黃芩素分子印跡聚合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】黃芩素分子印跡聚合物及其制備方法和應(yīng)用，由黃芩素、功能單體混合溶解在致孔劑中，形成黃芩素－功能單體復(fù)合物，再加入有效劑量的引發(fā)劑、交聯(lián)劑，超聲混合均勻，將上步所得的混合溶液通入氮氣密封；在氮氣保護下，分子印跡聚合物采用熱引發(fā)，置于振蕩培養(yǎng)箱中進行聚合反應(yīng)，聚合反應(yīng)結(jié)束后，所得到的分子印跡聚合物用有機溶劑進行洗脫，除去模板分子，直至洗脫液中檢測不出模板分子后，再用甲醇洗至中性，最后將分子印跡聚合物真空干燥而得。本發(fā)明所制備的沉淀分子印跡聚合物微球，與傳統(tǒng)的本體分子印記聚合物相比較，具有單分散性好、粒徑均一、大小可控，制備簡單、無復(fù)雜的后處理過程和周期較短等優(yōu)點。
【專利說明】黃芩素分子印跡聚合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種分子印跡聚合物的制備方法，特別是一種對黃芩素及其體內(nèi)代謝物具有特異性識別的分子印跡聚合物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃岑為唇形科植物黃岑Scutellaria baicalensis Georg1.的干燥根，具有抗炎、抗病毒、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的藥理作用，是我國常用中藥材之一。黃芩素是黃芩的主要有效成分之一,對多種疾病包括炎癥、腫瘤、纖維化性疾病、心腦血管性疾病以及神經(jīng)性疾病具有良好的防治作用。目前對于黃芩素的提取大多應(yīng)用有機溶劑提取或樹脂吸附，存在著前處理步驟繁瑣，有機溶劑消耗量大，環(huán)境污染，且選擇性差，富集容量低，提取率極低。因此，隨著黃芩素研究的不斷深入，迫切需要一種對黃芩中有效成分更為簡便實用，且高靈敏度的專一的現(xiàn)代分離檢測方法。
[0003]分子印跡技術(shù)是模仿“抗原-抗體”識別原理發(fā)展的一種特異性識別目標分子的技術(shù)。由于分子印跡聚合物兼有高效、穩(wěn)定和特異選擇性且合成價格低廉的特點，近年來在越來越多的領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，并取得良好效果。有文獻報道【楊清清，李娟，等.藥物分析雜志，2011，31 (I)】以原位聚合法合成黃芩素分子印跡整體柱，并對黃芩素和漢黃芩素進行了分離。此方法以原位聚合法引入分子印跡技術(shù)，直接在HPLC柱內(nèi)制備連續(xù)棒形聚合物，制備過程簡單。但是聚合物顆粒不均勻，單分散性差，大量印記位點位于材料內(nèi)部，大大降低了聚合物的吸附效率和親和力。
[0004]中國專利CN103102444A公開了一種金屬配位黃芩素分子印跡聚合物的制備方法，采用輻射聚合和分子印跡技術(shù)相結(jié)合，一改過去傳統(tǒng)的本體聚合方法，節(jié)省時間。但是合成的聚合物需要碾磨過篩，大量印記位點被破壞，而且顆粒單分散性和均勻度均較差。同時存在后處理較繁瑣的缺點。所以制備均一單分散的分子印跡聚合物，并與固相萃取相結(jié)合來分離提純黃芩提取物的研究`，具有廣闊的應(yīng)用前景和研究意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]解決的技術(shù)問題:本發(fā)明的目的在于提供一種黃芩素分子印跡聚合物及其制備方法和應(yīng)用，以黃芩素分子印跡聚合物為新型分離吸附材料，并與固相萃取相結(jié)合，從黃芩提取物中定向高效的分離、富集、純化黃芩素的方法，從而克服現(xiàn)有分離純化技術(shù)的不足，使其能夠簡單、快速、特異性地吸附黃芩素分子或其結(jié)構(gòu)類似物，實現(xiàn)對黃芩藥材及生物代謝樣品中化學(xué)成分的選擇性分離、高效富集。
