專利名稱：突變型hpgg基序和hdash基序δ-5去飽和酶以及它們在制備多不飽和脂肪酸中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及制備編碼突變型Λ-5脂肪酸去飽和酶(其中在細(xì)胞色素b5-樣域的HPGG[SEQ ID NO: 7]基序內(nèi)發(fā)生至少一個(gè)突變，并且在HDASH[SEQ ID NO:8]基序內(nèi)發(fā)生至少一個(gè)突變)的核酸片段。
背景技術(shù)：
包括植物、藻類、真菌、原生藻菌(stramenopiles)和酵母在內(nèi)的多種不同宿主正被研究旨在用于商業(yè)化多不飽和脂肪酸[“PUFA”]生產(chǎn)。基因工程已展示出，一些宿主(即使是亞油酸[LA;18:2co-6]和α -亞麻酸[ALA ; 18:3 ω-3]脂肪酸生產(chǎn)天然受限的那些)的天然能力可被充分改變以致使高水平生產(chǎn)多種長鏈o-3/co-6PUFA?；ㄉ南┧醄ARA ;20:4 ω-6]、二十碳五烯酸[ΕΡΑ ;20:5ω-3]和二十二碳六烯酸[DHA ;22:6 ω-3]的生產(chǎn)可能都需要Λ-5去飽和酶基因的表達(dá)，無論這是天然能力還是重組技術(shù)的結(jié)果。因此，本發(fā)明涉及具有高活性的新型Λ-5去飽和酶，其很好地適于整合進(jìn)商用宿主細(xì)胞中的PUFA生物合成途徑中。

發(fā)明內(nèi)容
在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有Λ-5去飽和酶活性的突變多肽，其包含:
(a)如 SEQ ID N0:34[HxGx]所示的氨基酸基序，其中 SEQ ID N0:34[HxGx]與 SEQID N0:7[HPGG]不同；和(b)如 SEQ ID NO:1 [HxxxH]所示的氨基酸基序，其中 SEQ ID NO:1 [HxxxH]與 SEQID N0:8[HDASH]不同。在第二實(shí)施方案中，(a)的氨基酸基序選自:SEQ ID NO: 9 [HgGG]、SEQ IDN0:10[HhGG]、SEQ ID NO:11[HPGs]、SEQ ID NO:12[HcGG]、SEQ ID N0:13[HwGG]和 SEQ IDN0:14[HaGG];并且，(b)的氨基酸基序選自:SEQ ID NO: 15 [HDgSH]、SEQ ID NO: 16 [HDsSH]、SEQ ID N0:17[HDAaH]、SEQ ID N0:18[HDAgH]和 SEQ ID NO:19[HeASH]。在第三實(shí)施方案中，基于BLASTP比對方法在與具有選自:SEQ ID NO: 21, SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:29的序列的多肽進(jìn)行比較時(shí)，所述突變多肽具有至少90%的序列同一性。在第四實(shí)施方案中，所述突變多肽的氨基酸序列選自:SEQ ID NO:139[EgD5R*-34gl57g]、SEQ ID NO:14 I[EgD5R*_34gI 58a]、SEQ ID NO:143[EgD5R*-34gl58g]、SEQ ID NO: 145[EgD5R*_34hI 58a]、SEQ ID NO:147[EgD5R*-34hl58g]、 SEQ ID NO:149[EgD5R*_36sl58a]、 SEQ IDN0:151[EgD5R*-36sl58g]、SEQ ID NO: 153 [EgD5M、密碼子優(yōu)化的 EgD5R*_34gl58g]、SEQ IDN0:157[EgD5Ml、密碼子優(yōu)化的 EgD5R*-34gl58g347s]、SEQ ID NO: 181 [EgD5S_36sl56e]、SEQ ID NO: 183 [EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:1 85 [ EgD5S-36sI 58 a ]、SEQ ID NO: 187 [EgD5S-36s 158g]、SEQ ID NO:2 I 3 [ EaD5S-35 a I 58g]、SEQ ID NO:215 [EaD5S-35al58s]、SEQ ID NO:2 17[EaD5S_35al59g]、SEQ IDN0:255[EgD5R-34gl58g]、SEQ ID NO:260[EgD5R_34gl58a]、SEQ ID NO:271[EaD5_35gl59g]和 SEQ ID NO:276[EaD5-35gl59a]。在第五實(shí)施方案中，所述突變多肽的二高-Y-亞麻酸至花生四烯酸的轉(zhuǎn)化效率為親本多肽的二高-Y -亞麻酸至花生四烯酸的轉(zhuǎn)化效率的至少64%，所述親本多肽包含與SEQ ID N0:7[HPGG]相同的氨基酸基序和與SEQ ID N0:8[HDASH]相同的氨基酸基序。在第六實(shí)施方案中，所述發(fā)明涉及編碼所述突變多肽中的任一種的分離的核酸分子。