CYP119-T213G/T214V突變酶及其用途技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于酶學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種CYP119酶的突變酶及其用途。

背景技術(shù)：
對(duì)映異構(gòu)體為分子量和結(jié)構(gòu)完全相同，但行駛功能完全不同的兩種化合物，然而，對(duì)于對(duì)映異構(gòu)體的拆分非常困難。催化劑的對(duì)映選擇性即體現(xiàn)了其催化底物生成單一對(duì)映異構(gòu)體的能力，因此，對(duì)應(yīng)選擇性的提高，有利于獲得單一對(duì)映異構(gòu)體。提高酶的對(duì)映選擇性為獲得單一手性化合物具有重要意義。CYP119酶(cytochromeP450119)來(lái)自黃石公園火山口分離的嗜酸嗜熱硫礦硫葉菌(Sulfolobussolfataricus)，因此該酶具耐酸抗高溫等作用。研究表明CYP119酶能催化月桂酸和苯乙烯等底物發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)，該反應(yīng)綠色環(huán)保具有較高應(yīng)用前景。由于該酶的天然底物未能確定，因此，利用苯乙烯作為CYP119酶的底物進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)時(shí)，獲得的對(duì)映選擇性不高。OrtizdeMontellano小組[1,2]報(bào)道，CYP119野生型酶在常溫下催化苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)的過(guò)氧化氫酶途徑中，S和R構(gòu)型的環(huán)氧苯乙烷之比約為3:1。其突變體T214V在過(guò)氧化氫途徑下的苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)速率比野生型有所提高，但其對(duì)映選擇性與野生型相比幾乎無(wú)變化。后來(lái)RabeKS等[3]，考察了CYP119酶催化苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)的最佳溫度和PH值，結(jié)果表明，溫度為70℃，TBHP為輔助氧化劑，pH8.5的甘氨酸緩沖液為野生型CYP119酶催化苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件,但是隨著溫度的升高，其對(duì)映選擇性降低。在70℃時(shí)，CYP119酶催化苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)產(chǎn)物S和R構(gòu)型的環(huán)氧苯乙烷之比降低為2:1。故本領(lǐng)域急需要解決其對(duì)映選擇性不高的難題。[1]KooL.S.,Tschirret-GuthR.A.,StraubW.E.,etal.J.Biol.Chem.2000,275,14112–14123.[2]KooL.S.,OrtizdeMontellano.J.Biol.Chem.,2002,124,5684-5691.[3]RabeKS,KikoK,NiemeyerCM.Chemicalbiologychemical.2008,9,420-425

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有的CYP119酶的對(duì)映選擇性不高的問(wèn)題。本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是提供了一種野生型CYP119酶的雙突變體。該CYP119酶的雙突變體的突變方式為T(mén)213G和T214V。進(jìn)一步的，上述的CYP119酶的雙突變體的氨基酸序列為SEQIDNo.2所示。本發(fā)明還提供了上述CYP119酶的雙突變體的編碼基因。進(jìn)一步的，上述CYP119酶的雙突變體的編碼基因的核苷酸序列為SEQIDNo.1所示。本發(fā)明也還提供了含有上述編碼基因的載體。同時(shí)，本發(fā)明提供了上述載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供了上述CYP119酶的雙突變體在制備環(huán)氧化反應(yīng)催化劑中的用途。其中，上述的環(huán)氧化反應(yīng)的底物為月桂酸或苯乙烯。也可以是月桂酸或苯乙烯的類(lèi)似物或衍生物。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明創(chuàng)造性地提供了一種CYP119酶的213G和214V的雙突變體，該雙突變體在常溫和高溫下均能有效催化苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)，同時(shí)能獲得較野生型酶明顯更高的對(duì)映選擇性。