射4wSPF雞，每種滅活疫苗注射4只SPF雞。在免疫后14d加強(qiáng)免疫一次，二免后21d采集雞血，分離血清并測(cè)定其效價(jià)。3.血清交叉反應(yīng)性交叉血凝抑制試驗(yàn)：測(cè)定各病毒尿囊液HA效價(jià)，將病毒HA價(jià)調(diào)至22(4單位病毒)，以PBS將各血清倍比稀釋，再加入已調(diào)整好的4單位病毒，37℃條件下作用15min，作用完畢加入1％雞紅細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到37℃條件下作用15min后觀察結(jié)果。交叉血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定不同分枝的H5亞型AIV與重組病毒抗血清的反應(yīng)性。交叉中和試驗(yàn)：在CEF細(xì)胞上測(cè)定不同分枝病毒組織細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)，中和試驗(yàn)前一天將CEF細(xì)胞鋪到96孔板中，待細(xì)胞鋪滿整個(gè)孔底方可使用，使用前將細(xì)胞以無菌PBS清洗細(xì)胞兩次。以維持液將各突變病毒抗血清在96孔板中作倍比稀釋，并與100個(gè)TCID50的病毒在37℃條件下作用10min，作用完畢將中和產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到CEF細(xì)胞上，細(xì)胞繼續(xù)在37℃5％CO2條件下培養(yǎng)4d，而后統(tǒng)計(jì)各血清能中和病毒的最大稀釋度為中和效價(jià)，取每組4份血清中和效價(jià)的平均值為最后結(jié)果。根據(jù)我國目前禽流感流行情況，我們選取了4株H5亞型禽流感病毒進(jìn)行交叉反應(yīng)性試驗(yàn)。病毒SY為野生骨架病毒且屬于2.3.4分枝(TangY,WuP,PengD,WangX,WanH,ZhangP,LongJ,ZhangW,LiY,WangW,ZhangX,LiuX.CharacterizationofduckH5N1influenzaviruseswithdifferingpathogenicityinmallard(Anasplatyrhynchos)ducks.AvianPathol.2009Dec；38(6):457-67.)，DT屬于7.2分枝(Zhang,W.,Xue,T.,Wu,X.,Zhang,P.,Zhao,G.,Peng,D.,Hu,S.,Wang,X.,Liu,X.,Liu,W.,2011,IncreaseinviralyieldineggsandMDCKcellsofreassortantH5N1vaccinecandidatevirusescausedbyinsertionof38aminoacidsintotheNAstalk.Vaccine29,8032-8041.)，WXD屬于2.3.2.1分枝，ZJC為2.3.4.6分枝(Gu,M.,Zhao,G.,Zhao,K.,Zhong,L.,Huang,J.,Wan,H.,Wang,X.,Liu,W.,Liu,H.,Peng,D.,Liu,X.,2013,Novelvariantsofclade2.3.4highlypathogenicavianinfluenzaA(H5N1)viruses,China.Emerg.Infect.Dis.19,2021-2024.)。從結(jié)果中(表2)我們可以看出，野生型病毒rS-156-/170+/181+免疫血清對(duì)SY株有較高的中和效價(jià)和血凝抑制效價(jià)，對(duì)其它分枝病毒的中和效價(jià)和血凝抑制效價(jià)較低。而重組病毒rS-156-/170+/181-免疫血清對(duì)SY株中和效價(jià)和血凝抑制效價(jià)與SY免疫血清相似，而對(duì)其它分枝病毒中和效價(jià)和血凝抑制效價(jià)均顯著高于SY免疫血清。因此，選取重組病毒rS-156-/170+/181-作為疫苗候選株，并以野生型病毒rS-156-/170+/181+為對(duì)照，進(jìn)行免疫保護(hù)性試驗(yàn)。表2候選株血清交叉反應(yīng)性a病毒W(wǎng)XD屬于2.3.2.1分枝，SY為野生骨架病毒且屬于2.3.4分枝，ZJC為2.3.4分枝變異病毒，DT屬于7.2分枝。4.免疫保護(hù)性試驗(yàn)4周齡SPF雞隨機(jī)分成3大組，每大組30只雞，其中一組用于免疫野生型病毒rS-156-/170+/181+，另一組用于免疫候選疫苗株rS-156-/170+/181-，還有一組為PBS免疫對(duì)照組。接種途徑均為頸部皮下注射，劑量為0.2mL/只，在免疫后21d采集血清，并用血凝抑制試驗(yàn)(HI)測(cè)定其抗體效價(jià)，同時(shí)用野生型的母本毒株SY和7.2分枝AIVDT株攻毒，攻毒劑量為106EID50/只雞，攻毒途徑為滴鼻點(diǎn)眼，并設(shè)空白對(duì)照組。攻毒后，全部試驗(yàn)雞連續(xù)觀察14d，并記錄其發(fā)病和死亡情況。分別在攻毒后的1、3、5和7d采集喉拭子和泄殖腔拭子，以雞胚滴定其中病毒含量，統(tǒng)計(jì)排毒情況。所有攻毒對(duì)照組SPF雞在攻毒后均出現(xiàn)典型的禽流感癥狀，且全部死亡。SY和DT株流感病毒攻毒后，結(jié)果如表3，兩免疫組均能有較好的保護(hù)(100％)，而且相對(duì)于野生型rS-156-/170+/181+免疫組來說，rS-156-/170+/181-免疫組能更好地抑制排毒，特別是在DT株流感病毒攻毒組中，兩免疫組在攻毒后7d泄殖腔排毒率上存在顯著性差異(P<0.05)。表3SPF雞免疫保護(hù)試驗(yàn)注：O，喉拭子；C，泄殖腔拭子。a差異顯著,P<0.05。