[0006]技術(shù)方案:黃芩素分子印跡聚合物，由黃芩素、功能單體混合溶解在致孔劑中，靜置2h，形成黃芩素一功能單體復(fù)合物，再加入有效劑量的引發(fā)劑、交聯(lián)劑，超聲5~lOmin，混合均勻，其中:黃芩素、功能單體的摩爾比為1:4~1:8，功能單體與交聯(lián)劑的摩爾比為1:3~1:6 ;致孔劑體積用量與交聯(lián)劑摩爾比為5~10:1 (mL/mmol);引發(fā)劑的用量是黃芩素、功能單體和交聯(lián)劑總質(zhì)量的3%~5% ;將上步所得的混合溶液通入氮氣lOmin，密封；在氮氣保護下，分子印跡聚合物采用熱引發(fā)，置于振蕩培養(yǎng)箱中進行聚合反應(yīng)，其中轉(zhuǎn)速為100~200r/min，聚合溫度為50~70°C，聚合反應(yīng)時間為20~36小時；聚合反應(yīng)結(jié)束后，所得到的分子印跡聚合物用有機溶劑進行洗脫，除去模板分子，直至洗脫液中檢測不出模板分子后，再用甲醇洗至中性，最后將分子印跡聚合物45°C真空干燥24h而得。
[0007]一種黃芩素分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于制備步驟為:1)將黃芩素、功能單體混合溶解在致孔劑中，靜置2h，形成黃芩素一功能單體復(fù)合物，再加入有效劑量的引發(fā)劑、交聯(lián)劑，超聲5~lOmin，混合均勻，其中:a.黃芩素、功能單體的摩爾比為1:4~1: 8，功能單體與交聯(lián)劑的摩爾比為1:3~1:6 ;b.致孔劑體積用量與交聯(lián)劑摩爾比為5~10:1(mL/mmol) ；c.引發(fā)劑的用量是黃芩素、功能單體和交聯(lián)劑總質(zhì)量的3%~5% ；2)將步驟I)中所得的混合溶液通入氮氣lOmin，密封；3)在氮氣保護下，分子印跡聚合物采用熱引發(fā)，置于振蕩培養(yǎng)箱中進行聚合反應(yīng)，其中轉(zhuǎn)速為100~200r/min，聚合溫度為50~70V ’聚合反應(yīng)時間為20~36小時；4)聚合反應(yīng)結(jié)束后，所得到的分子印跡聚合物用有機溶劑進行洗脫，除去模板分子，直至洗脫液中檢測不出模板分子后，再用甲醇洗至中性，最后將分子印跡聚合物45°C真空干燥24h。
[0008]所述的功能單體為:丙烯酸類:丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或三氟甲基丙烯酸；酰胺類:丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺；吡啶類:2-乙烯基吡啶或4-乙烯基吡啶。
[0009]所述的引發(fā)劑為過氧化苯甲?；蚺嫉惗‰妗?br> [0010]所述的致孔劑為四氫呋喃、乙腈、氯仿或二氯甲烷。
[0011]所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或N, N’-亞甲基二丙烯酰胺。
`[0012]所述步驟4)中的有機溶劑為甲醇和醋酸的混合溶液，甲醇和醋酸的體積比為4:1 ~9:1。
[0013]黃芩素分子印跡聚合物在分離純化黃芩素中的應(yīng)用，將該分子聚合物作為固相萃取柱的固定相，先用體積比5:1的甲苯-甲醇淋洗分子印跡聚合物柱上的非選擇性組分，然后用酸性溶劑將黃芩素洗脫下來。
[0014]有益效果:
[0015]1.黃芩藥材中存在的化合物結(jié)構(gòu)非常相似，且含量低、干擾大，非選擇性的分析材料很難對其進行分離純化。本發(fā)明合成的黃芩素分子印記聚合物為生物樣品中活性成分的高親和力、高選擇性分離提供了可能。
[0016]2.本發(fā)明所制備的沉淀分子印跡聚合物微球，與傳統(tǒng)的本體分子印記聚合物相比較，具有單分散性好、粒徑均一、大小可控，制備簡單、無復(fù)雜的后處理過程和周期較短等優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明中黃芩素單分散均一沉淀分子印跡聚合物的合成示意圖；
[0018]圖2是本發(fā)明合成的黃芩素沉淀分子印跡聚合物的掃描電鏡圖；
[0019]圖3是本發(fā)明合成的黃芩素分子印記聚合物的靜態(tài)吸附等溫線圖；
