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植物表達(dá)載體、蚜蟲(chóng)基因dsRNA表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法與工藝

文檔序號(hào):11965153閱讀:來(lái)源:國(guó)知局
植物表達(dá)載體、蚜蟲(chóng)基因dsRNA表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法與工藝

技術(shù)特征:
1.一種蚜蟲(chóng)基因dsRNA植物表達(dá)載體pRNAiAV2,其特征在于:所述載體的構(gòu)建方式如下:(1)以ToMV基因組為模板,利用引物CP_F和CP_R擴(kuò)增得到CP基因片段;(2)BamHI/PstI雙酶切將Rol啟動(dòng)子從pUC57載體上切下,克隆到p221CP的BamHI/PstI的位點(diǎn),得到載體p221-Rol-CP;(3)以載體pBI221為模板,利用引物NOS_F/NOS_R擴(kuò)增得到NOS終止子,將NOS終止子通過(guò)限制性內(nèi)切酶HindIII/PstI位點(diǎn)克隆到p221-Rol-CP,構(gòu)建為載體p221-RolCPNOS;(4)以ToMV基因組為模板,利用引物OAS_F和OAS_R擴(kuò)增得到OAS基因片段,將OAS基因片段通過(guò)限制性內(nèi)切酶BspEI/PstI位點(diǎn)克隆到p221-RolCPNOS,構(gòu)建為載體p221RolCPOAS;(5)將p221RolCPOAS的HindIII/EcoRI酶切片段克隆到pCAMBIA2300的相應(yīng)位點(diǎn),構(gòu)建成表達(dá)載體pBiRolCPOAS;(6)以棉蚜AV2基因片段為模板,用引物AV2_F和AV2_R擴(kuò)增棉蚜AV2的部分片段,將擴(kuò)增得到的片段克隆到pGEM-Teasy載體,用XmaI和XbaI從載體上把AV2片段切下,命名為AV2_XX;(7)用XmaI和XbaI消化pBiRolCPOAS,回收載體片段,并與AV2_XX連接,構(gòu)建得到載體pRolAV;(8)用BspEII和AvrII消化pRolAV,回收載體片段,并與AV2_XX連接,構(gòu)建得到載體pRNAiAV2;其中所述的Rol啟動(dòng)子的序列如SEQIDNO.2所示,所述的棉蚜AV2基因片段的序列如SEQIDNO.1所示,所述的引物CP_F為:GGATCCACCATGTCTTACTCAATCACT,CP_R為GAGCTCTTAAGATGCAGGTGCAGA,NOS_F為CTGCAGTCCGGATCGTTCAAACATTTGG,NOS_R為AAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGA,OAS_F為CTGCAGCCCGGGTCTAGAATTTGTGTCTGTGTGTATTG,OAS_R為TCCGGACCTAGGGTCAGCCCATACAGA。2.權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體在制作抗蚜蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
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