優(yōu)選地，所述分離的核酸分子具有選自以下的核苷酸序列:SEQ ID NO:138[EgD5R*-34gl57g]、SEQ ID NO:140[EgD5R*_34gl58a]、SEQ ID NO:142[EgD5R*-34gl58g]、SEQ ID NO: 144[EgD5R*_34hI 58a]、SEQ ID NO:146[EgD5R*-34hl58g]、 SEQ ID NO:148[EgD5R*_36sl58a]、 SEQ IDN0:150[EgD5R*-36sl58g]、SEQ ID NO: 152 [EgD5M、密碼子優(yōu)化的 EgD5R*_34gl58g]、SEQ IDN0:156[EgD5Ml、密碼子優(yōu)化的 EgD5R*-34gl58g347s]、SEQ ID NO: 180[EgD5S_36sl56e]、SEQ ID NO: 182 [EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:1 84 [ EgD5S-36sI 58 a ]、SEQ ID NO: 186 [EgD5S-36s 158g]、SEQ ID NO:2 I 2 [ EaD5S-35 a I 58g]、SEQ ID N0:214[EaD5S-35al58s]、SEQ ID NO:216[EaD5S_35al59g]、SEQ IDNO:254[EgD5R-34gl58g],SEQ ID NO:259[EgD5R_34gl58a]、SEQ ID NO:270[EaD5_35gl59g]和 SEQ ID N0:275[EaD5-35gl59a]。在第七實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及表達(dá)所述突變多肽中的任一種的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞選自:微生物，最優(yōu)選含油酵母；以及植物，最優(yōu)選油料種子植物。在第八實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生選自ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸的多不飽和脂肪酸。牛物保藏下列生物材料保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA20110-2209),并具有下
列名稱、保藏號和保藏日期。
生物材料保藏號保藏曰期
解脂耶氏酵母(Yarrowia ATCC PTA-100262009 年 5 月 14 日
Upolytica) Y8412上面列出的生物材料將按照國際承認(rèn)的用于專利程序目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的有關(guān)條款來保存。所列出的保藏物將會被保持在指定的國際保藏機(jī)構(gòu)中至少30年，并且一旦準(zhǔn)予專利公開它就將會對公眾開放。在由政府行為授予的專利權(quán)的部分廢除中，保藏物的可用性不會構(gòu)成實(shí)踐主題發(fā)明的許可。根據(jù)如美國專利申請公布2010-0317072-A1所述的方法，解脂耶氏酵母Y9502來源于解脂耶氏酵母Y8412。


和序列表圖1A和圖1B示出了 ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑，并且當(dāng)考慮下文對該途徑的描述時(shí)應(yīng)被視為是一起的。圖2是小眼蟲(Euglena gracilis) Δ-5去飽和酶的預(yù)測拓?fù)淠Ｐ?。圖3A、3B、3C和3D示出了來自小眼蟲的野生型Λ-5去飽和酶基因(B卩，EgD5 [SEQID NO: 20])與變體野生型小眼蟲(E.gracilis) Δ-5去飽和酶基因的DNA序列比對，所述突變野生型基因包含一個(gè)S347R突變(B卩，EgD5R[SEQ ID NO: 24])。圖4A、4B和4C示出了質(zhì)粒pDMW367_M4的構(gòu)建。圖5示出了來自小眼蟲的變體野生型Λ-5去飽和酶基因(B卩，EgD5R[SEQ IDNO: 24])的5’部分與合成突變型Λ-5去飽和酶的前204bp的序列比對，后者來源于小眼蟲并經(jīng)密碼子優(yōu)化以在解脂耶氏酵母中表達(dá)，并且包含HgGG[SEQ ID NO:9]和HDAgH[SEQ IDNO: 18]基序(B卩，EgD5M[SEQ ID NO: 152])。圖6提供了以下的質(zhì)粒圖譜:(A)pEgD 5M和(B)pDMW367-5M。圖7示出了解脂耶氏酵母菌株Z1978的發(fā)育。圖8提供了以下的質(zhì)粒圖譜:(A)pZKUM和(B)pZKL3_9DP9N。圖9示出了解脂耶氏酵母菌株Z8001至Z8054的發(fā)育。圖1OA示意性地示了與pYPS234的同源重組反應(yīng)，而圖1OB提供了 pYPS234的質(zhì)粒圖譜。