[0020]圖4是分子印跡聚合物定向分離、富集黃芩藥材中的黃芩素的色譜圖。A為藥材提取液，B為淋洗液，C為洗脫液，I為黃岑素?！揪唧w實施方式】
[0021]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0022]甲基丙烯酸(MAA)；
[0023]丙烯酰胺(AM)
[0024]三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRM)
[0025]N，N’-亞甲基二丙烯酰胺(MBA)
[0026]乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)
[0027]偶氮二異丁腈(AIBN)
[0028]實施例1:
[0029]稱取0.5mmol黃岑素,溶于60mL乙腈中，加入4.0mmol MAA,超聲IOmin,室溫放置2h。再加入 TRM12mmol，AIBN0.066g,超聲 lOmin，通氮氣 lOmin，密封，50°C，150r/min 震蕩培養(yǎng)箱上反應(yīng)25h。反應(yīng)結(jié)束時，將黃芩素分子印跡聚合物先以甲醇一冰醋酸(5:1，V/V)洗脫10次，甲醇洗5次，然后45°C真空干燥24h，得到黃芩素分子印跡聚合物(MIP-1)。
[0030]除合成過程中不添加模板分子以外，其余步驟均與黃芩素分子印跡聚合物制備步驟相同，得到非印跡聚合物(NIP-1)。
[0031]實施例2:`[0032]稱取0.5mmol黃岑素,溶于70mL四氫呋喃中，加入2.5mmol AM,超聲IOmin,室溫放置 2h。再加入 MBAlOmmol，AIBN0.056g，超聲 lOmin，通氮氣 lOmin，密封，60°C，200r/min震蕩培養(yǎng)箱上反應(yīng)25h。反應(yīng)結(jié)束時，將黃芩素分子印跡聚合物先以甲醇一冰醋酸(4:1，V/V)洗脫10次，甲醇洗5次，然后45°C真空干燥24h，得到黃芩素分子印跡聚合物(MIP-2)。
[0033]除合成過程中不添加模板分子以外，其余步驟均與黃芩素分子印跡聚合物制備步驟相同，得到非印跡聚合物(NIP-2 )。
[0034]實施例3:
[0035]稱取0.5mmol黃岑素,溶于50mL四氫呋喃中，加入2.5mmol AM,超聲lOmin,室溫放置 2h。再加入 EGDMAlOmmol，AIBN0.066g，超聲 lOmin，通氮氣 lOmin，密封，60°C，200r/min震蕩培養(yǎng)箱上反應(yīng)25h。反應(yīng)結(jié)束時，將黃芩素分子印跡聚合物先以甲醇一冰醋酸(4:1，V/V)洗脫10次，甲醇洗5次，然后45°C真空干燥24h，得到黃芩素分子印跡聚合物(MIP-3)。
[0036]除合成過程中不添加模板分子以外，其余步驟均與黃芩素分子印跡聚合物制備步驟相同，得到非印跡聚合物(NIP-3 )。
[0037]實施例4:
[0038]稱取0.5mmol黃岑素,溶于90mL氯仿中，加入3.0mmol甲基丙烯酰胺,超聲IOmin,室溫放置 2h。再加入 MBA9mmol，AIBN0.056g，超聲 lOmin，通氮氣 lOmin，密封，70°C，150r/min震蕩培養(yǎng)箱上反應(yīng)25h。反應(yīng)結(jié)束時，將黃芩素分子印跡聚合物先以甲醇一冰醋酸(6:1，V/V)洗脫10次，甲醇洗5次，然后45°C真空干燥36h，得到黃芩素分子印跡聚合物(MIP-4)。
[0039]除合成過程中不添加模板分子以外，其余步驟均與黃芩素分子印跡聚合物制備步驟相同，得到非印跡聚合物(NIP-4)。
[0040]實施例5:[0041]稱取0.5mmol黃芩素，溶于IOOmL氯仿中，加入3.5mmol AM，超聲lOmin，室溫放置2h。再加入 EGDMA14mmol，AIBN0.066g，超聲 5min，通氮氣 lOmin，密封，50°C，100r/min 震蕩培養(yǎng)箱上反應(yīng)25h。反應(yīng)結(jié)束時，將黃芩素分子印跡聚合物先以甲醇一冰醋酸(8:1，V/V)洗脫10次，甲醇洗5次，然后45°C真空干燥30h，得到黃芩素分子印跡聚合物(MIP-5)。