具有很好的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1、苯乙烯及R-，S-環(huán)氧苯乙烷標(biāo)準(zhǔn)品GC-MS圖譜，此圖反映了底物苯乙烯和環(huán)氧化產(chǎn)物的保留時(shí)間。圖2、雙突變酶在35℃下催化苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)的結(jié)果，此圖表明了在35℃下，苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)生成的兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體產(chǎn)物的積分面積比值，從而可計(jì)算得出其對(duì)映選擇性數(shù)據(jù)。圖3、雙突變酶在70℃下催化苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)的結(jié)果，此圖表明了在70℃下，苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)生成的兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體產(chǎn)物的積分面積比值，從而可計(jì)算得出其對(duì)映選擇性數(shù)據(jù)。圖4環(huán)氧苯乙烷離子碎片峰，具有了了環(huán)氧苯乙烷的特征離子峰，表明檢測(cè)產(chǎn)物存在。具體實(shí)施方式本研究小組根據(jù)前人結(jié)果，進(jìn)行了CYP119酶的213G和214V的雙突變，根據(jù)本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙突變體在常溫和高溫下催化苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)，均能獲得較野生型酶更高的對(duì)映選擇性。以下結(jié)合具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明。實(shí)施例一CYP119-T213G/T214V酶表達(dá)載體構(gòu)建CYP119酶野生型的核苷酸序列為SEQIDNo.5所示，氨基酸序列為SEQIDNo.6所示(WrightRL,HarrisK,SolowB,WhiteRH,KennellyPJ.CloningofapotentialcytochromeP450fromtheArchaeonSulfolobussolfataricus.FEBSLetters,1996,384:235-239.)。CYP119酶的突變，由于要對(duì)其進(jìn)行T213G和T214V的的雙突變，故根據(jù)含有CYP119野生型基因的載體pET30a-CYP119(SEQIDNo.7)載體設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)的引物序列。引物序列為：SEQIDNo.3和SEQIDNo.4，加粗并加下劃線處表示突變位點(diǎn)。擴(kuò)增CYP119-T213G/T214V酶的上游引物(SEQIDNo.3)：5'TTCTCATAGCGGGTAATGAGGGTGTTACTAACTTAATATCAAA3'；擴(kuò)增CYP119-T213G/T214V酶的下游引物(SEQIDNo.4)：5'TTTGATATTAAGTTAGTAACACCCTCATTACCCGCTATGAGAA3'。利用QuickchangeLightingSite-directedMutagenesisKit定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序，確認(rèn)是否完成突變及突變后位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。測(cè)序結(jié)果表明，定點(diǎn)突變完成，突變位點(diǎn)準(zhǔn)確，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。編碼的CYP119-T213G/T214V酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。CYP119-T213G/T214V酶的氨基酸序列(SEQIDNo.2)如下：1MYDWFSEMRKKDPVYYDGNIWQVFSYRYTKEVLNNFSKFSSDLTGYHERLEDLRNGKIRF61DIPTRYTMLTSDPPLHDELRSMSADIFSPQKLQTLETFIRETTRSLLDSIDPREDDIVKK121LAVPLPIIVISKILGLPIEDKEKFKEWSDLVAFRLGKPGEIFELGKKYLELIGYVKDHLN181SGTEVVSRVVNSNLSDIEKLGYIILLLIAGNEGVTNLISNSVIDFTRFNLWQRIREENLY241LKAIEEALRYSPPVMRTVRKTKERVKLGDQTIEEGEYVRVWIASANRDEEVFHDGEKFIP301DRNPNPHLSFGSGIHLCLGAPLARLEARIAIEEFSKRFRHIEILDTEKVPNEVLNGYKRL361VVRLKSNE實(shí)施例二CYP119-T213G/T214V酶表達(dá)載體純化將pET30a-CYP119-T213G/T214V質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plysS大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽(yáng)性單菌落，接種于5mL雙抗LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取2mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液于1L雙抗的TB培養(yǎng)基。