圖1lA示意性地示了與pYPS233的同源重組反應(yīng)，而圖1lB提供了 pYPS233的質(zhì)粒圖譜。圖12A示意性地示了與PYPS241的同源重組反應(yīng)，而圖12B提供了 pYPS241的質(zhì)粒圖譜。圖13 提供了以下的質(zhì)粒圖譜:(A)pZR5AU-555 和(B)pZR5AU-555M。根據(jù)下面的詳細(xì)描述和附帶的序列描述可更充分地理解本發(fā)明，下面的詳細(xì)描述和附帶的序列描述形成了本專利申請的一部分。下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“對含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求一序列規(guī)則”)，并且符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25 (1998)以及EPO和PCT的序列表要求(規(guī)則5.2和49.5 (a-bis)以及行政指令(AdministrativeInstructions)的208節(jié)和附錄C)。核苷酸的符號和格式以及氨基酸序列數(shù)據(jù)符合如37C.F.R.§1.822所示的規(guī)則。SEQ ID NO: 1-311是編碼基因或蛋白質(zhì)(或其部分)的0RF、引物或質(zhì)粒的0RF，如表I所鑒定的。表1:核酸和蛋白質(zhì)SEQ ID號的匯總
權(quán)利要求
1.具有Λ-5去飽和酶活性的突變多肽，包含: (a)如SEQ ID N0:34[HxGx]所示的氨基酸基序，其中 SEQ ID N0:34[HxGx]與 SEQ IDN0:7[HPGG]不同；和 (b)如SEQ ID NO:l[HxxxH]所示的氨基酸基序，其中 SEQ ID NO:l[HxxxH]與 SEQ IDN0:8[HDASH]不同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變多肽，其中: (a)所述(a)的氨基酸基序選自:SEQID N0:9[HgGG]、SEQ ID N0:10[HhGG]、SEQ IDNO:ll[HPGs]、SEQ ID NO: 12 [HcGG]、SEQ ID N0:13[HwGG]和 SEQ ID N0:14[HaGG];并且 (b)所述(b)的氨基酸基序選自:SEQID N0:15[HDgSH]、SEQ ID NO: 16[HDsSH]、SEQID N0:17[HDAaH]、SEQ ID N0:18[HDAgH]和 SEQ ID NO:19[HeASH]。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變多肽，其中基于BLASTP比對方法在與具有選自:SEQIDNO:21, SEQ ID N0:25和SEQ ID NO:29的序列的多肽進(jìn)行比較時(shí)，所述突變多肽具有至少90%的序列同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變多肽，所述突變多肽具有選自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:139[EgD5R*-34gl57g]、SEQ ID NO:141[EgD5R*_34gl58a]、SEQ ID NO:143[EgD5R*-34gl58g]、SEQ ID NO: 145[EgD5R*_34hI 58a]、SEQ ID NO:147[EgD5R*-34hl58g]、 SEQ ID NO:149[EgD5R*_36sl58a]、 SEQ IDNO:151[EgD5R*-36sl58g]、SEQ ID NO: 153 [EgD5M、密碼子優(yōu)化的 EgD5R*_34gl58g]、SEQ IDNO:157[EgD5Ml、密碼子優(yōu)化的 EgD5R*-34gl58g347s]、SEQ ID NO: 181 [EgD5S_36sl56e]、SEQ ID NO: 183 [EgD5S-36s157 g]、SEQ ID NO:1 85 [ EgD5S-36sI 58 a ]、SEQ ID NO: 187 [EgD5S-36s 158g]、SEQ ID NO:2 I 3 [ EaD5S-35 a I 58g]、SEQ ID NO:215 [EaD5S-35al58s]、SEQ ID NO:2 17[EaD5S_35al59g]、SEQ IDNO:255[EgD5R-34gl58g]、SEQ ID NO:260[EgD5R_34gl58a]、SEQ ID NO:271[EaD5_35gl59g]和 SEQ ID NO:276[EaD5-35gl59a]。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的突變多肽，其中所述突變多肽的二高-Y-亞麻酸至花生四烯酸的轉(zhuǎn)化效率為親本多肽的二高-Y -亞麻酸至花生四烯酸的轉(zhuǎn)化效率的至少64%，所述親本多肽包含與SEQ ID NO: 7 [HPGG]相同的氨基酸基序和與SEQ ID NO:8[HDASH]相同的氣基酸基序。