[0042]除合成過程中不添加模板分子以外，其余步驟均與黃芩素分子印跡聚合物制備步驟相同，得到非印跡聚合物(NIP-5 )。
[0043]實施例6:
[0044]稱取0.5mmol黃岑素，溶于200mL乙腈中，加入4.0mmo14-乙烯基吡唳，超聲IOmin,室溫放置 2h。再加入 TRM20mmol，AIBN0.066g,超聲 5min，通氮氣 lOmin，密封，70°C，100r/min震蕩培養(yǎng)箱上反應(yīng)25h。反應(yīng)結(jié)束時，將黃芩素分子印跡聚合物先以甲醇一冰醋酸(9:1，V/V)洗脫10次，甲醇洗5次，然后45°C真空干燥36h，得到黃芩素分子印跡聚合物(MIP-6)。
[0045]除合成過程中不添加模板分子以外，其余步驟均與黃芩素分子印跡聚合物制備步驟相同，得到非印跡聚合物(NIP-6 )。
[0046]測試實施例
[0047]取上述實施例3中合成的分子印跡聚合物MIP-3進行如下測試實驗。
[0048]測試實施例1.透射電鏡表征
[0049]圖2是本發(fā)明合成的黃芩素沉淀分子印跡聚合物的透射電鏡圖。可見，制備的印記聚合物微球大約900nm左右，且粒徑均一、單分散性好，作為固相萃取的固定相將會得到理想的柱壓和較高的分離效率。`
[0050]測試實施例2.靜態(tài)吸附試驗
[0051]精密稱取14份20mg印跡聚合物及非印跡聚合物，分別超聲分散于5mL系列濃度為0.25~2.5mmol/L的黃芩素四氫呋喃溶液中，密閉，室溫振搖4h，吸附平衡后用0.22 μ m的尼龍膜過濾，定量稀釋，紫外-可見分光光度儀于280nm處測定吸附前后黃芩素溶液濃度，根據(jù)式(I)計算出平衡吸附量I，平行操作三次。
rnn?nnCo - Ce)
[0052]Qe=畫^(I)
[0053]式中，Qe ( μπιο?/g)是平衡吸附量；V (L)是溶液的體積；CQ (mmol/L)是溶液的初始濃度;Ce (mmol/L)是溶液的平衡濃度；m (g)是聚合物的質(zhì)量。
[0054]結(jié)果表明MIP對黃芩素的吸附不同于物理吸附，而是一種有特異性識別位點的選擇性吸附，其最大吸附量達到60.34ymol/g，重復(fù)利用10次后仍能保持其較穩(wěn)定的吸附量。
[0055]測試實施例3.應(yīng)用例固相萃取定向分離富集黃岑藥材中的黃岑素
[0056]將制備的黃芩素分子印跡聚合物作為固相萃取固定相，定向分離富集黃芩藥材中的黃芩素，整個的分離過程依靠兩步洗脫完成，首先用甲苯-甲醇(5:1，V/V)作為淋洗液，其次用甲醇-冰醋酸(9:1)作為解吸附溶液。各個淋洗液和解吸附溶液的液相色譜圖如圖4所示。從圖4中可以看出，萃取前黃芩提取物中存在著多種組成成分；在通過填充MIP顆粒作為吸附相的固相萃取柱后，一次性處理黃芩素的回收率達到95%，純度可達到97%，說明合成的分子印記聚合物對黃芩素分子具有高度的親和力，是一種高效分離富集黃芩素的新吸附材料。
[0057]以上實例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，`都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.黃芩素分子印跡聚合物，其特征在于由黃芩素、功能單體混合溶解在致孔劑中，靜置2 h，形成黃芩素一功能單體復(fù)合物，再加入有效劑量的引發(fā)劑、交聯(lián)劑，超聲5~10 min,混合均勻，其中:黃芩素、功能單體的摩爾比為1:4~1:8，功能單體與交聯(lián)劑的摩爾比為1:3^1:6；致孔劑體積用量與交聯(lián)劑摩爾比為5~10:1 (mL/mmol);引發(fā)劑的用量是黃芩素、功能單體和交聯(lián)劑總質(zhì)量的3%~5% ;將上步所得的混合溶液通入氮氣10 min，密封；在氮氣保護下，分子印跡聚合物采用熱引發(fā)，置于振蕩培養(yǎng)箱中進行聚合反應(yīng)，其中轉(zhuǎn)速為100^200 r/min，聚合溫度為5(T70 °C，聚合反應(yīng)時間為20-36小時；聚合反應(yīng)結(jié)束后，所得到的分子印跡聚合物用有機溶劑進行洗脫，除去模板分子，直至洗脫液中檢測不出模板分子后，再用甲醇洗至中性，最后將分子印跡聚合物45 1:真空干燥24 h而得。