加入250μl/LTraceElement，37℃，震蕩培養(yǎng)至OD0.6。加入0.4mMIPTG，32℃，誘導(dǎo)45h。(3)12000rpm，4℃離心10min，棄上清，加入20mLPH7.4，50mMPBS溶液充分懸浮菌體。將樣品置于冰水上，超聲破胞，50％功率，3s-3s，20min分兩次破完。破胞后在55℃水浴中加熱15min，12000rpm，4℃，離心40min，取上清液即為粗酶液。CYP119-T213G/T214V酶的純化純化所需試劑配方：平衡液I：50mMPBS，PH7.4，5mM咪唑平衡液II：50mMPBS，0.5MNaCl，PH7.4，5mM咪唑洗脫液I：50mMPBS，PH7.4，20mM咪唑洗脫液II：50mMPBS，PH7.4，80mM咪唑純化步驟：1)平衡液I洗脫5個(gè)柱體積。2)用滅菌的0.22μm過(guò)濾膜過(guò)濾粗酶液，上柱。3)平衡液I洗5個(gè)柱體積。4)平衡液II洗5個(gè)柱體積。5)洗脫液I洗6個(gè)柱體積。6)洗脫液II洗5個(gè)柱體積，收集洗脫液。將收集的洗脫液II用Ultra-1510K濃縮至800μL左右，再用50mMPBS，PH7.4置換緩沖液3次，濃縮至600μL左右，酶液呈現(xiàn)鮮紅色或紅黑色。將濃縮酶稀釋201倍后，紫外分光光度計(jì)測(cè)得A415＝0.3165，據(jù)此算出酶量為15.78mg/L。-80℃保存。經(jīng)過(guò)此純化后，蛋白的純度達(dá)90％以上，滿(mǎn)足后續(xù)工作的要求。實(shí)施例三CYP119-T213G/T214V突變酶催化苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)的對(duì)映選擇性研究以叔丁基過(guò)氧化氫(TBHP)為輔助氧化劑，在反應(yīng)溫度分別為35℃和70℃時(shí)催化苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)，測(cè)定其在低溫和高溫下催化苯乙烯的對(duì)映選擇性。溫度為35℃時(shí)的反應(yīng)條件為：苯乙烯溶解在乙腈中，使其終濃度為8mM，叔丁基過(guò)氧化氫8mM，CYP119-T213G/T214V酶40μM。反應(yīng)緩沖體系為50mMbis-Trisbuffer,pH7.5，總體系200μL。反應(yīng)10min時(shí)用200μLCH2Cl2淬滅反應(yīng)。等體積CH2Cl2萃取3次，用GC-MS進(jìn)行產(chǎn)物的檢測(cè)。反應(yīng)溫度為70℃時(shí)的反應(yīng)條件為：苯乙烯溶解在pH8.5甘氨酸溶液中，使其終濃度為8mM，叔丁基過(guò)氧化氫8mM。CYP119-T213G/T214V酶40μM。反應(yīng)緩沖體系為甘氨酸緩沖液PH＝8.5，總體系200μL。反應(yīng)10min時(shí)，用200μLCH2Cl2淬滅反應(yīng)。等體積CH2Cl2萃取3次，用GC-MS進(jìn)行產(chǎn)物的檢測(cè)。將標(biāo)準(zhǔn)品苯乙烯，S-環(huán)氧苯乙烷，R-環(huán)氧苯乙烷進(jìn)行GC-MS分析，以確定底物和產(chǎn)物的保留時(shí)間。GC-MS的檢測(cè)條件：ThermoScientificITQ900,手性柱CP-chirasl-DexCB：80℃，1min；80-110℃，2℃/min升高；110℃保持1min。R-環(huán)氧苯乙烷保留時(shí)間：14.57min左右，S-環(huán)氧苯乙烷保留時(shí)間：15.36min左右，苯乙烯的保留時(shí)間為4.7min左右(圖1,4)。根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)，獲得R-環(huán)氧苯乙烷與S-環(huán)氧苯乙烷的峰面積(圖2,3)，計(jì)算催化苯乙烯環(huán)氧化反應(yīng)的對(duì)映選擇性數(shù)據(jù)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在35℃時(shí)，雙突變體催化苯乙烯環(huán)氧化產(chǎn)物S：R＝5.8:1；在70℃時(shí)，雙突變體催化苯乙烯環(huán)氧化產(chǎn)物S：R＝4.6:1。相對(duì)于現(xiàn)有的CYP119酶，無(wú)論在高溫或是低溫下反應(yīng)，對(duì)映選擇性均具有顯著的提高。