6.分離的核酸分子，所述分離的核酸分子編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的核酸分子，所述分離的核酸分子具有選自以下的核苷酸序列:SEQ ID NO:138[EgD5R*-34gl57g]、SEQ ID NO: 140 [EgD5R*_34gl58a]、SEQ ID NO:142[EgD5R*-34gl58g]、SEQ ID NO: 144[EgD5R*_34hI 58a]、SEQ ID NO:146[EgD5R*-34hl58g]、 SEQ ID NO:148[EgD5R*_36sl58a]、 SEQ IDN0:150[EgD5R*-36sl58g]、SEQ ID NO: 152 [EgD5M、密碼子優(yōu)化的 EgD5R*_34gl58g]、SEQ IDNO:156[EgD5Ml、密碼子優(yōu)化的 EgD5R*-34gl58g347s]、SEQ ID NO: 180[EgD5S_36sl56e]、SEQ ID NO: 182 [EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:1 84 [ EgD5S-36sI 58 a ]、SEQ ID NO: 186 [EgD5S-36s 158g]、SEQ ID NO:2 I 2 [ EaD5S-35 a I 58g]、SEQ ID NO:214[EaD5S-35al58s]、SEQ ID NO:216[EaD5S_35al59g]、SEQ IDNO:254[EgD5R-34gl58g],SEQ ID NO:259[EgD5R_34gl58a]、SEQ ID NO:270[EaD5_35gl59g]和 SEQ ID N0:275[EaD5-35gl59a]。
8.轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1所述的多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞選自微生物和植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述微生物宿主細(xì)胞是含油酵母。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述含油酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowia IipolyticaX
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含基因構(gòu)建體，所述基因構(gòu)建體包含選自以下的基因:SEQ ID NO: 152, SEQID NO: 156, SEQ ID N0:182和SEQ IDN0:212。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有選自以下的序列:SEQ ID NO: 153、SEQ IDN0:157、SEQ ID NO: 183 和 SEQ ID NO: 213。
14.根據(jù)權(quán)利要求8或11中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生選自ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸的多不飽和脂肪酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述植物宿主細(xì)胞是油料種子植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了突變型Δ-5去飽和酶，其能夠?qū)⒍?γ-亞麻酸[DGLA；20:3ω-6]轉(zhuǎn)化成花生四烯酸[ARA；20:4ω-6]和/或?qū)⒍妓南┧醄ETA；20:4ω-3]轉(zhuǎn)化成二十碳五烯酸[EPA；20:5ω-3]，并且在細(xì)胞色素b5-樣域的HPGG(SEQ ID NO:7)基序內(nèi)具有至少一個(gè)突變，以及在HDASH(SEQ ID NO:8)基序內(nèi)具有至少一個(gè)突變。還公開了分離的核酸片段和包含此類編碼Δ-5去飽和酶的片段的重組構(gòu)建體，以及制備長鏈多不飽和脂肪酸[“PUFA”]的方法。
文檔編號C12N15/54GK103080317SQ201180040815
公開日2013年5月1日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者M.W.博斯蒂克, M.D.多伯特, H.何, S-P.洪, D.M.W.波拉克, P.L.夏普, Y.J.王, Z.薛, N.S.亞達(dá)夫, H.張, Q.朱 申請人:納幕爾杜邦公司