2.一種黃芩素分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于制備步驟為: 1)將黃芩素、功能單體混合溶解在致孔劑中，靜置2h，形成黃芩素一功能單體復(fù)合物，再加入有效劑量的引發(fā)劑、交聯(lián)劑，超聲5~10 min，混合均勻，其中: a.黃芩素、功能單體的摩爾比為1:4~1:8，功能單體與交聯(lián)劑的摩爾比為1:3~1:6; b.致孔劑體積用量與交聯(lián)劑摩爾比為5~10:1(mL/mmol)； c.弓丨發(fā)劑的用量是黃芩素、功能單體和交聯(lián)劑總質(zhì)量的3%~5%； 2)將步驟I)中所得的混合溶液通入氮氣10min，密封； 3)在氮氣保護下，分子印跡聚合物采用熱引發(fā)，置于振蕩培養(yǎng)箱中進行聚合反應(yīng)，其中轉(zhuǎn)速為100~200 r/min，聚 合溫度為50~70 °C，聚合反應(yīng)時間為20~36小時； 4)聚合反應(yīng)結(jié)束后，所得到的分子印跡聚合物用有機溶劑進行洗脫，除去模板分子，直至洗脫液中檢測不出模板分子后，再用甲醇洗至中性，最后將分子印跡聚合物45 °C真空干燥 24 h。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃芩素分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述的功能單體為:丙烯酸類:丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或三氟甲基丙烯酸；酰胺類:丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺；吡啶類:2-乙烯基吡啶或4-乙烯基吡啶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃芩素分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述的引發(fā)劑為過氧化苯甲?；蚺嫉惗‰?。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃芩素分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述的致孔劑為四氫呋喃、乙腈、氯仿或二氯甲烷。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃芩素分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或N，N’ -亞甲基二丙烯酰胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃芩素分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于:所述步驟4)中的有機溶劑為甲醇和醋酸的混合溶液，甲醇和醋酸的體積比為4:廣9:1。
8.權(quán)利要求1所述黃芩素分子印跡聚合物在分離純化黃芩素中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述黃芩素分子印跡聚合物在分離純化黃芩素中的應(yīng)用，其特征在于:將該分子聚合物作為固相萃取柱的固定相，先用體積比5:1的甲苯-甲醇溶液淋洗分子印跡聚合物柱上的非選擇性組分，然后用酸性溶劑將黃芩素洗脫下來。
【文檔編號】C08F222/14GK103497277SQ201310408025
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】陳立娜, 李虹, 何宏亮, 高艷坤, 史麗英, 都述虎 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)